CN102133238A

CN102133238A - 枯草芽孢杆菌在拮抗幽门螺杆菌中的应用

Info

Publication number: CN102133238A
Application number: CN201110073965XA
Authority: CN
Inventors: 魏华; 曾明; 喻刚; 许恒毅; 程波财; 徐锋
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Nanchang University
Priority date: 2011-03-25
Filing date: 2011-03-25
Publication date: 2011-07-27

Abstract

一种枯草芽孢杆菌在拮抗幽门螺杆菌中的应用，枯草芽孢杆菌在营养肉汤液体培养基中37℃、180rpm摇床培养9小时，可产生抑制幽门螺杆菌生长的物质，有效抑制幽门螺杆菌生长；18小时抑菌能力达到最大，经纯化获得抑菌蛋白，制成治疗胃肠道疾病的制剂。本发明的技术效果是：来源于微生态制剂的枯草芽孢杆菌除了具有维持肠道微生态平衡的作用外，其培养物还对幽门螺杆菌有较强的拮抗作用，和常规治疗幽门螺杆菌所采用的抗生素疗法相比，它的使用可以克服前者副作用大和治疗后易复发等缺点。

Description

枯草芽孢杆菌在拮抗幽门螺杆菌中的应用

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌的应用，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌在拮抗幽门螺杆菌中的应用。

背景技术

。1983年Marshall和Warren等首次成功分离得到幽门螺杆菌，许多研究都证实它是引起慢性胃炎和十二指肠溃疡的主要病因，是导致胃癌发生的潜在因素。

目前，普遍采用国际标准三联疗法（standard triple therapy）对幽门螺杆菌感染进行治疗。即将铋、甲硝唑与四环素或氨苄青霉素联用，幽门螺杆菌根除率为50-90％。该疗法副作用大，同时可能导致幽门螺杆菌耐药株的产生，从而进一步增加治疗难度。另外，幽门螺杆菌在抗生素和体内不利因素的诱导下可形成细胞壁缺陷的L型，这也是临床上幽门螺杆菌感染治愈后易复发的主要因素之一。近年来，人们在研究替代抗生素治疗幽门螺杆菌感染方面做了大量的工作，发现多种拮抗幽门螺杆菌生长的方法，尤其是通过益生菌来预防和治疗幽门螺杆菌所引起的感染，更是目前研究的热点。

益生菌通过黏附、竞争、排斥、占位及产生抑制物等机制，抑制胃肠道内的致病菌，保持原籍菌群的优势，从而促进人体和动物体的健康。目前，国外对拮抗幽门螺杆菌的益生菌的研究主要集中在乳酸菌方面，多种乳杆菌分泌的乳酸及多种蛋白混合物都具有拮抗幽门螺杆菌的作用。动物实验证明，乳酸菌活菌制剂能有效防止幽门螺杆菌感染，并显著减轻动物体内幽门螺杆菌感染引发的炎症，降低幽门螺杆菌在胃内的定植密度。

枯草芽孢杆菌是一类好氧性革兰氏阳性细菌, 其所需营养简单，可以产生多种抗菌物质，抑制多种致病菌的生长。抗菌物质中大部分是多肽，主要抑制革兰氏阳性菌；有些多肽还能抑制革兰氏阴性菌、霉菌和酵母。其中有一些高分子量蛋白类的抗菌物质和低分子量的抗菌肽已被应用于治疗人类、动物和植物的疾病，同时也可作为生物表面活性剂、食品防腐剂、饲料添加剂和分子生物学的研究工具。

由于芽孢杆菌其能产生耐热抗逆的芽孢,而这一功能对菌剂的生产、剂型加工及其在环境中的存活、定殖与繁殖都十分有利，因此国内出现了多种微生态制剂，如 “整肠生”、“促菌生”“白天鹅”等。目前国内外在开展枯草芽孢杆菌预防和治疗幽门螺杆菌感染方面还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种枯草芽孢杆菌在拮抗幽门螺杆菌中的应用，该枯草芽孢杆菌菌株具有较强的抑制幽门螺杆菌生长能力，使用安全、无残留、不产生抗药性。

本发明是这样来实现的，一种枯草芽孢杆菌在拮抗幽门螺杆菌中的应用，枯草芽孢杆菌在营养肉汤液体培养基中37℃、180 rpm摇床培养9小时，可产生抑制幽门螺杆菌生长的物质，有效抑制幽门螺杆菌生长；18小时抑菌能力达到最大，经纯化获得抑菌蛋白，制成治疗胃肠道疾病的制剂。

将枯草芽孢杆菌在营养肉汤液体培养基中37℃、180 rpm摇床培养12-16小时，过滤菌体并制成拮抗幽门螺杆菌的活菌口服制剂。

本发明应用如下：

1、枯草芽孢杆菌上清液的抑菌作用

采用打孔扩散法对33株益生菌（包括芽孢杆菌、肠球菌，乳杆菌和双歧杆菌）发酵上清液及菌体破碎液进行体外拮抗幽门螺杆菌实验（见表1）。发现一株枯草芽孢杆菌的上清液对幽门螺杆菌具有显著抑制作用。通过对三株不同来源的幽门螺杆菌菌株（菌株编号分别为：NCTC11637、SS1、SS2000）抑制效果的比较发现，枯草芽孢杆菌对NCTC11637具有最强的抑制作用，抑菌圈直径达到22±0.4 mm，对另两株则分别达到15±0.23 mm和18±0.24 mm。进一步研究发现，此枯草芽孢杆菌对对单核增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌也具有拮抗作用。

表1为益生菌细胞组分对幽门螺杆菌的抑制结果。

Figure 201110073965X100002DEST_PATH_IMAGE001

注：T为典型菌株

２、利用枯草芽孢杆菌培养物制备功能性成分的方法：

发明人通过酸分级沉淀初步获得抑菌粗蛋白，去除了部分杂蛋白。将该粗蛋白通过阴离子交换层析进一步纯化，收集各洗脱峰的液体进行抑菌活性鉴定，在非变性凝胶电泳的辅助下，纯化获得单一的抑制幽门螺杆菌的蛋白，最终制成干粉或通过压片等方式做成功能性成分产品。

３、制备活菌制剂的方法：

本发明所述枯草芽孢杆菌可经过摇瓶培养获得大量拮抗幽门螺杆菌的活菌体，即在培养至菌体对数期（12-16小时）时，在4000 rpm离心10 min，并用生理盐水洗涤3次后，获得高密度的菌体。取出菌体，添加到以脱脂奶粉和乳清粉等可食用成分配成的营养液中，制成活菌制剂，或添加固形物制成固体活菌制剂。

本发明的技术效果是：来源于微生态制剂的枯草芽孢杆菌除了具有维持肠道微生态平衡的作用外，其培养物还对幽门螺杆菌有较强的拮抗作用，和常规治疗幽门螺杆菌所采用的抗生素疗法相比，它的使用可以克服前者副作用大和治疗后易复发等缺点。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌CICC 23589上清液不同温度热处理后抑菌效果实验。

图2为枯草芽孢杆菌CICC 23589上清液不同pH条件下抑菌效果实验。

图3为枯草芽孢杆菌CICC 23589上清液经阴离子交换层析不连续洗脱图谱。

图4为枯草芽孢杆菌CICC 23589上清液经阴离子交换层析后各组分SDS-PAGE图谱。

具体实施方式

实施例1：

1．将33株实验菌株在37℃、厌氧或好氧条件下进行液体培养，至18-48小时，10000 rpm离心30 min，取上清过0.22 μm滤器除菌。

2．将上清灌入透析袋（截留分子量3500 Da）中，两端用夹子夹紧，在透析袋外表面四周覆盖聚乙二醇（PEG），约4小时后，上清液被浓缩约10 倍，收集最终浓缩液备用。

3．用打孔器在脑心浸液琼脂培养基琼脂平板上打孔4-6个（孔间间隔20 mm），每孔分别加入100 μL培养上清和细胞破碎液，置于37℃微需氧条件下培养48小时，测各孔抑菌圈直径以分析对幽门螺杆菌生长的抑制作用。

4．实验结果如表1所示：在33株待测菌株的不同细胞组分中，枯草芽胞杆菌CICC 23589的培养上清液抑制幽门螺杆菌表现为阳性，而其余32个菌株上清液表现为阴性。

实施例2：

1．按实施例1中的方法收集枯草芽孢杆菌CICC 23589的培养上清液备用；

2．将上清液分别置于45、55、65、75、85、95、105、115℃水浴下加热5 min；

3．用实施例1中的打孔扩散法，测定上述各温度加热后的上清液样品抑制幽门螺杆菌的效果。

4．实验结果如图1所示：横坐标表示热处理的温度（℃），纵坐标为抑菌直径圈（mm）。从图1中可以看出，95℃以下的热处理对上清液中抑制幽门螺杆菌的成分的活性基本上没有影响。当热处理温度高于95℃时，温度的升高，抑菌成分逐步失去活性。

实施例3：

2．配制PBS（phosphate-buffered saline）缓冲液（20 mM），调节pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0：配制Tris-HCl缓冲液（20 mM），调节pH至9.0、10.0，备用；

3．在透析袋（截留分子量3500 Da）中装入2 mL浓缩10倍的枯草芽孢杆菌CICC 23589上清液，两端用透析袋夹夹紧；

4．将样品分别放入各pH值缓冲液中透析过夜，每隔4 小时更换缓冲液，至48小时结束透析，分别收集各透析袋中的液体；

5．用打孔扩散法测定各收集样品的拮抗幽门螺杆菌活性，测量抑菌圈直径；

6．实验结果如图2所示：横坐标表示pH值，纵坐标为抑菌圈直径（mm）。从图2中可以看出上清液在pH值范围2.0-8.0之间其抑制幽门螺杆菌的活性保持稳定。

实施例4：

1．按实施例1中的方法收集枯草芽孢杆菌的发酵上清液备用；

2．取浓缩的枯草芽胞杆菌CICC 23589发酵上清液15 mL，装入截留分子量为50 kD的超滤管中，4℃，4000 rpm，30 min；

3．将下层液体转移至30 kD超滤管上层，同上步条件超滤；

4．取上层死腔中液体，用pH 5.8的PBS溶解至15 mL，再次超滤，下层液体再次转移至30 kD；

5．同上方法依次使用10 kD、5 kD的超滤管进行超滤；

6．利用实施例1中的打孔扩散法对超滤后的各组分进行抑制幽门螺杆菌的实验，同时进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，缩写为SDS-PAGE）分析，电泳显示抑菌蛋白分子量在47.5-83 kD之间。

实施例5：

1．将2.5 mL规格的阴离子交换柱（Q Sepharose）与AKTA纯化系统连接；并用5倍于柱体积的磷酸盐缓冲液（pH 6.0，20 mM）进行平衡，流速2 mL/min；

2．将2 mL分子量＞50 kD的超滤样品上样阴离子交换柱，上样流速为1 mL/min；用pH 6.0，含1.0 M氯化钠的20 mM磷酸盐缓冲液进行不连续梯度洗脱（流速为2 mL/min），用不同离心管收集各洗脱峰流出液；

3．用实施例1所述的打孔扩散法测定各峰收集液抑制幽门螺杆菌的活性，同时进行SDS-PAGE分析各洗脱峰的蛋白组成。

4．实验结果如图3、4所示。

图3：不连续梯度洗脱后各洗脱峰的分离情况。从图3中可以看出三个洗脱峰被很好的分开，通过打孔扩散法对对前4个组分进行抑菌实验，结果表明只有洗脱峰A具有抑制幽门螺杆菌的活性。

图4：横坐标为不连续梯度洗脱后后各洗脱峰编号[1号为流穿峰；2号为洗脱峰A；3号为洗脱峰B；4号为洗脱峰C；5号为Marker（NEB^#p7708）；6号为上清原液]。根据本实施例中第3步的实验结果，第2泳道为抑制幽门螺杆菌的活性组分，该组分中浓度相对较高的具有3个条带，其分子量为76.3 kD、63.2 kD、58.5 kD。通过多次重复实验，发现洗脱峰A均具有抑制幽门螺杆菌的活性。SDS-PAGE图谱显示各次的洗脱峰A在63.2 kD处具有唯一的共同条带，初步认定抑菌蛋白的分子量为63.2 kD。

实施例6 利用枯草芽孢杆菌培养物制备功能性成分：

1．按实施例1中的方法收集枯草芽孢杆菌的发酵上清液备用

2．用6 M盐酸将上清液的pH调至4，然后收集沉淀并溶解于Tris-HCl中，通过酸沉淀初步获得抑制幽门螺杆菌的粗蛋白，去除部分杂蛋白。

3．将粗蛋白通过阴离子交换层析进一步纯化，收集纯化的抑菌蛋白水溶液，放置于－70℃冷冻24小时。

4．冻干制成粉剂或片剂等功能性成分。

实施例7 制备活菌制剂：

1．将枯草芽孢杆菌接种于营养肉汤培养中，于37℃、180 rpm摇床培养12-16小时，使活菌数达到最大。

2．将培养液在4000 rpm离心10 min，取沉淀的菌泥，并用生理盐水洗涤3次后，收集菌体。

3．将枯草芽孢杆菌菌体添加到以脱脂奶粉和乳清粉等可食用蛋白粉配成的营养液中制成活菌制剂，或添加固形物制成固体活菌制剂。

Claims

1. 一种枯草芽孢杆菌在拮抗幽门螺杆菌中的应用，其特征是枯草芽孢杆菌在营养肉汤液体培养基中37℃、180 rpm摇床培养9小时，可产生抑制幽门螺杆菌生长的物质，有效抑制幽门螺杆菌生长；18小时抑菌能力达到最大，经纯化获得抑菌蛋白，制成治疗胃肠道疾病的制剂。

2.根据权利要求１所述的一种枯草芽孢杆菌在拮抗幽门螺杆菌中的应用，其特征是将枯草芽孢杆菌在营养肉汤液体培养基中37℃、180 rpm摇床培养12-16小时，过滤菌体并制成拮抗幽门螺杆菌的活菌口服制剂。