JPS633789A - 新規なエステラ−ゼ及びその製造法 - Google Patents

新規なエステラ−ゼ及びその製造法

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JPS633789A
JPS633789A JP14745286A JP14745286A JPS633789A JP S633789 A JPS633789 A JP S633789A JP 14745286 A JP14745286 A JP 14745286A JP 14745286 A JP14745286 A JP 14745286A JP S633789 A JPS633789 A JP S633789A
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杉木 千晶
Kanji Nishizawa
西沢 完治
Fumitaka Kishimoto
岸本 文貴
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、微生物由来の新規なエステラーゼ及びその製
造法に関する。更に詳しくは、本発明はバシラス(Ba
cillus)属に属する微生物を培養して得られる新
規なエステラーゼ及びその製法に関する。
一般にエステラーゼとは、エステル結合を有する基質を
加水分解する酵素の総称であり、その基質特異性により
カルボン酸ニスステルに作用するもの、チオールエステ
ルに作用するもの、リン酸エステルに作用するもの、硫
酸エステルに作用するものに分類される。狭義にはカル
ボン酸エステルに作用するもののうち、低級脂肪酸のエ
ステルを加水分解するものをエステラーゼと呼びグリセ
ロールエステルを加水分解するものをリパーゼと呼んで
いる。リパーゼの粗標品には、リパーゼ作用の他にエス
テラーゼ作用があり両作用は実用上、耐熱性、トリプシ
ン及びアルカリ感受性基質であるエステルの脂肪酸の鎖
長の差などで区別されている。
しかし両作用の相違はむしろ基質の物理的存在状態の相
違に起因するといわれている。即ちエステラーゼ反応は
、水溶液中の基質に対して酵素が作用するとされている
が、リパーゼ反応は水に不溶性の基質と水との界面で進
行すると言われている。(例えば5arda ら、 B
iochem、Biophys、Acta。
30 513(1958)参照)。本発明にいうエステ
ラーゼは上記の狭義のエステラーゼを意味する。
近年、酵素を有機合成に応用する試みがさかんに行われ
ており各種のエステル化合物を酵素エステラーゼを用い
て加水分解し、光学活性化合物を取得する事、或いはブ
ロキラルな化合物からキラルな化合物を創製する事等の
試みが数多く報告されている。それらの報告の多くのも
のは豚肝エステラーゼ(Pig 1iver este
rase又はPorcineliver estera
se)を用いたものであるが(例えばLaumenらT
etrahedron Lett、 26407〜41
0(1985)及びWangらJ、Am、Chem、S
oc、1063695(1984)参照)豚肝エステラ
ーゼは高価であるうえに量的な供給に制限があり工業的
使用には不利であるため、豚肝エステゼの代わりに、微
生物起源のエステラーゼを用いる方法も試みられている
。その際エステラーゼ産生微生物菌体を用いているのが
一般的であり、酵素エステラーゼを精製しその性質を明
らかにしている例はほとんどない。(例えばKotan
iら、Agric、Biol 、Chem、4’し13
63〜1365(1983);Fugimotoら、J
、Chem、Soc、Commun、1333〜133
4(1985) ;及びBrannonら、J、Ant
ibiot、Commun。
挺L121〜124(1976)参照)。
−方、”微生物起源のエステラーゼとしては■Baci
llus 5ubtilis ATCC6633(Bi
ochea+ Btop −hys、Acta、485
 367−378(1977))  、 ■Bacil
lussubtilis  SR22(Biophem
、Biophys、Acta、429 191−197
(1976))、■Bacillus 5ubtili
s NRRL−8−558(Appl、Microbi
ol、30413−419(1975)) 、■Bac
illus 5tearother+aophiLus
(Archiv、Biochem。
Biophys、160504−513(1974))
 、■Pseudomonasaeniginosa(
J、Biochem、86643−656(1979)
 、■Pseudomonas cepacia(J、
Bgcteriol 118880−889(1974
))、■Pseudomonas fluoresce
ns(J。
Biochem、951047−1054(1984)
及び特開昭6O−30681)、■Escherich
ia colt K−12(J、Bacteriol。
149 6−14(1982))  、■Asperg
illus  nigerNRRL337(Agric
、Biol、Chem、471865−1868(19
83)及び@Mycobacterium smegi
atis ATCC1446B(J。
BacLeriol、1551249−1259(19
83))起源のエステラーゼ等が報告されているがB、
5ubtilis NRRL−8−558起源のエステ
ラーゼをセファロスポリン誘導体の合成に応用した例を
除いて、いずれの場合にも有機合成反応への応用につい
ては全く触れられていない。
本発明者らは、この様な状況のもとで豚肝エステラーゼ
と同様に有機合成反応への応用範囲の広い、微生物起源
のエステラーゼを取得すべく研究を重ねた結果、本発明
者らによって土壌より新たに分離されたバシラス(Ba
cillus)属に属する新規微生物バシラスエスピー
DC−1(Bacillus sp、DC−1)(徽工
研菌寄第8719号;特願昭6l−92595)の産生
ずる新規なエステラーゼがかかる優れた性質を有する事
を見出し本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、かかる優れた性質を有する微生物由来
の新規エステラーゼを供給する事によって有機合成化学
の分野で該エステラーゼを用い、光学活性化合物の製造
及びプロキラルな化合物からキラル化合物の創製等を工
業的に実施する事を可能にするものである。
本発明は第1に以下に示す理化学的性質を有する新規な
エステラーゼに関する。
1)作用: 有機カルボン酸エステルのエステル結合を加水分解する
2)基質特異性: 主として有機カルボン酸のアルコールエステルに作用し
、水溶性の短鎖脂肪酸エステルに高い活性を有する。短
鎖のモノ及びトリアシルグリセライドには作用するが、
長鎖のモノ、ジ、及びトリアシルグリセライドには作用
しない。バルミトイルCoAには作用するが、アセチル
CoA、コリンエステル、及びコレステロールエステル
には作用しない。
3)至適pH及びPH安定性ニ ジクロロビニル菊酸(本発明明細書中では以下DCPI
ト略Bする。)のP−ニトロフェニルエステルを基質と
した時の加水分解の至適pHは、8.5〜9゜0である
。10mM トリス塩酸緩衝液(PH’7.0〜9.0
)及び10mMリン酸緩衝液(pH5,0〜7.0)を
用いた場合、4℃、48時間後の残存活性はpH7,0
〜9.0では約100%、 pH6,0テハ約45%、
PH5,0テは約20zである。
4)至適温度及び熱安定性: DCPIのP−ニトロフェニルエステルを基質とした時
の加水分解の至適温度は100mM トリス塩酸緩衝液
pH9,0中で50〜55℃である。
同緩衝液中、各温度で10分間処理後の残存活性は、3
5℃100K、 40℃で約80%、50℃で約15χ
である。
5)分子量: 54 、000  ±2,000(ゲル濾過及びSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による) 6)等電点:4.8±0.1 7)失活条件: a)100μMフェニルメチルスルフォニルフルオライ
ド(PMSF)又は80μMジイソプロピルフルオロリ
ン酸(DIFP)存在下に37℃10分間処理すると完
全に失活する。
b)1mMデオキシコール酸ナトリウム及び5mMラウ
リル硫酸ナトリウムを含む100mM トリス塩酸緩衝
液(pH9,0)で37℃10分間処理すると各々約2
5%及び約70%活性が低下する。
本発明のエステラーゼはサブユニット構造を持たない1
本鎖ペプチドでその分子量が54,000±2゜000
である点で、Ba:1llus 5ubtilis A
TCC6633(150,000)、Bacillus
 5ubtilis  NRRL−8−558(190
゜000)、 Bacillus 5ubtilis 
5R−22(160,000)。
Bacillus stearothermophil
us (42,000−47,000)、Pseudo
monas cepacia (34,500)、Ps
eudmonasfluorescens (48,0
00)、Aspergillus niger NRR
L337 (23、000,27、800,29、50
0,127,000)及びMycobacterium
 s+++egmatis ATCC14468(36
+000〜41 、000)由来のエステラーゼとは明
らかに異なっている。又Pseudomonas ae
ruginosa  起源のエステラーゼはジイソプロ
ピルフルオロリン酸及びラウリル硫酸ナトリウムにより
失活しないのに対して、本発明のエステラーゼは、5鳳
Mラウリル硫酸ナトリウムで約70%、80μNジイソ
プロピルフルオロリン酸で完全に失活する点で異なる。
更にEscherichia coli K−12起源
のエステラーゼは膜に存在するカルボキシルペプチダー
ゼと言うべきもので、これも本発明のエステラーゼとは
細胞内局在性の点で相違は明らかである。よって本発明
のエステラーゼは従来知られていない新規なエステラー
ゼである。
第2に本発明は、バシラス(Bacills)属に属し
、上記の性質を有する新規なエステラーゼの産生能を有
する微生物を培養し、培養菌体中に該酵素を蓄積せしめ
、これを分離、採取する事を特徴とするエステラーゼの
製造法に関する。
本発明の新規なエステラーゼは微生物を用いて生産され
、その産生菌としてはバシラス(Bacillus)属
に属し、上記性質を有する酵素を産生ずる能力を有する
株であればよく例えばバシラス エスピーDC−1(B
acillus sp DC−1)が挙げられる0本国
株は微工研菌寄第8719号として寄託されており、そ
の菌学的性質は以下のとおりである。
(a)形態 1)細胞の形態および大きさ: 桿状ぞ(0,5〜0.6)μ膳X (1,2〜1.7)
μI。単独または2〜3個の連鎖をなす。
2)多形性:なし 3)運動性:あり 周鞭毛を有する 4)胞子の形成:あり 球状あるいはやや卵形で、直径0゜ 4〜0.6μ腸、栄養細胞の末端に形成されふ(らみを
有する。
5)ダラム染色:陰性 6)抗酸性:なし くb)各種培地における生育状態 1)肉汁寒天平板培地(35℃、24時間)形状;円形 周縁:なし 隆起:凸状 光沢:あり 表面:平滑 色調:半透明で黄白色 2)肉汁寒天斜面培養(35℃、24時間)生育度二普
通 拡布状またはしゆず状に生育 表面:平滑 色調:半透明で黄白色 光沢:あり 3)肉汁液体培養(35℃、24時間)生育度:普通 着色・脱色:なし 表面生育:菌環は形成しない 沈渣:生じる 4)肉汁ゼラチン穿刺培養(35℃、14日間)ゼラチ
ンを液化しない。
5)リドマスミルク培地(35℃、14日間)わずかに
アルカリ化し、allおよびペプトン化しない。
<c>生理学的性質 35℃、1〜5日間培養、陰性のものは14日間まで観
察。
1)硝酸塩の還元:陽性 硝酸を還元し、亜硝酸を生かす。
2)脱窒反応:陰性 3)MRテスト:陰性 4)VPテスト:陰性 5)インドールの生成:陰性 6)硫化水素の生成:陰性 7)デンプンの加水分解:陰性 8)クエン酸の利用 Koserの培地;陰性 Christensenの培地:陽性 9)無機・窒素源の利用 重工らによる5tanierらの培地の変法:(Yam
azaLo et al、J、Gen、Appl、Mi
crobiol。
(1982) 28:195−213)を用い、コハク
酸ナトリウムを炭素源として使用した。
硝酸塩:利用しない アンモニウム塩:利用する。
10)色素の生成:生成しない 11)ウレアーゼ Christensenの尿素培地:陽性12)オキシ
ターゼ:陽性 13)カラターゼ:陽性 14)生育の範囲 生育温度:10〜45℃(最適30〜35℃)生育P)
1:6.0〜9.5(最適8.5〜9.0)15)酸素
に対する態度:好気的にのみ生育する16) OFテス
ト:陰性 17)¥il[からの酸・ガスの生成 酸    ガス ■ L−アラビノース   −− ■ D−キシロース    −− ■ D−グルコース    −− ■ D−マンノース     −− ■ D−フラクトース   −− ■ D−ガラクトース   −− ■ 麦芽糖        −− ■ シー+1!         −一〇 乳糖   
      −− [相] トレハロース     −− ■ D−ソルビトール   −    −OD−マンニ
ット    −− 〇 イノシフト      −− [相] グリセリン     −− @ デンプン      ・ −− 以上の菌学的性質を有する菌について、パージエイズ・
マニュアル・オブ・デターミイネイティプ中バクテリオ
ロジー(Bergey’s Manual ofDet
er−minative Bacteriology)
第8版(1974年)に基づき検索した結果、好気的条
件下に生育する有胞子桿菌であることから、バシラス(
Bacillus)属に属する菌株と同定した。また、
本菌株を同属中の菌種と比較すると、バシラス・スファ
エリカス(Bacillus 5phaertcusお
よびバシラス・バステウリー(Bacillus  a
steurii)に近イ以しているが、第1表に示す点
で、これらの菌種とは異なっている。
第1表 以上のことから、本菌株をバシラス( Bacillus)属に属する新菌種と認め、バシラス
エスピーD C−1(Bacillus sp、DC−
1)と命名した。
本発明に用いる微生物としては本菌株とその変種、変異
株に限定されるものではな(、上記性質の酵素を有する
ものであれば良い。
本発明の新規なエステラーゼの産生菌は醗酵学の分野で
公知の常法に従って培養する事ができる。
使用する培地としては炭素源、窒素源、無機物及びその
他栄養素を適当量含有する培地ならば合成培地又は天然
培地のいずれも使用可能であり、液体培地又は固体培地
を用いて培養することができる。 具体的には炭素源と
しては、グルコース、フラクトース、マルトース、ガラ
クトース、リボース、サッカロース、澱粉、澱粉加水分
解物、糖蜜、廃糖蜜などの糖類、麦、米などの天然炭水
化物、クリセロール、マンニトール、メタノール、エタ
ノールなどのアルコール類、グルコン酸、ピルビン酸、
酢酸、クエン酸などの脂肪酸類、ノルマルパラフィン、
ケロシンなどの炭化水素類、グリシン、グルタミン酸、
グルタミン、アラニン、アスパラギンなどのアミノ酸類
など一般的な炭素源より使用する微生物の資化性を考慮
して、−種または二種以上適宜選択して使用すれば良い
窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、乾
燥酵母、大豆加水分解物、大豆粉、ミルクカゼイン、カ
ザミノ酸、各種アミノ酸、コーンステイープリカー、フ
ィツシュミールないし、その加水分解物、その他の動物
、植物、微生物の加水分解物などの有機窒素化合物、ア
ンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
などのアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、
尿素など無機窒素化合物より使用微生物の資化性を考慮
し、−種または二種以上を適宜選択して使用する。
さらに、無機塩として微量のマグネシウム、マンガン、
鉄、亜鉛、銅、ナトリウム、カルシウム、カリウムなど
のリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩、酢酸塩などの一
種または二種以上適宜添加し、必要に応じて植物油、界
面活性剤などの消泡剤を添加しても良い。
培養は、前記培地成分を含有する液体培地中で振盪培養
、通気撹拌培養、静置培養、連続培養などの通常の培養
法を用いて行うことができる。
培養条件は、培地の種類、培養法により適宜選択すれば
良く、本菌株が増殖し、エステラーゼを産生できる条件
であれば特に制限はない。通常は、培養開始のP)]を
8〜9に調整し、30〜35℃の温度条゛件下で培養す
ることが好ましい。培養日数は通常1〜2日が適当であ
る。
以上のようにして培養中に産出蓄積されたエステラーゼ
は次の様な方法で採取、分離する事ができる。
本エステラーゼは、菌体内に蓄積されるので、培養終了
後、菌体を濾過、遠心分離等の方法で集め、水又は緩衝
液で洗浄した後、例えば凍結融解処理、超音波処理、加
圧処理、浸透圧差処理、。
磨砕処理及びアセトン風乾処理等の物理的手段、もしく
は例えばりゾチームセルラーゼ等の細胞壁溶解酵素処理
の様な生化学的処理もしくは界面活性剤との接触処理な
どの化学的処理を単独もしくは組み合わせて施す事によ
り、菌体を破砕し、エステラーゼを抽出する事ができる
その−例を挙げれば次の通りである。
即ち、遠心分離により集めた面体を10011Mリン酸
カリウム緩衝液(pH9、0)で数回洗浄した後、同緩
衝液に懸濁し、加圧型破砕装置フレンチ・プレスにより
菌体を加圧破砕してエステラーゼを抽出する。こうして
菌体抽出物より得られる粗エステラーゼは塩析、有機溶
媒による分別沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、ゲ
ル濾過、疎水性クロマトグラフィー、水素結合クロマト
グラフィー、アフィニティクロマチグラフィー等のカラ
ムクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィー及
び電気泳動などの生化学分野で公知の手段を単独にもし
くは組み合わせて用いて精製する事ができる。
その−例を挙げれば次の通りである。
即ち、フレンチ・プレス処理により破砕した菌体処理物
を10,000g 、10分間遠心分離し、続いて上清
を100,000g、60分間超遠心分離して得られた
上滑を粗抽出液とする。
該抽出液を硫安40〜70χで塩析し、本エステラーゼ
を沈澱せしめ、該沈澱を20mM トリス塩酸緩衝液(
pH7,0)で溶解した後、同緩衝液で平衡化したDE
AE−セファロースCL−6Bに通過させ、エステラー
ゼを吸着させる。その後O〜0.5M Nacl直線濃
度勾配法にてエステラーゼを溶出する。0.25M付近
に溶出されるエステラーゼ活性を有する両分を濃縮後、
501IMトリス塩酸緩衝液(pH8,0)に対して透
析する。該濃縮液を同緩衝液で平衡化したセフアクリス
S−200スーパーフアインに通液し、溶出したエステ
ラーゼ画分を濃縮後、続いて同緩衝液で平衡化したセフ
ァデックスG−150スーパーフアインカラムに通液し
、エステラーゼを溶出する。
得られたエステラーゼ画分を濃縮後、20mM トリス
塩酸緩衝液(pH8,0)に対して透析し、同緩衝液で
平衡化したQAE−セファデックスに通過せしめ、エス
テラーゼを吸着させた後、0〜0.5MNacl直線濃
度勾配によりエステラーゼを溶出する。
この溶出液を濃縮後、5O5−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動に供したところ本エステラーゼは電・5HtO
5rng/  It 1Mnclt  ・41(to 
5Ig/  i 、Zn5O*・7HtO1mg/ I
l及びFe5Oa  ・7Hz021g/ lを含むp
H9.0の培地50m1に一白金耳接種し、30℃、2
4時間振とう培養した。この前培養で得られた種培養液
を、さらに、上記組成の培地5j7接種し、35℃、2
4時間、通気量5 i! /win撹拌速度600rp
mで培養した。培養終了後、9 、000g、10分間
の遠心分離により得た菌体を100mMリン酸カリウム
緩衝液pH9,0で2回洗浄し、培養液10抛l相当の
菌体を4mlの同緩衝液に懸濁して、フレンチ・プレッ
シャー・セル・プレス(アミンコ製)にて4℃38.0
00psiの圧で菌体を破砕した。
得られた菌体処理物を遠心分離(10,000g、 1
0分間)し、その上清を続いて超遠心分離(100,0
00g、60分間)して、エステラーゼ粗抽出液を得た
その結果、比活性4.86units/mgの粗酵素が
656抛g得られた。
実施例 2 実施例1に準じて得られた粗エステラーゼ抽出液を10
0mMリン酸カリウム緩衝液(pH9,0)で蛋白濃度
10〜20I1g/IIlニナル様に調整後、硫安40
Z iff和とし、生じた沈澱を遠心分離により除去し
た(10.000 xg10分間)、続いて上滑を硫安
70%飽和にし、沈澱を分取しく10,000gg 1
0分間)、20mM トリス塩酸緩衝液pH7,040
m1に溶解後、同緩衝液に対して透析した。その結果、
総括性量17848units、比活性6.80uni
ts /lagの粗酵素溶液が得られた。
このエステラーゼ溶液43.51111のうち10゜2
ml (4199uni ts、615mg prot
)を同緩衝液で平衡化したベツド体積14Q+il の
DEAE−セファロースCL−6R(2,6x26 c
m)に通液し、エステラーゼをD2AE−セファロース
CL−6Bに吸着させた後、同緩衝液でカラムを洗浄し
、0〜0.5MのNaC1直線濃度勾配によって、エス
テラーゼを0.25M NaC1付近に溶出した。その
結果、活性はピーク部分に3734units回収され
(89z) 、全溶出液では4115unfts(98
z)回収され、比活性は8.2倍上昇した。
エステラーゼ活性画分を限外濾過膜で濃縮後、該濃縮液
を5011IMトリス塩酸緩衝液pH8,0に対して透
析し、同緩衝液で平衡化したセファクリルS−200ス
ーパーフアイン(2,6X 100C!l)に通液し、
ゲル濾過を行った。溶出したエステラーゼ画分を濃縮後
501Mトリス塩酸緩衝液pH8,0で平衡化した。
セファデックスG−150スーパーフアインカラム(2
゜6 X 100c+a)に通液し、同緩衝液でエステ
ラーゼを溶出した。得られたエステラーゼ画分を濃縮後
、201Mトリス塩酸緩衝液pH8,0で平衡化した。
ベツド体積7011のQAE−セファデックス(1,6
X35cm)に通液し、エステラーゼを吸着させた後、
同緩衝液で洗浄した0次いで0〜0.5M NaC1の
直線濃度勾配溶出法でエステラーゼを溶出したところ、
NaC10,25〜0.3Mの部分に745unitの
活性が回収され、比活性は、413.8units/m
g又、粗抽出液からの活性回収率は9.9zであった。
このエステラーゼ溶液を約5倍に濃縮後、10χのSD
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、
エステラーゼは分子量54 、000の単一バンドとし
て認められた。これはセファクリルS−200スーパー
フアイン及びセファデックスG−150スーパーフアイ
ンによるゲル濾過の結果(52,000〜58゜000
)とよく−致しており、エステラーゼがサブユニット構
造を持たない1本鎖ペプチドである事が示唆された。但
し、ホスホリラーゼB(分子量92、500)、牛血清
アルブミン(66、200)、卵白アルブミン(45,
000)、炭酸脱水酵素(31,000)、大豆トリプ
シンインヒビター(21、500)及びリゾチーム(1
4,400)をSDS−PAGEによるエステラーゼ分
子量決定の標準物質とし、ブルーデキストラン(200
,000)、牛血清アルブミン(66,200)、卵白
アルブミン(45,000)、キモトリプシノーゲンA
(25,000)、リボヌクレアーゼA(13,700
)をゲル濾過によるエステラーゼ分子量決定の標準物質
とした。
実施例 3 実施例2に準じて得られた精製エステラーゼをLKB製
ポリポリアクリルアミドゲル度5%、架橋度3%、アン
フオライン濃度2.2χ)を用い、PH4,0〜6.5
の範囲で等電点電気泳動(電カー定: 15W)を、1
0℃で90分間行った。泳動後、コマジ−ブリリアント
ブルーR−250で染色し、蒼白質のバンドを検出した
。その結果、本エステラーゼの等電点は4゜8±0.1
であった。尚、電気泳動の際の標準物質として、バイオ
ランド社のPIママ−−(PI 4.65゜5.10.
6.00.6.50)及びオリエンタル酵母社の21マ
ーカー(PI 4.10. 4.90. 6.40)を
用いた。
実施例 4 実施例2に準じて得られた精製エステラーゼを下記撹拌
試薬を共に37℃で10分間インキュベーションした後
、前述の活性測定法に従って、残存酵素活性を測定した
。第2表にその結果を示す。
尚、第2表中、残存活性は、未処理の活性を100とし
た時の相対値(Z)で表した。又、第3表中1)はフェ
ニルメチルサルフォニルフルオライドを示し、2)ジイ
ソプロピルフルオロリン酸を示す。
第3表 ■ 「 実施N5 実施例2に準じて得られた精製エステラーゼを、100
mM トリス塩酸緩衝液pH9,0中で2〜20mMの
各基質に作用させ、その加水分解活性をpHスタット(
ラジオメーター社)で測定した。又コリンエステル、コ
レステロールエステル、チオールエステルの加水分解活
性を測定した。その結果を第4表及び第5表に示す。
第4表中、加水分解活性は、本エステラーゼの酪酸エチ
ル分解活性を100とする相対活性(X)で第5表 実施例 6 実施例2に準じて得られた精製エステラーゼを用いて、
DCPIのP−ニトロフェニルエステルを基質とした時
の酵素の至適pH及びpH安定範囲を測定した。その結
果を第1図及び第2図に示す。第1図に於いて、活性測
定は40℃で行い、pH5〜7には100mMリン酸カ
リウム緩衝液を、pH7〜9には100mM トリス塩
酸緩衝液を、pH9〜13には100mMのリン酸二カ
リウム・水酸化カリウム緩衝液を用いた。また活性は、
pH9.0に於ける活性値100とした時の相対活性(
X)で表した。
第2図に於いて酵素液は、pH5〜7の場合は、2抛M
のリン酸カリウム緩衝液、pH7〜9於いては、20m
Mのトリス塩酸緩衝液中に、4℃で保存し、各時間にお
ける残存活性を40℃、100mM トリス塩酸pH9
.0中で測定した。活性は、0時間における活性値を1
00とした時の活性残存率(Z)で表した。
実施例 7 実施例2に準じて得られた精製エステラーゼの至適温度
と熱安定性を測定した。その結果を第3図及び第4図に
示す。第3図に於いて横軸は絶対温度の逆数、縦軸は初
速度の対数を表す。又活性測定は、100!IIM ト
リス塩酸緩衝液pH9.0を用いて行った。
第4図に於いて、横軸に示された各温度で酵素液を15
分間前処理した後、40℃の100mM トリス塩酸緩
衝液pH9,0中で活性を測定した。活性は、未処理の
エステラーゼ活性を100とした時の活性残存率(Z)
で表した。
参考例 1 実施例1及び2に記載した硫安塩析法に準じて得られた
エステラーゼ粗酵素溶液(硫安40〜70Z画分、比活
性6.80ur、its/mg)を用いて、ジ/yot
+ビニル菊酸エチル(以下 本明細書中ではDCPEと
略称する。、)の加水分解反応を行った。
即ち、該粗酵素液1.0m1(410,OUNITS、
60.3mg)を、2zポリビニルアルコール1.Om
lを含むpH9,0の100mM  トリス塩酸緩衝液
8.Omlに添加し、(±)−シス、トランスDCPE
 (シス/ トランス 比=45155)を最終2mM
になる様、添加して35℃で96時間撹拌下に反応した
。96時間後この反応液に35XHC10,1++1を
加え反応を停止させた後、ジエチルエーテルで生成した
DCPIと未反応DCPEを酸析、抽出した。
抽出液をガスクロマトグラフィー(カラム:307:T
hermon 3000,1.1m 140’C)で分
析し、DCPIとDCPEのピーク面積比より、収率(
z)を算出した。
次に上記抽出液にIN NaOH2,Omlを添加して
DCPIのみをナトリウム塩として水層に抽出した後、
水層を35Z)ICIで鋪2以下とし、遊離してくるD
CPIをメチルイソブチルケトンで抽出後、濃縮した。
得うレタDCPIヲ) ルエン0.5ml ニ溶!し、
DCPIト等モルの塩化チオニル、ピリジン、3,5−
ジクロロアニリンを加えて80℃で反応させアニリドと
した後、高速液体クロマトグラフィー(カラム:SUM
IPAX DA−2100,移動相 n−ヘキサン:ジ
クロロエタン(10:3V/V) 、流速1.0ml/
win) テ異性体分析を行った。その結果を第6表に
示す。
第6表 1)収率は、原料中の(+)−トランスDCPHに対す
る得られた(+)−トランスDCPIのモル収率を表す
【図面の簡単な説明】
第1図は、本発明のエステラーゼの至適pHを示すもの
である。 第2図は、本発明のエステラーゼのpH安定性を示すも
のである。 第3図は、本発明のエステラーゼの至適温度を示すもの
である。 第4図は、本発明のエステラーゼの熱安定性を示すもの
である。 第1図 第2図 日数 第8図 (°C) 2.9 3.0  B、1 8.2 3.3 3.41
/T  (1/K) 受託番号変更届 昭和62年 1月19日 1、事件の表示 昭和61年 特許願 第147452号2、発明の名称 新規なエステラーゼ及びその製造法 3・手続きをした者 事件との関係  特許出願人 大阪市東区北浜5丁目15番地 (209)住友化学工業株式会社 代表者  森  英  雄 4、代理人 大阪市東区北浜5丁目15番地 5、旧寄託機関の名称 工業技術院微生物工業技術研究所 6、旧受託番号 微工研菌寄第8719号 (FERM  P−8719) 7、新寄託機関の名称 工業技術院微生物工業技術研究所 8、新受託番号 微工研条寄第1254号 (FERM  BP−1254) 9、添付書類の目録

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)下記の理化学的性質を有する新規エステラーゼ 1)作用: 有機カルボン酸エステルのエステル結合を加水分解する
    。 2)基質特異性: 主として有機カルボン酸のアルコールエステルに作用し
    、水溶性の短鎖脂肪酸エステルに高い活性を有する。短
    鎖のモノ及びトリアシルグリセライドには作用するが長
    鎖のモノ、ジ、及びトリアシルグリセライドには作用し
    ない。パルミトイルCoAには作用するがアセチルCo
    A、コリンエステル、及びコレステロールエステルには
    作用しない。 3)至適pH及びpH安定性: ジクロロビニル菊酸(本明細書中では以下DCPIと略
    称する。)のP−ニトロフェニルエステルを基質とした
    ときの、加水分解の至適pHは、8.5〜9.0である
    。 10mMトリス塩酸緩衝液(PH7.0〜9.0)及び
    10mMリン酸緩衝液(PH5.0〜7.0)を用いた
    場合、4℃、48時間後の残存活性は、pH7.0〜9
    .0では約100%、pH6.0では約45%,、pH
    5.0では約20%である。 4)至適温度及び熱安定性: DCPIのP−ニトロフェニルエステルを基質としたと
    きの加水分解の至適温度は100mMトリス塩酸緩衝液
    pH9.0中で50〜55℃である。 同緩衝液中、各温度で10分間処理後の残存活性は、3
    5℃で100%、40℃で約80%、50℃で約15%
    である。 5)分子量: 54,000±2,000(ゲル濾過及びSDS−ポリ
    アクリルアミドゲル電気泳動法による) 6)等電点:4.8±0.1 7)失活条件: a)100μMフェニルメチルスルフォニルフルオライ
    ド(PMSF)又は80μMジイソプロピルフルオロリ
    ン酸(DIFP)存在下に37℃10分間処理すると完
    全に失活する。 b)1mMデオキシコール酸ナトリウム及び5mMラウ
    リル硫酸ナトリウムを含む100mMトリス塩酸緩衝液
    (PH9.0)で37℃10分間処理すると、各々約2
    5%及び約70%活性が低下する。
  2. (2)バシラス(Bacillus)属に属する新規エ
    ステラーゼ産出菌を培養し、該培養物から新規エステラ
    ーゼを分離、回収する事を特徴とする新規エステラーゼ
    の製造法。
  3. (3)バシラス(Bacillus)属に属する新規エ
    ステラーゼ産出菌がバシラスエスピーDC−1¥(Ba
    cillus¥sp.DC−1)(微工研菌寄第871
    9号)である特許請求の範囲第2項記載の製造法
JP14745286A 1986-04-22 1986-06-24 新規なエステラ−ゼ及びその製造法 Expired - Lifetime JPH0761263B2 (ja)

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DE8787303531T DE3781192T2 (de) 1986-04-22 1987-04-22 Mikroorganismus, esterase und verfahren zu deren herstellung.
US07/041,290 US4904593A (en) 1986-04-22 1987-04-22 Novel microorganism, a novel esterase and method for preparing the same
EP87303531A EP0243167B1 (en) 1986-04-22 1987-04-22 A novel microorganism, a novel esterase and method for preparing the same

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113166766A (zh) * 2018-12-06 2021-07-23 天野酶制品株式会社 修饰型菊酸酯酶

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CN113166766A (zh) * 2018-12-06 2021-07-23 天野酶制品株式会社 修饰型菊酸酯酶

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