KR20070038855A - 바실러스 서브틸리스 kccm 10639 또는 kccm10640을 포함하는 식물병 방제용 조성물 및 이들을 이용한식물병 방제 방법 - Google Patents

바실러스 서브틸리스 kccm 10639 또는 kccm10640을 포함하는 식물병 방제용 조성물 및 이들을 이용한식물병 방제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신균주 바실러스 서브틸리스 KCCM 10639 또는 KCCM 10640을 포함하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 신균주 바실러스 서브틸리스 KCCM 10639, KCCM 10640 또는 이들의 순수배양물; 또는 이들의 순수배양물을 유효성분으로 함유하는 미생물제제 및 이를 이용한 식물병 방제 방법에 관한 것이다.
바실러스 서브틸리스, 식물병 방제

Description

바실러스 서브틸리스 KCCM 10639 또는 KCCM 10640을 포함하는 식물병 방제용 조성물 및 이들을 이용한 식물병 방제 방법{COMPOSITIONS FOR PREVENTING PLANT DISEASE COMPRISING BACILLUS SUBTILIS KCCM 10639 OR KCCM 10640 AND METHODS OF PREVENTING PLANT DISEASE BY USING THEM}
도 1은 바실러스 서브틸리스 KCCM 10639의 3,500배의 전자현미경 (A) 및 400배의 광학현미경 (B) 사진을 보인다. 내성포자 부분은 원으로 표시하였다.
도 2는 바실러스 서브틸리스 KCCM 10640의 전자현미경 사진이다. (A) 5,000배; (B) 10,000배
도 3에서는 바실러스 서브틸리스 KCCM 10639의 Rhizoctonia solani 에 대한 길항작용을 보여준다. KCCM 10639가 플레이트의 한가운데 직선형태로 접종되었고, 플레이트의 양끝에 Rhizoctonia solani가 자란 아가 플레이트를 놓아주고 2일 생장시킨 후 사진이다.
도 4는 바실러스 서브틸리스 KCCM 10639의 Pythium sp.에 대한 길항작용을 보여준다. 왼편이 대조구이고 오른편이 KCCM 10639가 한가운데 직선형태로 접종되었을 때, Pythium sp.의 성장을 억제하는 것을 보인다.
도 5는 바실러스 서브틸리스 KCCM 10640의 Rhizoctonia solani에 대한 항균활성을 보인다. (A) 바실러스 서브틸리스 KCCM10640이 접종된 것이고; (B) 대조구이다.
도 6에서는 바실러스 서브틸리스 KCCM 10640의 Pythium sp.에 대한 항균활성을 보인다. (A) 바실러스 서브틸리스 KCCM10640이 접종된 것이고; (B) 대조구이다.
도 7에서는 Rhizoctonia cerealis에 대한 길항작용을 보인다. (A) 바실러스 서브틸리스 KCCM 10639 (B) 바실러스 서브틸리스 KCCM 10640
도 8은 본 발명에 따른 미생물제제가 식물병원성이 없음을 보인다.
도 9는 미생물제제를 이용한 잔디에서 병발생억제 효과를 보인다.
도 10은 미생물제제를 병원균에 오염된 토양에 처리하였을 경우의 병발생억제 효과를 보인다.
최근 들어, 많은 연구자들은 식물 생장 및 인간의 건강에 유리하게 이용하기 위하여 토양 내 미생물상을 변화시키는 노력을 하였다. 박터라이제이션(Bacterization)이란 미생물 배양물을 작물 성장 또는 생육부위에 접종하는 것을 뜻하며 이러한 접종은 가끔 대단한 작물 수량 증대를 가져오기도 하지만, 실제로 그 접종된 미생물이 근권에서 어떠한 역할을 하는지에 대해서는 아직 분명하지 않다. 미생물은 종류에 따라 작물 생장기간 내에 근권에서 안정적으로 생존 생육함으로써 그 밀도를 유지시키는 종류가 있는 하면, 원래의 기존 근권 미생물에 의해 배척당함으로써 근권에 정착하지 못하는 것도 있다. 이 때 뿌리 주변에서 안정적으로 정착 및 증식하는 미생물을 '근권 미생물'이라 부른다.
미생물의 근권 정착이란 대단히 적극적인 과정으로서, 미생물이 종자표면 또는 토양 내에서 생존하면서 탄수화물과 아미노산이 풍부한 종자 분비물을 이용하여 증식하고, 뿌리 표면에서 부착하여 생장하는 뿌리를 따라 계속 이동 증식하는 전체적인 과정이다. 또한 이 근권 미생물은 관수에 의해서 수동적으로 뿌리 아랫부분까지 이동하기도 한다.
대표적인 근권미생물로서는 슈도모나스, 아조토박터, 바실러스 등이 있으며 근권 미생물 들은 그 증식속도가 빠르고, 운동성이 있으며, 뿌리 분비물을 선호하는 경향이 있는데, 식물에 유익한 영향을 주는 종류를 '식물 생장촉진 근권 미생물'이라 한다. 예전에는 식물 생장 촉진 근권 미생물의 유익 효과가 무, 감자, 사탕수수 등 뿌리 작물에 대해서만 인식되었으나 최근에는 귀리, 콩, 목화, 땅콩, 봉숭아, 벼 및 채소류 등 다양한 작물에서 그 긍정적 효과가 인정되고 있다.
미생물 접종처리에 의한 생장 촉진 효과와 병해방제효과는 동전의 양면으로 인식되어야 한다. 즉, 생장촉진효과를 가진 미생물이 병해억제효과를 가지기도 하며, 역시 병해 억제 기능 미생물이 식물 생장을 촉진한다는 사실이 많은 연구자들에 의하여 밝혀지고 있다. 일례로서 식물생장촉진 효과가 인정된 어떤 미생물(슈도모나스 세균)은 근권의 유해세균 및 곰팡이의 밀도를 저하시켜 병해를 줄여줌으로써 상대적으로 작물 생육을 촉진시킨다고 하는 연구결과가 있다.
즉 지금까지 그 작용 기작이 알려진 대부분의 식물생장촉진 근권 미생물은 유해 근권 미생물을 제어함으로써 간접적으로 작물 생육을 촉진하는 것으로 알려져 있다.
한편 근권 미생물이 식물 생장을 촉진시키는 물질(생리활성물질)을 생산함으로써, 식물 생장을 직접적으로 촉진시키는 경우도 있다. 즉, 이들 생리활성물질은 뿌리에 의한 양분 흡수를 촉진시킴으로써 뿌리털 발육증진, 뿌리 및 줄기 생장 촉진 등의 효과를 발휘한다고 알려져 있다. 결국 식물생장촉진 근권 미생물은, 병해방제에 의한 생육촉진 효과 외, 특수 생리활성 물질을 생산하여 작물 생리를 변화시킴으로써 병균 침입에 대한 식물체 자기 방어능력을 배가시켜 병해방지 및 생장촉진효과를 거두게 되는 것이다.
근권 미생물에 의한 생물학적 방제기작은 항균성, 경쟁, 용균, 특정양분고갈, 시안 생산 등에 의한다고 알려져 있다.
항균성의 경우, 연구실내에서 병원균에 대한 항균능(길항능)이 인정되는 근권 미생물이 작물재배현장에서도 같은 항균력이 반드시 발휘되는 것은 아니나 많은 경우 깊은 상관도를 나타낸다.
항균력은 주로 근권 미생물이 분비하는 항생물질과 시데로포(Siderophore)에 의한 것으로 알려져 있으나, 병해 생물방제의 주 효과는 주로 항생물질에 의한다. 예로서, 어떤 식물 생장 촉진 근권 미생물은 밀재배 토양에 투여 시 밀의 뿌리주변에 페나진이라고 하는 강력한 항생물질을 분비하여 병원균을 억제함으로써 병해 방지는 물론 수량증대 효과를 나타내고 있다.
경쟁이라 함은 근권 영양분과 뿌리의 병해 민감 부위에 대하여 근권 미생물과 병원균 서로간의 경쟁에 의하여 병원균을 무력화시킴으로써 병해 억제효과를 얻는 것을 말한다. 식물 생장 촉진 근권 미생물(슈도모나스 세균)은 다양한 영양성분을 빠른 속도로 섭취하여 병원균이 이용할 필수 영양 성분을 고갈시킴으로써 병원균이 뿌리의 특정 부위를 통해 침입하여 발병시키게 되는데 이 식물 생장 촉진 근권 미생물이 그 특정부위를 선점하여 정착함으로써 병원균이 뿌리 내 침입을 못하게 되어 병 발생을 예방할 수 있다.
용균이란 식물 생장촉진 근권 미생물이 생산하는 곰팡이 파괴 효소의 작용으로 병원성 곰팡이를 사멸시키는 것을 말한다. 즉 식물성장촉진 근권 미생물이 키티나제라고 하는 곰팡이 세포벽 용해 효소를 생산하여 병원곰팡이(피시움 등)의 세포를 파괴함으로써 병해방지 및 증수효과를 거둘 수 있다.
미량원소 중의 하나인 철 성분은 미생물 생장의 필수원소이나 토양 중에서 철은 주로 3가 철의 불용성 상태로 존재하므로 미생물에 직접 이용될 수 없다. 미생물은 이들 불용성 철을 흡수 이용하기 위하여 시데로포라고 하는 물질을 생산하여 시데로포-철이 결합된 킬레이트 화합물을 만듬으로써 철을 이용할 있는 것이다. 식물 생장촉진 근권 미생물을 다량의 또는 그 기능이 우수한 시데로포를 생산하여 빠른 속도로 철을 이용함으로써 근권의 유해미생물(병원균 포함) 생장에 필요한 철 성분을 고갈시켜 버리게 되며, 따라서 병원균은 생장 및 뿌리 내 침입을 할 수 없게 되는 것이다.
많은 근권 미생물은 시안화합물을 만들며 이것은 병원균 방제에 일조를 하고 있다. 즉 시안화합물은 근권의 병원균 균체에 치명적인 손상을 입힘으로써 그 생육을 저지할 수 있게 되는 것이다.
한국 특허 출원번호 1998-0012807, 2001-0063465 및 2003-0079546 에서는 바실러스 서브틸리스를 이용한 식물병 방제 방법이 개시되어 있다. 선충에 살충효과를 가지는 바실러스 균이 한국 특허 출원 2002-004324 및 2002-004325호로 출원되었고, 곤충에 살충효과를 가지는 바실러스에 대하여 한국 특허 출원 2002-0017167 및 2004-7007871 등으로 출원되었다. 또한 한국 출원 2003-0005335호에는 바실러스 렌티모브스를 이용한 미생물 농약 및 상기 미생물의 돌연변이 균주에 대하여 특허출원이 되었다.
본 발명은 식물병 방제를 위한 신균주 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCCM-10639 또는 KCCM 10640를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 잔디병의 예방에 효과적인 신균주 바실러스 서브틸리스 KCCM-10639 또는 KCCM 10640를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 신균주 바실러스 서브틸리스 KCCM-10639 및 KCCM 10640를의 순수배양물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 미생물제제 및 이를 이용한 식물병 방제 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 식물의 생장 촉진을 위한 신균주 바실러스 서브틸리스 KCCM-10639 및 KCCM 10640를 제공한다.
본 발명은 신균주 바실러스 서브틸리스 KCCM-10639 또는 KCCM 10640를의 순수배양물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 미생물제제를 제공한다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주는 균주 자체, 또는 이의 배양체, 이의 추출물 또는 이의 포자 단독으로 담체와 혼합하여 분말, 펠렛, 과립 또는 용액 등으로 제형화하여 식물병 방제용 미생물 제제로서 사용할 수 있으며, 상기 담체로는 물, 화이트 카르본, 카올린, 제오라이트 등을 사용할 수 있다.
제형화된 미생물 제제는 식물이 생장하고 있는 토양 또는 성장 중인 식물 표면에 처리함으로써 식물병에 의한 식물 성장의 억제 및 이로 인한 고사를 방제할 수 있다.
본 발명은 상기 미생물제제를 이용한 식물병 방제 방법을 제공한다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다
<실시예 1> 균주의 분리 동정 및 특징
신균주 바실러스 서브틸리스 KCCM-10639 또는 KCCM 10640는 전국 골프장 그린 및 페어웨이 표토층(10cm 내외)에서 선발되었고, 내성포자를 형성하며, 우수한 항균활성을 보이는 균주를 선발하였다. 또한 기존 화학농약에 대하여 내성을 보이는 균주를 선택하였다.
이중에서 우수한 효능을 가지는 미생물을 분리하였고, 이를 분리 동정한 결과 바실러스 서브틸리스 2종으로 동정되었으며, 이들 각각은 2004년 12월 28일 한국미생물보존센터에 기탁하였고, 각기 KCCM-10639, KCCM 10640의 기탁번호를 부여받았다.
신균주 KCCM-10639 및 KCCM 10640 바실러스 서브틸리스 균주들의 공통 특징
① 골프장 근권 및 엽권에 서식하고 있는 토착 미생물 균주이다.
② 제조의 용이성 및 제품의 생물학적 안정성을 위한 내성포자 형성균주이다.
③ 기존 화학농약과 교호적 사용을 위하여, 잔류농약에 사멸되지 않는다.
④ 생물학적 방제를 위하여 우수한 항균활성을 보인다.
⑤ 다양한 병발생 환경조건에서 우수한 증식활성을 가진다.
⑥ 잔디예취물과 토양영양분을 먹이로 생존 및 번식이 우수하다.
⑦ 토양에 대한 우수한 정착능을 가지고 있다.
1. 신균주 KCCM-10639 및 KCCM-10640의 배양적인 특징
PDA(감자 추출액 300g, 포도당 20g, 아가 15g, 증류수 1l)에서 배양이 되고, 생장 적정 pH 범위는 pH 5-9이며, 최적 pH는 pH 7 내외이다. 생장적정온도범위는 15-30℃이며, 최적 생장 온도는 25℃내외이다. 산소요구도는 강호기성이고, 배양 48시간이내에 내성포자 생성이 유도되어진다.
2. 형태적 특징
형태는 간상(Rod shape)이고, 내성포자를 생성하며, 전분가수분해능력이 있으며, 운동성이 있다. 도 1은 신균주 바실러스 서브틸리스 KCCM 10639의 전자현미경(A) 및 광학현미경 사진(B) 이다. 내성포자에 해당하는 부분을 원으로 나타내었다. 도 2는 신균주 바실러스 서브틸리스 KCCM 10640의 전자현미경 사진 (A. 5,000배; B. 10,000배)이다.
3. 분류
16s rDNA 염기서열분석결과 NCBI에 있는 Bacillus subtilis rDNA 서열과 99.9% 상동성을 보여서 모두 Bacillus subtilis로 동정되었다.
<실시예 2> 식물병 방제 효과 확인
골프장 그린 및 페어웨이 잔디 병해인 "라이족토니아 병해(라지패취, 브라운패취, 춘고병)" "피시움 병해(피시윰블라이트)"에 대한 병억제 효과를 실험하였다.
라이족토니아 병해 방제를 시험하기 위하여, Rhizoctonia solani를 사용하였드며, 피시움 병해에 대한 방제를 시험하기 위하여 Pythium sp.를 시험균주로 선택하였다. 배양한 길항균을 화염 멸균한 루프에 살짝 묻혀 테스트용 영양 브로쓰 아가(Nutrient Broth Agar)배지상 중앙부분에 2-3번 살짝 긁어준다. 대상병원균인 Rhizoctonia spp., 및 Pythium sp.는 지름 8mm로 떼어내어 NB배지 양쪽에 올려 놓는다. 25℃에서 2-3일 배양한 후 각 대상 병원균에 대한 길항력을 관찰하였다.
도 3에서는 바실러스 서브틸리스 KCCM 10639의 Rhizoctonia solani 에 대한 길항작용을 보여준다. KCCM 10639가 플레이트의 한가운데 직선형태로 접종되었고, 플레이트의 양끝에 Rhizoctonia solani가 자란 아가 플레이트를 놓아주고 2일 생장시킨 후 사진이다.
도 4에서는 바실러스 서브틸리스 KCCM 10639의 Pythium sp.에 대한 길항작용을 보여준다. 왼편이 대조구이고 오른편이 KCCM 10639가 한가운데 직선형태로 접종되었을 때, Pythium sp.의 성장을 억제하는 것을 보인다.
도 5에서는 바실러스 서브틸리스 KCCM 10640의 Rhizoctonia solani에 대한 항균활성을 보인다. (A) 바실러스 서브틸리스 KCCM 10640이 접종된 것이고; (B) 대조구이다.
도 6에서는 바실러스 서브틸리스 KCCM 10640의 Pythium sp.에 대한 항균활성에 대한 항균활성을 보인다. (A) 바실러스 서브틸리스 KCCM10640이 접종된 것이고; (B) 대조구이다.
도 7에서는 Rhizoctonia cerealis에 대한 길항작용을 보인다. (A) 바실러스 서브틸리스 KCCM 10639 (B) 바실러스 서브틸리스 KCCM 10640
<실시예 3> 종래 살균제(화학농약)에 대한 내성 확인
(1) 실험방법
① N.A(Nutrient broth agar) 배지를 2~3일 전에 만들어 놓는다.
② 멸균수(증류수)를 만든다. 그리고 농약을 실제 사용량(권장사용량)만큼의 비율로 멸균수(증류수)에 녹인다.
③ ②의 100㎕를 여과지에 흡수 시키고 수분을 말린다. 그리고 길항균을 100㎕ 스미어링(smearing)한 배지에 위의 여과지를 올려 놓는다. 그리고 밀봉하고 25℃에서 2일간 배양한다. 대조구는 증류수로 한다.
④ 실험결과를 관찰한다.
⑤ 균이 자라는 것을 보고 종이 디스크 주변에 클리어 존(생장저지대) 생성유무를 확인한다.
⑥ 클리어 존이 생기지 않았다면 길항균주는 그 농약에 내성이 있는 것이고, 생겼다면 농약에 영향을 받는 것이다. 이 때에는 클리어 존의 직경을 측정하여 그 정도를 기록한다.
(2) 결과
신균주 KCCM 10639 및 10640은 종래 사용되어진 살균제에 대하여 내성을 보인다. 종래 사용되어진 살균제의 종류 및 이에 대한 내성정도를 표 1에 나타내었다.
[표 1] 종래 살균제 및 이에 대한 내성도
계통 품목명 상표명 내성정도 사용농도(/100ml)
항생제 포리옥신디 수화제 영일-바이오 0.2g
피리미딘계 훼나리유제 훼나리유제 33.5㎕
트리아졸계 터부코나졸 수화제 실바코 0.05g
트리아졸계 터부코나졸 유제 호리쿠어 중강 50㎕
카바메이트계 지오판 수화제 톱신엠좁네이트-엠 0.065g
이속사졸계 아찌가렌 액제 에이원입고단 200㎕
유기인계 토로스 수화제 리조렉스 0.2g
유기인계 포세칠알 수화제 알리에테 0.2g
유기유황계 프로피 수화제 안트라콜 중강 0.2g
유기염소계 사프롤 유제 - 중강 100㎕
요소계 펜시쿠론 수화제 문고박사 0.1g
아실알라닌계 메타실 수화제 리도밀 중강 0.005g
아니라이드계 프로토닐 유제 몬카트 100㎕
스트로빌루린계 아족시스트로빈 수화제 헤리티지 0.1g
다키복시미드계 이프로 수화제 로브랄 0.1g
카바메이트계+디치오카바메이트계 지오람수화제 호마이금나락 0.1g
아실알라닌계+유기유황계 옥사프로 수화제 산도판-에이 중강 0.2g
아실알라닌계+디치오카바메이트계 메타실엠 수화제 리도밀-엠지 0.165g
<실시예 3> 식물병원성 검증
잔디에 병원균과 본 발명에 따른 미생물을 동시 접종하여 잔디에 병을 유발하는지 여부를 확인하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 잔디에 병원균과 본 발명에 따른 미생물을 동시 접종한 결과 병원균의 생장은 억제하였지만 잔디에는 감염을 유발하지 않아 본 발명에 따른 미생물들은 잔디에 비병원성이며 우수한 항균활성을 가지고 있음을 확인하였다.
<실시예 4> 미생물제제 제조 방법
(1) 액제의 제조
① 영양 브로쓰 파우더(Nutrient Broth powder) 8g와 실리콘오일 0.5~1.0㎖를 물 1L와 고루 섞는다.
② 121℃에서 15분간 고온고압멸균(Autoclaving) 후 길항균 0.1~0.2㎖를 접종한다.
③ 25℃에서 4일간 배양한 후 배양액을 수거한다.
(2)입제의 제조
① 제오라이트 5㎏에 위에서 상기 수거한 액제 1L를 고루 섞는다.
② 입제 제조기에서 40℃로 1일간 건조한 후 건조된 입제를 수거한다.
<실시예 5> 본 발명에 따른 미생물제제를 이용한 잔디에서 병발생억제 효과 확인
실시예 4에 의해 제조되어진 미생물제제를 광도, 온도, 습도 등 환경요인이 실제현장과 같이 제어되는 인공식물생장상 자동제어시스템에서 식물병 방제효과를 확인하였다. Pythium sp.Rhizoctonia solani를 접종하고, 실시예 4에 따라 제조되어진 미생물제제를 처리하였을 때 잔디에서 병 발생율이 87~95% 억제되었다(도 9 참조). 또한 Pythium sp. 에 오염된 토양에 실시예 4에 따라 제조되어진 미생물제제를 혼합처리시 병발생율이 100% 억제되었다(도 10 참조).
본 발명에 따른 신규한 바실러스 서브틸리스 KCCM 10639 및 KCCM 10640균은 식물의 병발생을 우수하게 억제하였다. 특히 상기 미생물들을 내성포자를 형성하여 미생물제제의 제조의 용이성 및 제품의 생물학적 안정성이 있다. 또한 신규한 바실러스 서브틸리스 KCCM 10639 및 KCCM 10640균은 현재 많이 사용하고 있는 화학농약에 내성을 나타내기 때문에 화학농약과 교호적 혹은 동시에 사용가능하다. 또한 다양한 병발생 환경조건에서 우수한 증식활성을 가지고, 토양에 대한 우수한 정착능을 가지고 있다. 따라서 본 발명에 따른 미생물제제는 식물병 특히 잔디병의 방제에 매우 우수한 능력을 가지고 있다.

Claims (4)

  1. 식물병 방제를 위한 신균주 바실러스 서브틸리스 KCCM 10639 또는 KCCM 10640.
  2. 제 1 항의 바실러스 서브틸리스 KCCM 10639, KCCM 10640 또는 이들의 혼합물의 순수배양물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제를 위한 미생물제제.
  3. 제 1 항의 바실러스 서브틸리스 KCCM 10639, KCCM 10640 또는 이들의 혼합물의 유효량을 식물 또는 토양에 살포함으로써 식물병을 방제하는 방법.
  4. 제 1 항의 바실러스 서브틸리스 KCCM 10639, KCCM 10640 또는 이들의 혼합물의 유효량과 첨가제를 혼합하는 것을 특징으로 하는 미생물제제 제조방법.
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