KR100494663B1

KR100494663B1 - 항진균 활성세균인 바실러스 서브틸리스 ｙｓ1, 감마선 조사를 이용한 돌연변이체 제조방법 및 그 돌연변이체

Info

Publication number: KR100494663B1
Application number: KR10-2001-0063465A
Authority: KR
Inventors: 이영근; 송인근; 조규성; 장병일; 정혜영
Original assignee: 한국원자력연구소
Priority date: 2001-10-15
Filing date: 2001-10-15
Publication date: 2005-06-13
Also published as: KR20030031371A

Abstract

본 발명은 항진균 활성세균인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) YS1 및 그의 돌연변이체에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 온천수로부터 분리한 항진균 활성세균인 바실러스 서브틸리스 YS1 및 감마선 조사를 이용하여 제조된 그의 돌연변이체, 그리고 방사선 조사를 통한 돌연변이체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 항진균 활성을 가지는 미생물 바실러스 서브틸리스 YS1 및 그 돌연변이체는 넓은 항진균 스펙트럼을 보여 다양한 곰팡이에 의한 식물병을 방제하는데 효과적일 뿐만 아니라 상용 화학농약에 높은 저항성과 생존능력이 있어 환경친화형 미생물농약 및 유기물 분해능을 이용한 다기능적 환경친화형 토양개량제, 퇴비부숙제, 환경정화제 등으로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방사선 조사를 통한 돌연변이체 분리방법은 기능성 균주의 개량을 빠르고 간편하게 하는데 이용될 수 있다.

Description

항진균 활성세균인 바실러스 서브틸리스 ＹＳ1, 감마선 조사를 이용한 돌연변이체 제조방법 및 그 돌연변이체{Bacillus subtilis YS1 having antifungal activity, preparation method of its mutants by gamma radiation and the mutants thereof}

본 발명은 항진균 활성세균인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) YS1 및 그의 돌연변이체에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 온천수로부터 분리한 항진균 활성세균인 바실러스 서브틸리스 YS1 및 감마선 조사를 이용하여 제조된 그의 돌연변이체, 그리고 방사선 조사를 통한 돌연변이체의 제조방법에 관한 것이다.

대부분의 신농약 연구는 주로 화학적인 합성방법으로 수행되고 있어 극심한 환경오염을 초래하고 있을 뿐만 아니라 먹이 사슬의 기본적 생태계 원리에 따라 그 악기능은 소비자인 인간의 건강에 심각한 영향을 미치게 된다. 또한, 기존의 화학농약들은 미생물의 저항성 증가로 인하여 매년 더 많은 양을 사용하게 되어 농민 뿐만 아니라 소비자들의 건강문제를 야기하고 있다. 또한, 기존의 신농약 개발에는 많은 시간과 연구인력이 소요될 뿐만 아니라 막대한 환경오염을 초래하고 있기 때문에, 이를 극복할 수 있는 무공해 미생물농약의 개발이 절실히 요구된다.

특히, 환경 보호와 생태계 보전에 관한 그린 라운드(Green Round) 협약이 국제적 관심의 대상이 되면서, 과다한 농약 등의 남용이 심각한 문제로 대두되고 이를 대체하는 식물 방제용 무공해 농약(biocide)의 개발이 국제적으로 경쟁이 치열한 핵심 분야로 등장하고 있다. 기존 농약에 의한 환경오염 문제를 극복하기 위하여 생산, 저장 및 적용이 용이하고 병원균을 효과적으로 억제하는 길항 미생물을 선발하고 생물 활성물질을 분리하는 것은 매우 시급한 과제이다. 특히 항진균 활성 물질은 포유동물에 대하여 독성이 기존 농약보다 낮고, 식물에 약해가 없으면서, 활성은 탁월하고 잔류성은 적어서 윤작에도 영향이 없으며 지하수, 토양, 하천수 등을 오염시키지 말아야 한다.

지금까지 개발된 항진균제는 크게 살리실산(salicilic acid), 알루미늄 염 (aluminum salt), 아연 염(zinc salt), 요오드, 에탄올, 유기산(benzoic acid, propionic acid 등)과 같이 표면 감염부위에 직접 작용하는 국소성 제제(nonsystemic agent)와 조직과 기관에 흡수되어 작용하는 전신성 제제(systemic agent)로 구별된다.

현재 사용되는 전신성 항진균제 계열을 살펴보면, (1) 페놀-에테르 화합물인 그리소풀빈(griseofulvin, Penicillium sp.), (2) 폴리엔 계열인 암포테리신 B (amphotericin B, Am B; Streptomyces nodosus), 하마이신(hamycin, Streptomyces pimprina), 니스타틴(nystatin, Streptomyces noursei), 나타마이신(natamycin), (3) 피리미딘 계열인 플루사이토신(flucytosine, 5FC), (4) 아졸 유도체인 미코나졸(miconazole, MON), 케토코나졸(ketoconazole, KET), 플루코나졸(fluconazole, FLU), 제나코나졸(genaconazole, GEN), 이트라코나졸(itraconazole, ITR), 사퍼코나졸(saperconazole, SAP), (5) 펩타이드 계열인 실로펀진(cilofungin, CIL), 사라마이세틴(saramycetin, Streptomices saraceticus), (6) 아릴아민 계열인 터비나핀 (terbinafine, TER), 나프티핀 (naftifine), (7) 몰포린(morpholines) 계열인 펜프로피모프(fenpropimorph) 등이 대표적이라 할 수 있다. 그러나 전신성 항진균제는 많은 종류가 보고되고 미생물로부터 생산도 가능하며 그 유도체가 활용되고 있음에도 불구하고, 항진균 활성 스펙트럼 및 독성 등의 많은 문제점이 있다. 따라서 농작물에 가장 큰 폐해를 가져다 주는 식물 병원성 진균류의 방제 뿐 아니라, 의학적으로 진균 감염증 치료에 실용화할 수 있는 저독성, 특이성, 속효성 항진균제의 개발은 무엇보다 시급하다.

한편, 생물학적 제어(biological control) 방법을 통하여 질병 억제에 관여하는 미생물 대사산물은 항진균제를 포함하여 시더로포아(siderophore), NH₃ 효소, 하이드로겐 시아니드(hydrogen cyanide) 등을 들 수 있고 이들은 길항적 활성을 보인다. 지금까지 보고된 진균류에 대한 생물학적 제어에 활용되는 미생물 살균제제로는 슈도모나스(Pseudomonas), 바실러스(Bacillus), 스트렙토미세스 (Streptomyces), 아그로박테리움(Agrobacterium), 버콜데리아(Burkholderia) 등의 세균과 트리코더마(Trichoderma), 지로클라디움(Gilocladium), 퓨사리움(Fusarium) 등과 같은 진균으로부터 유래한 것 등이 알려져 있다(Fravel 등, 1998). 현재 40 여개에 달하는 미생물 살균제가 등록된 상태이나(Fravel 등, 1998; Lumsden 등, 1995) 그들 대부분의 제품들은 토양전염성 퓨사리움(Fusarium), 피티움(Pythium), 리족토니아(Rhizoctonia), 스클레로티니아(Sclerotinia), 피토프토라 (Phytophthora) 등과 같은 식물병원성 진균류의 방제용으로 상용되는 제품으로 시장점유율이 아직 미비한 실정이다. 또한 현재까지, 분리된 기능성 균주를 직접 이용하거나 균주의 생산 산물을 직접 이용하려는 개발은 많이 시도되고 있으나 이들 분리 균주로부터 기능의 변화가 오는 돌연변이체를 분리하고 이를 응용하려는 시도, 특히 감마선을 이용한 돌연변이체 제조는 거의 없는 실정이다.

이에 본 발명자들은 새로운 미생물 제제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 온천수로부터 분리한 바실러스 서브틸리스 YS1이 식물병원성 및 동물병원성 진균을 포함하는 다양한 병원성 진균류에 대해 활성을 가진다는 것을 확인하는 한편, 감마선조사를 이용하여 돌연변이체를 제조하는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 가지는 미생물인 바실러스 서브틸리스 YS1 및 감마선 조사를 이용하여 제조된 그의 돌연변이체, 그리고 방사선 조사를 통한 돌연변이체의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 병원성 진균에 특이적인 항진균 활성을 가지는 미생물인 바실러스 서브틸리스 YS1을 제공한다.

또한, 본 발명은 방사선 조사에 의해 제조된, 항진균 활성이 증강 또는 소실된 바실러스 서브틸리스 YS1 균주의 돌연변이체 및 영양요구주 및 감마선 조사를 이용한 바실러스 서브틸리스 YS1 균주의 돌연변이체 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

먼저 본 발명은 병원성 진균에 특이적인 항진균 활성을 가지는 미생물인 바실러스 서브틸리스 YS1을 제공한다.

본 발명자들은 유성온천의 원수로부터 항진균 활성 미생물을 분리하였고, 본 발명의 미생물은 바실러스 서브틸리스로 동정되었다. 본 발명자들은 상기 미생물을 바실러스 서브틸리스 YS1 균주로 명명하고 2001년 2월 7일부로 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호: KFCC 11265).

또한, 본 발명은 방사선 조사에 의해 제조된 항진균 활성이 증강 또는 소실된 바실러스 서브틸리스 YS1 균주의 돌연변이체 및 감마선 조사를 이용한 바실러스 서브틸리스 YS1 균주의 돌연변이체 제조방법을 제공한다.

본 발명자들은 방사선 조사를 통하여 야생형 바실러스 서브틸리스 YS1으로부터 돌연변이체를 제조한 결과, YS1-1002, YS1-1006, YS1-1009, Y25 및 Y67의 5개의 돌연변이체를 얻을 수 있었다. 야생형 균주 및 방사선조사를 통해 유도된 돌연변이체를 영양요구주 선별 배지에 접종하여 영양요구성을 판별한 결과, Y25는 트립토판, Y67은 아르기닌과 우라실 또는 프롤린과 트립토판이 동시에 첨가된 영양배지에서만 생존한다는 것을 확인하였다.

본 발명의 돌연변이체의 제조방법은

(1) 바실러스 서브틸리스 YS1(수탁번호: KFCC 11265)에 방사선을 조사한 후 약 95%의 치사율을 보이는 방사선 조사선량에서 생존한 균체를 회수하는 단계;

(2) 상기 균체중에서 병원성 진균인 칸디다 알비칸스에 대하여 형태적 특징 및 항진균 활성에 변화가 보이는 균주를 선별하는 단계;

(3) 상기 단계 2에서 선별된 균주에 다시 방사선을 조사한 후 약 95%의 치사율을 보이는 방사선 조사선량에서 생존한 균체를 회수하는 단계;

(4) 상기 단계 3에서 회수된 균체중에서 병원성 진균인 칸디다 알비칸스에 대하여 항진균 활성이 소실된 균주를 선별하는 단계; 및

(5) 상기 단계 4에서 선별된 균주를 4회 계대배양 후 복귀돌연변이가 일어나지 않는 변이주를 선별하는 단계로 구성된다.

상기 단계 1 또는 단계 3에 있어서, 방사선으로는 자외선, X선 또는 감마선이 이용될 수 있으며, ⁶⁰Co를 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명자들은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 YS1 및 그 돌연변이체들의 항진균 활성을 분석하였다. 즉, 항진균 활성스펙트럼을 분석하기 위하여 아가 플러그(agar plug) 형태로 병원성 진균류를 각각 PDA 배지의 중앙에 접종한 후, 전배양된 항진균 세균의 배양액을 종이판 접종 방법으로 in vivo 길항실험을 수행하여 종이판의 가장 자리에서부터 투명억제대(hollow zone) 까지의 길이를 측정함으로써 상대적인 항진균 활성도를 조사하였다.

그 결과, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 YS1은 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 리족토니아 솔라니 BP(Rhizoctonia solani BP), 알터나리아 솔라니(Alternaria solani), 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 피토프소라 캅시시 (Pythophthora capsici), 콜렉토트리키움 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 마이코스파렐라 멜로니스(Mycosphaerella melonis), 퓨사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 피티움 울티멈(Phythium ultimum), 보트리오사에리아 도티데아(Botryoshaeria dothidea), 스클레로티니아 스클레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum) 등의 식물 병원성 진균, 동물 병원성 진균인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대하여 생장억제 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 1 참조). 또한 본 발명의 돌연변이체 YS1-1002, YS1-1006 및 YS1-1009 균주는 항진균 활성이 야생형에 비해 일부 진균에 대해서 증가되었는데, 특히 YS1-1009 돌연변이체는 보트리오사에리아 도티데아(Botryoshaeria dothidea)에 대해 야생형에 비해 항진균 활성이 증가되는 것을 확인하였다(표 4 참조).

또한, 본 발명자들은 기존의 경작지에 오염되어 있는 상용농약에 대한 본 발명의 바실러스 서브틸리스 YS1 및 그 돌연변이체의 저항성 및 생장능력을 조사하였다. 즉, 본 발명자들은 농경지에서 가장 높은 빈도로 사용되는 살균제, 살충제, 제초제 등의 농약을 선정하여 용도에 따라 구별하여 사용하였다.

그 결과, 바실러스 서브틸리스 YS1은 베노밀, 옥사디실, 에디펜포스, 펜시큐론, 아족시스트로빈, 이미다클로프리드, 카보퓨란, 클로르피리포스, 디아지논 및 글리포세이트에 뛰어난 저항성을 보였으며, YS1-1006은 옥사디실, 에디펜포스, 펜시큐론, 아족시스트로빈 및 디아지논에, YS1-1009는 베노밀, 플루시라졸, 에디펜포스 아족시스트로빈 및 카보퓨란에 뛰어난 저항성을 보이는 것을 확인하였다(표 6 참조).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 YS1 및 그 돌연변이체의 지방산(fatty acid), 전분(starch), 섬유소(cellulose), 포도당(glucose) 및 리그닌(lignin)에 대한 분해능력을 분석하였다.

그 결과, 바실러스 서브틸리스 YS1 및 그 돌연변이체 균주들은 일반적으로 식물 기원의 난분해성 물질인 리그닌(lignin)을 분해하는 리그닌 분해효소 활성(ligninase activity)를 보였고, 특히 YS1-1006 돌연변이체는 야생형 균주에 비해 포도당 분해효소(β-glucosidase) 및 리그닌 분해효소 활성이 증강된 돌연변이체라는 것을 확인하였다(표 7 참조).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 YS1 및 그 돌연변이체의 영양원, 온도 및 pH에 따른 성장률을 분석하였다.

영양원에 따른 분리 균주의 성장률은 인산원, 탄소원 및 질소원의 종류에 따른 본 발명의 균주들의 생장곡선을 구하여 측정하였다. 인산원(phosphate source)으로는 인 농도를 달리하여 항진균 세균의 성장률을 측정하였고, 탄소원(carbon source)으로는 포도당(glucose), 락토스(lactose), 수크로스(sucrose) 및 글리세롤(glycerol)을 이용하였으며, 질소원(nitrogen source)으로는 펩톤(peptone), 이스트 추출물(yeast extract), 트립톤(tryptone) 및 요소(urea)를 이용하여 포도당 배지에 각각의 질소원을 첨가한 것을 사용하였다.

그 결과, 인산원에 따른 항진균 세균들의 성장률은 처리된 인산의 농도에 비례하여 성장하는 양상을 보여주었으며(도 3의 A 참조), 질소원의 경우는 4가지의 질소원 중에서 이스트 추출물이 함유된 배지에서 가장 빠른 성장률을 보였다. 요소가 함유된 배지에서는 낮은 성장률을 보였으며 잠복기가 8시간 이상 걸렸다(도 3의 B 참조). 탄소원의 경우 포도당과 수크로스를 첨가한 배지에서 성장률이 우수하였으나 락토스가 함유된 배지에서는 YS1과 그 돌연변이 균주들의 잠복기가 14시간 이상 지속되었다(도 3의 C 참조).

본 발명의 균주들의 성장률에 미치는 온도의 영향을 측정한 결과, 본 발명의 균주들은 37℃-45℃에서 최적의 생장을 보였다. 이들 균주는 50℃에서도 최적 성장온도에서 나타나는 빠른 성장을 나타냈으나 최적 성장온도에서와는 달리 안정기에서 사멸기로의 급속한 변화를 보였다(도 3의 D 참조). pH에 대한 생장정도를 측정한 결과, pH 7에서 모든 균주의 성장이 양호하였으며 pH 3에선 성장이 전혀 일어나지 않았고, pH 5에 비해 pH 9에서 성장이 더욱 빠른 것을 확인하였다. 이로 보아 YS1 균주는 호염기성 세균으로 판단된다(도 3의 E 참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 바실러스 서브틸리스 YS1 균주의 분리 및 동정

본 발명자들은 온천의 원수로부터 세균들을 분리하여 이 중 항진균 활성이 뛰어난 세균을 분리하였다. 분리된 세균을 순수배양하여 그람염색(Gram stain)을 행하고, MIDI 시스템을 이용한 FAME(fatty acid methyl esters) 분석과 데이타베이스(Database)를 이용하여 동정하였으며, 생화학적 특성을 파악하기 위해 API CH 키트에 적용하여 동정 결과를 보완하였다.

그 결과, 본 발명의 미생물은 바실러스 서브틸리스로 동정되었으며, 본 발명자들은 상기 미생물을 바실러스 서브틸리스 YS1 균주로 명명하고 2001년 2월 7일부로 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호: KFCC 11265).

<실시예 2> 돌연변이체의 제조 및 영양요구성 분석

본 발명자들은 방사선 조사를 통하여 실시예 1의 세균으로부터 돌연변이체를 제조하였다. 구체적으로, 실시예 1의 세균 1 ㎖을 마이크로퓨즈 튜브(microfuge tube)에 넣고 0 kGy에서 25 kGy의 방사선을 조사한 후, NA배지(Nutrient agar, Difco)에 도말하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 각 구간별 생균수로 감수성을 조사하고 95%의 치사율을 보이는 방사선 조사선량에서 생존한 균체를 칸디다 알비칸스가 미리 도말된 NA 배지에 접종하여 4시간 배양 후, 형태적 특징 및 항진균 활성에 변화를 보이는 특징적인 균주를 돌연변이체로 제조된 후보 균주로 선정하였다. 이후, 액체 배양을 한 후, 세균 배양액을 각 50㎕ 씩 종이판(paper disc)에 접종하여 37℃에서 1일 동안 배양한 후, 다시 95% 치사선량으로 방사선을 조사한 후 상기의 실험을 반복하고 야생형 균주에 비하여 항진균 활성이 증가된 균주를 4회에 걸친 계대배양 후 복귀 돌연변이가 일어나지 않는 변이주를 돌연변이체로 선정하였다. 야생형 균주 및 방사선조사를 통해 유도된 돌연변이체를 각각 GM63 최소배지(Glucose minimal 63 medium)에 접종하여 37℃에서 배양한 후, 미배양 균주를 하기 표 1에 나타난 영양원 조성을 각기 GM63 배지에 추가하여 제조한 영양요구주 선별 배지에 접종하여 37℃에서 3일간 배양한 후, 영양요구성을 판별하였다.

영양요구주 판별배지

구분	Sol 1	Sol 2	Sol 3	Sol 4	Sol 5
Sol 6	아데노신	구아닌	시스테인	메티오닌	티아민
Sol 7	히스티딘	류신	이소류신	리신	바린
Sol 8	페닐알라닌	티로신	트립토판	트레오닌	프롤린
Sol 9	글루타민	아스파라긴	우라실	아스파트산	아르기닌
Sol 10	티민	세린	글루탐산	디아미노피멜릭산	글리신
Sol 11	피리독신	니코틴산	바이오틴	알라닌	알란닌

그 결과, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 YS1은 50 Gy에서 25 kGy에 걸쳐 여러 선량(dose)의 방사선을 조사하였을 경우, 방사선 감수성의 지표인 D₁₀ 값은 2.39 kGy로 나타났고 20 kGy의 방사선 조사선량에서도 생존이 가능한 방사선 저항성 균주였으며(도 2), YS1-1002, YS1-1006, YS1-1009, Y25 및 Y67의 5개의 돌연변이체를 얻을 수 있었다. 영양요구주 선별배지에서는 Y25는 Sol 3와 Sol 8배지에서만 생존하였다. Sol 3과 Sol 8의 공통 영양원은 트립토판(tryprophan)으로 Y25는 트립토판 요구주임을 알 수 있었다. Y67은 Sol 3, Sol 5, Sol 8과 Sol 9에서만 생존하였다. 영양요구주 판별배지에서와 같이 Y67은 아르기닌(arginin)과 우라실(uracil) 또는 프롤린(proline)과 트립토판이 동시에 첨가된 영양배지에서만 생존할 수 있음을 알 수 있었다. Y25와 Y67의 영양요구성을 재조사한 결과도 동일하였다(표 2 및 표 3).

균주

LA

GM63

Sol1

Sol2

Sol3

Sol4

Sol5

Sol6

Sol7

Sol8

Sol9

Sol10

Sol11

YS1

+

-

+

-

+

Y25

+

-

+

-

+

-

Y67

+

-

+

-

+

-

+

-

균주	트립토판	우라실	아르기닌	프롤린	아르기닌트립토판	프롤린우라실	우라실아르기닌	프롤린트립토판
YS1	+	+	+	+	+	+	+	+
Y25	+				+			+
Y67	-	-	-	-	-	-	+	+

<실험예 1> 바실러스 서브틸리스 YS1 및 돌연변이체의 항진균 활성 스펙트럼 분석

본 발명자들은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 YS1 및 그 돌연변이체들의 항진균 활성을 분석하였다. 구체적으로, 항진균 활성스펙트럼을 분석하기 위하여 아가 플러그(agar plug) 형태로 병원성 진균류를 각각 PDA 배지(Potato dextrose agar, Difco)의 중앙에 접종한 후, 전배양된 항진균 세균의 배양액을 종이판(paper disk, Advantec, Toyo) 접종 방법으로 in vivo 길항실험을 수행하였다. 종이판의 가장 자리에서부터 투명억제대(hollow zone) 까지의 길이를 측정하여 상대적인 항진균 활성도를 조사하였다. 동물병원성 진균인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 항진균 활성 실험은 칸디다 알비칸스 전배양액을 0.7% 의 아가(agar)가 첨가된 NB배지(Nutrient broth medium, Difco)에 섞어 NA배지에 탑 아가(top agar)를 만든 후, 항진균 세균 배양액 50 ㎕를 접종하여 37℃에서 배양한 후, 투명억제대의 크기를 항진균 활성도로 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 YS1은 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 리족토니아 솔라니 BP(Rhizoctonia solani BP), 알터나리아 솔라니(Alternaria solani), 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 피토프소라 캅시시(Pythophthora capsici), 콜렉토트리키움 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 마이코스파렐라 멜로니스(Mycosphaerella melonis), 퓨사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 피티움 울티멈(Phythium ultimum), 보트리오사에리아 도티데아(Botryoshaeria dothidea), 스클레로티니아 스클레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum) 등의 식물 병원성 진균 및 동물 병원성 진균인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대하여 생장억제 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 1). 또한 본 발명의 돌연변이체 YS1-1002, YS1-1006 및 YS1-1009 균주는 항진균 활성이 야생형에 비해 일부 진균에 대해서 증가되었는데 특히, YS1-1009 돌연변이체는 보트리오사에리아 도티데아(Botryoshaeria dothidea)에 대해 야생형에 비해 항진균 활성이 증가되는 것을 확인하였다(표 4).

병원성 진균	YS1 균주 돌연변이체의 항진균 활성
병원성 진균	YS1-1006	YS1-1009
리족토니아 솔라니	++(=)	++(=)
리족토니아 솔라니 BP	+(=)	+(<wt)
퓨사리움 옥시스포럼	+(<wt)	+(<wt)
마이코스파렐라 메놀리스	+(=)	+(<wt)
알터나리아 솔라니	+(=)	+(=)
피티움 울티멈	+(<wt)	+(<wt)
보트리오사에리아 도티데아	+(=)	+(>wt)
피리큘라리아 오리재	+(=)	+(<wt)

wt: 야생형 균주, +:양호, ++ 매우 양호

<실험예 2> 바실러스 서브틸리스 YS1 및 돌연변이체의 상용농약에 대한 저항성 및 생장능력 분석

본 발명자들은 기존의 경작지에 오염되어 있는 상용농약에 대한 본 발명의 바실러스 서브틸리스 YS1 및 그 돌연변이체의 저항성 및 생장능력을 조사하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 농경지에서 가장 높은 빈도로 사용되는 농약을 조사하여 살균제 11종, 살충제 7종, 제초제 2종 등 20 종의 농약을 선정하여 순도 75% 이상의 특급시약을 동부한농(주)으로부터 제공받아 용도에 따라 구별하여 사용하였다.

이들 농약의 일반명 및 용도를 표 5에 나타내었다.

농약의 종류	일반 명칭	순도(%)	농도(ppm)	용매
살균제(Fungicide)	일반 명칭	순도(%)	농도(ppm)	용매
	베노밀(Benomyl)	95.0	250	아세톤
	플루시라졸(Flusilazole)	98.6	20	메탄올
	테뷰코나졸(Tebuconazole)	98.0	250	이소프로판올
	옥사디실(Oxadixyl)	98.0	250	메탄올
	에디펜포스(Edifenphos)	95.0	300	메탄올
	만코제브(Mancozeb)	83.0	1,000	H₂O
	펜시큐론(Pencycuron)	97.0	250	이소프로판올
	아조시스트로빈(Azoxystrobin)	98.4	100	아세톤
	수산화구리(Copper hydroxide)	89.0	800	암모니아
	이소프로티오란(Isoprothiorane)	96.0	400	H₂O
	이프로벤포스(Iprobenphos)	97.0	50	아세톤
살충제(Insecticide)	이프로벤포스(Iprobenphos)	97.0	50	아세톤
	클로르페나피르(Chlorfenapyr)	93.2	50	아세톤
	이미다클로프리드(Imidacloprid)	95.0	50	이소프로판올
	카보퓨란(Carbofuran)	75.0	300	이소프로판올
	펜피록시메이트(Fenpyroximate)	98.0	25	메탄올
	클로르피리포스(Chlorpyrifos)	93.0	200	메탄올
	BPMC	93.0	500	아세톤
	디아지논(Diazinon)	95.0	30	아세톤
제초제(Herbicide)	디아지논(Diazinon)	95.0	30	아세톤
	부타클로르(Butachlor)	87.9	50	아세톤
	글리포세이트(Glyphosate)	98.0	50	H₂O

농약에 대한 저항성 분석은 경작지에서 사용되는 농도의 농약이 첨가된 NA 배지에서 배양된 세균배양액 50 ㎕를 종이판(Paper disc)에 접종한 후, 30℃에서 3일간 배양하여 성장 여부를 측정하였다.

그 결과, 바실러스 서브틸리스 YS1은 베노밀, 옥사디실, 에디펜포스, 펜시큐론, 아족시스트로빈, 이미다클로프리드, 카보퓨란, 클로르피리포스, 디아지논 및 글리포세이트에 뛰어난 저항성을 보였으며, YS1-1006은 옥사디실, 에디펜포스, 펜시큐론, 아족시스트로빈 및 디아지논에, YS1-1009는 베노밀, 플루시라졸, 에디펜포스 아족시스트로빈 및 카보퓨란에 뛰어난 저항성을 보이는 것을 확인하였다(표 6).

농약의 종류	YS1	YS1-1006	YS1-1009
베노밀(Benomyl)	+++	++	+++
플루시라졸(Flusilazole)	++	++	+++
테뷰코나졸(Tebuconazole)	-
옥사디실(Oxadixyl)	+++	+++	++
에디펜포스(Edifenphos)	+++	+++	+++
만코제브(Mancozeb)	++	++	++
펜시큐론(Pencycuron)	+++	+++	++
아조시스트로빈(Azoxystrobin)	+++	+++	+++
수산화구리(Copper hydroxide)	-	++	-
이소프로티오란(Isoprothiorane)	++	+	+
이프로벤포스(Iprobenphos)	++	+	+
클로르페나피르(Chlorfenapyr)	++	+	+
이미다클로프리드(Imidacloprid)	+++	++	++
카보퓨란(Carbofuran)	+++	++	+++
펜피록시메이트(Fenpyroximate)	++	++	++
클로르피리포스(Chlorpyrifos)	+++	++	+
BPMC	-	-	-
디아지논(Diazinon)	+++	+++	++
부타클로르(Butachlor)	++	++	++
글리포세이트(Glyphosate)	+++	++	++

-: 저항성 없음; +:약한 저항성; ++: 강한 저항성; +++: 뛰어난 저항성

<실험예 3> 바실러스 서브틸리스 YS1 및 돌연변이체의 유기물 분해능 분석

본 발명자들은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 YS1 및 그 돌연변이체의 지방산(fatty acid), 전분(starch), 섬유소(cellulose), 포도당(glucose) 및 리그닌(lignin)에 대한 분해능력을 분석하였다. 구체적으로, 지방 분해능(lipolytic activity)은 시에라(Sierra, 1957)의 방법을 변형하여 트윈(tween)-80을 함유하는 고체배지(펩톤(peptone) 10 g, CaCl₂ 0.1 g, 아가(agar) 15 g, 트윈-80 1 ㎖/ℓ)에 균주를 접종하고 25℃에서 3일간 배양한 후, 균체 주위에 불투명한 결정체가 나타나면 지방 분해능이 있는 것으로 결정하였다. 전분 분해능(amylase activity)은 수용성 전분(soluble starch)이 함유된 배지(전분(starch) 5 g, 펩톤 10 g, CaCl₂ 0.5 g, MgCl₂ 5 g, MgSO₄ 2 g, KCl 1 g, FeSO₄ 0.001 g, 아가 1.5%/ℓ)에서 25℃로 3일간 배양한 후, 균체에 그람 요오드(Gram's iodine) 용액을 첨가하여 균체 주위에 투명대의 형성 여부를 관찰함으로써 전분 분해능을 분석하였다. 섬유소 분해능(cellulolytic activity)은 카르복시메틸셀룰로스(Carboxymethylcellulose, CMC)배지(CMC 5 g, MgSO₄ 2 g, CaCl₂ 0.5 g, KCl 1 g, FeSO₄ 0.001 g, 아가 1.5%/ℓ)에서 25℃에서 5일간 배양한 후, 0.5% 콩고-레드(Congo-red) 용액을 균체에 처리하여 투명대 형성 여부를 관찰함으로써 섬유소 분해능을 분석하였다. 포도당 분해능은 아세큐린(Aseculin, 6,7-dihydroxycoumarin 6-glucosidase)가 함유된 배지 (아세큐린 3 g, 차펙 용액(Czapek soln., NaNO₃ 40 g, KCl 10 g, MgSO₄ 7H₂O 0.2 g/ℓ) 50 ㎖, 2% K₂HPO₄ 50 ㎖, 1% ZnSO₄ 7H₂O 1 ㎖, 0.5% CuSO₄ 5H₂O 1 ㎖, 페릭 사이트레이트(ferric citrate) 0.2 g, 아가 1.5%/ℓ)에서 25℃로 5일간 배양한 후, 균체 주위에 검은색 환(black zone)이 형성되는지를 관찰함으로써 글루코스 분해효소 활성(β-glucosidase activity) 여부를 분석하였다. 리그닌 분해능(Ligninase activity)은 폴리 R-다이(Poly R-478 dye, Sigma)가 첨가된 배지(KH₂PO₄ 0.6 g, MgSO₄ 7H₂O 0.5 g, K₂HPO₄ 0.4 g, (NH₄)₂타트레이트(tartrate) 0.22 g, 소르보스(sorbose) 4 g, 폴리-R(Poly R-478) 0.2 g, 미네랄 용액(mineral soln., CaCl₂ 2H₂O 7.4 g, 페릭 사이트레이트 1.2 g, ZnSO₄ 7H₂O 0.7 g, MnSO₄ 5H₂O, CoCl₂ 6H₂O 0.1 g, 티아민(Thiamine HCl) 10 ㎎/ℓ) 10 ㎖, 아가 1.5%, pH 4.5)에서 25℃로 5일간 배양한 후, 균체 주위에 투명환의 형성 여부를 관찰함으로써 리그닌 분해능을 분석하였다(Glenn과 Gold, 1983).

그 결과, 바실러스 서브틸리스 YS1 및 그 돌연변이체 균주들은 일반적으로 식물 기원의 난분해성 물질인 리그닌(lignin)을 분해하는 리그닌 분해효소 활성(ligninase activity)를 보였고, 특히 YS1-1006 돌연변이체는 야생형 균주에 비해 포도당 분해효소(β-glucosidase) 및 리그닌 분해효소 활성이 증강된 돌연변이체라는 것을 확인하였다(표 7).

균주	효소 활성
균주	포도당 분해효소	SA	LA	CA	리그닌 분해효소
YS1	+^a	-	++	-	+
YS1-1006	+	-	+	-	+
YS1-1009	++	-	++	-	++

SA: 전분 분해효소 활성(amylase activity),

LA: 지방 분해효소 활성(lipolytic activity, fatty acid esterase activity),

CA: 셀룰로스 분해효소 활성(cellulase activity),

^a효소 활성도; -: 효소활성 없음, ++: 뛰어남, ++: 매우 뛰어남

<실험예 4> 바실러스 서브틸리스 YS1 및 돌연변이체의 생장조건 분석

본 발명자들은 본 발명의 서브틸리스 YS1 및 그 돌연변이체의 영양원, 온도 및 pH에 따른 성장률을 분석하였다.

<4-1> 영양원에 따른 성장률

영양원에 따른 분리 균주의 성장률을 측정하였다. 구체적으로, 인산원(phosphate source)으로는 Glu-MOPS 배지에 인 농도를 0.01 mM, 0.1 mM, 1 mM, 2 mM로 각각 달리하여 항진균 세균의 성장률을 측정하였다. 탄소원(carbon source)으로는 포도당(glucose), 락토스(lactose), 수크로스(sucrose) 및 글리세롤(glycerol)을 이용하였으며, 포도당 배지(Glucose-M63)에 각각의 탄소원을 글루코스 대신 0.5%씩 첨가하여 사용하였고, 질소원(nitrogen source)으로는 펩톤(peptone), 이스트 추출물(yeast extract), 트립톤(tryptone) 및 요소(urea)를 이용하여 포도당 배지에 각각의 질소원을 0.5%로 첨가한 것을 사용하였다.

그 결과, 인산원에 따른 항진균 세균들의 성장률은 처리된 인산의 농도, 즉 0.01 mM, 0.1 mM, 1 mM의 농도에 비례하여 성장하는 양상을 보여주었다. 그러나 1 mM과 2 mM의 인산 농도에서는 성장률의 차이를 보이지 않았다. 따라서 1 mM이하의 인산 농도가 본 발명의 균주 성장에 적당하다는 것을 확인하였다(도 3의 A). 질소원의 경우는 4가지의 질소원 중에서 이스트 추출물이 함유된 배지에서 가장 빠른 성장률을 보였다. 요소가 함유된 배지에서는 낮은 성장률을 보였으며 잠복기가 8시간 이상 걸렸다(도 3의 B). 탄소원의 경우 포도당과 수크로스를 첨가한 배지에서 성장률이 우수하였으나 락토스가 함유된 배지에서는 YS1과 그 돌연변이 균주들의 잠복기가 14시간 이상 지속되었다(도 3의 C).

<4-2> 온도에 따른 성장률

전배양된 각 세균 배양액 1 ㎖를 100 ㎖의 NB 배지에 접종한 후, 25, 30, 35, 37, 40, 45 및 50℃의 각 구간에서 시간별 성장률을 650 nm의 흡광도로 측정하여 플로팅(plotting)하였다. 55℃ 온도 구간의 경우, 1일 단위로 성장률을 측정하였으며, 동시에 배양액 100 ㎕를 NA 배지에 도말하여 37℃에서 1일간 배양한 후, 나타난 집락수를 계수하였다.

그 결과, 본 발명의 균주들은 37℃-45℃에서 최적의 생장을 보였다. 이들 균주는 50℃에서도 최적 성장온도에서 나타나는 빠른 성장을 나타냈으나 최적 성장온도에서와는 달리 안정기에서 사멸기로의 급속한 변화를 보였다(도 3의 D).

<4-3> pH에 따른 성장률

pH에 대한 생장정도를 측정하기 위하여 3, 5, 7, 9 및 11의 pH 구간의 NB 배지에 각 균주를 접종한 후, 37℃에 배양하면서 시간별 성장률을 650 nm의 흡광도로 측정하여 플로팅하였다.

그 결과, pH 7에서 모든 균주의 성장이 양호하였으며 pH 3에선 성장이 전혀 일어나지 않았고, pH 5에 비해 pH 9에서 성장이 더욱 빠른 것을 확인하였다. 이로 보아 YS1 균주는 호염기성 세균으로 판단된다(도 3의 E).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 항진균 활성을 가지는 미생물 바실러스 서브틸리스 YS1 및 그 돌연변이체는 넓은 항진균 스펙트럼을 보여 다양한 곰팡이에 의한 식물병을 방제하는데 효과적일 뿐만 아니라 상용 화학농약에 높은 저항성과 생존능력이 있어 환경친화형 미생물농약 및 유기물 분해능을 이용한 다기능적 환경친화형 토양개량제, 퇴비부숙제, 환경정화제 등으로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방사선 조사를 통한 돌연변이체 분리방법은 기능성 균주의 개량을 빠르고 간편하게 하는 데 이용될 수 있다.

도 1은 바실러스 서브틸리스의 항진균 활성 스펙트럼을 보여주는 사진이고,

A: 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani),

B: 리족토니아 솔라니 BP(Rhizoctonia solani(BP)),

C: 알터나리아 솔라니(Alternaria solani),

D: 알터나리아 알터나타 (Alternaria alternata),

E: 피토프소라 캅시시(Phyphthora capsici),

F: 콜렉토트리키움 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioide s)

G: 마이코스파렐라 멜로니스(Mycosphaerella melonis),

H: 퓨사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum),

I: 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea),

J: 피티움 울티멈(Phythium ultimum),

K: 보트리오사에리아 도티데아(Botryoshaeria dothidea),

L: 스클레로티니아 스클레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum)

도 2는 바실러스 서브틸리스 YS1의 방사선 감수성을 나타내는 그래프이고,

도 3의 A는 인산(phosphate) 농도에 따른 바실러스 서브틸리스 YS1의 생장곡선을 나타내는 그래프이고,

도 3의 B는 질소원(nitrogen source)에 따른 바실러스 서브틸리스 YS1의 생장곡선을 나타내는 그래프이고,

도 3의 C는 탄소원(carbon source)에 따른 바실러스 서브틸리스 YS1의 생장곡선을 나타내는 그래프이고,

도 3의 D는 온도에 따른 바실러스 서브틸리스 YS1의 생장곡선을 나타내는 그래프이고,

도 3의 E는 pH에 따른 바실러스 서브틸리스 YS1의 생장곡선을 나타내는 그래프이다.

Claims

항진균 활성을 가지는 미생물 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) YS1(수탁번호: KFCC 11265).
제 1항에 있어서, 상기 미생물은 50℃의 고온에서 생장가능한 호온성인 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 YS1.
제 1항의 미생물을 이용하여 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 리족토니아 솔라니 BP(Rhizoctonia solani BP), 알터나리아 솔라니(Alternaria solani), 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 피토프소라 캅시시(Pythophthora capsici), 콜렉토트리키움 글로에오스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides), 마이코스파렐라 멜로니스(Mycosphaerella melonis), 퓨사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 보트리티스 시네리아 (Botrytis cinerea), 피티움 울티멈(Phythium ultimum), 보트리오사에리아 도티데아(Botryoshaeria dothidea), 스클레로티니아 스클레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum)으로 이루어진 군중에서 선택되는 식물 병원성 진균의 생장을 억제하는 방법.
제 1항의 미생물을 이용하여 동물 병원성 진균인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 생장을 억제하는 방법.
제 1항의 미생물을 토양에 살포하는 것을 특징으로 하는 토양의 정화방법.
제 1항의 미생물 바실러스 서브틸리스 YS1의 돌연변이체로서 항진균 활성 및 포도당 분해효소(β-glucosidase) 및 리그닌 분해효소 활성이 증강된 바실러스 서브틸리스 YS1-1006(수탁번호: KCCM-10319)
제 1항의 미생물 바실러스 서브틸리스 YS1의 돌연변이체로서 병원성 진균에 대한 항진균 활성이 소실된 바실러스 서브틸리스 YS1-67(수탁번호: KCCM-10318).
(1) 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) YS1(수탁번호 KFCC 11265)에 방사선을 조사한 후 약 95%의 치사율을 보이는 방사선 조사선량에서 생존한 균체를 회수하는 단계;

(2) 상기 균체중에서 병원성 진균인 칸디다 알비칸스에 대하여 형태적 특징 및 항진균 활성에 변화가 보이는 균주를 선별하는 단계;

(3) 상기 단계 2에서 선별된 균주에 다시 방사선을 조사한 후 약 95%의 치사율을 보이는 방사선 조사선량에서 생존한 균체를 회수하는 단계; 및

(4) 상기 단계 3에서 회수된 균체중에서 병원성 진균인 칸디다 알비칸스에 대하여 항진균 활성이 소실된 균주를 선별하는 단계를 포함하는 제 6항 및 제7항의 돌연변이체의 제조방법.
제 8항에 있어서, 단계 1 또는 단계 3의 방사선은 자외선, X선 및 감마선으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 9항에 있어서, 상기 감마선은 ⁶⁰Co인 것을 특징으로 하는 제조방법.