CN104774866B - 拟南芥丝氨酸羟甲基转移酶基因与甲酸脱氢酶基因的双表达应用 - Google Patents
拟南芥丝氨酸羟甲基转移酶基因与甲酸脱氢酶基因的双表达应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104774866B CN104774866B CN201510133694.0A CN201510133694A CN104774866B CN 104774866 B CN104774866 B CN 104774866B CN 201510133694 A CN201510133694 A CN 201510133694A CN 104774866 B CN104774866 B CN 104774866B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- shmt
- tobacco
- gene
- fdh
- hcho
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 title claims abstract description 37
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 35
- 108010043428 Glycine hydroxymethyltransferase Proteins 0.000 title abstract description 25
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 title abstract description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 214
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 69
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 30
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 abstract description 139
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 abstract description 135
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 abstract description 37
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 29
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 29
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 abstract description 23
- 230000035882 stress Effects 0.000 abstract description 16
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 abstract description 13
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 abstract description 10
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 abstract description 8
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 abstract description 8
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 abstract description 6
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 abstract description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 6
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 abstract description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 2
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 abstract 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 43
- 229920003266 Leaf® Polymers 0.000 description 40
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 36
- 235000019256 formaldehyde Nutrition 0.000 description 34
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 30
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 102000002667 Glycine hydroxymethyltransferase Human genes 0.000 description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 17
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 17
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 description 10
- 101150086278 fdh gene Proteins 0.000 description 10
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 7
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 6
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 6
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 229930002868 chlorophyll a Natural products 0.000 description 5
- 229930002869 chlorophyll b Natural products 0.000 description 5
- NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M chlorophyll b Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C=O)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M 0.000 description 5
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 5
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 5
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 4
- -1 TDI Substances 0.000 description 4
- YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N acetylacetone Chemical compound CC(=O)CC(C)=O YRKCREAYFQTBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000006860 carbon metabolism Effects 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 3
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 3
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 3
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 3
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 3
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 3
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O HORQAOAYAYGIBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000877 Melamine resin Polymers 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N chloroform;3-methylbutan-1-ol Chemical compound ClC(Cl)Cl.CC(C)CCO BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- ORZHVTYKPFFVMG-UHFFFAOYSA-N xylenol orange Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC1=C(O)C(C)=CC(C2(C3=CC=CC=C3S(=O)(=O)O2)C=2C=C(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)C(O)=C(C)C=2)=C1 ORZHVTYKPFFVMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BGJSXRVXTHVRSN-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-trioxane Chemical compound C1OCOCO1 BGJSXRVXTHVRSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KXGFMDJXCMQABM-UHFFFAOYSA-N 2-methoxy-6-methylphenol Chemical compound [CH]OC1=CC=CC([CH])=C1O KXGFMDJXCMQABM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSTNYGQPCMXVAQ-KIYNQFGBSA-N 5,6,7,8-tetrahydrofolic acid Chemical compound N1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-KIYNQFGBSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 1
- 208000014085 Chronic respiratory disease Diseases 0.000 description 1
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 1
- 240000005250 Chrysanthemum indicum Species 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 206010067477 Cytogenetic abnormality Diseases 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 108010082495 Dietary Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000888214 Flaveria pringlei Serine hydroxymethyltransferase 1, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001040808 Homo sapiens Serine hydroxymethyltransferase, cytosolic Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 101710138460 Leaf protein Proteins 0.000 description 1
- 102000006404 Mitochondrial Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010058682 Mitochondrial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000002454 Nasopharyngeal Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102100021225 Serine hydroxymethyltransferase, cytosolic Human genes 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical class [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001807 Urea-formaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 206010000059 abdominal discomfort Diseases 0.000 description 1
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N anthrone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008425 anthrones Chemical class 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 231100000481 chemical toxicant Toxicity 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000549 coloured material Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- NKDDWNXOKDWJAK-UHFFFAOYSA-N dimethoxymethane Chemical compound COCOC NKDDWNXOKDWJAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000002481 ethanol extraction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- IVJISJACKSSFGE-UHFFFAOYSA-N formaldehyde;1,3,5-triazine-2,4,6-triamine Chemical compound O=C.NC1=NC(N)=NC(N)=N1 IVJISJACKSSFGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008236 heating water Substances 0.000 description 1
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000003859 lipid peroxidation Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 201000011216 nasopharynx carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000008816 organ damage Effects 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 229920001568 phenolic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000005011 phenolic resin Substances 0.000 description 1
- HKOOXMFOFWEVGF-UHFFFAOYSA-N phenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=CC=C1 HKOOXMFOFWEVGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940067157 phenylhydrazine Drugs 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- ODGAOXROABLFNM-UHFFFAOYSA-N polynoxylin Chemical compound O=C.NC(N)=O ODGAOXROABLFNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 102000005912 ran GTP Binding Protein Human genes 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 230000035807 sensation Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000011091 sodium acetates Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- FDRCDNZGSXJAFP-UHFFFAOYSA-M sodium chloroacetate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)CCl FDRCDNZGSXJAFP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010129 solution processing Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical class OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了拟南芥丝氨酸羟甲基转移酶基因与甲酸脱氢酶基因的双表达应用，本发明以拟南芥丝氨酸羟甲基转移酶SHMT基因cDNA构建植物表达载体，通过农杆菌介导转入烟草，检测正确后将拟南芥甲酸脱氢酶FDH基因cDNA所构建的植物表达载体通过农杆菌介导转入其中，获得插入两个外源基因SHMT/FDH的双表达转基因烟草，可提高植物对甲醛的吸收和耐受能力；实验结果表明双表达转基因烟草通过改变烟草叶绿素和可溶性糖含量而有效降低HCHO对植物的毒害，使转基因烟草叶片能在较高浓度HCHO胁迫下保持较好的HCHO吸收能；双表达转基因烟草能有效的降低氧化胁迫的发生，且这种效果比单表达转基因烟草更显著。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及拟南芥丝氨酸羟甲基转移酶SHMT基因与甲酸脱氢酶FDH基因的植物表达载体在制备吸收甲醛能力增强的双表达转基因植物中的应用。
背景技术
甲醛（HCHO）被广泛的用于化工合成﹑工业制造、医药合成等所涉及的化学领域及其他工业领域，尤其是在化学农药及其中间体合成领域甲醛有着举足轻重的作用。现代化学农药的生产过程中不能避免的要产生大量含甲醛的农药生产废水，这些农药生产废水中普遍含有大量的甲醛以及醇、苯、酚、三聚甲醛、甲缩醛等物质，由于废水中甲醛的存在使得其处理变得十分困难。而且按照国家标准《污水综合排放标准（GB8978-1996）》规定：二级排放标准的甲醛含量不得高于2mg/L，所以含甲醛的农药生产废水要直接排放不仅不符合环保要求，并且对动植物都具有严重的危害性。由于甲醛在工业生产中的用途很广，完全的限制是不现实的，所以必须对工业生产中甲醛废水进行无害化处理。另一方面随着生活质量的不断提高装修已成为现代生活的一部分，而装修所用的材料胶合板、细木工板、中密度纤维板和刨花板等含有大量HCHO，这是因为目前生产人造板材使用的多种胶粘剂比如脲醛树脂、三聚氰甲醛、胺基甲醛树酯、酚醛树脂等多以HCHO为主要成分，所以HCHO气体成为装修房间中空气污染的主要化学物质之一。
HCHO是一种广泛存在的有毒化学物质，它可以溶于水中以液态存在，也可以挥发成为气体以气态形式存在。HCHO可以被还原为甲醇也可以被氧化为甲酸，而这三种物质对生物都具有一定的毒性。其中HCHO由于含有羰基基团因此具有较强的亲电特征，其具有十分活泼的化学性质能与各种脂类、核酸和蛋白质发生非特异性反应，并能导致生物体内各种相关物质失去生物活性。HCHO对人和动物具有较强毒性，它能导致皮肤敏感并能引起皮肤炎症；HCHO也能进入呼吸系统并引起该系统出现变态反应，通过血液循环被运输到全身引起肺部病变、肝脏器官损伤、免疫调节能力下降等。如果我们长期使用含有HCHO的水，会引发胃部不适、免疫障碍、贫血以及引起神经性病变，会对生物体产生急性或慢性的危害。如果人们暂时留在含有低剂量HCHO气体的室内时会使人产生不舒服的感觉，而长时间呼吸微量的HCHO会导致慢性呼吸道疾病，鼻咽癌、结肠癌、脑癌、月经紊乱、妊娠综合症、新生儿染色体异常、细胞核的基因突变，DNA单链内交连和DNA与蛋白质交连、白血病、青少年记忆力和智力下降等。当房间内HCHO气体浓度升高时，可刺激人眼使人流眼泪并引起咽喉不适或疼痛。而人体接触更高浓度HCHO气体可引起咳嗽、恶心或肺水肿等不良反应，如果HCHO气体浓度达到30mg/m3时可致人死亡。相对于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、TDI、VOC等有害物质来说，甲醛具有潜伏周期长（3-15年）、隐藏深、分布广、易挥发、治理难、危害大等特性。
甲酸脱氢酶（FDH）和丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)是植物一碳代谢的两个关键酶，FDH可将甲酸氧化为CO2，SHMT介导Gly和Ser之间的相互转换。FDH和SHMT的表达可被多种非生物胁迫诱导，在植物响应非生物胁迫过程中发挥重要作用。在拟南芥甲醛代谢过程中FDH能将甲醛代谢产生的甲酸氧化为CO2，SHMT则催化Gly和5,10-13CH2-THF（四氢叶酸）的反应产生丝氨酸。FDH和SHMT的表达都受甲醛胁迫的诱导。丝氨酸（Ser）是拟南芥甲醛代谢的重要产物之一，但在烟草甲醛代谢过程没有产生Ser。本研究尝试利用PrbcS启动子在WT烟草叶片中过量表达拟南芥光呼吸途径的SHMT1产生SHMT转基因烟草，将烟草甲醛的碳代谢流引入Ser的合成，增强烟草对甲醛的抗性和吸收能力。
利用PrbcS启动子在SHMT转基因叶片中过量表达拟南芥甲酸代谢途径的FDH产生SHMT/FDH双转基因烟草，用13C-NMR分析转基因烟草对2mM和6mM液体甲醛的代谢机制，结果表明在转基因烟草叶片中SHMT和FDH的同时过量表达不能将甲醛的碳代谢流引入Ser的合成，但却能将甲醛的碳代谢流引入葡萄糖（[U-13C]Gluc）的合成，在烟草中引入了一条新的甲醛代谢途径。SHMT/FDH双转基因烟草叶片甲醛代谢产生[4-13C]Asn、[3-13C]Gln、[U-13C]OA和H13COOH的量大于FDH和SHMT单转基因烟草，说明甲醛胁迫下FDH和SHMT在转基因烟草叶片中的同时过量表达使烟草原有甲醛代谢途径的作用大大增强，这使得SHMT/FDH转基因烟草对液体甲醛的抗性和吸收能力比FDH和SHMT单转基因烟草的强。
发明内容
本发明的目的在于将拟南芥丝氨酸羟甲基转移酶SHMT基因的植物表达载体与甲酸脱氢酶FDH基因的植物表达载体在制备吸收甲醛能力增强的双表达转基因植物中的应用，其中丝氨酸羟甲基转移酶SHMT基因的GenBank登录号为6899944，甲酸脱氢酶FDH基因的GenBank登录号为6625952，制备含有拟南芥丝氨酸羟甲基转移酶基因(即SHMT基因)和甲酸脱氢酶基因（即FDH基因）的耐受甲醛的双表达转基因植物。
本发明所述的丝氨酸羟甲基转移酶基因SHMT的cDNA来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana），GenBank登录号为6899944，甲酸脱氢酶基因FDH的cDNA来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana），GenBank登录号为6625952。
本发明的上述目的是通过下述的技术方案得以实现的：
1、植物表达载体的构建
1.1 SHMT基因植物表达载体的构建
（1）从GenBank中查找拟南芥SHMT基因的cDNA序列，并设计序列如下的一对引物：
上游引物 5' GCATGCATGGCGATGGCCATGGCTCTTC 3'（含有SphI位点）；
下游引物 5' CTCGAGTTAGTTCTTGTACTTCATG 3'（含有XhoI位点）；
上游引物5'端形成SphI酶切位点；下游引物3'末端加XhoI酶切位点，以拟南芥第一链cDNA为模板扩增，通过PCR扩增得到SHMT基因的全长cDNA（1554bp）；
（2）回收并纯化SHMT全长基因cDNA片段，并将其连接到pMD-19T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD19-SHMT；
（3）构建入门载体pENTR-PrbcS-SHMT，用SphI和XhoI酶切pMD19-SHMT和pENTR-PrbcS-ADH，回收SHMT的cDNA片段和载体DNA片段pENTR，进行连接、转化感受态细胞，得到入门载体pENTR-PrbcS-SHMT；
（4）构建植物表达载体pK2-PrbcS-SHMT，通过Gateway技术的LR反应把SHMT亚克隆到植物表达载体pK2GW7中，获得SHMT基因的植物表达载体pK2-PrbcS-SHMT。
1.2 FDH基因植物表达载体的构建
（1）从GenBank中查找拟南芥FDH基因的cDNA序列，并设计序列如下的一对引物：
上游引物 5' GCATGCATGGCGATGAGACAAGCCGCTAAGG 3'（含有SphI位点）；
下游引物 5' CTCGAGTTACCGGTACTGAGGAGCAAGTTCA 3'（含有XhoI位点）
上游引物5'端加GCATGC特征序列，并由此形成SphI酶切位点；下游引物3'末端加XhoI酶切位点，以拟南芥第一链cDNA为模板扩增，通过PCR扩增得到FDH基因的全长cDNA（1155bp）；
（2）回收并纯化FDH全长基因cDNA片段，并将其连接到pMD-19T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD19-FDH；
（3）构建入门载体pENTR-PrbcS-T*-FDH，用SphI和XhoI酶切pMD19-FDH和pENTR-PrbcS-T*-GFP，回收FDH的cDNA片段和载体DNA片段pENTR，进行连接、转化感受态细胞，得到入门载体pENTR-PrbcS-T*-FDH；
（4）构建植物表达载体pH2-PrbcS-T*-FDH，通过Gateway技术的LR反应把FDH亚克隆到植物表达载体pH2GW7中，获得FDH基因的植物表达载体pH2-PrbcS-T*-FDH。
本发明的植物表达载体对那些能实施转基因操作的植物都适用，如烟草、拟南芥、矮牵牛、非洲菊等。在本发明的实施中以烟草为例说明该表达载体的应用过程。
2、烟草的转化
采用电转化转化质粒pK2-PrbcS-SHMT进入农杆菌感受态细胞，涂布在Spe平板上生长两天后，用菌落PCR检测质粒是否转化到农杆菌中。PCR扩增用SHMT的上下游引物， 扩增片段理论长度为1.6kb，PCR产物经电泳检测显示与理论值相符，表明质粒已转入农杆菌中。制备烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)的无菌苗，通过农杆菌介导，用叶盘法转化烟草，然后通过组织培养获得小苗，筛选具有卡那霉素（Km）抗性植株，将其转移到MS培养基（含有3%蔗糖）上继续培养，从而获得无菌的转基因烟草植株。
以已经成功筛选出的过量表达拟南芥SHMT烟草作为受体，将pH2-PrbcS-T*-FDH植物表达载体转入农杆菌（A.tumefaciens C58C1，pMP90）中。使用植物叶盘法由农杆菌介导将pH2-PrbcS-T*-FDH植物表达载体转化进入已经检测正确的过量表达拟南芥SHMT烟草中。转化完成后的叶盘置于25℃恒定光照（100μmol∙m-2∙s-1）下进行培养，转基因小苗需在含有卡那霉素（Km，50μg/ml）和潮霉素（Hyg，20μg/ml）的双抗性培养基上进行筛选，所得的再生苗中就有过量表达拟南芥SHMT/FDH烟草。
3、SHMT/FDH基因插入情况的检测
为了检测目的基因SHMT/FDH是否插入有卡那霉素和潮霉素抗性植株烟草的基因组，以抗性苗的基因组为模板，利用SHMT和FDH上下游引物做PCR检测，PCR扩增产物片段理论长度分别为1.6kb和1.2kb，PCR产物经电泳检测显示与理论值相符，说明目的基因SHMT/ FDH已插入到烟草基因组中。
4、SHMT/FDH基因转录水平的检测
为了检测目的基因SHMT/FDH在双表达转基因烟草中是否转录，提取抗性苗RNA，利用SHMT和FDH上下游引物进行RT-PCR检测，RT-PCR扩增片段理论长度分别为1.6kb和1.2kb，RT-PCR产物经电泳检测显示与理论值相符，说明目的基因SHMT/FDH已在转基因烟草中正常转录。
5、SHMT/FDH基因表达水平的检测
为了检测目的基因SHMT和FDH编码的蛋白在双表达转基因烟草中是否表达，选取经RT-PCR检测正确的转基因株系的嫩叶，提取总蛋白进行Western分析，一抗分别为SHMT和FDH的鼠抗体。根据SHMT和FDH基因的核酸序列推测表达的蛋白大小分别约为57.2kDa和42.1kDa，Western分析结果检测到的蛋白质条带大小与理论预测值相符，说明SHMT和FDH编码的蛋白在烟草中已成功表达。
6、转基因烟草甲醛吸收能力检测
根据蛋白表达水平，选择高表达的转基因株系进行甲醛吸收能力检测，分别用2、4、6mM HCHO溶液处理野生型烟草（WT）植株、SHMT转基因烟草和SHMT/FDH转基因烟草植株0、6、12、18、24、30、36、42和48 h，检测处理液中剩余HCHO的含量。
结果发现在2mM HCHO溶液中过量表达拟南芥SHMT烟草及过量表达拟南芥SHMT/ FDH烟草其吸收HCHO的能力较为相似，均略高于野生型的烟草，尤其是在24 h后过量表达拟南芥SHMT烟草及过量表达拟南芥SHMT/FDH烟草的HCHO吸收速度均明显快于野生型，其中以过量表达SHMT/FDH烟草的HCHO吸收速度最快。但是到48 h后无论是两种转基因烟草还是野生型烟草均将2mM HCHO溶液中的HCHO吸收完毕。
4mM HCHO溶液处理时，两种转基因烟草和野生型烟草其吸收曲线整体趋势相似，但是在24 h后野生型烟草及过量表达拟南芥SHMT烟草的HCHO吸收速度有一个明显的下降，而过量表达拟南芥SHMT/FDH双基因的烟草只出现了略微的下降，而且48 h后两种转基因烟草已经将溶液中所有HCHO吸收完毕，但野生型烟草所在的溶液中还残余8.3%的HCHO。
6mM HCHO处理时，过量表达拟南芥SHMT/FDH烟草吸收曲线的斜率明显高于野生型烟草以及过量表达拟南芥SHMT烟草，这些结果表明在烟草中过量表达拟南芥SHMT基因及过量表达拟南芥SHMT/FDH双基因增强了烟草对液体HCHO的吸收能力，并且过量表达拟南芥SHMT/FDH双基因的烟草对HCHO的吸收能力最强。
7、转基因烟草对甲醛的抗性检测
（1）叶绿素含量的测定：2mM液体HCHO胁迫并没有严重的损伤各植株的光合作用，叶片还保持较高的生命活力，这个结果与2mM液体HCHO胁迫下野生型烟草和这两种转基因烟草的HCHO吸收能力相一致，但是当HCHO胁迫的浓度提高到6mM时，烟草中过量表达拟南芥SHMT及过量表达拟南芥SHMT/FDH能有效降低HCHO对植物的毒害作用，使得转基因烟草的叶片能在较高浓度HCHO胁迫下保持较好的HCHO吸收能力。
（2）可溶性糖和总蛋白含量的测定：野生型和两种转基因植株对于2mM液体HCHO均具有一定耐受性，同时2mM液体HCHO胁迫也没有导致可溶性总蛋白的显著性变化，当6mM液体HCHO胁迫48小时后，野生型的可溶性总糖含量相对于未处理时没有显著性变化，而两种转基因植株的可溶性总糖含量却发生了显著上升，且由于过量表达拟南芥SHMT/FDH烟草对于HCHO胁迫的耐受性明显强于野生型和过量表达拟南芥SHMT烟草，所以其总蛋白含量还维持在较高水平。
（3）过氧化氢（H2O2）、丙二醛（MDA）和羰基化蛋白（PC）含量的测定：高浓度HCHO处理后H2O2含量上升说明烟草细胞受到氧化损伤，而在烟草中过量表达拟南芥SHMT基因和过量表达SHMT/FDH双基因均可以减轻烟草细胞所受到的这种氧化损伤，2 mM HCHO处理48 h后MDA、PC含量在野生型和两种转基因植株叶片中并未出现显著性变化，但是在6 mM HCHO处理48 h后野生型植株叶片中MDA、PC含量分别出现了39.8%和22.5%的极显著性升高。说明高浓度HCHO胁迫会导致烟草中膜脂过氧化和蛋白质过氧化水平都显著性升高，但是通过烟草中过量表达拟南芥SHMT基因和过量表达拟南芥SHMT/FDH基因能有效的降低这种氧化胁迫的发生。
实验结果表明本发明的重组载体pK2-PrbcS-SHMT在转基因植株中的应用可提高其对甲醛的吸收速率和抗性，且SHMT/FDH双表达转基因植物的甲醛吸收速率和抗性较SHMT单表达转基因植物更高。
附图说明
图1为本发明中pMD19-SHMT的克隆策略示意图；
图2为本发明中入门载体pENTR-PrbcS-SHMT的克隆策略示意图；
图3为本发明中植物表达载体pK2-PrbcS-SHMT的克隆策略示意图；
图4为本发明中 pMD19-T-FDH的克隆策略示意图；
图5为本发明中入门载体pENTR-PrbcS-T*-FDH的克隆策略示意图；
图6为本发明中植物表达载体pH2-PrbcS-T*-FDH的克隆策略示意图；
图7 为本发明中SHMT基因在转基因烟草中的整合、转录和表达的检测电泳图；其中A图：SHMT基因在转基因烟草基因组中整合情况检测，以pK2-PrbcS-SHMT质粒为模板为正对照（PC），以野生型烟草基因组模板为负对照（WT）；B图：SHMT基因在转基因烟草中转录水平检测电泳图，以pK2-PrbcS-SHMT质粒为模板为正对照（PC），以野生型烟草基因组模板为负对照（WT）；C图：SHMT蛋白在转基因烟草中表达水平检测，以提取的拟南芥中总蛋白为正对照（PC），提取的野生型烟草中总蛋白为负对照（WT）；D图：提取5号和6号转基因烟草的线粒体和细胞质蛋白进行SHMT蛋白的定位分析；图中1~6为抗生素筛选的转基因烟草；
图8为本发明中 SHMT基因和FDH基因在过量表达拟南芥SHMT/FDH烟草中整合情况的检测；其中A图：SHMT基因在转基因烟草基因组中整合情况检测；B图：SHMT基因在转基因烟草中转录水平检测；C图：FDH蛋白在转基因烟草中表达水平检测；D图：FDH基因在转基因烟草中转录水平检测；图中1~7为双抗素筛选的转基因烟草；
图9为本发明中 SHMT基因和FDH基因在过量表达拟南芥SHMT/FDH烟草中表达水平和定位的检测；其中A图：FDH基因在转基因烟草中表达水平检测；B图：FDH基因在转基因烟草中表达水平检测；C图：SHMT蛋白定位于细胞质、线粒体；FDH蛋白定位于叶绿体；图中6~8为双抗素筛选的转基因烟草；
图10为本发明中WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草在2mM甲醛处理时溶液中剩余HCHO含量百分比及叶片吸收液体HCHO曲线；其中A图：2mM溶液中剩余HCHO含量占起始HCHO含量的百分比，CK空白对照为未放入任何植物叶片的2mM HCHO溶液用于监测HCHO的挥发；B图：2mM植物净吸收HCHO量占起始HCHO含量的百分比；
图11为本发明中WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草在4mM甲醛处理时溶液中剩余HCHO含量百分比及叶片吸收液体HCHO曲线；其中A图：4mM溶液中剩余HCHO含量占起始HCHO含量的百分比，CK空白对照为未放入任何植物叶片的4mM HCHO溶液用于监测HCHO的挥发；B图：4mM植物净吸收HCHO量占起始HCHO含量的百分比；
图12为本发明中WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草在6mM甲醛处理时溶液中剩余HCHO含量百分比及叶片吸收液体HCHO曲线；其中A图：6mM溶液中剩余HCHO含量占起始HCHO含量的百分比，CK空白对照为未放入任何植物叶片的6mM HCHO溶液用于监测HCHO的挥发；B图：6mM植物净吸收HCHO量占起始HCHO含量的百分比；
图13为本发明中液体HCHO胁迫下WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中叶绿素a含量变化情况；其中A图：2mM HCHO溶液处理0h和48h时WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中叶绿素a含量；B图：6mM HCHO溶液处理0h和48h时WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中叶绿素a含量；WT为野生型烟草；
图14为本发明中液体HCHO胁迫下WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中叶绿素b含量变化情况；其中A图：2mM HCHO溶液处理0h和48h时WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中叶绿素b含量；B图：6mM HCHO溶液处理0h和48h时WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中叶绿素b含量；WT为野生型烟草；
图15为本发明中液体HCHO胁迫下WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中总叶绿素含量变化情况；其中A图：2mM HCHO溶液处理0h和48h时WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中总叶绿素含量；B图：6mM HCHO溶液处理0h和48h时WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中总叶绿素含量；WT为野生型烟草；
图16为本发明中液体HCHO胁迫下WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中可溶性总糖含量变化情况；其中A图：2mM HCHO溶液处理0h和48h时WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中可溶性总糖含量；B图：6mM HCHO溶液处理0h和48h时WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中可溶性总糖含量；WT为野生型烟草；
图17为本发明中液体HCHO胁迫下WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中可溶性总蛋白含量变化情况；其中A图：2mM HCHO溶液处理0h和48h时WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中可溶性总蛋白含量；B图：6mM HCHO溶液处理0h和48h时WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中可溶性总蛋白含量；WT为野生型烟草；
图18为本发明中液体HCHO胁迫下WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中H2O2含量变化情况；其中A图：2mM HCHO溶液处理0h和48h时WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中H2O2含量；B图：6mM HCHO溶液处理0h和48h时WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中H2O2含量；WT为野生型烟草；
图19为本发明中液体HCHO胁迫下WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中MDA含量变化情况；其中A图：2mM HCHO溶液处理0h和48h时WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中MDA含量；B图：6mM HCHO溶液处理0h和48h时WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中MDA含量；WT为野生型烟草；
图20为本发明中液体HCHO胁迫下WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中PC含量变化情况；其中A图：2mM HCHO溶液处理0h和48h时WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中PC含量；B图：6mM HCHO溶液处理0h和48h时WT、SHMT和SHMT/FDH转基因烟草叶片中PC含量；WT为野生型烟草。
具体实施方式
试剂与仪器：
试剂主要分为分子生物学实验试剂、植物遗传转化所需的培养基以及转基因植物鉴定和检测所需的各种试剂；各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP、质粒提取试剂盒等为宝生物工程有限公司(大连)产品，TRIzoL Reagent RNA提取试剂盒、Gateway LR clonase Enzyme Mix kit购自Invitrogen公司；其余试剂均为国产分析纯。
仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。
所有引物序列均在大连宝生物公司合成。
本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1：SHMT/FDH基因cDNA的PCR扩增及TA克隆
用TRIzoL Reagent（Invitrogen）从拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗中提取总RNA，取植物嫩叶约0.1g，加入1ml的TRIzoL提取液在研钵中研磨，室温静置5min后移入离心管，再加入0.2ml氯仿，振荡混匀，离心15min（12000rpm），转移上清液至新管，加入0.5ml异丙醇，混匀室温放置10min，4℃离心10min（12000rpm），弃上清，沉淀用75％乙醇1ml清洗，4℃离心5min（7500rpm），弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20μl焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水溶解RNA。使用M-MuLV Reverse Transcriptase Kit（TaKaRa）进行cDNA的合成，取植物总RNA约0.1μg-5μg，oligo(dT) 50ng，10mM dNTP mix 1μl，用DEPC处理水补足至10μl，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5min，冰浴10min，加入反应混合物9μl（5×reaction buffer 4μl，25mM MgCl2 4μl，0.1M DTT 2μl，RNA酶抑制剂1μl），将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温2min，加入1μl M-MuLV ReverseTranscriptase，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温20min，然后42℃保温70min，合成cDNA。
从GenBank中查找拟南芥SHMT基因的cDNA序列（1554bp），并设计序列如下的一对引物：上游引物 5' CACCGCATGCCGATGGCCATGGCTCTTC 3'（含有SphI位点）；下游引物 5'CTCGAGTTAGTTCTTGTACTTCATG 3'（含有XhoI位点）；从GenBank中查找拟南芥FDH基因的cDNA序列（1155bp），并设计序列如下的一对引物：上游引物 5'GCATGCATGGCGATGAGACAAGCCGCTAAGG 3'（含有SphI位点）；下游引物 5'CTCGAGTTACCGGTACTGAGGAGCAAGTTCA 3'（含有XhoI位点）
以cDNA为模板，用SHMT基因cDNA上下游特异性引物进行PCR，扩增得到SHMT的全长cDNA 1554bp。回收并纯化SHMT全长基因片段，并将其连接到pMD-19T (大连宝生物公司)载体上（图1），转化大肠杆菌感受态DH5α（天根生化科技），采用碱裂解法提取质粒DNA，经1％琼脂糖凝胶电泳，选取大小和理论值相符的重组质粒做进一步的PCR检测和双酶切检测。以重组质粒为模板，用引物5'和3'引物扩增得到1554bp的PCR产物。根据阳性重组质粒pMD19-SHMT载体两端的多克隆位点，用EcoR I单酶切重组质粒，经1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重组质粒pMD19-SHMT单酶切产物理论上为2.7kb和1.6kb左右的条带。
FDH基因以同样的方式进行cDNA的扩增与TA克隆（图4），连接成功的重组质粒pMD19T-FDH单酶切产物理论上为2.7kb和1.2kb左右的条带。
实施例2：构建入门载体pENTR-PrbcS-SHMT与pENTR-PrbcS-T*-FDH
用SphI和XhoI双酶切pMD19-SHMT和pENTR-PrbcS-ADH，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，分别回收pMD19-SHMT被切割后产生的SHMT基因的cDNA片段（1.6kb）和pENTR-PrbcS-ADH被切割后产生的载体片段pENTR-PrbcS，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pENTR-PrbcS和SHMT基因的cDNA片断产生入门载体pENTR-PrbcS- SHMT（图2）。用连接反应混合物转化高效率（108）的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，购自天根生化科技公司)，把转化好的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Km，50μg/ml)的平板上，于37℃过夜培养，筛选Km抗性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中提取质粒，选出连接成功的质粒载体pENTR-PrbcS-SHMT。以pENTR-PrbcS-SHMT为模板，利用SHMT基因上下游引物进行PCR扩增，扩增结果得到约1.6kb左右的条带。用SphI（Takara）和Xho I（Takara）双酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上只产生两条带，分别为约4.7kb和1.6kb。确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pENTR-PrbcS-SHMT。
FDH基因以同样的方式构建入门载体pENTR-PrbcS-T*-FDH（图5），SphI（Takara）和Xho I（Takara）双酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上只产生两条带，分别为约4.7kb和1.2kb
实施例3：构建植物表达载体pK2-PrbcS-SHMT和pH2-PrbcS-T*-FDH
通过Gateway技术的LR反应把SHMT亚克隆到植物表达载体pK2GW7中（图3）。用质粒抽提试剂盒纯化Gateway的目的载体pK2GW7，在Gateway的LR反应体系中加pENTR-PrbcS-SHMT和pK2GW7各150ng，1μl LR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogen)，混均于25℃反应过夜，通过整合酶作用把SHMT整合到pK2GW7中获得SHMT的植物表达载体质粒pK2-PrbcS-SHMT。反应混合物用于转化高效率（108）大肠杆菌感受态细胞(DH5α，购自天根生化科技公司)，把转化好的大肠杆菌涂于加有壮观霉素(Spe，50μg/ml)的平板上，37℃过夜培养，筛选Spe抗性重组子菌落。从Spe抗性重组子菌落中提取质粒，选出大小和对照质粒pK2GW7相似的整合成功的质粒pK2-PrbcS- SHMT进行PCR检测，以pENTR-PrbcS-SHMT为正对照模板，pK2GW7为负对照模板。pK2-PrbcS-SHMT和pENTR-PrbcS-SHMT扩增产物均出现约1.6kb的条带，负对照没有扩增产物。进一步用酶切验证重组质粒的正确性，用SphI和XhoI酶切检测pK2-PrbcS-SHMT，酶切结果得到4.7kb和1.6kb左右的两条带。确认是整合成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。pK2GW7携带的筛选标记基因为卡那霉素抗性基因（Km），这样可用加有卡那霉素的平板筛选转基因植物。
FDH基因以同样的方式构建植物表达载体pH2-PrbcS-T*-FDH（图6），用SphI和XhoI酶切检测pH2-PrbcS-T*-FDH，酶切结果得到4.7kb和1.2kb左右的两条带。确认是整合成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。pH2GW7携带的筛选标记基因为潮霉素抗性基因（Hyg），这样可用加有潮霉素的平板筛选转基因植物。
实施例4：用植物表达载体转化农杆菌
制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体pK2-PrbcS-SHMT转入农杆菌（Agrobacterium tumefaciens C58C1，pMP90）中，在加有壮观霉素的平板上筛选转化子。取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀；将混合物加入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混和液落至杯底；将电转化杯置于电转化仪(BIO-RAD)滑槽中，用1mm的电击杯和200欧姆，2.5kV/0.2cm的参数进行电击，电击后立即取出电转化杯,迅速加入0.5mlSOC培养基，混匀，转移到1.5ml的离心管中；28℃, 200rpm摇床培养3-5h；室温下，7500rpm离心1min，弃大部分上清，保留100ml将细胞悬浮；把农杆菌涂布于有壮观霉素(Spe，50mg/ml)的LB固体培养基上，28℃培养2天获得单菌落；首先用牙签挑取农杆菌菌落放入20μl ddH2O中，98℃处理5分钟后取出10μl农杆菌裂解液作为PCR反应的模板。PCR检测pK2-PrbcS- SHMT转化结果，正对照扩增体系模板使用pENTR-PrbcS-SHMT质粒，负对照使用pK2GW7质粒，扩增片断理论长度约为1.6kb，PCR产物经电泳分析显示其片段大小与理论预测值相符，表明质粒已转入农杆菌。
以同样的方法将FDH的植物表达载体pH2-PrbcS-T*-FDH转入农杆菌（Agrobacterium tumefaciens C58C1，pMP90）中并检验质粒是否成功转入农杆菌，扩增片断理论长度约为1.2kb。
实施例5：用含有植物表达载体的农杆菌转化烟草
挑取携带有质粒pK2-PrbcS-SHMT的农杆菌单菌落接种于50ml的LB培养基中（含Spe，100μg/ml），180rpm，28℃培养24h，待菌液OD600至1.0左右，离心10min（3000rpm），沉淀菌体。再用10ml左右的MS液体培养基悬浮，离心10min（3000rpm），沉淀菌体。重复以上操作2～3次。最后加入一定体积的MS液体培养基重悬浮，使菌体的OD600值为0.5。制备烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)的无菌苗，通过农杆菌介导，用叶盘法转化烟草，然后通过组织培养获得小苗，进一步筛选获得所需的转基因植物。把无菌烟草的叶片切成小片叶盘，在制备好的农杆菌菌液中浸染15~20min，用无菌吸水纸吸干后，平铺于愈伤组织诱导培养基MS1（MS+NAA02.1μg/ml+BAP 0.02μg/ml）上黑暗共培养2天，将外植体转移至含卡那霉素(50μg/ml)的芽诱导培养基MS4（MS+NAA0.53μg/ml+BAP0.5μg/ml）上进行芽的诱导，约15天继代一次。待有芽生成后，转入含卡那霉素(50μg/ml)的MS培养基上进行根的诱导。
以同样的方法用含有FDH植物表达载体pH2-PrbcS-T*-FDH的农杆菌转化进入已经检测正确的过量表达拟南芥SHMT基因烟草中。转化完成后的叶盘置于25℃恒定光照（100μmol∙m-2∙s-1）下进行培养，转基因小苗需在含有卡那霉素（Km，50μg/ml）和潮霉素（Hyg，20μg/ml）的双抗培养基上进行筛选，所得的再生苗中就有过量表达拟南芥SHMT/FDH烟草。
实施例6：SHMT与SHMT/FDH基因在转基因烟草中插入情况及表达水平的检测
为了确认通过卡那霉素筛选的转基因烟草株系确实含有导入的目的基因DNA片段，用PCR方法对筛选到的转基因烟草作进一步的鉴定。首先采用CTAB法提取植物基因组：称取植物叶片100mg左右置于1.5ml离心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末状；加入900μl预热到65℃的2×CTAB缓冲液（Tris-HCl pH 7.5 100mM，EDTA 20mM，NaCl 1.4M，CTAB 2%），65℃度水浴加热20分钟后取出冷却；加入500μl氯仿-异戊醇混合液（24：1）摇匀，4℃离心10min（7500rpm）后转移上清至1.5ml EP管；再次加入500μl氯仿-异戊醇混合液（24：1）摇匀，4℃离心10min（7500rpm）；取出上清置于新的EP管中，加入1/10体积3M pH5.2 醋酸钠和等体积异丙醇，摇匀后4℃离心20min（12000rpm）；弃上清，用75％乙醇清洗两次后，干燥，用含RNase的TE缓冲液溶解并降解RNA，获得的基因组DNA样品。以转SHMT烟草抗性苗基因组作为模板，用SHMT基因上下游引物进行PCR扩增检测SHMT是否插入烟草基因组。扩增产物大小约为1.6kb，和预期推测一致，说明目的基因均已插入这些转基因株系的基因组，野生型烟草基因组PCR产物未出现目标条带（图7A）。
为了考察目的基因在转基因烟草株系中的转录情况，从转基因植物中抽取总RNA，反转录成cDNA后用于RT-PCR分析，检测SHMT基因在转基因植物中的转录水平。采用TRIzoLReagent（Invitrogen）提取RNA，取植物嫩叶约0.1g，加入1ml的TRIzoL提取液在研钵中研磨，室温静置5min后移入离心管，再加入0.2ml氯仿，振荡混匀，离心15min（12000rpm），转移上清液至新管，加入0.5ml异丙醇，混匀室温放置10min，4℃离心10min（12000rpm），弃上清，沉淀用75％乙醇1ml清洗，4℃离心5min（7500rpm），弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20μl焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水溶解RNA。所获得的RNA样品用凝胶电泳检测质量和浓度。使用Reverse Transcriptase进行cDNA的合成，取植物总RNA约0.1μg-5μg，oligo(dT) 50ng，10mM dNTP mix 1μl，用DEPC处理水补足至10μl，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5min，冰浴10min，加入反应混合物9μl（5×reaction buffer 4μl，25mM MgCl2 4μl，0.1M DTT 2μl，RNA酶抑制剂1μl），将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温2min，加入1μl M-MuLV Reverse Transcriptase，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温20min，然后42℃保温70min，合成cDNA。以cDNA为模板，用SHMT基因的上下游引物进行RT-PCR分析，考察转基因烟草中是否有目的基因的转录物。结果证明转基因烟草植株均有目的基因的转录物，而野生型的烟草则没有，说明目的基因SHMT已在转基因烟草中正常转录（图7B）。
为了检测目的基因SHMT编码的蛋白在烟草中是否表达，选取经RT-PCR检测正确的转基因株系的嫩叶，提取总蛋白进行Western分析。一抗为SHMT的蛋白抗体。根据SHMT基因的核酸序列推测表达的蛋白大小约为57.2kD，Western分析结果说明检测到的蛋白质条带大小与理论预测值相符，说明SHMT编码的蛋白在烟草中已成功表达（图7C），定为分析为线粒体蛋白与细胞质蛋白（图7D）。
以同样的方法检测SHMT/FDH双表达转基因烟草中SHMT和FDH基因的插入情况（图8A、C）及表达水平（图8B、D），SHMT和FDH基因理论扩增产物大小分别约1.6kb和1.2kb，蛋白大小分别约为57.2和42.1（图9）。
实施例7：转基因烟草对液体甲醛吸收能力的测定
甲醛可与Nash试剂（醋酸氨：15%，冰醋酸：0.3%，乙酰丙酮：0.2%）发生化学反应产生有颜色的物质，该物质的最大吸收波长为410nm，因此可以制备标准曲线，根据HCHO-Nash标准曲线即可计算出反应液中甲醛的含量，利用该方法可以测定植物对甲醛的吸收速率。
为了检测过表达拟南芥SHMT基因和双表达拟南芥SHMT/FDH基因后对烟草吸收液体HCHO能力的影响，我们分别称取3g野生型和两种转基因烟草小苗叶片，然后分别加入100mL的HCHO处理液2mM（2 mmol L-1, 5 mmol L-1 KHCO3 和 0.1%MES），4 mM（4 mmol L-1, 5mmol L-1 KHCO3 和 0.1%MES），6 mM（6 mmol L-1, 5 mmol L-1 KHCO3 和 0.1%MES）。同时以只含同样处理液的培养瓶（透气孔封死）作为对照，检测HCHO的挥发程度。所有样品均在25℃条件下持续光照并振荡培养（100 μmol∙m-2∙s-1/80 rpm）。在6、12、18、24、30、36、42、48h分别取50μl处理液，加Nash试剂450ml，再加水500ml于30℃水浴30min，测定OD410，再根据标准曲线计算出处理液残存甲醛浓度，及叶片吸收甲醛百分比。结果表明在烟草中过量表达拟南芥的SHMT基因和双表达拟南芥SHMT/FDH基因增强了烟草对液体HCHO的吸收速率，而且过量表达拟南芥SHMT/FDH双基因的烟草对HCHO的吸收能力更强（图10、11、12）。
实施例8：转基因烟草对甲醛的抗性检测
（1）叶绿素含量的测定：HCHO溶液处理烟草叶片结束后用预冷无菌蒸馏水冲洗叶片4~5次，纸巾吸干叶片表面残留的蒸馏水，95%乙醇提取叶绿素，紫外分光光度法测定665nm和649nm处的光吸收值A665和A649，根据下述公式计算得到叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量（图13、14、15）。其中叶绿素a（Ca（mg/L））＝13.95×A665－6.88×A649；叶绿素b（Cb（mg/L））＝24.96×A649-7.32×A665；总叶绿素浓度C（a+b）＝Ca＋Cb。叶绿素含量（mg/gF.W.）＝（色素浓度×提取液体积×稀释倍数）/（样品鲜重×1000）。
（2）取HCHO处理后的叶片0.5 g用植物蛋白提取液（50 mM This-HCl、10%甘油、10mMβ-巯基乙醇、1 mM PMSF、2 mM EDTA、10%不溶性PVP）进行抽提，所获得的抽提液可用于可溶性总蛋白含量的测定及分析。可溶性总糖含量采用蒽酮比色法测定：分别吸取葡萄糖溶液（0.4μg/μl）0、40、80、120、160、200μl，为了让终体积达到200 μl，每个体系中另加入ddH2O补足，至此可溶性糖含量可分别达到0、16、32、48、64、80μg。向每管加入1 ml蒽酮，待混合反应后，放入沸水浴中加热10 min，冰上迅速冷却后，分光光度计测625 nm处光吸收值，记OD625，制作的标准曲线回归方程为y=41.077x+0.0331（其中x：OD625，y：可溶性糖的浓度（mg/ml），R2=0.9957），之后开始配制样品的反应体系（20μL抽提液＋180μL ddH2O＋1ml蒽酮），同样读取625nm处的光吸收值OD625，套入标准曲线公式中，计算出可溶性总糖含量（图16）。采用Bradford法测定可溶性蛋白含量：取2μl蛋白的抽提液加入800μL H2O、200μLBradford solution混合均匀后，在室温放置2min，用分光光度计读取595nm处的光吸收值OD595，代入标准曲线y=32.594x-0.224（其中x：OD595，y：蛋白含量（μg），R2=0.9995），计算出蛋白的含量。根据上样量计算可溶性总蛋白含量（图17）。
（3）取HCHO处理后的叶片0.5 g用液氮速冻后充分研磨，This-HCl缓冲液（1 mol/L，pH 7.5）充分抽提，抽提液可用于可溶性糖以及各项氧化胁迫相关生理指标的测定及分析。过氧化氢（H2O2）的含量的测定我们采用二甲酚橙法。用MiliQ水来配制试剂A（3.3mMFeSO4，3.3mM (NH4)2SO4，412.5mM H2SO4）与试剂B（165μM二甲酚橙，165mM山梨醇）。使用前需将试剂A与试剂B按照1：10的比例混合后成为工作试剂。此工作试剂和H2O2待测液按照2：1的比例混合后，水浴30℃显色30min后，测定其560nm处光吸收值OD560，参照标准曲线y=0.1734x-0.0055（x：H2O2浓度（mg/mL），y：OD560，R2=0.9995）计算H2O2含量（图18）。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法来测定。在0.4mL含有0.6% TBA（硫代巴比妥酸）20% TCA（三氯乙酸）的溶液中加入0.4mL抽提液，沸水浴15min后即刻置于冰上冷却。(12000 rpm/10min)，读上清液的光吸收值OD532和OD450。代入公式中：MDA浓度（μmol·L-1）= 6.45∙OD532-0.56∙OD450从而计算 MDA的浓度（图19）。羰基化蛋白（PC）的含量的测定，我们采用2，4-二硝基苯肼（DNPH）法。将0.1 mL样品抽提液与0.4mL 10mM的DNPH的溶液混合后，黑暗处反应1h，其间每隔10 min摇一次，后加入0.5mL 的20% TCA溶液用来沉淀蛋白，(12000 rpm /15min)，后弃上清。沉淀用1 mL乙酸/乙酸乙酯混合液（乙酸：乙酸乙酯=1：1，V/V）洗三次，后加入盐酸胍（1.25mL 6M）充分的溶解沉淀，金属浴（37℃15 min）后测定370nm处的光吸收值OD370。PC浓度（mol/L）=（测定管吸光度-空白管吸光度）×（稀释体积）/22（22为PC毫摩尔消光系数）（图20）。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 拟南芥丝氨酸羟甲基转移酶基因与甲酸脱氢酶基因的双表达应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caccgcatgc cgatggccat ggctcttc 28
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctcgagttag ttcttgtact tcatg 25
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcatgcatgg cgatgagaca agccgctaag g 31
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctcgagttac cggtactgag gagcaagttc a 31
Claims (1)
1.拟南芥丝氨酸羟甲基转移酶SHMT基因的植物表达载体与甲酸脱氢酶FDH基因的植物表达载体在制备吸收甲醛能力增强的双表达转基因植物中的应用，其中丝氨酸羟甲基转移酶SHMT基因的GenBank登录号为6899944，甲酸脱氢酶FDH基因的GenBank登录号为6625952。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510133694.0A CN104774866B (zh) | 2015-03-26 | 2015-03-26 | 拟南芥丝氨酸羟甲基转移酶基因与甲酸脱氢酶基因的双表达应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510133694.0A CN104774866B (zh) | 2015-03-26 | 2015-03-26 | 拟南芥丝氨酸羟甲基转移酶基因与甲酸脱氢酶基因的双表达应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104774866A CN104774866A (zh) | 2015-07-15 |
| CN104774866B true CN104774866B (zh) | 2017-11-10 |
Family
ID=53616636
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510133694.0A Expired - Fee Related CN104774866B (zh) | 2015-03-26 | 2015-03-26 | 拟南芥丝氨酸羟甲基转移酶基因与甲酸脱氢酶基因的双表达应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104774866B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115927453B (zh) * | 2023-01-31 | 2023-11-24 | 昆明理工大学 | 苹果酸脱氢酶基因在提高植物甲醛吸收代谢能力中的应用 |
| CN115851826B (zh) * | 2023-01-31 | 2023-11-24 | 昆明理工大学 | 谷氨酰胺合成酶在提高植物甲醛吸收代谢能力中的应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000225000A (ja) * | 1999-02-03 | 2000-08-15 | Feather Glass:Kk | ホルムアルデヒド脱水素酵素固定フィルター |
| CN101165172A (zh) * | 2007-10-15 | 2008-04-23 | 广西大学 | 一种重组甲基营养杆菌及其应用 |
-
2015
- 2015-03-26 CN CN201510133694.0A patent/CN104774866B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000225000A (ja) * | 1999-02-03 | 2000-08-15 | Feather Glass:Kk | ホルムアルデヒド脱水素酵素固定フィルター |
| CN101165172A (zh) * | 2007-10-15 | 2008-04-23 | 广西大学 | 一种重组甲基营养杆菌及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Overexpression of formate dehydrogenase in Arabidopsis thaliana resulted in plants tolerant to high concentrations of formate;Rong Li等;《Journal of Plant Physiology》;20021031;第159卷(第10期);摘要，第1073页图4 * |
| 植物丝氨酸羟甲基转移酶基因研究进展;马莉等;《生物技术通报》;20081231(第2期);全文 * |
| 矮牵牛甲醛代谢机理研究及提高其甲醛代谢能力的遗传操作;张韦;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20130115(第1期);摘要，第74页，第77页 * |
| 通过遗传操作提高植物代谢甲醛的能力;马莉;《全国优秀硕士论文全文数据库 基础科学辑》;20080915(第9期);摘要，第69-77页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104774866A (zh) | 2015-07-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102136088B1 (ko) | 식물계에서의 중금속 감소 | |
| AU2006237317B8 (en) | Improved methods controlling gene expression | |
| CN106459923B (zh) | 植物中烟碱向降烟碱转化的减少 | |
| ES2685797T3 (es) | Treonina sintasa de nicotiana tabacum y métodos y usos de esta | |
| CN109996879B (zh) | 具有缩短的到开花时间的植物 | |
| EP3456181A1 (en) | Method for creating transformed plant | |
| DE10212892A9 (de) | Konstrukte und Verfahren zur Regulation der Genexpression | |
| KR20180051530A (ko) | 감소된 아스파라긴 함량을 갖는 식물 | |
| MX2014005298A (es) | Modulacion de beta-damascenona en plantas. | |
| EP3480314A1 (en) | Regulation of alkaloid content | |
| CN104774866B (zh) | 拟南芥丝氨酸羟甲基转移酶基因与甲酸脱氢酶基因的双表达应用 | |
| Yu et al. | Enhancing wheat regeneration and genetic transformation through overexpression of TaLAX1 | |
| CN102337280B (zh) | 短芽孢杆菌甲醛脱氢酶基因及其植物表达载体与应用 | |
| CN104745619A (zh) | 拟南芥甲酸脱氢酶fdh基因的植物表达载体及其应用 | |
| Alotaibi et al. | Functional analysis of SBPase gene promoter in transgenic wheat under abiotic stresses | |
| Borkowska et al. | Transgenic potato plants expressing soybean ß-1, 3-endoglucanase gene exhibit an increased resistance to Phytophthora infestans | |
| CN101570761B (zh) | 拟南芥谷胱苷肽依赖型甲醛脱氢酶基因的植物表达载体及其构建方法和应用 | |
| CN101265479A (zh) | 一种柠檬酸合成基因的植物表达载体及其应用 | |
| CN104928316A (zh) | 拟南芥过氧化氢酶基因cat的植物表达载体及其应用 | |
| CN102363790B (zh) | 拟南芥热激因子基因AtHsfA1d 的植物表达载体及其应用 | |
| Xia et al. | Transcriptional regulation of expression of the maize aldehyde dehydrogenase 7 gene (ZmALDH7B6) in response to abiotic stresses | |
| CN107630032A (zh) | 烟草14‑3‑3g基因的植物表达载体及其应用 | |
| Dembinski et al. | Negative regulation of asparagine synthetase in the leaves of maize seedlings by light, benzyladenine and glucose | |
| CN107805641A (zh) | 烟草14‑3‑3c基因的植物表达载体及其应用 | |
| RU2801948C2 (ru) | Модулирование содержания редуцирующих сахаров в растении |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20171110 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |