KR100866611B1 - 온도 변화에도 안정한 바실러스 서브틸러스 ａｈ18의제제화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바실러스 서브틸러스 AH18 균주(기탁번호: KACC 91205P)를 선별하여 승온에서 배양하는 단계; 형성된 포자에 열 스트레스(heat stress)를 가하여 열 유도 내생포자를 생성시키는 단계; 포자 혼합물로부터 잔류 성장 세포를 제거하여, 포자만 존재하는 배양물을 생성시키는 단계; 및 살균 및 건조한 무기 담체에 상기 바실러스 서브틸러스 AH18 배양물을 가하여 내생포자-담체 혼합물 제형을 제조하는 단계로 이루어 진 바실러스 미생물 제제의 제조 방법에 관한 것으로, 제형화시에 열 저항성 포자를 생성시키고, 최종 단계에서 무기 미세다공성 담체를 혼입시킴으로써, 바실러스 제품을 비용 효율적이며 고온 및 저온 변이에 대항하여 휴면 상태를 유지하여, 특별한 처리 공정 없이도 미생물 제제를 유통될 수 있도록 하는데 효과적이다.

미생물 제제, 바실러스 서브틸러스, 내생포자

Description

온도 변화에도 안정한 바실러스 서브틸러스 ＡＨ18의 제제화 방법{A Method for formulating stable microbial agent of Bacillus subtilis AH18 against temperature fluctuation}

도 1은 80℃에서 성장 세포의 생존율을 나타낸 그래프이다.

도 2는 상이한 조건하에서 생산된 바실러스 서브틸러스 AH18(기탁번호: KACC 91205P) 내생포자의 열 안정성을 나타낸 그래프이다.

도 3은 바실러스 서브틸러스 AH18 내생포자-담체 제형의 열 안정성을 나타낸 그래프이다.

도 4는 상온의 온도변화에 대항하여 무기담체가 바실러스 내성포자의 안정성 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 온도변화에도 안정성을 보이는 바실러스 미생물 제제의 제형화 방법에 관한 것으로 보다 구체적으로는, 미생물 제제의 제형화시에 열 저항성 포자를 생성시키고, 최종 단계에서 무기 미세다공성 담체를 혼입시킴으로써, 바실러스 제품을 비용 효율적이며 고온 및 저온 변이에 대항하여 휴면 상태를 유지하도록 하는 미생물 제제의 제조 방법에 관한 것이다.

농업에 있어서, 농작물의 질병을 억제하기 위한 환경친화적 방식으로 종래 화학 농약을 대체하는데 효과적인 미생물 제제(microbial agent)가 탐구되고 있다.

미생물제제란 살아있는 미생물의 기능을 직접적으로 이용하는 것으로, 토양 등에 시용하는 경우 표시된 특정 함유 유용 미생물의 활성에 의해 용도에 따른 효과를 가지며 최종적으로 식물재배에 도움이 되는 효과를 나타내는 제제라고 할 수 있다.

미생물제제는 살아있는 미생물과 경우에 따라서는 접종균을 흡착한 담체(carrier), 접종균 활성화를 위한 유기영양원, 그 외의 보조제로 구성되어 있지만, 효과를 가지는 주된 성분은 제제 원료에 표시된 미생물 즉 원료에 들어있는 미생물의 기능에 의한다는 것이다.

미생물제제란 완성품인 일반 제품과는 달리 소비되는 순간까지 생명력이 유지되어 살아있는 기능을 발휘하여야 하는 진행성 제품이므로, 생산과 소비등 모든 면에 새로운 각도로 접근하여야 한다. 즉 생산자는 생산으로써 끝나는 것이 아니라 소비에 이르기 까지 살아있는 기능을 유지하게 하여야 하며, 소비자는 생산에서부터 파생될 수 있는 문제점을 사전에 인지하여 생명력이 있는 제품을 공급받을 수 있게 항상 주지하고 있어야 한다. 또한 생산자와 소비자는 미생물제제를 이용한다 는 단순한 입장에서 벗어나, 자연환경을 구성하는 일원으로서 사용 후에 발생될 수 있는 생태계 변이에 대한 적극적인 이해와 관심을 가져야 한다.

세균은 분열에 의해 증식하다가 생육조건이 불량하게 되면 휴면상태에 들거나 사멸하는 것이 대부분이지만 Bacillus속등과 같은 세균은 포자를 형성하여 스트레스에 저항하며 장기간 생존할 수 있다. 사상균이나 방선균의 대부분은 균사상태로 영양생장을 하다가 포자등을 형성하여 다음 세대를 대비한다. 이와 같이 미생물은 각자가 가지고 있는 생장 및 형질보존방법에 따라 자연생태계에 적응하면서 존속하지만 미생물은 서식환경에 의해 큰 영향을 받는다.

토양은 완충능이 크고, 물리화학적인 특성이 미소부위별로 다르기 때문에 어느정도의 악조건에서도 미생물의 생존율이 높지만 인위적으로 만들어진 매체에서는 일반적으로 낮다. 이러한 이유 때문에 미생물제제에는 Bacillus속, 효모(yeast), Trichoderma속, Mucor속등 포자와 같은 내성체를 형성하여 생존성이 비교적 강한 균이 이용되지만, 미생물제제내에서의 생존율 즉 재현율은 기간이 경과함과 더불어 저하되는게 일반적인 현상이다. 이러한 감소율을 낮추기 위해 여러 종류의 물질이 첨가되지만 일정기간이 지나면 미생물수가 효과 발현에 필요한 생존율 이하로 되거나 사멸된다. 이렇게 된 제품은 미생물제제로서는 아무런 의미가 없고 단지 유 무기물에 지나지 않게 된다.

몇몇 연구 그룹에 의해 주요 식물 병원균을 억제할 수 있는 다양한 균주가 동정되고 특성화된 바 있으나, 이들 균주를 상업적으로 제형화시킨 예는 거의 없는 실정이다. 이러한 상업적 제형화가 드문 이유는 미생물 제제의 유익한 특성을 전 달하고, 유통 과정에서 손쉬운 취급 절차를 제공하는데 있어 비용-효율적인 제형화 방법이 결여되어 있기 때문이다.

미생물 제제를 제형화한 제품은 하절기에 운송 및 저장되는 동안 종종 50℃ 이상의 온도에 놓이게 되고, 또한 전체적인 유통 기간 동안 다양한 온도에 노출되기 때문에, 미생물이 온도 변이에 견디어 장기간 생존가능하도록 하는 제형화 전략이 주요 고려 사항 중 하나가 되고 있다.

또한, 미생물 제제의 제형화는 제품이 박테리아의 성장을 촉진시키는 온도 범위 내에 있을 때 미생물의 활동을 억제하여야 하는데, 그렇지 않으면, 과-증식으로 개봉 시 또는 그 전에 제품의 폭발을 야기시킬 수 있다. 따라서, 제형화의 목적은 균주를 “휴면 상태(dormancy)”에 있게 하는 것이며, 이것이 미생물 제품의 최종 품질을 결정하게 된다.

이러한 이유로 인하여, 그램 양성 균주인 바실러스가 그램 음성에 바람직하고, 고온에서 균주 안정성을 제공한다고 여겨지는 내생포자(endospore)를 이용하는 미생물 제제로서 주로 제형화되고 있다. 바실러스 메가테리움(B. megaterium)과 클로스트리디움 퍼프린겐스(Clostridium perfringens)를 이용한 포자형성(sporulation)에 대한 연구들은 열 스트레스를 가함으로써 후속 형성되는 포자(spore)의 열 저항성을 증가시킬 수 있다는 사실을 보여주고 있다.

마찬가지로, 온화한 열 스트레스에 사전-노출된 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 세포 또한 보다 열 안정성인 포자를 생성시킨다고 알려져있다. 그러나, 시장에서 유통되는 바실러스 제품을 샘플링하여 제품 라벨상에 지시된 박테리아 농 도를 조사하면, 많은 제품이 그들이 주장하는 박테리아 수를 충족시키지 않는데, 이는 생산 단계에서 안정한 포자가 적절하게 생성되지 않았거나, 제형화 과정이 “포자 휴면상태(spore dormancy)"를 유지시킬 수 없다는 사실을 제시하는 것이다.

다양한 미생물 및 생존물(survival)의 불활성 상태는 생장 배지, 수분 함량 및 담체의 불활성 성분에 의존한다는 점이 교시된 바 있다. 그러나, 내생포자 형성 박테리아 종에 대하여, 수분 함량은 휴면 상태에는 거의 양향을 미치지 않는다고 알려져 있다.

반면에, 환경의 온도 변이는 상기에 언급한 바와 같은 바실러스 제품의 제형화에 있어 내생포자의 안전성을 결정하는 현저한 환경적 인자일 수 있고, 최종 제형에 있어 포자 품질 및 상이한 무기 담체가 고온 및 저온 하에 놓인 내생포자의 휴면상태에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 알아보는 것이 중요한 과제가 되고 있다. 또한, 내생포자 및 박테리아 균주의 생존물이 생장 조건 및 제형화 동안 혼합된 성분들과 밀접한 관련이 있다면, 제형화 비용은 상업 시장을 살리기 위해 낮아야 한다.

미생물 제제의 개발은 미생물의 선택, 대량 생산을 위한 최적 조건의 결정 및 배합으로 이루어진다. 예상된 미생물 제제의 효과를 나타내기 위하여는 유익한 유기체가 유통 과정 동안 다양한 환경적 조건을 통해 생존하여 살아있는 채로 소비자에게 공급되어야 한다. 따라서, 균주 안정성을 제공하기 위한 제형화 방법은 최종 제품의 품질 및 상업적 성공을 결정하는 단계인 것이다.

따라서, 본 발명은 미생물 제제를 제형화함에 있어 저장 및 유통 환경에서의 온도 변화를 견뎌낼 수 있도록 하는 미생물 제제의 제형화 방법을 수립하는데 그 목적이 있다.

이러한 본 발명의 목적은 바실러스 서브틸러스 AH18의 열-안정성 내생포자를 생산하고, 무기 담체를 이용하여 환경의 고온 및 저온 변이에서도 포자 안정성을 유지함으로써 안정한 바실러스 서브틸러스 AH18 미생물 제제를 제형화하는 방법에 의해 달성되었다.

본 발명은 바실러스 서브틸러스 AH18(기탁번호: KACC 91205P) 균주를 선별하여 승온에서 배양하는 단계; 형성된 포자에 열 스트레스(heat stress)를 가하여 열 유도 내생포자를 생성시키는 단계; 포자 혼합물로부터 잔류 성장 세포를 제거하여, 포자만 존재하는 배양물을 생성시키는 단계; 및 살균 및 건조한 무기 담체에 상기 바실러스 서브틸러스 AH18 배양물을 가하여 내생포자-담체 혼합물 제형을 제조하는 단계로 이루어 진 바실러스 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에서 바실러스 서브틸러스 AH18 배양물과 혼합되는 무기 담체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 미생물 제제를 제공한다.

이하, 바람직한 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하지만, 본 발명 이러한 실시예로 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

균주 선별 및 배양

식물 생장 촉진 특성에 따라 바실러스 서브틸러스 AH18을 미리 선별하고, 37℃에서 루리아-버타니(Luria-Bertani, LB) 배지를 이용하여 배양하였다. 이 균주는 LB 배지에서 15-55℃의 광범위한 생장 온도 범위를 가졌고, 최적 생장 온도는 37℃였다. 고형 배지는 1.5% 한천를 사용하여 제조한 LB 또는 0.1×LB 였다.
상기 바실러스 서브틸러스 AH18(Bacillus subtilis AH18) 균주는 농업생명공학연구원에 2005년 11월 25일 기탁하고 미생물 기탁번호 KACC 91205P를 부여받았다.

오버나잇 종균 배양물(overnight starter culture) 0.5mL를 LB 배지 50mL에 주입하고 회전 진탕기에서 37℃, 200rpm으로 배양하였다. 배양물이 후기 지수증식기(10⁸ CFU/mL)에 도달할 때까지 4 시간 동안 배양된 세포를 생장시켰다.

배양물을 생장 온도에서 2 시간 동안 더 배양하여 영양고갈 (food depleted)에 의한 포자를 형성 하였다. 열 안정성을 갖는 포자를 생성하기 위해서는 세포를 후기 지수증식기까지 4 시간 동안 42℃에서 생장시키고, 57℃의 치사 온도에서 2 시간 동안 열 스트레스(heat stress)를 가하였다.

90℃에서 포자의 열 안정성을 분석하기 전에 포자 혼합물을 80℃에서 10 분 동안 배양하고, 잔류 영양형 세포를 제거하여, 포자만 존재하는 배양물을 생성시켰다.

내생포자의 열 안정성 분석

모바헤디 앤드 웨이티스(Movahedi and Waites) 방법과 유사한 과정을 거쳐 포자의 열 저항성을 분석하였는데 다음과 같이 방법론을 변경하였다.

포자만의 배양물을 90℃ 수조에서 배양하고, 시료를 60 분 동안 20 분 간격으로 수집하였다. 생존 세포를 37℃에서 16시간 동안 배양한 0.1×LB 플레이트상에 희석 도말(dilution plating)하여 계수하였다. logNo/N 대 시간을 플롯팅하여 생존 곡선을 생성시켰다(여기서, No는 초기 세포 숫자를 나타내고, N은 주어진 시점에서의 생존 세포 수를 나타낸다). 시그마플롯(SigmaPlot ver. 8.02) 소프트웨어를 사용하였다. 에러 바(error nar)를 P≤0.05에서 계산하였다.

담체의 MIC ( minimum inhibitory concentration , 최소 저해 농도) 결정

무기 담체는 한국요업기술원(Korea Institute of Ceramic Engineering and Technology; KICET; Seoul, Korea)에서 제조한 합성 제올라이트 또는 다양한 제조업자들이 자연 채광하여 가공한 제올라이트였다. 합성 담체는 KICET에서 제공받았으며, 천연 담체는 지정된 공급원으로부터 상업적으로 구입하였다.

담체를 살균하고, 사용 전에 80℃에서 2 일 동안 건조하였다. 지수 성장시킨 바실러스 서브틸러스 AH18 세포를 0.04%-10% 무기 담체에 타서 LB중의 최종 농도가 10⁴CFU/mL가 되게 하였다. 24-웰 마이크로-타이터 디쉬를 사용하여 200 rpm으 로 균일하게 진탕시키면서 37℃에서 20 시간 동안 배양하였다.

희석 도말을 수행하여 각 웰에서의 생존 세포 수를 측정하고, 담체 농도가 10 미만의 생존 수를 허용하는 농도를 MIC (minimum inhibitory concentration; 최소 저해 농도) 라 정의하였다.

실온에서 내생포자- 담체 배합의 안정성 분석

10%의 최고 농도에서 생장 억제를 나타내지 않는 담체를 선택하였다. 이들은 최종적으로 합성 제올라이트 NaY(1), 합성 제올라이트 NaA(4), 천연 제올라이트(7), 카올린 클레이 미네랄(12), 펄라이트(14,15)였다(각 숫자들은 표 1에 기재한 것에 상응한다).

열 유도 포자 제조물 1 mL를 무기 담체 10 g과 혼합하여 최종 수분 농도가 10%(v/w)가 되도록 하여 내생포자-담체 혼합물을 제조하였다. 수분에도 불구하고, 배합 제조물은 여전히 원 담체의 박편형(flaky) 외양을 유지하였고, 응집 또는 뭉침(caking)의 징후를 나타내지 않았는데, 이는 담체의 다공성 특성에 기인한 다고 보여진다.

각 내생포자-담체 제조물 1g을 열-차폐성 플라스틱 진공 주머니 (heat sealable vacuum bags) 에 밀봉하여 탈수를 방지하였으나, 진공상태로 만들지는 않았다. 각 제형에 대해 1g 짜리 시료 총 10개 주머니를 제조하였다. 제제화된 것들은 온도 변화가 15 내지 25℃의 범위에 있었던 10월부터 다음해 5월까지 실험실에서 상온에서 보관하였다. 각각의 1g 제조물의 생존 세포 수를 37℃에서 0.1×LB 상에서 희석 도말하여 총 6개월 동안 매월 측정하였다. 각 제형에 대하여 총 4회의 독립적 실험을 수행하였다. 6개월 동안 평균 생존 세포 수의 변화를 나타내는 곡선을 시그마플롯 ver. 8.0를 사용하여 만들었다. 에러 바는 명확성을 위해 생략하였다.

무기 담체의 물리적 성질 결정

무기 담체의 다공성 특성을 나타내는 물리적 성질을 얻어 표 1에 열거하였다.

<표 1>

무기 담체의 다공 특성

¹ 전형적인 화학 조성: 1, Na₁₂Si₁₂Al₁₂O_{48 ?}216H₂O; 4, Na_xSi_{12 - x}Al_xO_{48 ?}nH₂O (x=3-4, n=220-260). 펠라이트의 조성은 각각 펠라이트 시료 I 및 II에 지시되어 있음

² 평균 입자 크기는 평균 1마이크론 미만 입자에 대해서는 전기영동 광 산란법으로, 마이크로 크기의 입자에 대해서는 레이저 확산법으로 측정하였음.

평균 입도는 미크론 미만의 입자에 대해서는 전기영동 광 산란 방법(electrophoretic light scattering method)(ELS-8000, Photal)으로 측정하였고, 미크론 크기의 입자에 대해서는 레이저 확산 방법(laser diffraction method)(Mastersizer 2000, Malvern)으로 측정하였다.

다공도, 표면적, 평균 기공 직경 및 기공 크기 분포를 나타내는 수치를 수은 침투법(mercury intrusion) 및 질소 가스 흡착법으로 산정하였으며, 수은 침투법을 사용함에 있어, 수은 세공측정기(mercury porosimeter)를 사용하여 기공 크기 분포를 측정하였다. 질소 가스 흡착을 이용한 BET 표면적 및 평균 기공 직경 수치는 ASAP2010으로 측정하였다.

바실러스 서브틸리스 AH18 내생포자의 생산

기하급수적으로 생장한 바실러스 서브틸러스 AH18 세포 10⁶ CFU가 80℃의 온도로 가온되었을 때, 희석 도말에 의해 측정한 바와 같이(도 1 참조) 10분 후 100 개 이하의 세포만이 생존하였다. 또한, 바실러스 서브틸러스 AH18의 성장 세포가 80℃에서 10 분 이상 동안 생존할 수 없으나, 특정 세포(현미경 조사로 측정됨)는 20 분 이상 열-저항성을 나타냈었다. 높은 온도에도 견디는 이들 세포는 이후 20분 더 생존을 유지하였다.

현미경으로 관찰된 응축 세포 크기 및 저항성 그램 염색 특성들은 이들 열-저항성 세포들이 고온하에서 생산된 내생포자임을 제시하였다. 이 실험으로 바실러스 서브틸러스 AH18의 성장 세포가 80℃에서 10분 이상 생존할 수 없음을 결론 내렸다.

열 스트레스하에서 생산된 포자들이 영양고갈에 의해 생산된 것들 보다 열 안정성이 있는지 여부를 알아보기 위해, 42℃의 승온하에서 생산된 바실러스 서브틸러스 AH18의 후기 지수증식기 배양물을 57℃에서 2 시간 동안 배양하여 열-스트레스 내생포자를 생산하였다. 비교를 위하여, 동일한 후기 지수증식기 배양물을 37℃의 통상의 배양 온도에서 생산하고 37℃에서 2 시간 동안 더 배양시켜 영양고갈에 의한 포자를 생산하였다. 각각의 세포 배양물은 80℃에서 10분간 정치하여 혹시 살아있을 수 있는 영양형 세포를 제거하여, 90℃의 열 안정성 분석시에 급속한 감소를 야기시킬 수 있는 무리를 차단하였다. 이 단계 이후에, 잔존하는 생존 포자들은 영양고갈에 의해 생산된 경우 1-2×10⁵ CFU/mL였고, 열 스트레스하에서 생산된 경우 1-7×10⁴ CFU/mL였다 (결과는 나타내지 않았음).

90℃에서 바실러스 서브틸러스 AH18 의 열 안정성

포자만의 배양물을 90℃에서 배양하여 상이한 포자 제조물의 열 안정성을 분석하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 영양고갈에 의해 생산된 포자들은 60 분 이상 동안 약 1,000 배 감소한 반면, 열 스트레스하에서 생산된 것들은 동일한 기간 동안 단지 약 10 배 감소를 나타내었다.

이러한 결과는 열 스트레스하에서 생산된 바실러스 서브틸러스 AH18 내생포자들이 90℃에서 1 시간 동안 비교했을 때 영양고갈에 의해 생산된 것들 보다 100 배 이상 열 안정성일 수 있음을 제시하였다.

한편, 추가의 실험을 통해, 90℃에서 1 시간 동안 분석하였을 때, 57℃의 치사 온도 이하에서 생산된 바실러스 서브틸러스 AH18 내생포자가 37℃의 영양고갈 상태에서 생산된 것들 보다 100 배의 열 저항성을 나타내었다.

바실러스 서브틸러스 AH18 의 생존에 대한 무기 담체의 영향

바실러스 서브틸러스 AH18을 위한 제형화 담체를 선택하기 위하여, 여러 합성 및 천염 무기 담체에 대해 최소 억제 농도를 측정함으로써 바실러스 서브틸러스 AH18의 생존에 대한 그들의 영향을 시험하였다(결과는 나타내지 않았음).

대조 웰 중의 바실러스 서브틸러스 AH18이 10⁴ CFU의 출발 접종물로부터 20 시간 배양 후 10⁵ 배 증가한 반면, 무기 담체를 포함하는 웰 중의 세포 수는 담체의 농도에 따라 다양하였고, 생장 억제를 나타내는 담체의 MIC는 담체들의 상이한 화학적 조성 또는 물리적 구조에 기인하여 0.01 내지 4%였다.

그러나, 몇몇 담체들은 10%의 최대 사용 농도에서 조차도 세포 생장을 억제하지 않았고, 바실러스 서브틸러스 AH18 세포가 대조구 만큼 고밀도로 생장하였다. 10%에서 억제 효과를 나타내지 않는 무기 담체들은 합성 제올라이트 NaY, 합성 제올라이트 NaA, 천연 제올라이트, 카올린 클레이 미네랄 및 두개의 상이한 공급원의 펄라이트였다.

바실러스 서브틸러스 AH18 내생포자의 열 안정성에 대한 무기 담체의 영향

내생포자-담체 제형을 제조하기 위하여, 합성 제올라이트 담체 NaY(1) 및 NaA(4), 및 천연 제올라이트[클리노프틸로라이트(clinoptilolite)](7), 천연 카올린 클레이 미네랄(12) 및 상이한 제조업자에 의해 생산된 두개의 펄라이트 I 및 II(각각 14 및 15)를 열-스트레스 유도 내생포자 배양물과 10%(v/w)로 혼합하였다.

이들 제조물을 사용하여, 바실러스 서브틸러스 AH18 내생포자의 열 안정성에 대한 무기 담체의 영향을 분석하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 이들은 조사된 담체에 상관없이 90℃에서 1 시간 동안 열 안정성에 대한 현저한 음성 효과를 나타내지 않았고, 생존률은 도 2에서와 같이 생산된 포자만 있는 제조물과 동등한 수준 이었다. 포자만 있는 시료는 액상이었고, 내생포자-담체 제형은 10% 물을 함유하고 있기 때문에, 이는 내생포자의 열 안정성이, 적어도 실험 조건하에서, 수분 함량에 현저하게 영향받지 않았다 는 사실을 제시할 수 있다.

15-25℃에서 6 개월 동안 담체 제형중의 열-유도된 바실러스 서브틸러스 AH18 내생포자의 안정성

15-25℃의 온도 변이하에서 무기 담체 제형중의 열-유도된 바실러스 서브틸러스 AH18 내생포자의 안정성을 조사하기 위하여, 열-밀봉된 플라스틱 주머니의 내생포자-담체 제조물 1g중의 다양한 세포 수를 총 6 개월 동안 매 달 측정하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 담체 1(NaY 제올라이트), 4(NaA 제올라이트), 7(천연 제올라이트) 및 12(카올린 클레이)를 사용한 제조물은 각각 조사된 기간 전체에 걸쳐 다양한 세포 수에서 안정하였다. 응축된 세포 형태 및 그램 균주에 대한 저항성은 이들 제조물중의 세포들이 6 개월 후에도 여전히 포자로서 남아있음을 제시하였다(결과는 나타내지 않았음).

그러나, 펄라이트를 사용한 세균성 제형은 세포 수의 점진적인 증가를 보여주어, 6 개월 후에는, 담체 14에 담지된 균수는 100배 증가 하였고, 담체 15의 것은 10⁷ 배 증가 하였다. 시료 15에 대한 증진된 세포 수는 액상으로 유지된 포자만의 제형과 같은 양상의 증가폭을 보여주었다(도 4에서 □와 ◆로 비교됨). 펄라이트 15 제형과 포자만의 액상 배양물 각각에 있어서, 세포 수는 1 개월 후 빠르게 증가하였고, 이는 내생포자의 휴면상태가 제조 초기에 깨졌음을 알 수 있었다. 반면에, 펄라이트 시료 14중의 포자들은 2 개월까지 안정성을 유지하는 것으로 보였 으나, 이후, 영향형 세포로 변화되어, 잔여 4 개월 전체에 걸쳐 점진적으로 증식하였다.

증식도의 차이는 시료 번호 15를 사용한 것에 비해 펄라이트 14를 사용한 것이 10⁵ 배 작았다(도 4에서 □와 ■로 비교됨). 그럼에도 불구하고, 세포 형태 및 운동성에 대한 현미경 분석은 이들 펄라이트 제조물 각각 중의 세포들이 조사 기간 마지막에서 활동성을 가진 영향형 세포였음을 제시하였다(결과는 나타내지 않음). 이러한 결과는 담체 1, 4, 7 및 12가 6 개월 이상 동안 휴면 상태를 유지하는 데 매우 효과적인 반면, 펄라이트 담체는 발아를 촉진시키고, 따라서 영양형 세포의 증식을 촉진시킨다는 사실을 제시하였다.

여러 담체에 의해 부여된 포자-안정성 정도의 차이를 이들 담체의 물리적 특성, 주로 다공성 특성을 분석함으로써 조사하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 화학적 조성, 구조적 다양성 또는 평균 입도의 차이는 미미한 차이를 보이는 것 같으나, 수은 침투법으로 측정한 담체의 평균 기공 크기는 포자 휴면 상태와 음성적으로 관계가 있음을 제안하고, 0.63-0.084㎛ 범위(중간 및 미세다공성)의 평균 기공 직경을 가져서 큰 BET 표면적을 나타내는 합성 및 천연 제올라이트와 카올린 클레이 미네랄은 포자 휴면 상태를 유지할 수 있었음에 반해, 3.7-8.0㎛ 범위(거대다공성)의 기공 크기를 가져 작은 BET 표면적을 나타내는 펄라이트 담체는 포자 발아 및 성장 세포의 증식을 촉진시킬 수 있었다.

중간 및 미세다공성 담체와 거대다공성 담체의 기공율을 비교함에 있어, 79% 이상의 기공율이 포자 발아를 촉진시키는데 또 다른 기연 인자였다. 이들 결과는 비교적 보다 작은 기공율 및 작은 평균 기공 직경으로 인한 큰 BET 표면적을 나타내는 합성 또는 천연 제올라이트, 또는 카올린 클레이 미네랄이 15 내지 25 ℃의 실온에서 바실러스 서브틸러스 AH18 내생포자에 대해 6 개월 동안 안정성을 제공할 수 있다.

고온하에서 생존능력을 유지시키기 위하여, 42℃에서 바실러스 서브딜러스를 생장시키고, 후기 지수증식기(exponential phase) 배양을 57℃의 치사 온도(lethal temperature)로 유지시켜 인공적으로 포자형성(sporulation)을 유도시킴으로써 바실러스 서브틸러스 AH18의 열안정성 내생포자를 생산 단계에서 생성시켰다.

90℃에서 1 시간 동안 정량적으로 분석된 포자의 안정성은 치사 온도-스트레스 하에서 생성된 포자들이 37℃의 통상 생장 온도에서 영양고갈 조건하에서 생성된 포자들 보다 100 배 이상 열-안정성이 있다는 사실을 제시하였다. 온도 변화 범위 15 내지 25℃에서 있을 수 있는 포자 발아 및 과증식(over-proliferation) 문제점을 제어하기 위하여, 여러가지 화학적 조성, 구조 및 기공 직경을 갖는 제올라이트, 펄라이트, 카올린 클레이 미네랄과 같은 합성 및 천연 무기 담체를 제형에 도입하였다.

모두 6개월 동안 분석된 포자의 안정성은 평균 기공 직경이 작고 BET 표면적이 큰 물질이 포자의 휴면 상태를 유지시키는데 효과적이며, 기공 직경이 0.63-0.084㎛이어서 BET 표면적이 11-763m²/g로 큰 합성 및 천연 제올라이트, 및 카올린 클레이 미네랄이 6개월 동안 포자 휴면 상태를 유지시킬 수 있었던 반면, 평균 기공 크기가 3.7-8.0㎛로 커서 BET 표면적이 4.1-0.95m²/g로 작은 펄라이트 담체는 성장 세포(vegetative cell)의 발아 및 활성 생장을 촉진시킨다는 사실을 보여주었다. 또한, 포자-휴면상태를 유지한 담체는 74% 미만의 기공도를 보여주었다.

이를 통하여, 다양한 화학적 조성 및 구조를 갖는 다양한 무기 담체가 고온하에서 내생포자의 열 안정성을 유지함에 있어 현저한 차이를 보이지 않음에도 불구하고, 15 내지 25℃에서 6 개월 동안 포자 휴면 상태를 유지하는데는, 중간 및 미세다공성 담체 와 거대다공성 담체 사이에 현저한 차이가 있었다.

담체의 상이한 물리적 특성을 분석함에 있어서, 담체의 평균 기공 직경이 포자 휴면 상태를 유지하거나 깨뜨리는데 주요한 인자인 것으로 여겨지고(표 1 참조), 평균 기공 크기가 0.63 ㎛ 이하인(중간 및 미세다공성) 합성 및 천연 제올라이트 및 카올린 클레이 미네랄 담체가 휴면상태를 유지하는데 효과적인 반면, 3.7㎛ 이상(거대다공성)의 펄라이트 담체는 포자 발아 및 바실러스 서브틸러스 성장 세포의 생장을 촉진하는데 효과적이었다(표 1 및 도 4 참조).

일단 휴면 상태가 깨지게 되면, 3.7㎛ 크기를 갖는 펄라이트 I에서 큰 기공 직경(8㎛)을 갖는 펄라이트 II에서 보다 많은 세균 생장이 검출되었다(표 1 및 도 4, 비교 시료 14 및 15).

미생물 활성이 생존에 특히 요구될 때는 큰 기공 크기의 무기 담체를 도입할 수 있지만, 균주의 지속적인 안정성이 요구되는 최종 미생물 제품인 경우, 미생물 의 휴면을 유지하는 것이 관건이기 때문에 큰 크기의 다공성 물질로 제제화하는 것은 바람직하지 않은 것으로 사료된다.

여기서, 미세다공성 무기 담체가 왜 내생포자의 휴면 상태를 유지하는데 효과적인지는 알 수 없으나, 작은 미생물이 담지 될 수 없는 작은 기공이 있는 경우 기공이 수분을 흡수하여 포자가 있는 기공 표면으로부터 물리적으로 격리시켜놓기 때문에 발아에 필요한 수분이 없는 상태가 되지 않나 추축해 볼 수 있다. 이와는 반대로 포자가 담지될 수 있는 큰 기공의 경우에는 수분을 기공 내로 흡수하여 수분의 저장고 역할을 하기 때문에 포자의 발아및 영양형 세포의 생장을 촉지한다 생각된다. 이는 기공 크기가 서로 달랐을 때, 기공이 큰 펠라이트일 수록 포자가 휴면에서 일찍 깨어났고 영양형세포의 증식도 크게 일어났다는 사실로 논리를 보완할 수 있겠다 (표 1 및 도 4, 비교 시료 14 및 15).

결론적으로, 바실러스 서브틸러스 AH18의 열 저항성 내생포자는 생장 단계에서 승온에 이어 치사 온도에 의해 포자생성을 유도시킴으로서 생산할 수 있으며, 열 안정성 내생포자는 90℃ 까지의 열에서 1 시간 동안 저항할 수 있다. 내생포자의 휴면상태는 0.63㎛의 평균 기공 직경을 가져서 큰 BET 표면적을 갖는 중간 혹은 미세다공성 담체와 배합될 때 15-25℃에서 6 개월 동안 유지될 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 미생물 제제의 제형화 방법은 제형화시에 열 저항성 포자를 생성시키고, 최종 단계에서 무기 미세다공성 담체를 혼입시킴으 로써, 바실러스 제품을 비용 효율적이며 고온 및 저온 변이에 대항하여 휴면 상태를 유지하여, 특별한 관리 없이도 미생물 제제를 유통될 수 있도록 하는데 효과적이어서 미생물 제제 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (3)

1. 바실러스 서브틸러스 AH18 균주(기탁번호: KACC 91205P)를 선별하여 37℃에서 배양하고, 42℃에서 생장시키는 단계;

   형성된 포자에 치사온도 57℃의 열 스트레스(heat stress)를 가하여 열 유도 내생포자를 생성시키는 단계;

   포자 혼합물로부터 잔류 성장 세포를 제거하여, 포자만 존재하는 배양물을 생성시키는 단계; 및

   미리 살균 및 건조한 중간 및 세기공성 무기 담체에 상기 바실러스 서브틸러스 AH18 열 안정성 포자 배양물을 가하여 내생포자-담체 혼합물 제형을 제조하는 단계

   로 이루어진 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸러스 AH18의 제제화 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 무기 담체가 합성 제올라이트 NaY(SiO₂:Al₂O₃:Na₂O=46:20:11), 합성 제올라이트 NaA(SiO₂:Al₂O₃:Na₂O=39:34:20), 천연 제올라이트[클리토프틸롤라이트(Clinoptilolite)] 또는 카올린 클레이 미네랄로 구성되는 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 바실러스 서브틸러스 AH18의 제제화 방법.
3. 제1항 또는 제2항의 방법에 의해 제조된 바실러스 서브틸러스 AH18 미생물 제제.

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