CN117586926B - 副干酪乳杆菌lp-116、lp-116后生元组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

副干酪乳杆菌lp-116、lp-116后生元组合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了副干酪乳杆菌LP‑116、LP‑116后生元组合物及其制备方法与应用，其中，副干酪乳杆菌LP‑116的保藏号为CGMCC NO.26441，LP‑116后生元组合物包括灭活的副干酪乳杆菌LP‑116与麦角硫因。LP‑116后生元组合物中灭活的副干酪乳杆菌LP‑116的个数为1012个/g，麦角硫因含量为40 mg/g。本发明的副干酪乳杆菌LP‑116以及LP‑116后生元组合物能够改善或修复肠上皮细胞屏障损伤，能够提高对结肠炎小鼠的炎症产生缓解效果。

Description

副干酪乳杆菌LP-116、LP-116后生元组合物及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及副干酪乳杆菌LP-116、LP-116后生元组合物及其制备方法与应用，属于微生物技术领域。
背景技术
益生菌是“当摄入足够数量时，对宿主产生健康益处的活性微生物”。这一定义强调了益生菌必须满足其为“活”的要求。早些年，益生菌主要是以活菌的形式使用，但活菌制剂可能存在潜在的安全隐患，并且不能与抗生素混合使用，易受加工、储存以及动物消化道酸性环境等条件的影响而不稳定。随着人类对益生菌的研究范围和功能的扩大深入，研究者们发现不仅活菌能够发挥益生功能，有一些“非活菌”组分也表现出明显的促进健康的作用，如灭活的菌体细胞、菌体死亡后溶解释放的成分，以及细菌的代谢产物等。其中，菌体成分包括脂磷壁酸、细胞表面蛋白、肽聚糖、荚膜多糖、菌毛、鞭毛等，代谢产物包括酶、多肽类、短链脂肪酸、胞外多糖等。这些具有促进健康功效的灭活菌和代谢物均属于“后生元(Postbiotics)”的范畴。后生元是指对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分的制剂。
麦角硫因是一种天然的硫咪唑氨基酸类强抗氧化剂，化学名称为2-硫代咪唑氨基酸，其左旋结构具有良好的生理活性，具有硫酮和硫醇两种形式的异构体。研究表明，麦角硫因具有抗氧化、抗炎、保护神经、心血管保护、预防肝脏疾病等作用。基于麦角硫因强抗氧化性、稳定性高、无毒性的特点，使其在生物医疗领域具有良好的应用前景。麦角硫因具有良好的抗氧化、抗炎作用，可作用于肠道疾病、糖尿病、心血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病、子痫前期和肺损伤。
人体肠道具有复杂的微环境，肠道屏障的存在有助于肠道结构的保存，而全世界有超过1000万人受到溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)的困扰。研究表明肠道菌群失调和肠道上皮屏障功能障碍与UC和CD的发生有直接关系。当肠道屏障受损时，局部免疫被激活，紧密连接(tight junction，TJ)蛋白结构发生改变，导致细胞因子失衡，介导肠道通透性降低。细胞间相互作用形成的TJ蛋白是肠上皮细胞的主要防御屏障。因此，保持肠道屏障的完整性至关重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供副干酪乳杆菌LP-116、LP-116后生元组合物及其制备方法与应用，能够改善或修复肠上皮细胞屏障损伤，能够提高对结肠炎小鼠的炎症产生缓解效果。
为达到上述目的，本发明是采用下述技术方案实现的：
一方面，本发明提供一种具有治疗或预防肠道屏障受损功能的副干酪乳杆菌LP-116，其特征在于，所述副干酪乳杆菌LP-116的保藏号为CGMCC NO.26441。
另一方面，本发明提供一种具有治疗或预防肠道屏障受损功能的LP-116后生元组合物，其特征在于，所述LP-116后生元组合物包括热灭活副干酪乳杆菌LP-116和麦角硫因。
进一步的，所述LP-116后生元组合物中热灭活副干酪乳杆菌的浓度为1012个/g，麦角硫因浓度为40mg/g。
另一方面，本发明提供一种具有治疗或预防肠道屏障受损功能的LP-116后生元组合物的制备方法，包括以下步骤：
a培养保藏号为CGMCC NO.26441的副干酪乳杆菌LP-116，获得副干酪乳杆菌LP-116菌液；b将步骤a中副干酪乳杆菌LP-116菌液离心，无菌蒸馏水洗涤菌体细胞两次后重悬，获得副干酪乳杆菌LP-116菌悬液；
c将步骤b中获得的副干酪乳杆菌LP-116菌悬液进行灭活处理，
d冷冻干燥步骤c获得的菌液，获得LP-11 6后生元；
e将步骤d获得的LP-116后生元与麦角硫因混合，获得LP-116后生元组合物。
进一步的，步骤b中，离心的转速为8000r/min，离心的温度为4℃，离心的时间为10min；步骤c中，灭活温度为100℃，灭活时间为30min。
进一步的，步骤e中：LP-116后生元与麦角硫因的质量比为24:1。
另一方面，本发明提供保藏号为CGMCC NO.26441的副干酪乳杆菌LP-116、包括灭活的保藏号为CGMCC NO.26441的副干酪乳杆菌LP-116的LP-116后生元以及包括灭活的保藏号为CGMCC NO.26441的副干酪乳杆菌LP-116的LP-116后生元组合物在制备用于治疗或预防肠道失调或肠道不适或肠道屏障受损的载体中的应用。
进一步的，所述肠道失调或肠道不适或肠道屏障受损为肠病或腹泻。
进一步的，所述载体为饲料和/或药物。
进一步的，所述饲料的形式包括干饲料和/或湿饲料；
进一步的，所述药物的形式包括片剂、胶囊、微胶囊、颗粒剂、粉剂、丸剂、栓剂、液剂和/或糖浆。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：
细胞试验发现，通过使用本发明提供的含有副干酪乳杆菌LP-116与麦角硫因的LP-116后生元组合物，能够显著提高Caco-2细胞的电阻值，降低细胞单分子层的通透性，并且改善Caco-2细胞TJ蛋白(ZO-1)的表达能力实现改善或修复肠道屏障功能损伤。
动物试验发现，LP-116与麦角硫因的后生元组合物制剂显著缓解葡聚糖硫酸钠盐(dextran sodium sulfate,DSS)诱导的小鼠结肠长度缩短和结肠病理损伤。
LP-116后生元和麦角硫因二者具有协同促进作用，能够增强对Caco-2细胞单层损伤的改善效果，能够提高对结肠炎小鼠的炎症产生缓解效果。
附图说明
图1所示为本发明副干酪乳杆菌LP-116一种实施例的扫描电子显微镜图；
图2所示为本发明副干酪乳杆菌LP-116一种实施例的菌株生长曲线；
图3所示为本发明LP-116后生元组合物对肠上皮屏障细胞影响的一种实施例柱状图；
其中，图3(A)所示为本发明LP-116后生元组合物对肠上皮屏障细胞间跨膜电阻影响的一种实施例柱状图；
图3(B)所示为本发明LP-116后生元组合物对肠上皮屏障细胞通透性影响的一种实施例柱状图；
图4所示为本发明LP-116后生元组合物对Caco-2细胞的TJ蛋白表达影响的一种实施例的免疫荧光染色图；
图5所示为本发明LP-116后生元组合物对结肠炎小鼠造模期间C57BL/6J小鼠的体重变化折线图；
图6所示为本发明LP-116后生元组合物对结肠炎小鼠的结肠度修复效果的一种实施例的柱状图；
其中，图6(A)所示为本发明LP-116后生元组合物对结肠炎小鼠的结肠长度修复效果的一种实施例的柱状图；
图6(B)所示为本发明LP-116后生元组合物对结肠炎小鼠的结肠重量/结肠长度修复效果的一种实施例的柱状图；
图7所示为本发明LP-116后生元组合物对结肠炎小鼠的结肠修复效果的一种实施例的HE染色图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本申请的涉及的菌株、药品和仪器的介绍：
副干酪乳杆菌LP-116，分离于自然发酵的东北酸菜，于2023年1月9号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.26441，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，拉丁文名称为Lactobacillus paracasei。
人结直肠腺癌细胞(Caco-2细胞)来源于武汉普普诺赛生命科技有限公司(中国)。
C57BL/6J小鼠，购自于北京维通利华实验动物技术有限公司。
MRS液体培养基配方(1L)：蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾(K2HPO4)2.0g、柠檬酸三铵(C6H17N3O7)2.0g、乙酸钠(CH3COONa·3H2O)5.0g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.2g、硫酸锰(MnSO4·4H2O)0.05g、Tween-80 1mL加入去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装后于121℃高压灭菌15min，待冷至常温。
MRS固体培养基配方(1L)：在MRS液体基础上加入琼脂20.0g，去离子水1L搅拌加热煮沸至充分溶解，分装后于121℃高压灭菌15min，待冷至60℃左右倒平板，备用。
CaCO3-MRS固体培养基配方(1L)：在MRS液体基础上加入琼脂20.0g，1.0g CaCO3，去离子水1L搅拌加热煮沸至充分溶解，分装后于121℃高压灭菌15min，待冷至60℃左右倒平板，备用。
Caco-2细胞培养基配方：DMEM高糖培养基中添加胎牛血清、青霉素链霉素双抗、谷氨酰胺以及非必需氨基酸，获得包含10wt％胎牛血清、1wt％的青霉素链霉素双抗、1wt％谷氨酰胺、1wt％非必需氨基酸的Caco-2细胞培养基。
麦角硫因，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
C57BL/6J小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
葡聚糖硫酸钠盐(dextran sodium sulfate,DSS)，购自美国MP Biomedicals公司。
多聚甲醛溶液，购自爱必信(上海)生物科技有限公司。
苏木精-伊红，购自美国默克Merck集团。
脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)，购自Sigma-Aldrich公司(美国)。
荧光素异硫氰酸酯(FITC)，购自Sigma-Aldrich公司(美国)。
胎牛血清(FBS)，购自上海逍鹏生物科技有限公司(中国)。
DMEM高糖培养基，购自上海逍鹏生物科技有限公司(中国)。
青霉素链霉素双抗，购自上海逍鹏生物科技有限公司(中国)。
胰蛋白酶，购自上海逍鹏生物科技有限公司(中国)。
磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)，购自上海逍鹏生物科技有限公司(中国)。
胞质紧密粘连蛋白1(ZO-1)(货号：21773-1-AP)，购自proteintech Group生物技术有限公司(中国)。
488标记山羊抗兔IgG抗体CoraLite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(货号：SA00013-2)，购自proteintech Group生物技术有限公司(中国)。
594标记山羊抗兔IgG抗体CoraLite594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(货号：SA00013-4)购自proteintech Group生物技术有限公司(中国)。
CO2培养箱，厂商力康生物医疗科技控股有限公司(中国)。
恒温培养箱，厂商北京东联哈尔仪器制造有限公司(中国)。
本申请的副干酪乳杆菌LP-116，分离于黑龙江省绥化市地区自然发酵的酸菜。
(一)样品采集
取新鲜发酵的酸菜汁水100mL和0.9wt％的无菌生理盐水900mL，并混合搅拌均匀，获得采集样品。
(二)乳酸菌富集
将样品按照1％(v/v)的接种量接种到10mL的MRS液体培养基富集培养，37℃严格厌氧培养48～72h，得到培养液。
(三)菌株分离
取培养液1mL，并加入9mL 0.9wt％的无菌生理盐水稀释10倍，继续用0.9wt％的无菌生理盐水进行十倍稀释，依次获得稀释比例为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的菌悬液。
吸取不同稀释比例的菌悬液各0.1mL，均采用涂布法分别接种至CaCO3-MRS固体培养基，37℃严格厌氧培养48h。
(四)菌株纯化
待CaCO3-MRS固体培养基上出现典型菌落后，挑取标准乳酸菌的菌落特征以及产生溶钙圈的单菌落。
将挑选出的单菌落进行连续培养三次，培养基内菌落形态一致，并且革兰氏染色为紫色，菌株细胞形态单一，即获得纯菌株，参考图1。
纯菌株的为革兰氏染色阳性、杆状、无芽孢、接触酶和氧化酶为阴性的菌株，具体基本特征详见表1。
表1副干酪乳杆菌LP-116的基本特征
(五)菌株保存
将纯菌株接种至MRS液体培养基，并于37℃培养24h，获得菌株菌液。
分别取900μL纯菌株和50％无菌甘油，置于细胞冻存管中充分混匀，并编号为LP-116，置于-80℃冷冻保存，备用。
同时，取纯菌株接种至MRS固体斜面培养基，并编号为LP-116，保存，送检并鉴定。
(六)菌株生长曲线
活化菌株LP-116：
将编号为LP-116的菌种从-80℃冰箱取出，并接种在MRS液体培养基中，于37℃恒温活化24h。
将活化菌株转接于相应MRS固体培养基，并于37℃恒温培养箱培养48h。
挑取单菌落接种于MRS液体培养基，并置于37℃恒温培养18h，以提高菌株活力，获得副干酪乳杆菌LP-116菌液。
制作生长曲线：
将活化后的LP-116菌液以1％(v/v)的接种量接种在MRS液体培养基中，在37℃下培养24h，并每隔2h测定菌液的OD 600值，以时间为横坐标，以OD 600值及pH为纵坐标，建立LP-116菌株的生长曲线，参考图2。
(七)分子生物学鉴定
(1)模板制备
取LP-116菌液100μL溶于50μΙTaKaRa Lysis Buffer for Microorganism toDirect PCR(货号：D304)中变性。
应用时，反应条件：80℃，15min。
将变性后的混合液离心处理。
应用时，离心过程的转速为1000r/min，离心温度为25℃，离心时间为10s。
(2)16s rDNA PCR扩增
实验组：以离心后的上清作为模板DNA(Template DNA)，使用TransGen的PCR扩增试剂High Fidelity(HiFi)PCR SuperMix I(货号：AS131)，进行PCR扩增。
阴性对照组：与实验组的区别是使用1μl的16S-free H2O作为模板DNA。
阳性对照组：与实验组的区别是使用1μl的已知菌株16S rDNA作为模板DNA。
应用时，PCR反应体系详见表2。
表2PCR反应体系
(3)16s rDNA测序
参考表3，以1541R-new和27F为引物，使用ABI公司型号：3730XL的DNA测序仪进行测序。
表3 16s rDNA测序相关引物
引物名称 引物序列(5'→3')
1541R-new AAGGAGGTGATCCAGCCGCA
27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
本申请PCR扩增得到16S rDNA序列长度为1454bp，具体序列如下：
CAAGTCGACGAGTTCTCGTTGATGATCGGTGCTTGCACCGAGATTCAACATGGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTTAGGGAGCGAGCCGTCTAAGGTGGGACAAATGAT(SEQ ID NO:1)。
将LP-116菌株的16S rDNA序列在NCBI中进行同源性比对后发现，LP-116菌株与副干酪乳杆菌属具有100％同源性，结果显示LP-116菌株属于副干酪乳杆菌属Lactobacillusparacasei。
将副干酪乳杆菌LP-116于2023年1月9号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.26441，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
应用时，副干酪乳杆菌LP-116以非活体细胞形式存在。
本申请的LP-116后生元组合物，包括灭活的副干酪乳杆菌LP-116与麦角硫因。
应用时，后生元组合物中灭活的副干酪乳杆菌的浓度为1012个/g，麦角硫因浓度为40mg/g。本申请LP-116后生元的制备方法，包括以下步骤：
a培养保藏号为CGMCC NO.26441的副干酪乳杆菌LP-116，获得副干酪乳杆菌LP-116菌液。
应用时，将活化后的LP-116菌液以1％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基培中，并置于37℃恒温箱培养24h，获得副干酪乳杆菌LP-116菌液。
b湿热灭菌法灭活步骤a培养好的副干酪乳杆菌LP-116菌液。
b1将培养好的副干酪乳杆菌LP-116菌液离心处理。
应用时，离心过程中：转速为8000r/min，离心温度为4℃，离心时间为10min。
b2用无菌蒸馏水洗涤两次离心后的菌株沉淀。
b3用无菌蒸馏水和洗涤后的菌株沉淀制备副干酪乳杆菌LP-116菌悬液。
c水浴加热副干酪乳杆菌LP-116菌悬液，以灭活副干酪乳杆菌LP-116，获得包括灭活的副干酪乳杆菌LP-116及其代谢产物的灭活菌悬液。
应用时，湿热灭菌法加热灭活的条件为：灭活温度为100℃，灭活时间为30min。
d冷冻干燥步骤c获得的菌液，获得LP-11 6后生元。
实际应用时，分别取样灭活前和灭活后的菌悬液，并分别用0.9wt％的无菌生理盐水稀释涂布在MRS固体培养基上，置于37℃恒温培养箱静止培养48h后，进行平板计数，检测灭活效果。
本申请灭活后的菌悬液在MRS固体培养基上没有菌落长出，表明灭活后的菌悬液中的副干酪乳杆菌LP-116灭活成功。
本申请LP-116后生元组合物的制备方法，包括以下步骤：
e将步骤d获得的LP-116后生元与麦角硫因混合，获得LP-116后生元组合物。
步骤e中：LP-116后生元与麦角硫因的质量比为24:1。
本领域技术人员能够根据上述的制备方法获得包括灭活的副干酪乳杆菌LP-116与麦角硫因的LP-116后生元组合物。
实际应用时，LP-116后生元组合物中灭活的副干酪乳杆菌的浓度为1012个/g，麦角硫因的浓度为40mg/g。
本申请保藏号为CGMCC NO.26441的副干酪乳杆菌LP-116、包括灭活的保藏号为CGMCC NO.26441的副干酪乳杆菌LP-116的LP-116后生元以及包括灭活的保藏号为CGMCCNO.26441的副干酪乳杆菌LP-116的LP-116后生元组合物在制备用于治疗或预防肠道失调或肠道不适或肠道屏障受损的载体中的应用。
其中，肠道失调或肠道不适或肠道屏障受损为克罗恩病、肠病或腹泻。应用时，肠道失调或肠道不适或肠道屏障受损是由致病性细菌引起的。
载体为饲料和/或药物。
饲料的形式包括干饲料和/或湿饲料。
药物的形式包括片剂、胶囊、微胶囊、颗粒剂、粉剂、丸剂、栓剂、液剂和/或糖浆。
本发明获得的后生元组合物能够调节经脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导的Caco-2细胞单分子层电阻值和渗透率的损伤和TJ蛋白的表达。
本发明获得的副干酪乳杆菌LP-116、LP-116后生元、LP-116后生元组合物能够改善由葡聚糖硫酸钠盐(dextran sodium sulfate,DSS)引起的小鼠肠道屏障功能障碍。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
Caco-2细胞培养：
S1将Caco-2细胞加入Caco-2细胞培养基中，并置于37℃、5％ CO2的CO2培养箱中培养，Caco-2细胞培养基每2天更换一次，直到Caco-2细胞融合率达到90％，用胰酶消化融合的Caco-2细胞，直到在倒置显微镜中观察到Caco-2细胞成为单细胞分散状态。
实施例1：
本实施例分析LP-116后生元组合物对肠上皮屏障细胞间跨膜电阻和通透性的影响。
LPS作为革兰氏阴性菌重要组成部分，是一种常见的内毒素，能够明显改变肠上皮细胞的通透性和电阻性。因此，通过在transwell细胞培养室中培养Caco-2细胞构建细胞单层并利用LPS诱导进而建立肠道屏障功能障碍模型。通过检测细胞间跨膜电阻(TEER)以及硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-dextran)转运情况测定Caco-2细胞单层的紧密性和渗透性，进而评价LP-116后生元及其组合物是否能够改善由LPS引起的肠道屏障功能损伤。
设置5组实验：Control组、LPS组、LP-116后生元组、麦角硫因组、LP-116后生元组合物组。
LP-116后生元组合物组设置步骤如下：
S11将分散状态的Caco-2细胞以1×104cells/cm2的密度接种到12孔transwell细胞培养室中，并置于37℃、5％ CO2的CO2培养箱中培养21天，直到Caco-2细胞完全分化且电阻值达到500Ω/cm2以上。
S12将1.0μg/mL的LP-116后生元组合物溶液100μL加入到细胞单层黏膜侧，同时加入100μg/mL的LPS100μL，置于37℃、5％ CO2的CO2培养箱孵育24h后，测定各孔的TEER值。
应用时，Control组的步骤S12中，既不添加LP-116后生元组合物溶液，也不添加LPS。
LPS组的步骤S12中，只添加LPS，不添加LP-116后生元组合物溶液。
LP-116后生元组的步骤S12中，将1.0μg/mL的LP-116后生元组合物溶液替换为1.0μg/mL LP-116后生元溶液。
麦角硫因组的步骤S12中，将1.0μg/mL的LP-116后生元组合物溶液替换为0.04μg/mL麦角硫因溶液。
测定TEER值后，将细胞单层黏膜侧用无菌PBS缓冲液洗涤两次后加入1mg/mL的FITC-dextran 100μL，置于37℃、5％ CO2的CO2培养箱孵育2h后，移取细胞单层浆膜侧内的培养液100μL于黑色的96孔板中，并快速置于酶标仪中，于激发波长为480nm、发射波长为520nm条件下测定荧光强度，即FITC-dextran通过Caco-2细胞单分子层的荧光强度。参考图3(A)，LPS组的Caco-2细胞单层屏障经100μg/mL的LPS处理24h后，Caco-2细胞单分子层TEER值为71.7±1.96％，比对Control组下降了29.3％，表示肠上皮屏障的完整性被破坏。LP-116后生元组及LP-116后生元组合物组中Caco-2细胞跨膜电阻值均高于LPS组，并且LP-116后生元组合物组对LPS诱导引起的Caco-2肠道屏障功能损伤的改善效果最为明显，均高于LP-116后生元组和麦角硫因组(p<0.05)。
参考图3(B)，LPS组FITC-dextran通过Caco-2细胞单分子层的转运速率显著高于其他组(p<0.05)，即，相对于其他组，LPS组中Caco-2单层细胞的通透性显著增加，肠道屏障功能受损严重。结合LPS组、麦角硫因组以及LP-116后生元组合物组可知，麦角硫因对受损的肠道屏障损伤的改善效果不佳(p>0.05)；结合LPS组、LP-116后生元组以及LP-116后生元组合物组可知，经LP-116后生元以及LP-116后生元组合物处理后的Caco-2细胞的荧光强度显著降低(p<0.05)，且LP-116后生元组合物组的通透性低于LP-116后生元组，可见，虽然LP-116后生元够修复Caco-2细胞单层，但是通过在LP-116后生元中添加麦角硫因获得的LP-116后生元组合物能够提高对受损的肠道屏障损伤的改善效果。LP-116后生元和麦角硫因二者具有协同促进作用，对Caco-2单层细胞的通透性改善效果大幅度增强。
实施例2：
本实施例分析LP-116后生元组合物对Caco-2细胞TJ蛋白表达的影响。
本实施例通过免疫荧光观察Caco-2细胞的TJ蛋白表达。
设置5组实验：Control组、LPS组、LP-116后生元组、麦角硫因组、LP-116后生元组合物组。
LP-116后生元组合物组设置步骤如下：
S11将分散状态的Caco-2细胞以1.0×104个/孔的密度接种到24孔板，并置于37℃、5％CO2的CO2培养箱中培养，直到细胞融合至80％。
S12将1.0μg/mL的LP-116后生元组合物溶液100μL加入各孔，同时，加入100μg/mL的LPS1000μL，置于37℃、5％ CO2的CO2培养箱孵育24h。
应用时，Control组的步骤S12中，既不添加LP-116后生元组合物溶液，也不添加LPS。
LPS组的步骤S12中，只添加LPS，不添加LP-116后生元组合物溶液。
LP-116后生元组的步骤S12中，将1.0μg/mL的LP-116后生元组合物溶液替换为1.0μg/mL LP-116后生元溶液。
麦角硫因组的步骤S12中，将1.0μg/mL的LP-116后生元组合物溶液替换为0.04μg/mL麦角硫因溶液。S13除去24孔板中的培养基，用无菌PBS缓冲溶液洗涤三次后，依次向24孔板中添加200μL 4wt％多聚甲醛固定20min，添加200μL 0.5wt％TritonX-100通透20min，添加200μL 5％ FBS溶液室温封闭15min，添加200μL ZO-1一抗溶液置于4℃过夜，添加荧光二抗室温孵育1h；
本实施例的200μL ZO-1一抗溶液稀释100倍。
S14室温下，用DAPI染核10min后，用甘油封片观察、拍照。本实施例通过免疫荧光染色观察ZO-1在Caco-2细胞单层中的分布。
参考图4，Control组的Caco-2细胞单层显示完整的TJ蛋白网络，而LPS组因LPS诱导Caco-2细胞单层损伤，规则的连接复合体被破坏，呈现不规则排列。通过对比LPS组、麦角硫因组、LP-116后生元组以及LP-116后生元组合物组可知，LP-116后生元组合物组中TJ蛋白网络结构更为完整，说明改善效果更为明显。LP-116后生元和麦角硫因二者具有协同促进作用，能够增强对Caco-2细胞单层损伤的改善效果。
实施例3：
本实施例分析LP-116后生元组合物对结肠炎小鼠造模期间体重、结肠长度以及结肠组织学变化的影响。
将C57BL/6J小鼠饲养于室温为25±2℃、相对湿度为50±5％的环境中，同时保持饲养环境每12h调节光/暗。适应饲养一周后选择50只体重25±2g的C57BL/6J小鼠，并将C57BL/6J小鼠分为5组，分别为Control组、DSS组、LP-116后生元组(50mg/kg)、麦角硫因组(2mg/kg)和LP-116后生元组合物组(50mg/kg)。
实验过程中，Control组小鼠给予自由摄入饮水和饮食，同时每日灌胃0.1mL生理盐水。其余各组的C57BL/6J小鼠，在第一周，给予自由摄入饮水和饮食，同时每日灌胃0.1mL生理盐水；在第二周和第三周，以灌胃的形式进行给药，其中，LP-116后生元组的给药剂量为50mg/kg，麦角硫因组的给药剂量为2mg/kg，LP-116后生元组合物组的给药剂量为50mg/kg；在第三周，使C57BL/6J小鼠摄入2％(w/v)的DSS。3周后实验结束后采用断颈法处死C57BL/6J小鼠，测定C57BL/6J小鼠体重损失和结肠长度，同时取结肠组织待用。
小鼠在适应性喂养的第一周内不进行任何处理，适应性喂养结束后在第二周和第三周以灌胃的形式进行给药，给药剂量按照LP-116后生元组(50mg/kg)、麦角硫因组(2mg/kg)和LP-116后生元组合物组(50mg/kg)。
将C57BL/6J小鼠距离肛门1cm处的末端结肠置于4wt％多聚甲醛溶液中固定24h后，取部分末端结肠进行苏木精-伊红染色，并于光学显微镜下观察结肠形态学的改变。
参考图5，C57BL/6J小鼠经DSS诱导结肠炎后，C57BL/6J小鼠体重下降，并出现便血的情况。
参考图6(A)，DSS组C57BL/6J小鼠的结肠长度最短，Control组C57BL/6J小鼠的结肠长度最长。参考图6(B)，DSS组C57BL/6J小鼠的结肠重量/结肠长度最低，Control组C57BL/6J小鼠的结肠重量/结肠长度最高。相对于正常C57BL/6J小鼠，通过DSS诱导获得的结肠炎C57BL/6J小鼠的结肠质量和结肠长度均出现差异，即结肠炎小鼠造模成功，能够用各组C57BL/6J小鼠的结肠重量/结肠长度作为实验性溃疡性结肠炎程度的重要评价标准。
参考图6，结合DSS组、LP-116后生元组、麦角硫因组、LP-116后生元组合物组可知，LP-116后生元以及麦角硫因均能够缓解DSS诱导结肠炎造成的结肠长度缩短的问题，能够抑制结肠重量/结肠长度比值降低的问题，且LP-116后生元和麦角硫因二者具有协同促进作用，改善因溃疡性结肠炎引起的结肠肿大程度。
参考图7，Control组C57BL/6J小鼠的结肠的隐窝结构规则，有完整的黏膜上皮，腺体排列整齐；DSS组C57BL/6J小鼠的结肠病理组织可见黏膜上皮出现损伤、脱落，隐窝结构发生改变、隐窝萎缩甚至消失，杯状细胞减少，且杯状细胞内的粘液消失。结合DSS组、LP-116后生元组、麦角硫因组、LP-116后生元组合物组可知，麦角硫因组、LP-116后生元组以及LP-116后生元组合物组C57BL/6J小鼠的结肠上皮细胞完整度均高于DSS组，然而，相对于LP-116后生元组以及麦角硫因组，LP-116后生元组合物组C57BL/6J小鼠的结肠上皮细胞的隐窝形态更接近Control组，隐窝数量更多、杯状细胞更多，且杯状细胞内的粘液恢复状态更佳，可见，LP-116后生元和麦角硫因二者具有协同促进作用，能够提高对结肠炎小鼠的炎症产生缓解效果。

Claims (9)

1. 一种具有治疗或预防肠道屏障受损功能的LP-116后生元组合物，其特征在于，所述LP-116后生元组合物包括热灭活副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）LP-116和麦角硫因；
所述副干酪乳杆菌LP-116的保藏号为CGMCC NO.26441。
2. 根据权利要求1所述的具有治疗或预防肠道屏障受损功能的LP-116后生元组合物，其特征在于，所述LP-116后生元组合物中热灭活副干酪乳杆菌的浓度为1012个/g，麦角硫因浓度为40 mg/g。
3.一种具有治疗或预防肠道屏障受损功能的LP-116后生元组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a培养保藏号为CGMCC NO.26441的副干酪乳杆菌LP-116，获得副干酪乳杆菌LP-116菌液；
b将步骤a中副干酪乳杆菌LP-116菌液离心，无菌蒸馏水洗涤菌体细胞两次后重悬，获得副干酪乳杆菌LP-116菌悬液；
c将步骤b中获得的副干酪乳杆菌LP-116菌悬液进行灭活处理，
d冷冻干燥步骤c获得的菌液，获得LP-11 6后生元；
e将步骤d获得的LP-116后生元与麦角硫因混合，获得LP-116后生元组合物。
4.根据权利要求3所述的具有治疗或预防肠道屏障受损功能的LP-116后生元组合物的制备方法，其特征在于，
步骤b中，离心的转速为8000 r/min，离心的温度为4℃，离心的时间为10 min；
步骤c中，灭活温度为100℃，灭活时间为30 min。
5.根据权利要求3所述的具有治疗或预防肠道屏障受损功能的LP-116后生元组合物的制备方法，其特征在于，步骤e中：LP-116后生元与麦角硫因的质量比为24:1。
6.如权利要求1所述的LP-116后生元组合物在制备用于治疗或预防肠道屏障受损的载体中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肠道屏障受损为肠病或腹泻。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述载体为饲料和/或药物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，
所述饲料的形式包括干饲料和/或湿饲料；
所述药物的形式包括片剂、胶囊、微胶囊、颗粒剂、粉剂、丸剂、栓剂和/或液剂。
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Title
Heat-Killed Lacticaseibacillus paracasei Repairs Lipopolysaccharide-Induced Intestinal Epithelial Barrier Damage via MLCK/MLC Pathway Activation;Zhixin Xie et al.;《Nutrients》;20230404;第15卷;1-19 *
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