JPH0811758B2 - ポリペプチド同族体マリノスタチン - Google Patents
ポリペプチド同族体マリノスタチンInfo
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- JPH0811758B2 JPH0811758B2 JP61005091A JP509186A JPH0811758B2 JP H0811758 B2 JPH0811758 B2 JP H0811758B2 JP 61005091 A JP61005091 A JP 61005091A JP 509186 A JP509186 A JP 509186A JP H0811758 B2 JPH0811758 B2 JP H0811758B2
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- marinostatin
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- protease
- column
- homolog
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規なポリペプチドに関し、更に詳しくは
ゲル濾過法で測定した分子量が約1,500〜1,700で構成ア
ミノ酸残基が12〜14の新規なポリペプチド同族体マリノ
スタチン（Marinostatin）、特にマリノスタチンＣ−
１、同Ｃ−２に関する。
ゲル濾過法で測定した分子量が約1,500〜1,700で構成ア
ミノ酸残基が12〜14の新規なポリペプチド同族体マリノ
スタチン（Marinostatin）、特にマリノスタチンＣ−
１、同Ｃ−２に関する。
このポリペプチド同族体マリノスタチンは、種々のプ
ロテアーゼに対する阻害効果を有し、特にズブチリシ
ン、牛α−キモトリプシン、パンクレアチンプロテアー
ゼ、プロティナーゼＫなどのセリンプロテアーゼを強く
阻害する。
ロテアーゼに対する阻害効果を有し、特にズブチリシ
ン、牛α−キモトリプシン、パンクレアチンプロテアー
ゼ、プロティナーゼＫなどのセリンプロテアーゼを強く
阻害する。
発明の概要 本発明者らは、種々の海洋環境においてプロテアーゼ
インヒビター生産微生物の探索を行い、約3,000株の菌
株をスクリーニングした結果、神奈川県油壷湾の海水試
料中より、プロテアーゼインヒビター生産菌株、アルテ
ロモナス（Alteromonas）sp.B−10−31を分離した。
インヒビター生産微生物の探索を行い、約3,000株の菌
株をスクリーニングした結果、神奈川県油壷湾の海水試
料中より、プロテアーゼインヒビター生産菌株、アルテ
ロモナス（Alteromonas）sp.B−10−31を分離した。
そして更に本発明者らは、この菌株の培養上清にすぐ
れたズブチリシン阻害活性を認め、このインヒビターを
新たにマリノスタチン（Marinostatin）と命名し、この
粗製インヒビターである粗マリノスタチンが、セリンプ
ロテアーゼ及びチオールプロテアーゼは阻害するのに対
しメタルプロテアーゼ及び酸性プロテアーゼは阻害しな
いことをつきとめた（Bulletin of the Japanese Socie
ty of Scientific Fisheries,51（５）,805−810（198
5））。
れたズブチリシン阻害活性を認め、このインヒビターを
新たにマリノスタチン（Marinostatin）と命名し、この
粗製インヒビターである粗マリノスタチンが、セリンプ
ロテアーゼ及びチオールプロテアーゼは阻害するのに対
しメタルプロテアーゼ及び酸性プロテアーゼは阻害しな
いことをつきとめた（Bulletin of the Japanese Socie
ty of Scientific Fisheries,51（５）,805−810（198
5））。
この先行技術を基に本発明者らは、更に研究を進めた
結果、粗製マリノスタチンの精製に成功し、その本体
が、単純ペプチドであることをはじめて確認しただけで
なく、ポリペプチド同族体であってＡ、Ｂ、Ｃの画分に
分離することができ、しかも画分Ｂ、Ｃは、更にＢ−
１、Ｂ−２及びＣ−１、Ｃ−２に分離精製できるだけで
なく、Ｃ−１、Ｃ−２についてはそのアミノ酸配列を決
定するのに成功し、そしてアミノ酸配列のみでなく、そ
の起源及び作用等についても総合的に検討した結果、本
マリノスタチンが従来未知の新規物質であることを確認
し、遂に本発明の完成に至ったものである。以下、本発
明について詳述する。
結果、粗製マリノスタチンの精製に成功し、その本体
が、単純ペプチドであることをはじめて確認しただけで
なく、ポリペプチド同族体であってＡ、Ｂ、Ｃの画分に
分離することができ、しかも画分Ｂ、Ｃは、更にＢ−
１、Ｂ−２及びＣ−１、Ｃ−２に分離精製できるだけで
なく、Ｃ−１、Ｃ−２についてはそのアミノ酸配列を決
定するのに成功し、そしてアミノ酸配列のみでなく、そ
の起源及び作用等についても総合的に検討した結果、本
マリノスタチンが従来未知の新規物質であることを確認
し、遂に本発明の完成に至ったものである。以下、本発
明について詳述する。
本発明に係るポリペプチド同族体マリノスタチンＣ−
１、Ｃ−２を生産するのに用いられるアルテロモナスs
p.B−10−31株の菌学的性質は以下の通りである。
１、Ｃ−２を生産するのに用いられるアルテロモナスs
p.B−10−31株の菌学的性質は以下の通りである。
I.形態的性質 （１）菌形：通常短桿菌 （２）大きさ:0.4〜0.6μｍ×0.8〜2.0μｍ （ペプトン寒天斜面培地で20℃で48時間培養） （３）運動性：極鞭毛、運動性あり、 （４）グラム染色：グラム陰性 II.培養的性質 （１）ペプトン寒天平板培養：生育良好、円形（直径、
５〜7mm）で平らな隆起をしており、コロニー縁は波状
で黄色、不透明で培養日数の経過に伴い、褐色の色素の
産生あり。
５〜7mm）で平らな隆起をしており、コロニー縁は波状
で黄色、不透明で培養日数の経過に伴い、褐色の色素の
産生あり。
（２）ペプトン寒天斜面培養：生育良好、糸状、台状な
いし扁平状、全般に平滑。黄色で少し硬く、培養日数の
経過に伴い、褐色の水溶性色素を産生。
いし扁平状、全般に平滑。黄色で少し硬く、培養日数の
経過に伴い、褐色の水溶性色素を産生。
（３）ペプトン液体培養：厚膜状で表面がしわ状とな
る。白く濁る。
る。白く濁る。
III.生理的性質 （１）硝酸塩：還元せず （２）デンプン：加水分解する （３）クエン酸：利用せず （４）色素：褐色の水溶性色素の産生 （５）ウレアーゼ：陽性 （６）オキシダーゼ：陽性 （７）カタラーゼ：陰性 （８）生育pH:pH5〜９、最適pH:6〜７ （９）生育温度:20〜35℃、最適温度:20〜25℃ （10）生育食塩濃度:3〜５％、最適濃度:3.5％ （11）酸素要求性：好気的 （12）Ｏ−Ｆテスト：陰性 （13）酸およびガスの生成:L−アラビノース、Ｄ−キシ
ロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラク
トース、Ｄ−ガラクトース、ショ糖、乳糖、Ｄ−ソルビ
ット、Ｄ−マンニット、イノシット、グリセリン、デン
プン、マルトース、ラムノースおよびズルシットのすべ
てについて酸およびガスの生成なし （14）ゼラチン：層状に液化 （15）エスクリン：分解せず （16）キチン：分解せず （17）リパーゼ：陰性 （18）フォスファターゼ：陽性 （19）レシチナーゼ：陰性 （20）Ｇ＋Ｃ含量:42.0モル％ 以上の菌学的性質に基づきBergey′s Manual of Dete
rminative Bacteriology（第８版）により、本菌株はア
ルテロモナス属に属する菌株と同定した。この菌は茨城
県筑波郡谷田部町東１−１−３に所在する工業技術院微
生物工業技術研究所に昭和60年12月23日に微工研菌寄託
第8582号として寄託した。
ロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラク
トース、Ｄ−ガラクトース、ショ糖、乳糖、Ｄ−ソルビ
ット、Ｄ−マンニット、イノシット、グリセリン、デン
プン、マルトース、ラムノースおよびズルシットのすべ
てについて酸およびガスの生成なし （14）ゼラチン：層状に液化 （15）エスクリン：分解せず （16）キチン：分解せず （17）リパーゼ：陰性 （18）フォスファターゼ：陽性 （19）レシチナーゼ：陰性 （20）Ｇ＋Ｃ含量:42.0モル％ 以上の菌学的性質に基づきBergey′s Manual of Dete
rminative Bacteriology（第８版）により、本菌株はア
ルテロモナス属に属する菌株と同定した。この菌は茨城
県筑波郡谷田部町東１−１−３に所在する工業技術院微
生物工業技術研究所に昭和60年12月23日に微工研菌寄託
第8582号として寄託した。
本発明に係る新規なポリペプチド同族体マリノスタチ
ンＣ−１及びＣ−２の化合物的性質は以下に示す通りで
ある。なお、本発明においては、後記する実施例の記載
からも明らかなように、マリノスタチン同族体を３画分
Ａ、Ｂ及びＣに分離し、その内Ｃ画分のほかＢ画分につ
いても精製処理を行い、Ｂ−１及びＢ−２に分離するこ
とができたので、これらについても、本発明の理解を更
に深めるために参考として必要に応じて記述することと
する。
ンＣ−１及びＣ−２の化合物的性質は以下に示す通りで
ある。なお、本発明においては、後記する実施例の記載
からも明らかなように、マリノスタチン同族体を３画分
Ａ、Ｂ及びＣに分離し、その内Ｃ画分のほかＢ画分につ
いても精製処理を行い、Ｂ−１及びＢ−２に分離するこ
とができたので、これらについても、本発明の理解を更
に深めるために参考として必要に応じて記述することと
する。
（１）マリノスタチンの化学的性質 ｉ）分子量:50mM トリス−HCl緩衝液（pH8.0）で平衡
化したセファデックスＧ−25カラム（2.5×80cm、ファ
ルマシア社製）を用いてAndrewsの方法（Biochemical J
ournal 91,222〜232,1964）に従って測定 Ｃ−１ 約1,500 Ｃ−２ 約1,700 ii）紫外線吸収スペクトル（50mM トリス−HCl緩衝液
中）：（μmax:275nm,μmin:254nm） iii）構成アミノ酸 第１表参照 なお、構成アミノ酸は次のようにして測定した。即
ち、精製マリノスタチンを6N HCl（２回蒸留）中で真
空下に110℃で24時間加水分解し、減圧下にHClを除去
し、残渣を0.2Mクエン酸ナトリウム緩衝液（pH＝2.2）
0.3mlに溶解し、Spackmannの方法（Analytical Chemist
ry 30,1190〜1206,1958参照）でアミノ酸分析を実施し
た。
化したセファデックスＧ−25カラム（2.5×80cm、ファ
ルマシア社製）を用いてAndrewsの方法（Biochemical J
ournal 91,222〜232,1964）に従って測定 Ｃ−１ 約1,500 Ｃ−２ 約1,700 ii）紫外線吸収スペクトル（50mM トリス−HCl緩衝液
中）：（μmax:275nm,μmin:254nm） iii）構成アミノ酸 第１表参照 なお、構成アミノ酸は次のようにして測定した。即
ち、精製マリノスタチンを6N HCl（２回蒸留）中で真
空下に110℃で24時間加水分解し、減圧下にHClを除去
し、残渣を0.2Mクエン酸ナトリウム緩衝液（pH＝2.2）
0.3mlに溶解し、Spackmannの方法（Analytical Chemist
ry 30,1190〜1206,1958参照）でアミノ酸分析を実施し
た。
なお、糖分は、いずれも0.02％以下であって、マリノ
スタチンは単純ペプチドと同定された。
スタチンは単純ペプチドと同定された。
iv）アミノ酸配列： 各マリノスタチンＣ−１、Ｃ−２のアミノ酸配列は、
手動エドマン分解法により、次のように同定された。
手動エドマン分解法により、次のように同定された。
Ｃ−1:Phe−Ala−Thr−Met−Arg−Tyr−Pro−Ser−Asp
−Asp−Ser−Glu Ｃ−2:Gln−Pro−Phe−Alg−Thr−Met−Arg−Tyr−Pro
−Ser−Asp−Asp−Ser−Glu 上記結果から明らかなように、マリノスタチンＣ−１
は12個の構成アミノ酸残基をもち、またＣ−２は14個の
構成残基を有する。そしてＣ−２はＣ−１と同じ12個の
構成アミノ酸残基に加えて、グルタミン酸とプロリンの
残基各１個を更に有するものである。
−Asp−Ser−Glu Ｃ−2:Gln−Pro−Phe−Alg−Thr−Met−Arg−Tyr−Pro
−Ser−Asp−Asp−Ser−Glu 上記結果から明らかなように、マリノスタチンＣ−１
は12個の構成アミノ酸残基をもち、またＣ−２は14個の
構成残基を有する。そしてＣ−２はＣ−１と同じ12個の
構成アミノ酸残基に加えて、グルタミン酸とプロリンの
残基各１個を更に有するものである。
ｖ）HPLC分析： 各マリノスタチンＣ−１及びＣ−２の各マリノスタチ
ン溶液100μｌをHPLC（高速液体クロマトグラフィー）
に；カラム温度40℃、流速1ml/min、圧力60kg/cm2、検
出器280nmでのUVモニターの条件でかけて分析した。得
られた結果は第２図（ｃ）〜（ｄ）に示した通りであ
る。フルスケールは0.005AUFS（吸収ユニットフルスケ
ール）である。なお、参考としてＢ−１、Ｂ−２のチャ
ートを第２図（ａ）〜（ｂ）に示した。
ン溶液100μｌをHPLC（高速液体クロマトグラフィー）
に；カラム温度40℃、流速1ml/min、圧力60kg/cm2、検
出器280nmでのUVモニターの条件でかけて分析した。得
られた結果は第２図（ｃ）〜（ｄ）に示した通りであ
る。フルスケールは0.005AUFS（吸収ユニットフルスケ
ール）である。なお、参考としてＢ−１、Ｂ−２のチャ
ートを第２図（ａ）〜（ｂ）に示した。
（２）マリノスタチンの物理的性質 熱安定性:100℃で10分間加熱しても失活せず pH安定性:pH2〜８において安定 （但し、pH＞10で失活）（第１図参照） なお、pH安定性はマリノスタチンＣ−１及びＣ−２を
各種pHの緩衝液中で100℃で10分間処理した後のズブチ
リシン阻害活性の低下率で図示した。なお、参考として
Ｂ−１、Ｂ−２のpH安定性も図示した。
各種pHの緩衝液中で100℃で10分間処理した後のズブチ
リシン阻害活性の低下率で図示した。なお、参考として
Ｂ−１、Ｂ−２のpH安定性も図示した。
メタルイオンに対する安定性:Co2＋（10mM）及びFe2
＋（10mM）の存在下においてそれぞれ約40％及び30％失
活 なお、メタルイオンに対する安定性はマリノスタチン
Ｂ−１、Ｂ−２、Ｃ−１及びＣ−２を各種メタルイオン
を含む液中で30℃で10分間インキュベートした後のズブ
チリシン阻害活性の低下率を測定して行なった。その結
果、Co2＋及Fe2＋で阻害率がそれぞれ40％及び30％低下
し、Fe3＋の存在下では逆に20％増加し、Na＋、Ｋ＋、B
a2＋、Ca2＋、Cu2＋、Mg2＋、Zn2＋、Mn2＋などでは影
響されなかった。
＋（10mM）の存在下においてそれぞれ約40％及び30％失
活 なお、メタルイオンに対する安定性はマリノスタチン
Ｂ−１、Ｂ−２、Ｃ−１及びＣ−２を各種メタルイオン
を含む液中で30℃で10分間インキュベートした後のズブ
チリシン阻害活性の低下率を測定して行なった。その結
果、Co2＋及Fe2＋で阻害率がそれぞれ40％及び30％低下
し、Fe3＋の存在下では逆に20％増加し、Na＋、Ｋ＋、B
a2＋、Ca2＋、Cu2＋、Mg2＋、Zn2＋、Mn2＋などでは影
響されなかった。
次に本発明に係るマリノスタチンの各種プロテアーゼ
に対する阻害効果について説明する。
に対する阻害効果について説明する。
（実験方法） マリノスタチンの各種プロテアーゼに対する阻害効果
の測定はアンソン（Anson）法（M.L.Anson,J.Gen.Physi
ol.,22,79−80,1938）を一部修正した方法によった。即
ち、第２表に示した各pH及び各濃度でプロテアーゼを添
加した0.5mlの緩衝液とマリノスタチン溶液0.5mlを混合
し、30℃において12分間放置した。次に１％Hammarsten
カゼイン溶液（緩衝液中）を加え、さらに12分間反応さ
せた。反応終了後、2mlの５％トリクロル酢酸を加え
て、酵素反応を停止させ、未消化カゼイン沈澱を濾別
し、得られた濾液の吸光度（λ＝280nm）を測定した。
同時にブランク及び対照の吸光度を測定して式（１−B/
A）×100（％）（式中、Ａは12分間の反応後のサンプル
添加しない場合の吸光度であり、Ｂは12分間の反応後の
サンプルを添加した場合の吸光度である）で表わされる
阻害率を求めた。
の測定はアンソン（Anson）法（M.L.Anson,J.Gen.Physi
ol.,22,79−80,1938）を一部修正した方法によった。即
ち、第２表に示した各pH及び各濃度でプロテアーゼを添
加した0.5mlの緩衝液とマリノスタチン溶液0.5mlを混合
し、30℃において12分間放置した。次に１％Hammarsten
カゼイン溶液（緩衝液中）を加え、さらに12分間反応さ
せた。反応終了後、2mlの５％トリクロル酢酸を加え
て、酵素反応を停止させ、未消化カゼイン沈澱を濾別
し、得られた濾液の吸光度（λ＝280nm）を測定した。
同時にブランク及び対照の吸光度を測定して式（１−B/
A）×100（％）（式中、Ａは12分間の反応後のサンプル
添加しない場合の吸光度であり、Ｂは12分間の反応後の
サンプルを添加した場合の吸光度である）で表わされる
阻害率を求めた。
結果は第２表に示す通りである。第２表に示したよう
にマリノスタチンはズブチリシン、牛α−キモトリプシ
ン、パンクレアチンプロテアーゼ、プロティナーゼＫな
どのセリンプロテアーゼに対して強い阻害効果を示した
が、チオールプロテアーゼ、メタルプロテアーゼ、酸性
プロテアーゼは阻害しなかった。
にマリノスタチンはズブチリシン、牛α−キモトリプシ
ン、パンクレアチンプロテアーゼ、プロティナーゼＫな
どのセリンプロテアーゼに対して強い阻害効果を示した
が、チオールプロテアーゼ、メタルプロテアーゼ、酸性
プロテアーゼは阻害しなかった。
なお、第２表において、プロテアーゼサンプルとして
は、それぞれ次のものを使用した。
は、それぞれ次のものを使用した。
セリンプロテアーゼ： （Ａ）ズブチリシン （長瀬産業社製） （Ｂ）牛トリプシン （シグマ社製） （Ｃ）牛α−キモトリプシン（Ｐ−Ｌバイオケミカル社
製） （Ｄ）パンクレアチンプロテアーゼ （シグマ社製） （Ｅ）プロティナーゼＫ （メルク社製） メタルプロテアーゼ： （Ｆ）シュードモナス・アエルギノーサエラスターゼ
（長瀬産業社製） （Ｇ）サーモリシン （生化学工業社製） （Ｈ）プロナーゼ （ベーリンガー社製） チオールプロテアーゼ： （Ｉ）パパイン （シグマ社製） （Ｊ）フィシン （シグマ社製） 酸性プロテアーゼ： （Ｋ）豚ペプシン （ワシントン社製） 次に本発明に係るマリノスタチンＣ−１及びＣ−２の
製造法について以下に説明する。即ち、アルテロモナス
属に属し、マリノスタチンを生産する能力を有する微生
物を先ず培地に培養して、マリノスタチンを培養物中に
蓄積せしめ、この培養物から採取することによって所望
のマリノスタチンを得ることができる。
製） （Ｄ）パンクレアチンプロテアーゼ （シグマ社製） （Ｅ）プロティナーゼＫ （メルク社製） メタルプロテアーゼ： （Ｆ）シュードモナス・アエルギノーサエラスターゼ
（長瀬産業社製） （Ｇ）サーモリシン （生化学工業社製） （Ｈ）プロナーゼ （ベーリンガー社製） チオールプロテアーゼ： （Ｉ）パパイン （シグマ社製） （Ｊ）フィシン （シグマ社製） 酸性プロテアーゼ： （Ｋ）豚ペプシン （ワシントン社製） 次に本発明に係るマリノスタチンＣ−１及びＣ−２の
製造法について以下に説明する。即ち、アルテロモナス
属に属し、マリノスタチンを生産する能力を有する微生
物を先ず培地に培養して、マリノスタチンを培養物中に
蓄積せしめ、この培養物から採取することによって所望
のマリノスタチンを得ることができる。
本発明に係るマリノスタチンを製造するのに使用する
ことができる微生物はアルテロモナス属に属し、マリノ
スタチンを生産する能力を有する微生物であれば、任意
の微生物を用いることができる。好適な菌株としては前
記Ｂ−10−31株があげられる。このＢ−10−31株の菌学
的性質は、前記の通りであるが、この菌株はアルテロモ
ナス属に属する既知菌種の場合にみられるように、その
性状が例えば紫外線、Ｘ線、薬品等の人工的変異手段で
変異することもあるが、このような変異株であってもマ
リノスタチンの生産能を有する限り、すべて、本発明に
係るマリノスタチンの製造に使用することができる。
ことができる微生物はアルテロモナス属に属し、マリノ
スタチンを生産する能力を有する微生物であれば、任意
の微生物を用いることができる。好適な菌株としては前
記Ｂ−10−31株があげられる。このＢ−10−31株の菌学
的性質は、前記の通りであるが、この菌株はアルテロモ
ナス属に属する既知菌種の場合にみられるように、その
性状が例えば紫外線、Ｘ線、薬品等の人工的変異手段で
変異することもあるが、このような変異株であってもマ
リノスタチンの生産能を有する限り、すべて、本発明に
係るマリノスタチンの製造に使用することができる。
本発明に係るマリノスタチンの培養においては通常の
海洋細菌の培養法を一般に用いることができる。かかる
培養のための栄養源としては従来公知の種々のものを用
いることができる。即ち、海水をベースとし、これに炭
素源としてグルコース、デンプン、サッカロース、フラ
クトース、ラクトースなどを単独または組合わせて用い
ることができる。無機および有機の窒素源としては塩化
アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムな
どを、また天然窒素源としてはポリペプトン、酵母エキ
ス、コーンスティープリカー、カザミノ酸などを単独ま
たは組み合わせて用いることができる。
海洋細菌の培養法を一般に用いることができる。かかる
培養のための栄養源としては従来公知の種々のものを用
いることができる。即ち、海水をベースとし、これに炭
素源としてグルコース、デンプン、サッカロース、フラ
クトース、ラクトースなどを単独または組合わせて用い
ることができる。無機および有機の窒素源としては塩化
アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムな
どを、また天然窒素源としてはポリペプトン、酵母エキ
ス、コーンスティープリカー、カザミノ酸などを単独ま
たは組み合わせて用いることができる。
培養方法には特に制限はないが、液体培養法が最も適
しており、培養温度にも特に制限はないが、一般には20
〜25℃が最適で、培地のpHはHClやNaOHなどを添加してp
H5〜９、好ましくは６〜７で培養を行うことが望まし
い。このようにして液体培養で通常９〜33時間培養を行
うと、マリノスタチンが培養物中に生成蓄積される。こ
の培養物中のマリノスタチンの生成量が最大に達した時
に培養を停止し、菌体を遠心除去し、培養液と菌体とに
分離する。
しており、培養温度にも特に制限はないが、一般には20
〜25℃が最適で、培地のpHはHClやNaOHなどを添加してp
H5〜９、好ましくは６〜７で培養を行うことが望まし
い。このようにして液体培養で通常９〜33時間培養を行
うと、マリノスタチンが培養物中に生成蓄積される。こ
の培養物中のマリノスタチンの生成量が最大に達した時
に培養を停止し、菌体を遠心除去し、培養液と菌体とに
分離する。
得られた培養濾液からマリノスタチンを単離精製する
には、微生物代謝生産物を、その培養液から単離するた
めに用いられる通常の分離・精製法を利用することがで
きる。例えば、培養生産物を遠心分離法で培養液と菌体
とに分離し、得られた上清を例えば以下のようにして処
理することにより所望のマリノスタチン同族体を個々に
単離することができる。
には、微生物代謝生産物を、その培養液から単離するた
めに用いられる通常の分離・精製法を利用することがで
きる。例えば、培養生産物を遠心分離法で培養液と菌体
とに分離し、得られた上清を例えば以下のようにして処
理することにより所望のマリノスタチン同族体を個々に
単離することができる。
即ち、前記上清をダイヤイオンHP−20、CM−セルロフ
ァインカラムクロマト、セファデックスＧ−25ゲル濾過
および高速液体クロマトグラフィーなどの手法を用いて
精製した。
ァインカラムクロマト、セファデックスＧ−25ゲル濾過
および高速液体クロマトグラフィーなどの手法を用いて
精製した。
実施例 次に実施例をあげて本発明を更に詳細に説明するが、
本発明の技術的範囲を以下の例に限定するものでないこ
とはいうまでもない。なお、マリノスタチンの阻害活性
はズブチリシンに対する阻害度から求めた。
本発明の技術的範囲を以下の例に限定するものでないこ
とはいうまでもない。なお、マリノスタチンの阻害活性
はズブチリシンに対する阻害度から求めた。
実施例１ 種菌としては、アルテロモナスsp.B−10−31（微工研
菌寄第8582号）を用いた。この菌株の１白金耳を500ml
容三角フラスコの種培地（ポリペプトン0.6％、グルコ
ース0.05％及び酵母エキス0.1％を含む海水（pH6.0））
100mlに植菌し、20℃で24時間振とう培養（200rpm）し
た。かくして得られた種培養液12mlを3L容三角フラスコ
中の本培地（培地組成：前記と同じ）600mlに植菌し、2
0℃で24時間振とう培養した。なお、培養中培地のpHは
制御しなかった。
菌寄第8582号）を用いた。この菌株の１白金耳を500ml
容三角フラスコの種培地（ポリペプトン0.6％、グルコ
ース0.05％及び酵母エキス0.1％を含む海水（pH6.0））
100mlに植菌し、20℃で24時間振とう培養（200rpm）し
た。かくして得られた種培養液12mlを3L容三角フラスコ
中の本培地（培地組成：前記と同じ）600mlに植菌し、2
0℃で24時間振とう培養した。なお、培養中培地のpHは
制御しなかった。
この培養液より菌体を遠心除去し、上清6.5Lを得た。
得られた上清にダイヤイオンHP−20樹脂（三菱化成
（株）製イオン樹脂）97.5gを添加し、生成マリノスタ
チン同族体混合物を吸着させた。１時間撹拌後、この樹
脂をカラムに充填し、カラムを0.01％酢酸2Lで洗浄し、
そして０〜100％の直線的に濃度変化するメタノールで
吸着成分を溶出した。溶出系の混合チャンバーには0.01
％酢酸750mlを含ませた。流速は60ml/hrに調整し、溶出
画分15mlを集めた。活性画分を一緒にし、これを減圧下
に40℃で濃縮した。
（株）製イオン樹脂）97.5gを添加し、生成マリノスタ
チン同族体混合物を吸着させた。１時間撹拌後、この樹
脂をカラムに充填し、カラムを0.01％酢酸2Lで洗浄し、
そして０〜100％の直線的に濃度変化するメタノールで
吸着成分を溶出した。溶出系の混合チャンバーには0.01
％酢酸750mlを含ませた。流速は60ml/hrに調整し、溶出
画分15mlを集めた。活性画分を一緒にし、これを減圧下
に40℃で濃縮した。
濃縮物を予め0.01％酢酸で平衡化したCM−セルロファ
インカラム（４×45cm）にかけ、280nmでの吸光度が０
になるまで酢酸でカラムを洗浄した。次に、０〜0.5Mの
直線的に変化する濃度でNaClを含む酢酸によって溶出さ
せた。流速60ml/hrで15mlづつの画分を集め、マリノス
タチン同族体を３画分Ａ、Ｂ及びＣに分離した（第３図
参照）。このうち画分Ａの量は少量であったので、更に
精製することはしなかった。画分Ｂ及びＣは分離し、以
下のように別々に精製した。
インカラム（４×45cm）にかけ、280nmでの吸光度が０
になるまで酢酸でカラムを洗浄した。次に、０〜0.5Mの
直線的に変化する濃度でNaClを含む酢酸によって溶出さ
せた。流速60ml/hrで15mlづつの画分を集め、マリノス
タチン同族体を３画分Ａ、Ｂ及びＣに分離した（第３図
参照）。このうち画分Ａの量は少量であったので、更に
精製することはしなかった。画分Ｂ及びＣは分離し、以
下のように別々に精製した。
即ち、画分Ｂ及び同Ｃを別々にダイヤイオンHP−20カ
ラム（２×20cm）にかけ、カラムを0.01％酢酸1Lで洗浄
し、90％メタノール水で溶出した。活性成分を集め、真
空下に濃縮し、0.2M NaClを含む0.01％酢酸で平衡化し
たセファデックスＧ−25カラム（2.5×85cm）にかけ
た。活性成分を同じ流出液を用いて流速12ml/hrで溶出
し、画分を5mlづつ集めた。活性画分を集め、ダイヤイ
オンHP−20カラム（２×20cm）にかけ、カラムを0.01％
酢酸500ml、次いで90％メタノール水で洗浄し、マリノ
スタチン同族体を含む溶出成分を減圧下に再度濃縮し
た。
ラム（２×20cm）にかけ、カラムを0.01％酢酸1Lで洗浄
し、90％メタノール水で溶出した。活性成分を集め、真
空下に濃縮し、0.2M NaClを含む0.01％酢酸で平衡化し
たセファデックスＧ−25カラム（2.5×85cm）にかけ
た。活性成分を同じ流出液を用いて流速12ml/hrで溶出
し、画分を5mlづつ集めた。活性画分を集め、ダイヤイ
オンHP−20カラム（２×20cm）にかけ、カラムを0.01％
酢酸500ml、次いで90％メタノール水で洗浄し、マリノ
スタチン同族体を含む溶出成分を減圧下に再度濃縮し
た。
この濃縮物は更に分取HPLCで精製した。マリノスタチ
ン同族体溶液を予めアセトニトリル−0.05％トルフルオ
ロ酢酸（1:4,v/v）混合溶媒で平衡化したODSカラム（20
×250mm）にかけ、同じ混合溶媒を用いて10ml/分の流速
で溶出させ、280nmでその吸光度をチェックした。以上
の操作により、前記CM−セルロファインカラムの画分Ｂ
及びＣはそれぞれ二つに分離し、その保持時間からＢ−
１、Ｂ−２、Ｃ−１及びＣ−２とした。結果は以下の通
りであった。
ン同族体溶液を予めアセトニトリル−0.05％トルフルオ
ロ酢酸（1:4,v/v）混合溶媒で平衡化したODSカラム（20
×250mm）にかけ、同じ混合溶媒を用いて10ml/分の流速
で溶出させ、280nmでその吸光度をチェックした。以上
の操作により、前記CM−セルロファインカラムの画分Ｂ
及びＣはそれぞれ二つに分離し、その保持時間からＢ−
１、Ｂ−２、Ｃ−１及びＣ−２とした。結果は以下の通
りであった。
得られた各画分をODS−1215−Ｎ−ヌクレオシルカラ
ムにアセトニトリル−0.05％トリフルオロ酢酸（1:4）
溶媒で溶出したところ、第２図（ａ）〜（ｄ）に示すよ
うにいずれも均質精製物であった。
ムにアセトニトリル−0.05％トリフルオロ酢酸（1:4）
溶媒で溶出したところ、第２図（ａ）〜（ｄ）に示すよ
うにいずれも均質精製物であった。
得られた本発明に係るマリノスタチン同族体Ｃ−１及
びＣ−２の物性は前述の通りであった。
びＣ−２の物性は前述の通りであった。
第１図は本発明に係るマリノスタチンの温度100℃にお
けるpH安定性を示すグラフである。 第２図（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）はマリノスチ
ンタＢ−１、Ｂ−２、Ｃ−１及びＣ−２の液体クロマト
グラフィーチャートである。 第３図はマリノスタチン同族体の精製分離工程における
溶出画分を示すグラフである。
けるpH安定性を示すグラフである。 第２図（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）はマリノスチ
ンタＢ−１、Ｂ−２、Ｃ−１及びＣ−２の液体クロマト
グラフィーチャートである。 第３図はマリノスタチン同族体の精製分離工程における
溶出画分を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (56)参考文献 Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｊａ ｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｓ ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｆｉｓｈｅｒｉｅ ｓ，51［５］（1985）Ｐ．805−810
Claims (1)
- 【請求項１】下記特性を有するポリペプチド同族体マリ
ノスタチン。 （１）マリノスタチンＣ−１ ａ）構成アミノ酸及び残基数 ｂ）分子量 1,418 ｃ）熱安定性 100℃、10分間加熱条件下でも失活しない。 ｄ）pH安定性 pH2〜８において安定 ｅ）作用 セリンプロテアーゼを阻害する。 （２）マリノスタチンＣ−２ ａ）構成アミノ酸及び残基数 ｂ）分子量 1,644 ｃ）熱安定性 100℃、10分間加熱条件下でも失活しない。 ｄ）pH安定性 pH2〜８において安定 ｅ）作用 セリンプロテアーゼを阻害する。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61005091A JPH0811758B2 (ja) | 1986-01-16 | 1986-01-16 | ポリペプチド同族体マリノスタチン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61005091A JPH0811758B2 (ja) | 1986-01-16 | 1986-01-16 | ポリペプチド同族体マリノスタチン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62164698A JPS62164698A (ja) | 1987-07-21 |
| JPH0811758B2 true JPH0811758B2 (ja) | 1996-02-07 |
Family
ID=11601720
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61005091A Expired - Lifetime JPH0811758B2 (ja) | 1986-01-16 | 1986-01-16 | ポリペプチド同族体マリノスタチン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0811758B2 (ja) |
-
1986
- 1986-01-16 JP JP61005091A patent/JPH0811758B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＢｕｌｌｅｔｉｎｏｆｔｈｅＪａｐａｎｅｓｅＳｏｃｉｅｔｙｏｆＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＦｉｓｈｅｒｉｅｓ，５１［５（１９８５）Ｐ．８０５−８１０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62164698A (ja) | 1987-07-21 |
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