JPH05199864A - クレブシェラ・オクシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ） Ｎｏ．１９−１ とこれを利用するアルファサイクロデキストリンの製造方法 - Google Patents

クレブシェラ・オクシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ） Ｎｏ．１９−１ とこれを利用するアルファサイクロデキストリンの製造方法

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    • C12R2001/22—Klebsiella

Abstract

(57)【要約】 【構成】 澱粉の分解能とアルファサイクロデキストリ
ンの選択的な生成能を有する新菌株であるクレブシェラ
・オクシトカ（Klebsiella oxytoca) No.19-1(寄託番
号：KCCM 10002) 、およびこの菌株が生産するサイクロ
デキストリン形成酵素を利用して澱粉から選択的にサイ
クロデキストリンを製造することを特徴とするアルファ
サイクロデキストリンの製造方法。 【効果】 澱粉からアルファサイクロデキストリンだけ
を生成させる新たな微生物を提供することができ、また
この微生物を使用して、従来のような酵素処理及び酵素
の除去を行うための複雑な精製工程を経なくとも、簡便
に高収率でアルファサイクロデキストリンを製造するこ
とができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、澱粉を分解してアルフ
ァサイクロデキストリンを生産する菌株であるクレブシ
ェラ・オクシトカ（Klebsiella oxytoca) No.19-1(寄託
番号：KCCM10002)とこれを利用してアルファサイクロデ
キストリンを製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】サイクロデキストリンはブドウ糖から環
状構造の多糖類として分子の内部に空洞(cavity)を持っ
ており、他の化学物質、特に疎水性物質と複合体を形成
することができる。この性質によって揮発性物質の安定
化、酸化及び光分解性物質の保護、難溶性物質の溶解度
の上昇と色調の改善及び特異臭のマスキング(masking)
等の物理化学的な性質の変化、難溶性物質の乳化及び化
学反応性の変化等の効果があるので、食品、化学、製
薬、農薬等の産業分野で広く用いられている。このサイ
クロデキストリンはブドウ糖６分子、７分子、８分子が
アルファ１、４結合したものをそれぞれアルファ、ベー
タ、ガンマサイクロデキストリンと呼び、これにアルフ
ァ１、６結合した分岐形サイクロデキストリン等の存在
も知られており、これらはその種類によって化学的な特
性が異なる。
【０００３】このうち、アルファサイクロデキストリン
はベータサイクロデキストリンよりも溶解度がかなり高
く、アルファアミラーゼによって分解されにくい。ま
た、アルファサイクロデキストリンは人体に無害で、体
内に吸収された場合に難消化性であり、一部の有益な腸
内の細菌によって分解、吸収されてしまうので、難消化
性の多糖類の機能性食品の素材として注目を浴びてい
る。
【０００４】従来のアルファサイクロデキストリンの製
造としては、澱粉と、サイクロデキストリンの形成酵素
（サイクロデキストリン・グルコシルトランスフェラー
ゼ）を生産する微生物の培養液或いは培養液から精製さ
れたサイクロデキストリンの形成酵素を反応させた後、
反応産物の中に生成したアルファサイクロデキストリン
を有機溶媒で処理するか或いは各種のクロマトグラフィ
ー等の複雑な精製工程によって分離、製造する方法が知
られている。
【０００５】従来でもサイクロデキストリンを生産する
菌株では、色々な種類が報告されており、アルファサイ
クロデキストリンを生産する菌株では、バチルス・マセ
ランス（Bacillus macerans)とバチルス・ステアロサー
モフィルス（Bacillus stearothermophilus)及びクレブ
シェラ・ニューモニアエ (Klebsiella pneumoniae)等が
代表的である。しかし、これらの生産菌株は一種類のサ
イクロデキストリンだけを生産するのではなく、各種の
サイクロデキストリンが一緒に生成されるものであるか
ら、アルファサイクロデキストリンの生産菌株として知
られた微生物であるとしても、他の種類のサイクロデキ
ストリンが一緒に生成される。
【０００６】従って、純度の高いサイクロデキストリン
を製造するには複雑な分離精製過程が必要である。一
方、澱粉とサイクロデキストリンの形成酵素を反応さ
せ、サイクロデキストリンを生成する時、アルファサイ
クロデキストリンの生成比率を増加させるため、反応液
にドデシル硫酸ナトリウム或いはｎ−デカノール等の化
学物質を添加する方法が紹介されていた。しかし、この
方法はアルファサイクロデキストリンの生成比率を増加
させる効果を示すが、添加された化学物質を除去するた
め、もっと複雑な段階の精製工程が必要になる難点があ
った。
【０００７】最近、このような既存の方法を改善してク
レブシェラ属の菌株である、クレブシェラ・ニューモニ
アエ・サブスピーシーズ・ニューモニアエ(Klebsiealla
pneumoniae subsp. pneumoniae)アルファ-CD 株からア
ルファサイクロデキストリンの生成促進物質を使用しな
くても、アルファサイクロデキストリンを生産すること
ができる技術が特開平1-225493号に提案されている。し
かし、この場合でも分岐サイクロデキストリンを生産し
ないので、比較的改善された方法であると言えるが、ベ
ータサイクロデキストリンが多く生産されるばかりでな
く、10g/l の比較的低い濃度のアルファサイクロデキス
トリンが生成され、反応時間も三時間位かかるなど、非
経済的であるので改善の余地が多かった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは長い間の
研究の末に従来とは違った、澱粉からアルファサイクロ
デキストリンだけを生成させる新たな微生物を発見し
て、従来のような酵素処理及び酵素の除去を行うための
複雑な精製工程を経なくとも、簡便に高収率でアルファ
サイクロデキストリンを製造することができる方法を見
出し、本発明を完成した。
【０００９】従って、本発明は澱粉からアルファサイク
ロデキストリンだけを生成する新たな菌株と、これを利
用してアルファサイクロデキストリンを製造する方法を
提供することを、その目的とするものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は、澱粉の分解能
とアルファサイクロデキストリンの選択的な生成能を有
する新菌株である、クレブシェラ・オクシトカ（Klebsi
ella oxytoca) No.19-1 (寄託番号：KCCM 10002) であ
る。また、本発明は、新菌株であるクレブシェラ・オク
シトカ（Klebsiella oxytoca) No.19-1(寄託番号：KCCM
10002) が生産するサイクロデキストリン形成酵素を利
用して澱粉から選択的にサイクロデキストリンを製造す
ることを特徴とするアルファサイクロデキストリンの製
造方法である。
【００１１】以下、本発明をさらに詳細に説明すれば次
のようである。本発明は澱粉と反応してアルファサイク
ロデキストリンだけを選択的に生成する新たな微生物を
土壌から分離し、この菌株のサイクロデキストリン形成
酵素を利用して、従来に比べて簡便に効率的に高収率で
アルファサイクロデキストリンを製造することができ
る。本発明による新たな微生物を分離した背景を見る
と、広範な自然界から上記のような特性を有する微生物
を探索し続けたが、韓国の慶尚南道で採集した土壌の試
料からアルファサイクロデキストリンの生成能力を有す
る微生物を選んで同定した。この微生物の形態学的な特
性、培養学的な特性などにおいて見ると、澱粉を分解し
てアルファサイクロデキストリンを生成させる点では、
これまで知られたクレブシェラ・オクシトカ（Klebsiel
la oxytoca) 菌株とは異なって、選択的であり、高い生
産性でアルファサイクロデキストリンが得られる有用で
新しい菌株であることがわかった。
【００１２】従って、本発明者らは上記の微生物をバー
ジェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バク
テリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacter
iology) 第一巻とAPI 20E Kit(フランス) の索引によっ
て、クレブシェラ・オクシトカ（Klebsiella oxytoca)
に属する新たな菌株であると判断し、この菌株をクレブ
シェラ・オクシトカ（Klebsiella oxytoca) No.19-1 と
命名した。
【００１３】この新たな菌株は韓国種菌協会(Korean Cu
lture Center & Microorganism) に1990年11月23日、寄
託番号KCCN 10002で寄託した。新たな菌株であるクレブ
シェラ・オクシトカ（Klebsiella oxytoca) No.19-1 に
対する特性を分析した結果は次のようである。 １．形態的な特徴 形態：短桿菌、0.3 〜1.0 μm × 0.6〜３μm 運動性：陰性 胞子：陰性 グラム染色：陰性。
【００１４】２．培養上の特徴 肉汁寒天平板の培養：生育は良好、やや隆起と平滑湿
潤、淡黄色のコロニーを持つ。 肉汁寒天斜面の培養：生育は良好、斜面の全体に生育す
る。 MacConkey 平板の培養：生育は良好、鮮桃色のコロニー
を持つ。 生育のできるpH：４〜９ 生育のできる温度：10〜45℃ 酸素：通性嫌気性。
【００１５】３．生理的な特徴 澱粉の加水分解 陽性 カゼインの加水分解 陰性 ＣＭＣ(Carboxymethyl cellulose) の加水分解 陰性 プルランの加水分解 陽性 ゼラチンの加水分解 陰性 クエン酸の利用 陽性 Ｖ．Ｐ．テスト 陽性 インドールの生成 陽性 硫化水素の生成 陽性 Ｍ．Ｒ．テスト 陰性 カタラーゼ 陽性 オキシダーゼ 陰性 ウレアーゼ 陽性 ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ 陽性 硝酸の還元 陽性 色素の生成 陰性 トリプトファン脱アミノ反応 陰性 リシン脱炭酸反応 陽性 オルニチン脱炭酸反応 陰性 アルギニンの分解 陰性 Fecal coliform テスト 陰性。
【００１６】糖の酸化とガス生成 ブドウ糖 陽性 マンニット 陽性 イノシット 陽性 ソルビット 陽性 ラムノース 陽性 ショ糖 陽性 メリビオース 陽性 アミグダリン 陽性 アラビノース 陽性。
【００１７】本発明によると、土壌から分離、同定した
クレブシェラ・オクシトカ（Klebsiella oxytoca) No.1
9-1(寄託番号:KCCM 10002)菌株を利用してアルファサイ
クロデキストリンを製造する方法において、先ず新たな
菌株を生育のよい合成培地或いは天然培地に接種して培
養した。ここで、培地条件は澱粉或いはアミノペクチン
が炭素源として含まれなければならない。その他、窒素
源と無機塩等は特別な制限なしに使用できる。培養条件
として好気的な条件で、培地のpHを中性付近に調節し、
30〜40℃の培地温度が望ましい。この条件で、培養を行
うと、通常約９時間の後、サイクロデキストリン形成酵
素の活性が最高に達し、それ以上培養しても活性が増加
しにくい。又、アルファサイクロデキストリンの生産に
おいて、新たな菌株の培養上澄液に存在する酵素を精製
しないまま、澱粉と反応させてもよいが、一般的に通常
の方法によって、酵素を部分的に精製してから使用する
方が望ましい。従って、新たな菌株の培養上澄液から部
分的に精製した酵素を基質の澱粉溶液と混合し、pHは中
性、温度は20〜55℃に維持させながら反応すると、アル
ファサイクロデキストリン以外の他のサイクロデキスト
リンを生産しないという、新たな菌株の酵素の特性によ
って、ベータ或いはガンマサイクロデキストリンを別に
除去させるゲル濾過等の複雑な工程を経なくとも、かな
り高い純度のアルファサイクロデキストリンを製造する
ことができる。
【００１８】
【発明の効果】本発明によれば、澱粉からアルファサイ
クロデキストリンだけを生成させる新たな微生物を提供
することができる。またこの微生物を使用して、従来の
ような酵素処理及び酵素の除去を行うための複雑な精製
工程を経なくとも、簡便に高収率でアルファサイクロデ
キストリンを製造することができる。
【００１９】
【実施例】以下、実施例によって本発明をより詳細に説
明する。 実施例１ 可溶性澱粉10ｇ、ペプトン５ｇ、酵母エキス５ｇ、リン
酸２カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム0.2gを蒸留水１リ
ットルに溶かした培地にクレブシェラ・オクシトカ（Kl
ebsiella oxytoca) No.19-1(寄託番号:KCCM 10002)菌株
を接種して、37℃で９時間培養した。6,000 ×ｇで５分
間遠心分離し、菌体を除去した培養上澄液に３倍量のエ
タノールを添加し、よく混合した後、４℃で一晩放置し
た。温度４℃、6,000 ×ｇで10分間遠心分離して沈澱物
を分離し、乾燥した後、少量のリン酸緩衝溶液 (50mM p
hosphate buffer, pH 6)を加えて溶解させた。次に、乾
燥した緩衝溶液で一晩透析した後、これを凍結乾燥して
粗酵素に使用した。
【００２０】粗酵素のサイクロデキストリンの形成活性
はレジュネ (Lejeune)らの方法 (Analytical Biochemis
try, 181, p6〜11, 1989) を利用して次のように測定し
た。５％(w/v) の澱粉溶液 0.6ml、１mMメチルオレンジ
0.105ml及び50mMリン酸緩衝溶液 (pH６）1.295ml で構
成された基質溶液に適当に稀釈した酵素溶液を１ml加え
て混合し、37℃で10分間反応させた後、６N HCl 溶液を
0.150ml 添加して反応を終結した。反応液を15℃で30分
間保管した後、507nm で吸光度を測定して既に作成した
標準曲線(standard curve)から酵素の活性を産出した。
【００２１】実施例２ pH７に調節した 10 ％(w/v) 可溶性澱粉と１mM CaCl2・
2H2Oの溶液１リットルを５分間加熱糊化して冷却した
後、実施例１で製造した粗酵素を 0.5ｇ(1700 単位) 添
加して除々に攪拌させながら、40℃で20時間反応させ
た。５分間沸騰させて反応を終結した後、反応産物を高
速液体クロマトグラフィーで分析した（carbohydrateカ
ラム、R1 detector 、流速2.0ml/分、アセトニトリル：
水＝65：35(v/v) 、Waters Co. USA) 。
【００２２】得られたサイクロデキストリンのＨＰＬＣ
分析の結果を図１に示す。アルファサイクロデキストリ
ン以外のベータ、ガンマ及び分岐形サイクロデキストリ
ンは存在しなかった。又、既存の濃度がわかっているア
ルファサイクロデキストリンの商品試料の場合である図
２に比べて、実施例の結果によると、反応液の中に生成
したアルファサイクロデキストリンの濃度は15g/100g澱
粉であった。これはアルファサイクロデキストリンの生
成を促進する物質を使用しなくても、短時間でかなり高
いアルファサイクロデキストリンが生産されていること
を意味する。反応の終わった後、反応液を濃縮してから
濾過し、未反応の澱粉を除去して噴霧乾燥すると、従来
の方法に比べて簡便に純度が99％以上のアルファサイク
ロデキストリンの粉末を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明による実施例で、20時間の反応後、得
られたサイクロデキストリンのＨＰＬＣ分析結果を示す
図。
【図２】 従来の方法によって商品化された公知の標準
アルファ、ベータ、ガンマサイクロデキストリンのＨＰ
ＬＣ分析結果を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:22） (72)発明者 崔 起 賢 大韓民国ソウル特別市城東區下往２洞韓信 アパート３棟603号 (72)発明者 權 ▲イク▼ 夫 大韓民国ソウル特別市西大門區弘恩洞裕珍 アパートＡ棟203号

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 澱粉の分解能とアルファサイクロデキス
    トリンの選択的な生成能を有する新菌株である、クレブ
    シェラ・オクシトカ（Klebsiella oxytoca)No.19-1(寄
    託番号：KCCM 10002)
  2. 【請求項２】 クレブシェラ属の微生物が生成する酵素
    を利用してアルファサイクロデキストリンを製造する方
    法において、新菌株であるクレブシェラ・オクシトカ
    （Klebsiella oxytoca) No.19-1(寄託番号：KCCM 1000
    2) が生産するサイクロデキストリン形成酵素を利用し
    て澱粉から選択的にサイクロデキストリンを製造するこ
    とを特徴とするアルファサイクロデキストリンの製造方
    法。
JP3353912A 1990-12-20 1991-12-19 クレブシェラ・オクシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ） Ｎｏ．１９−１ とこれを利用するアルファサイクロデキストリンの製造 Expired - Fee Related JPH0685713B2 (ja)

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KR1019900021177A KR930001384B1 (ko) 1990-12-20 1990-12-20 클렙시엘라 옥시토카 No. 19-1과 이를 이용한 알파 사이클로덱스트린의 제조방법
KR21177 1990-12-20

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KR930001384B1 (ko) 1993-02-27
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