KR100464825B1 - 바실러스 스테아로서머필러스 ｄｌ-3 균주, 이를 포함하는 미생물제제 및 이의 생산방법 - Google Patents

바실러스 스테아로서머필러스 ｄｌ-3 균주, 이를 포함하는 미생물제제 및 이의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바실러스 스테아로서머필러스 DL-3 균주, 이를 포함하는 미생물제제 및 이의 생산방법에 관한 것으로, 토양에서 미생물을 분리하여 배양한 후 얻은 배양액을 원심분리하여 균체를 수득하고 상기에서 분리한 미생물의 형태 및 생리학적 특성을 확인한 후 동정하고 바실러스 스테아로서모필러스 DL-3로 명명한 다음 상기에서 수득한 균체를 사용하여 5종의 병원성 곰팡이에 대하여 길항력을 조사한 뒤 상기 바실러스 스테아로서모필러스 DL-3 균주를 액체 배양한 후 원심분리하여 얻은 균체에 생리식염수 또는 5 내지 10%(w/v) 농도로 탈지분유를 첨가하여 섞은 후 진공냉동건조하여 미생물제제를 제조함으로써 검은무늬병, 균핵병, 시들음병, 잿빛곰팡이병 및 흑지병 등의 병원성 곰팡이의 생물학적 방제가 가능하므로 유기화학 농약의 단점을 보완한 친환경적인 생물방제를 제공할 수 있어 농약제조산업상 매우 뛰어난 효과가 있다.

Description

바실러스 스테아로서머필러스 ＤＬ-3 균주, 이를 포함하는 미생물제제 및 이의 생산방법{Bacillus stearothermophilus DL-3 strain, a microbial compostion comprising the same and a method of producing the microbial composition}
본 발명은 바실러스 스테아로서머필러스 DL-3 균주, 이를 포함하는 미생물제제 및 이의 생산방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 토양으로부터 분리한 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) DL-3 균주, 이를 유효성분으로 포함하는 병원성 곰팡이 방제용 미생물제제 및 상기 미생물제제를 생산하는 방법에 관한 것이다.
알터나리아 알터나타 (Alternaria alternata)는 병원성 곰팡이로서 어린 작물에서 생육 말까지 어느 시기에나 작물에 침입하여 검은무늬병을 발병시킨다. 스크레로티니아 스크레로티룸 (Sclerotinia sclerotirum)은 곰팡이의 일종으로 배, 사과, 복숭아, 자두, 살구 및 감귤 등의 과수와 오이와 가지 등의 작물에도 침입하여 균핵병을 일으킨다. 푸자리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum)은 토마토, 무, 가지 등에 침입하여 시들음병을 일으켜며 뿌리, 줄기 및 잎에 발병하여 작물 전체를 고사시킨다. 보트리티스 시네리아 (Botrytis cinerea)에 의하여 과일의 꽃과 꽃잎에 발병하는 잿빛곰팡이병은 과일의 저장중에 주로 나타나며 처음에는 과육이 변색이 되고 심하면 과실전체가 부패하는 무서운 병이다. 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani)는 48종 263종의 식물에 침입하여 식물의 흑지병을 유발시키는 원인균이다.
상기와 같이 검은무늬병, 균핵병, 시들음병, 잿빛곰팡이병 및 흑지병은 작물 및 과수의 치명적인 병으로 각각의 병에 유효한 유기합성 농약을 사용하여야 하므로 많은 종류의 유기합성 농약을 사용하여 방제하고 있으나 완전한 방제 및 치유가 불가능하며 유기합성 농약의 일반적이 특징인 잔류성 및 비선택성 등과 같이 환경에 미치는 악영향 때문에 방제를 위하여 대량으로 사용하기도 어려운 실정이다.
이에 본 발명자들은 새로운 미생물제재를 개발하기 위하여 병원성 곰팡이에 대하여 항곰팡이성 활성을 가지는 미생물을 토양에서 선별하여 동정하고 그들의 항곰팡이 스펙트럼과 이들이 생산하는 항곰팡이성 활성물질의 특성을 조사하고 이 미생물을 이용하여 미생물제재을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 토양에서 미생물을 분리하여 배양한 후 얻은 배양액을 원심분리하여 균체를 수득하고 상기에서 분리한 미생물의 형태 및 생리학적 특성을 확인한 후 동정하고 바실러스 스테아로서모필러스 DL-3 균주로 명명한 다음 상기에서 수득한 균체를 사용하여 5종의 병원성 곰팡이에 대하여 길항력을 조사한 뒤 상기 바실러스 스테아로서모필러스 DL-3 균주를 액체 배양한 후 원심분리하여 얻은 균체에 생리식염수 또는 5 내지 10%(w/v) 농도로 탈지분유를 첨가하여 섞은 후 진공냉동건조하여 미생물제제를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 토양에서 분리됨을 특징으로 하는 수탁번호가 KCCM 10386인 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) DL-3 균주를 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) DL-3 균주를 유효성분으로 포함함을 특징으로 하는 미생물제제를 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) DL-3 균주를 액체배양한 후 원심분리하여 얻은 균체에 생리식염수 또는 5 내지 10%(w/v) 농도로 탈지분유를 첨가하여 섞은 후 진공냉동건조함으로써 미생물제제를 생산하는 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 토양에서 미생물을 분리하여 배양한 후 얻은 배양액을 원심분리하여 균체를 수득하고 상기에서 분리한 미생물의 형태 및 생리학적 특성을 확인한 후 동정하고 바실러스 스테아로서모필러스 DL-3로 명명한 다음 상기에서 수득한 균체를 사용하여 5종의 병원성 곰팡이에 대하여 길항력을 조사한 뒤 상기 바실러스 스테아로서모필러스 DL-3 균주를 액체 배양한 후 원심분리하여 얻은 균체에 생리식염수 또는 5 내지 10%(w/v) 농도로 탈지분유를 첨가하여 섞은 후 진공냉동건조하여 미생물제제를 제조함으로써 달성하였다.
이하 본 발명의 구성을 설명한다.
도 1은 검은무늬병의 원인균인 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata)의 생육을 저해시키는 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) DL-3 균주의 모습을 나타낸 것이다.
도 2는 균핵병의 원인균인 스크레로티니아 스크레로티룸(Sclerotinia sclerotirum)의 생육을 저해시키는 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) DL-3 균주의 모습을 나타낸 것이다.
도 3은 시들음병의 원인균인 푸자리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum)의 생육을 저해시키는 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) DL-3 균주의 모습을 나타낸 것이다.
도 4는 잿빛곰팡이병의 원인균인 보트리티스 시네리아 (Botrytis cinerea)의 생육을 저해시키는 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) DL-3 균주의 모습을 나타낸 것이다.
도 5는 흑지병의 원인균인 라이족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani)의 생육을 저해시키는 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) DL-3균주의 모습을 나타낸 것이다.
본 발명은 토양에서 미생물을 분리하여 배양한 후 얻은 배양액을 원심분리하여 균체를 수득하는 단계; 상기 단계에서 분리한 미생물의 형태 및 생리학적 특성을 확인한 후 동정하고 바실러스 스테아로서모필러스 DL-3로 명명하는 단계; 상기단계에서 수득한 균체를 사용하여 5종의 병원성 곰팡이에 대하여 길항력을 조사하는 단계; 및 상기 바실러스 스테아로서모필러스 DL-3 균주를 액체 배양한 후 원심분리하여 얻은 균체에 생리식염수 또는 5 내지 10%(w/v) 농도로 탈지분유를 첨가하여 섞은 후 진공냉동건조하여 미생물제제를 제조하는 단계로 구성된다.
본 발명에서 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) DL-3 균주는 경남 김해시 대동면 동아대학교 부속농장의 유기물이 풍부한 토양으로부터 분리한 후 한국종균협회에 2002년 6월 8일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM 10386를 부여받았다.
본 발명 바실러스 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) DL-3 균주는 일반 한천 배지를 사용하여 배양하면서 평판 도말법으로 분리하였다.
본 발명은 토양을 생리식염수에 적당히 희석한 후 일반배지에 접종하여 25 내지 35℃에서 150 내지 200rpm으로 55 내지 85시간 동안 배양한 다음 종균 배양액을 얻고 상기에서 얻은 종균 배양액을 전기 배지에 3 내지 5%(v/v)로 접종하고 25 내지 35℃에서 150 내지 200rpm으로 3 내지 7일 동안 배양한 후 원심분리하여 상등액을 제거함으로써 분리한 미생물, 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) DL-3 균주를 얻는다.
본 발명 미생물제제의 제조시 안정제로서 탈지분유를 첨가하며 탈지분유의 농도는 5 내지 10%(w/v)의 범위가 바람직하며 더욱 바람직하게는 10%(w/v)이다.
이하 본 발명을 하기 위한 실시예에 의해 상세히 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1 : 토양에서의 미생물 분리 및 배양
유기물이 풍부한 토양을 채취하고 망이 가는 체로 거른 후, 채취한 토양을 멸균된 생리식염수 (0.85% NaCl)에 적당히 희석한 후 영양 한천(Nutrient agar) 배지를 사용하여 30℃에 배양하면서 평판 도말법으로 미생물을 분리하였다. 분리한 미생물을 영양(Nutrient) 배지에 한 백금니 접종하고 25 내지 35℃에서 150 내지 200rpm으로 55 내지 85시간 동안 배양한 종균 배양액을 전기 배지에 3 내지 5%(v/v)로 접종하고, 25 내지 35℃에서 150 내지 200rpm으로 3 내지 7일 동안 배양하였다. 배양액 및 배양액을 5000 내지 9000 × g의 범위에서 10 내지 30분 동안 원심분리하여 상등액을 제거한 후 수득한 균체를 증류수로 세척하여 작물에 병을 일으키는 곰팡이들에 대한 길항작용 시험에 사용하였다.
실시예 2 : 미생물의 동정과 형태 및 생리학적 특성 조사
상기 실시예 1에서 분리한 미생물은 일차적으로 현미경 검정을 통하여 형태학적인 특징을 확인하였고 그램 스테인(gram stain), 글루코스 발효 테스트(glucose fermentation test), 카탈라아제 테스트(catalase test), 옥시다제 테스트(oxydase test) 및 카제인 가수분해 테스트(casein hydrolysis test) 등을 통하여 균주의 생리학적인 특성을 확인하였다. 분리한 균주의 형태 및 생리학적인 특성을 확인한 후, API 50CH/B 키트(kit) (BioMerieus, France)를 사용하여 동정한결과, 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus)임을 확인하였으며 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) DL-3로 명명하였다. 상기 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) DL-3 균주를 한국종균협회에 2002년 6월 8일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM 10386를 부여받았다. 바실러스 스테아로서모필러스 DL-3 균주의 탄소원 이용에 대한 결과는 표 1과 같다.
바실러스 스테아로서모필러스 DL-3 균주의 탄소원 이용도
탄소원 이용도 탄소원 이용도
글리세롤(Glycerol) + 살리신(Salicine) +
에리티톨(Erythitol) - 셀로비오즈(Cellobiose) -
D-아라비노스(D-Arabinose) - 말토즈(Maltose) +
L-아라비노스(L-Arabinose) + 락토즈(Lactose) -
리보스(Ribose) + 멜리비오즈(Melibiose) -
D-자일로스(D-Xylose) - 사카로즈(Saccharose) +
L-자일로스(L-Xylose) - 트레할로즈(Trehalose) +
아도니톨(Adonitol) - 이눌린(Inuline) -
β-메틸-자일로사이드(β-Methyl-xyloside) - 멜레지토즈(Melezitose) -
갈락토스(Galactose) + D-라피노즈(D-Raffinose) -
D-글루코스(D-Glucose) + 아미돈(Amidon) -
D-프럭토스(D-Fructose) + 글리코겐(Glycogen) -
D-만노스(D-Mannose) - 자일리톨(Xylitol) -
L-소보스(L-Sorbose) - β젠티오비오스(βGentiobiose) -
람노스(Rhamnose) - D-투란노즈(D-Turanose) -
둘시톨(Dulcitol) - D-릭소스(D-lyxose) -
이노시톨(Inositol) + D-타가토즈(D-Tagatose) -
만니톨(Mannitol) + D-푸코스(D-Fucose) -
소르비톨(Sorbitol) + L-푸코스(L-Fucose) -
α메틸-D-만노사이드(αMethyl-D-mannoside) - D-아라비톨(D-Arabitol) -
α메틸-D-글루코사이드(αMethyl-D-glucoside) + L-아라비톨(L-Arabitol) -
N-아세틸 글루코사민(N-Acetyl glucosamine) - 글루코네이트(Gluconate) -
아미그달린(Amygdaline) - 2 세토-글루코네이트(2 ceto-gluconate) -
아르부틴(Arbutine) - 5 세토-글루코네이트(5 ceto-gluconate) -
에스쿨린(Esculine) -
바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) DL-3 균주는 여러 가지 탄소원을 이용하는 성질 외에도 섬유소, 전분 및 단백질을 분해하는 능력이 있음을 확인하였다.
실시예 3 : 분리한 균체의 길항작용 조사
상기 실시예 1에서 얻은 상등액 및 균체를 사용하여 작물에 병을 일으키는 5종의 병원성 곰팡이에 대하여 가지는 길항력을 검정하기 위하여 대치배양을 하였다. 즉, 감자 덱스트로스 한천(Potato dextrose agar) 배지를 만들고 미리 배양된 병원성 곰팡이의 절편을 배지 중앙부에 위치시킨 다음 중앙부를 중심으로 일정한 거리를 두어 멸균된 직경 1cm의 페이퍼 디스크(paper disk)에 균체 배양액을 50 ㎕를 점적하고 25℃에서 6일간 배양하였다. 병원성 곰팡이의 생육 저지 정도를 확인하고 저지원의 크기를 측정하였다. 검은무늬병, 균핵병, 시들음병, 잿빛곰팡이병 및 흑지병의 원인균들에 대한 길항력을 상대적으로 표시한 저지원의 크기는 표 2과 같다.
토양에서 분리한 미생물의 검은무늬병, 균핵병, 시들음병, 잿빛곰팡이병 및 흑지병 원인균에 대한 생육저해
병명 원인균 저지원의 크기(mm)
배양액 균체
검은무늬병 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata) 7.8 ± 1.2 9.7 ± 2.4
균핵병 스크레로티니아 스크레로티룸(Sclerotinia sclerotirum) 4.8 ± 0.6 5.6 ± 1.5
시들음병 푸자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 5.6 ± 0.9 4.7 ± 0.2
잿빛곰팡이병 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea) 5.3 ± 1.2 6.2 ± 0.7
흑지병 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 2.8 ± 0.6 3.4 ± 0.4
실시예 4 : 미생물제재의 생산
바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) DL-3 균주를 액체 배양한 후, 원심 분리하여 균체를 분리하였다. 액체 배양은 탄소원과 질소원, 무기염류를 포함하는 배지에 접종하여, 25 내지 35℃에서 150 내지 200rpm으로 55 내지 85시간 동안 배양한 종균 배양액을 전기 배지에 3 내지 5%(v/v)로 접종하고, 25 내지 35℃에서 150 내지 200rpm으로 3 내지 7일 동안 실시하였다. 원심 분리는 5000 내지 9000 × g의 범위에서 10 내지 30분 동안 실시하였다. 분리한 균체에 생리식염수 또는 5% 내지 10% (w/v) 농도로 탈지분유를 섞은 후 진공냉동건조하여 미생물제제를 생산하였다. 진공냉동건조시에 첨가하는 안정제의 종류에 따른 생존율의 변화는 표 3과 같다. 표 3에서 알 수 있듯이 10%(w/v)농도의 탈지분유를 안정제로 첨가가여 냉동진공건조할 경우, 생존율은 약 99%이었다.
진공냉동건조시 안정제에 따른 생존율의 변화
동결건조 전 생균수 동결건조 후 생균수
동결건조 첨가물 생균수 생존율(%)
13.90 x 108 생리식염수 10.60 x 108 76.3
생리식염수 + 5% 탈지분유 12.00 x 108 86.3
생리식염수 + 10% 탈지분유 13.80 x 108 99.2
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명은 바실러스 스테아로서머필러스 DL-3 균주, 이를 포함하는 미생물제제 및 이의 생산방법은 검은무늬병, 균핵병, 시들음병, 잿빛곰팡이병 및 흑지병 등의 병원성 곰팡이의 생물학적 방제가 가능하므로 유기화학 농약의 단점을 보완한 친환경적인 생물방제를 제공할 수 있어 농약제조산업상 매우 뛰어난 효과가 있다.

Claims (5)

  1. 병원성 곰팡이에 대하여 길항성이 있는 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) DL-3 균주(KCCM 10386).
  2. 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) DL-3 균주(KCCM 10386)를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 병원성 곰팡이의 생물학적 방제용 미생물 제제.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 병원성 곰팡이는 검은무늬병, 균핵병, 시들음병, 잿빛곰팡이병, 흑지병 중 어느 하나임을 특징으로 하는 병원성 곰팡이의 생물학적 방제용 미생물 제제.
  4. 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) DL-3 균주(KCCM 10386)를 액체배양한 후 원심분리하여 얻은 균체를 진공냉동건조함을 특징으로 하는 병원성 곰팡이의 생물학적 방제용 미생물 제제의 생산방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 진공냉동건조시 안정제로 생리식염수 또는 5 내지 10%(w/v) 농도로 탈지분유를 첨가함을 특징으로 하는 병원성 곰팡이의 생물학적 방제용 미생물 제제의 생산방법.
KR10-2003-0004615A 2003-01-23 2003-01-23 바실러스 스테아로서머필러스 ｄｌ-3 균주, 이를 포함하는 미생물제제 및 이의 생산방법 KR100464825B1 (ko)

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