KR930001384B1 - 클렙시엘라 옥시토카 No. 19-1과 이를 이용한 알파 사이클로덱스트린의 제조방법 - Google Patents

클렙시엘라 옥시토카 No. 19-1과 이를 이용한 알파 사이클로덱스트린의 제조방법 Download PDF

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Abstract

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Description

클렙시엘라 옥시토카 No. 19-1과 이를 이용한 알파 사이클로덱스트린의 제조방법
제1도는 본 발명에 따른 실시예에서 반응 20시간 후 얻어진 사이클로덱스트린 반응물의 HPLC 분석결과 이고,
제2도는 종래 방법에 의해 상품화된 공지의 표준 알파, 베타, 감마, 사이클로 덱스트린을 HPLC에 의해 분석한 결과 나타낸 것이다.
본 발명은 전분을 분해하고 알파 사이클로덱스트린을 생산하는 신균주 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca) No. 19-1과 이를 이용하여 알파 사이클로덱스트린을 제조하는 방법에 관한 것이다.
사이클로덱스트린은 포도당으로 구성된 환상구조의 다당류로써 분자 내부에 공동(cavity)을 가지고 있어서 다른 화학물질, 특히 소수성(hydropho-bic)물질과 복합체를 형성할 수 있는 능력이 있다.
이러한 성질로 인하여 휘발성 물질의 안정화, 산화 및 광분해성 물질의 보호, 난용성 물질의 용해도 상승과 색조의 개선 및 특이취의 마스킹(masking)등의 물리화학적 성질의 변화, 난용성 물질의 유화 및 화학반응성의 변화등의 효과를 거둘 수 있어서 식품, 화학, 제약, 농약 등의 산업분야에서 널리 이용되고 있다.
이러한, 사이클로덱스트린은 포도당 분자 각각 6, 7, 8개가 알파 1,4(α-1,4) 결합된 알파, 베타, 감마 사이클로덱스트린과 여기에 알파 1,6(α-1,6)결합된 분기형 사이클로덱스트린(branched cyclodextrin)등의 존재가 알려져 있으며 이들은 그 종류에 따라 화학적 특성이 다르다. 이중에서도 알파 사이클로덱스트린은 베타 사이클로덱스트린보다 용해도가 매우 높고 알파 아밀라아제 (α-amylase)에 의해 분해되지 않으며, 인체에 무해하고, 체내에 흡수되었을 경우 난소화성이며 일부 유익한 장내 세균에 의해 분해 흡수되기 때문에 난소화성 다당류의 기능성 식품 소재로 주목받고 있다.
종래의 알파 사이클로덱스트린의 제조는 전분과 사이클로덱스트린 형성 효소(Cyclodextrin Glucosyltran-sferase)를 생산하는 미생물의 배양액 또는 배양으로부터 정제된 사이클로덱스트린 형성 효소를 반응시킨 후 반응 산물중 생성된 알파 사이클로덱스트린을 유기용매 처리 또는 각종 크로마토그래피 등의 복잡한 정제 과정을 거쳐 분리제조하는 방법등이 알려져 있다.
종래에도 사이클로덱스트린 생산 균주는 여러 종류가 보고되어 있으며, 알파 사이클로덱스트린을 생산하는 균주로는 바실러스 마세란스(Bacillus macerans)와 바실러스 스테아로써머필러스(Bacillus stearother-mophilus) 및 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)등이 대표적이다.
그러나, 그 생산 균주별로 한 종류의 사이클로덱스트린만을 생산하는 것이 아니며, 여러 종류의 사이클로덱스트린이 함께 생성되는 것이기 때문에 비록 알파 사이클로덱스트린 생산 균주로 알려진 미생물이라 하더라도 다른 종류의 사이클로덱스트린이 함께 생성되며, 따라서 순도 높은 알파 사이클로덱스트린을 제조하는 데에는 별도로 복잡한 분리 정제 과정이 필요하다.
한편, 전분과 사이클로덱스트린 형성 효소를 반응시켜 사이클로덱스트린을 생성시킬때 알파 사이클로덱스트린의 생성 비율을 증가시키기 위하여 반응액에 소디움 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS) 또는 노말 데실 알코올(n-decyl alcohol)등의 화학물질을 첨가하는 방법이 소개되어 있으나, 이 방법은 비록 알파 사이클로덱스트린의 생성 비율을 증가시키는 효과를 나타내기는 하지만 첨가된 화학물질을 제거하기 위하여 보다 더 복잡한 단계의 정제 과정이 필요하게 되는 어려움이 있었다.
최근에는 위와 같은 기존의 방법을 개선하여 클렙시엘라속 균주인 클렙시엘라 뉴모니아주(Klebsiella pmeumoniae subsp. pneumoniae α-CD주)로부터 알파 사이클로덱스트린의 생성 촉진물질을 사용하지 아니하고 알파 사이클로 덱스트린을 생산해 낼 수 있다는 기술이 일본특개평 1-225493호로 제안되어 있다.
그러나, 이 경우에도 분기 사이클로덱스트린을 생산하지 않기 때문에 비교적 개선된 방법이라 할 수는 있으나 베타 사이클로덱스트린이 상당량 생산될 뿐 아니라 10g/의 비교적 낮은 농도의 알파 사이클로덱스트린이 생성되며 반응시간도 3일간 필요하는 등 비경제적이므로 역시 개선의 여지가 많았다.
이에 본 발명자들은 오랜 연구끝에 종래와는 달리 전분으로부터 알파 사이클로덱스트린만을 생성시키는 새로운 미생물을 발견하므로써, 종래와 같이 효소 처리 및 효소제거를 위한 복잡한 정제 과정과 반응액 중에 첨가된 화학물질을 제거하는 복잡한 과정을 거치지 아니하면서도 간편하고도 고수율로 알파 사이클로덱스트린을 제조할 수 있게 되어 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 전분 분해로부터 알파 사이클로덱스트린만을 생성하는 신균주와 이를 이용하여 알파사이클로덱스트린을 제조하는 방법을 제공하는 그 목적이 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 전분 분해능과 알파 사이클로덱스트린의 선택적 생성능을 가진 신균주 클렙시엘라 옥시토카 No. 19-1(Klebsiella oxytoca No. 19-1)에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 미생물을 이용하여 알파 사이클로덱스트린을 제조함에 있어서, 신균주 클렙시엘라 옥시토카 No. 19-1을 이용하여 전분으로부터 선택적으로 알파 사이클로덱스트린을 제조하는 방법을 포함한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 전분과 반응하여 알파 사이클로덱스트린만을 선택적으로 생성하는 신규한 미생물을 토양으로부터 분리하였으며, 이균주의 사이클로덱스트린 형성 효소를 이용하여 종래에 비하여 간편하고 효율적으로 알파 사이클로덱스트린을 제조한 것이다.
본 발명에 따른 새로운 미생물의 분리 배경을 살펴보면, 광범위한 자연계로부터 상기와 같은 특성을 가진 미생물을 탐색해오다 대한민국 경상남도에서 채취한 토양 시료로부터 알파 사이클로덱스트린 생성능력을 가진 미생물을 선발하고 동정하였다. 이 미생물은 형태학적 특성, 배양학적 특성, 생리학적 특성 등에 대해 살펴본 바, 전분을 분해하고 알파사이클로덱스트린을 생성시킨다는 점에서 이제까지 알려진 클렙시엘라 옥시토카(klebsiella oxytoca)균주와는 다르며, 선택적이고도 높은 알파사이클로덱스트린 생산성을 보이는 산업적으로 유용한 신규한 균주인 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명자들은 이러한 미생물을 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology vol. 1과 APL 20E Kit(프랑스)의 Index에 의거, 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca)에 속하는 신균주인 것으로 판단하였으며, 이 균주를 클렙시엘라 옥시토카 No. 19-1(Klebsiella oxytoca No. 19-1)로 명명하였다.
이러한, 신균주는 한국종균협회(Korean Culture Center & Microorganism)에 1990. 11. 23일자 기탁번호 KCCM 10002로 기탁하였다.
상기와 같은 신균주 클렙시엘라 옥시토카 No. 19-1에 대한 특성을 분석한 결과는 다음과 같다.
1.형태적 특징
형 태 : 단간균, 0.3~1.0㎛×0.6-3㎛
운동성 : 음성
포 자 : 음성
그람염색 : 음성
2. 배양상 특징
육즙 한천 평판배양 : 생육 양호, 약간의 융기와 평활, 습윤, 담황색의 콜로니 가짐
육즙 한천 사면 배양 : 생육 양호, 사면 전체에 생육함
MacConkey 평판배양 : 생육 양호, 선분홍색의 콜로니 가짐
생육가능 pH : 4~9
생육가능 온도 : 10~45℃
산소 : 통성형기성
3. 생리적 특징
전분 가수분해 양성
케이신(casein)가수분해 음성
CMC 가수분해(Carboxy Methly Cellulose) 음성
풀루란(Pullulan)가수분해 양성
젤라틴(Gelatin)가수분해 음성
구연산 이용 양성
V.P. 테스트 양성
인돌 테스트 양성
황화수소 생성 양성
M.R. 테스트 음성
카탈레이스(Catalase) 양성
옥시데이스(Oxidase) 음성
요소분해(Urease) 양성
베타 갈락토시데이스(β-Galactosidase) 양성
질산환원 양성
색소 생성 음성
트립토판 탈아미노 반응(Tryptophane desaminase) 음성
라이신 탈탄산 반응(Lysine decarboxylase) 양성
오르니틴 탈탄산 반응(Ornithine decarboxylase) 음성
알지닌 분해(Arginine dihydrolase) 음성
휘컬 콜리폼 테스트(Fecal coliform test) 음성
당의 산화와 가스 생성
포도당 양성
만티톨(mannitol) 양성
이노시톨(inositol) 양성
솔비톨(sorbitol) 양성
람노스(rhamnose) 양성
슈크로스(sucrose) 양성
멜리비오스(melibiose) 양성
아미그달린(amygdalin) 양성
아라비노스(arabinose) 양성
상기와 같이 본 발명에 따른 토양으로부터 분리 동정한 클렙시엘라 옥시토카 No. 19-1(KCCM 10002)균주를 이용하여 알파 덱스트린을 제조하는 방법을 살펴보면, 우선 신균주를 생육이 잘될 수 있는 합성배지 또는 천연 배지에 접종하여 진탕 배양한다.
여기에서 배지조건은 전분 또는 아밀로펙틴(Amylopectin)이 탄소원으로 포함되어야 하며 그 외에 질소원과 무기염 등은 특별한 제한없이 사용이 가능하다. 배양조건으로는 호기적 조건하에서 배지의 pH를 중성부근으로 조절하고 30~40℃의 배양온도가 바람직하다.
이러한 조건하에서 배양을 행하면 통상 약 9시간 후 사이클로덱스트린 형성 효소의 활성이 최고조에 달하며 더 이상 배양하여도 활성이 그 이상으로 증가하기 어렵다.
또한, 알파사이클로덱스트린 생산에 있어서 신균주의 배양상등액에 존재하는 효소를 정제하지 않은 채 전분과 반응시켜도 무방하지만 일반적으로 통상의 방법에 따라 효소를 부분적으로 정제한 후 사용하는 것이 바람직하다.
따라서, 신균주의 배양상등액으로부터 부분 정제한 효소를 기질인 전분 용액과 혼합하고 pH는 중성, 온도는 20~55℃로 유지시키며 반응시키면 알파사이클로덱스트린 이외의 다른 사이클로덱스트린은 생성시키지 않는다는 신균주가 생산하는 효소의 특성으로 인하여 베타 또는 감마사이클로덱스트린을 별도로 제거시키는 크로마토그래피(Chromatography)등의 복잡한 과정을 거치지 않아도 매우 높은 순도의 알파사이클로덱스트린을 제조할 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 따른 신균주가 생성한 효소는 음이온 교환수지를 사용하여 50mM 아세테이트 완충액과 50mM인산염 완충액을 이용하여 차례로 분획하고 정제한 결과 반응 최적온도는 37℃, 반응최적 pH는 5.5~7.5, 분자량은 68,000인 것으로 나타났다. 따라서 이런 본 발명에서의 효소는 기존의 알려진 사이클로덱스트린 형성효소인 예컨대 바실러스 마세란스(Bacillus macerans)의 효소(최적 pH 5.5~7.5, 분자량 145,000), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)의 효소(최적 pH 6, 분자량 68,000), 마이크로코커스(Micrococcus sp.)의 효소(최적 pH 5~8, 분자량 88,000), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)의 효소(최적 pH 6~7.2, 분자량 68,000)등과 같은 공지효소와 동일하지 않은 것으로 확인되었으며, 무엇보다도 공지효소와 비교해 볼때 알파 사이클로덱스트린 이외의 베타 또는 감마 사이클로덱스트린을 생성하지 않는다는 점에서 공지의 것과는 큰 차이가 있고, 이는 매우 놀랄만한 새로운 사실로서, 이 결과로부터 본 발명의 신균주는 종래와는 다른 새로운 효소를 생성하고, 이에 의해서 고순도, 고수율의 알파 사이클로덱스트린을 생산하는 것이 가능해진 것이다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다.
[실시예 1]
수요성 전분(soluble starch) 10g, 펩톤(peptone)5g, 효모추출물(yeast extract)5g, K2HPO4, 1g, MgSO4·7H2O 0.2g을 증류수 1ℓ에 녹인 배지에 클렙시엘라 옥시토카 No. 19-1(KCCM 10002)균주를 접종하여 37℃에서 9시간 동안 진탕배양 하였다. 6,000×g에서 5분간 원심분리하여 균체를 제거한 배양 상등액에 3배량의 에탄올을 첨가하고, 잘 혼합시킨 다음 4℃에서 하룻밤 방치하였다. 4℃온도, 6,000×g에서 10분간 원심 분리를 행하여 침전물을 분리하고 이를 건조시킨 후 소량의 인산완충용액(50mM Phosphate buffer, pH 6)을 가하여 용해시켰다.
그 다음에는 동일한 완충용액으로 하룻밤 투석한 후 이를 동결건조하여 전분과 반응시킬 조효소(crude enzyme)로 사용하였다. 조효소의 사이클로덱스트린 형성 활성은 Lejeune등의 방법(Analytical Biochemistry, 181, p6-11, 1989)을 이용하여 다음과 같이 측정하였다.
5%(w/v)의 전분용액 0.6㎖, 1mM methyl orange 용액 0.105㎖ 및 50mM phosphate 완중용액(pH 6) 1.295㎖로 구성된 기질용액에 적절하게 희석된 효소용액을 1㎖ 첨가하여 혼합하고 37℃에서 10분간 반응시킨 후 6N HCl용액을 0.150㎖ 첨가하여 반응을 종결시켰다. 반응액을 15℃에서 30분간 보관한 후 507㎚에서 흡광도를 측정하여 미리 작성한 표준곡선(standard curve)으로부터 효소의 활성을 산출하였다.
효소활성의 1단위(Unit)는 정해진 조건하에서 1분당 1μmole의 알파 사이클로덱스트린을 생성시키는 효소의 양으로 하였다.
[실시예 2]
pH 7로 조정된 10%(w/v)수용성 전분(soluble starch), 1mM CaCl2·2H2O 1ℓ를 5분 동안 가열 호화시키고 냉각시킨 다음 실시예 1에서 제조한 조효소를 0.5g(1700단위) 첨가하여 서서히 교반시켜 주면서 40℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 끓는 물에서 5분 동안 처리하여 반응을 종결시킨 다음 반응산물을 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 분석하였다(carbohydrate column, Rl detector, 유속 2.0㎖/min, acetonitrile : water=65 : 35, Waters Co. USA).
상기와 같은 본 발명에 따른 실시예의 결과는 제1도에 나타내었으며 알파사이클로덱스트린 이외의 베타, 감마 및 분기형 사이클로덱스트린은 존재하지 않았다.
또한, 기존의 농도를 알고 있는 알파 사이클로덱스트린 상품시료의 경우인 제2도와 비교하여 볼때 실시예의 결과에 의하면 반응액중에 생성된 알파 사이클로덱스트린의 농도는 15g/100g전분이었다.
이것은 알파 사이클로덱스트린 생성 촉진물질을 사용하지 않으면서도 단시간내에 매우 높은 알파 사이클로덱스트린이 생산되고 있음을 의미한다.
반응종료후 반응액을 농축한 후 여과하여 미반응된 전분을 제거하고, 분무 건조하면 종래의 방법과 비교하여 매우 간편하게 순도 99% 이상의 알파 사이클로덱스트린 분말을 얻을 수 있다.

Claims (2)

  1. 전분 분해능과 알파 사이클로덱스트린의 선택적 생성능을 사진 신균주 클렙시엘라 옥시토카 No. 19-1(기탁번호 : KCCM 10002).
  2. 클렙시엘라속 미생물이 생성하는 효소를 이용하여 알파 사이클로덱스트린을 제조함에 있어서, 신균주 클렙시엘라 옥시토카 No. 19-1(기탁번호 : KCCM 10002)가 생산하는 사이클로덱스트린 형성효소를 이용하여 전분으로부터 선택적으로 알파 사이클로덱스트린을 제조함을 특징으로 하는 알파 사이클로덱스트린의 제조방법.
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