JP2003267998A

JP2003267998A - トリプシンの新規インヒビターｔｕ−５３５０物質とその製造法及び用途

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Publication number: JP2003267998A
Application number: JP2002071791A
Authority: JP
Inventors: Masakazu Uramoto; 昌和浦本; Kiyoshi Hirasawa; 清平沢; Yasuyuki Tezuka; 保行手塚
Original assignee: Hokko Chemical Industry Co Ltd; Tamagawa Gakuen
Current assignee: Hokko Chemical Industry Co Ltd; Tamagawa Gakuen
Priority date: 2002-03-15
Filing date: 2002-03-15
Publication date: 2003-09-25
Anticipated expiration: 2022-03-15
Also published as: JP4095815B2

Abstract

(57)【要約】【課題】消化酵素トリプシンに酵素活性阻害作用をも
つトリプシンインヒビターとして有用な新規物質を提供
することを目的とする。【解決手段】 270〜280℃（分解）の融点と3697.5の分
子量をもつ白色粉末として、トリプシンインヒビターで
ある新規ペプチド、TU-5350物質がボーベリア・エスピ
ーAB5350株（FERM P-18715号）の培養により得られた。
TU-5350物質は、35個のアミノ酸残基よりなるアミノ酸
配列を有し、その構成アミノ酸は、下記の13種： Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Ile、Leu、Phe、
Lys、Trp、Arg である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は消化酵素トリプシン
に阻害活性を有してトリプシンインヒビターとして有用
である新規ペプチド、TU-5350物質（以下、単にTU-5350
物質と称することもある）に関し、またその製造法およ
びその用途に関するものである。

【０００２】更に詳しく言えば、本発明は、ボーベリア
属に属するTU-5350物質生産菌を培養して生産される新
規ペプチド、TU-5350物質に関し、またこのTU-5350物質
の製造法に関する。また本発明はTU-5350物質またはそ
の塩を有効成分とする農園芸用殺虫剤、あるいはヒトの
トリプシンの過剰蓄積に起因した疾病の治療用の医薬組
成物に関する。しかもまた、本発明は、TU-5350物質の
生産菌として有用である新規な微生物であるところの、
ボーベリア・エスピー AB5350（Beauveria sp.AB5350）
株に関するものである。本発明の新規ペプチド、TU-535
0物質は、植物に対する害虫、特にヨトウガに殺虫活性
あるいは幼虫生育抑制活性を有することから、農園芸用
殺虫剤として有用である。また、TU-5350物質は強力な
トリプシン阻害活性を有することから、トリプシンの過
剰蓄積が原因で引き起こされる疾病、例えば人間の急性
膵炎の治療用の医薬として期待される。

【０００３】

【従来の技術】マメ科植物、例えば大豆植物には、トリ
プシンインヒビターを含むいくつかのプロテアーゼイン
ヒビターが存在することが知られている（Yamamotoら、
J. Biochem. 94巻、849頁 (1983)）。植物におけるトリ
プシンインヒビターの役割はよくわかっていないが、そ
のトリプシンインヒビターは昆虫の発育を妨げることが
報告されている(R. Johnsonら、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 86巻、9871頁 (1989))。しかし、植物における
トリプシンインヒビターは約8,000〜20,000の大きい分
子量を有する蛋白質であること、植物中のその生成量が
微量であることから、植物から安価に製造することが難
しい。このため、植物におけるトリプシンインヒビター
は、その殺虫剤としての開発は行なわれていない。

【０００４】一方、近年、マメ科植物のトリプシンイン
ヒビター蛋白をコードする遺伝子を、異種植物に導入す
ることにより、耐虫性植物を作る試みが行なわれている
（R.Johnsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，86巻、9
871頁 (1989)、特開平11−075845号公報、等）。

【０００５】また、トリプシンインヒビターは脊椎動物
の膵臓、血漿、尿中に存在することが確認されており、
消化酵素トリプシンの活性を阻害する蛋白質であるトリ
プシンインヒビターが知られる〔B. Kasselら、Methods
Enzymol. 19巻; 844頁(1970)〕。このような医薬用途
に用いられている蛋白質性のトリプシンインヒビターと
しては、アプロチニン（牛の肺から抽出可能な物質）
や、ウリナスタチン（ヒトの尿から抽出可能な物質）が
知られている。アプロチニンおよびウリナスタチンは膵
の自己消化が原因とされる急性膵炎の治療薬として使用
されている。

【０００６】しかし、従来知られている蛋白質性のトリ
プシンインヒビターは、分子量が大きい物質であるか
ら、その製造における精製にはゲル濾過法等の複雑な方
法を用いなければならず、操作が煩雑になる欠点があ
る。また、その蛋白質性トリプシンインヒビターのほと
んどが動植物から抽出法により製造されており、価格も
高価にならざるを得ない。

【０００７】微生物は抗生物質の製造において使用され
ていることから明らかなように、微生物の使用は生理活
性物質の大量生産に適している。しかし、微生物が生産
するトリプシンインヒビターとしては、現在までにわず
かな物質しか知られておらず、そのトリプシン阻害効果
も充分なものではなかった。その例としては、アンチパ
イン(H. Sudaら、J. Antibiotics, 25巻、263頁(1972))
およびロイペプチン(H. Umezawaら、Chem. Pharm. Bul
l. 17巻、1986頁(1969))などがあげられる。

【０００８】

【発明が解決すべき課題】上述のように、トリプシンイ
ンヒビターは、農業場面に限らず医薬用途としても有用
な物質である。したがって、新規で安全な殺虫活性物質
は農業場面で待望されており、さらには、急性膵炎に有
効な治療薬は少なく、それらの新規な物質とその利用場
面の開発が強く望まれている。

【０００９】したがって、本発明の目的は、上記の課題
に対応する望ましい性質をもつ新規で有用なトリプシン
インヒビターを微生物の培養により提供することにあ
り、またそのような新規なトリプシンインヒビターの製
造法を確立することにあり、それらによって、従来技術
に伴う課題を解決しようとするものである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決することを目的として研究を重ねた。その一環と
して、種々の土壌および植物などから微生物を分離し、
その微生物が培養液中に生産するトリプシン阻害活性を
示す物質を収得することについて鋭意研究を重ねた。そ
の結果、本発明者らは、糸状菌の一種であるボーベリア
属に属する新規な菌株を培養し、その培養液中にトリプ
シン阻害活性を示す物質が生産されていることを発見し
た。そこで、研究の結果として、該微生物の培養物から
トリプシン阻害活性物質を分離・精製・単離することに
成功した。該物質はその化学構造および生物活性の対
象、効果などを含めた諸性質の点で既知物質と一致しな
い新規なペプチド物質であることを確認し、これをTU-5
350物質と称することにした。また、該TU-5350物質は、
中程度の分子量を持つペプチドであるが、熱に対して比
較的安定であり、濃縮など熱処理を要する工程でも失活
しない。また、高分子蛋白の精製単離に通常用いられる
ゲル濾過法は該TU-5350物質の精製工程で必要とせず、
低分子物質を精製単離する一般的方法で効率良く回収及
び精製単離することができるという、TU-5350物質の安
価な製造法が提供できることが判明した。

【００１１】すなわち、第１の本発明としては、トリプ
シンに対する阻害活性を有し且つ下記の物理化学性状と
下記のアミノ酸配列部分構造を有する新規ペプチド、TU
-5350物質を提供するものである。 (1) 外観；白色粉末 (2) 比旋光度（[α]_D ²⁵）； ‐268°(c 0.07、H
₂O)： (3) 融点； 270〜280℃（分解） (4) 分子量； 3697.5 (5) 紫外線吸収スペクトル（H₂O）；λ_maxnm(ε) 22
3(83677)、280(10563、肩吸収) (6) 赤外線吸収スペクトル（KBr錠剤法）；υ_max(cm
^-1) 3100〜3650、2926、1645、1541 (7) 構成アミノ酸の種類は下記の13種である：Thr、Se
r、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Ile、Leu、Phe、Lys、Tr
p、Arg (8) 本TU-5350物質は35個のアミノ酸残基よりなるアミ
ノ酸配列を有し、そのN末端の部分構造は下記の配列を
有する：（N末端）Ser−Gly−Ile−Cys−Trp−Arg−Ala−Cys−P
he−Pro−Ser−Pro−Pro−Ser−Cys−Pro−Glu−Gly−L
eu−Glu−Ala−Glu−Gln−Lys−* 但し、上記の式中で*は未確定の10個のアミノ酸残基よ
りなるアミノ酸配列を表す。

【００１２】また、第２の本発明によると、ボーベリア
属に属する前記の新規ペプチド、TU-5350物質の生産菌
を培地中で培養し、その培養物から前記のTU-5350物質
を採取することを特徴とする、ペプチド、TU-5350物質
の製造法が提供される。

【００１３】

【発明の実施の形態】次に、第２の本発明によるTU-535
0物質の製造法について説明する。本発明の方法で用い
られるTU-5350物質の生産菌は、TU-5350物質またはその
塩を産生する能力を有するものであれば、いかなる微生
物でもよい。具体的な例としては、本発明者らが神奈川
県足柄郡の土壌より新たに分離したボーベリア属の菌株
AB5350があり、この菌株は本発明の方法に最も有効に用
いられるTU-5350物質生産菌の一例である。

【００１４】このAB5350株の菌学的性質を以下に記載す
る。 (1) 各培地における生育状態 AB5350株のコーンミール寒天培地上における生育は良好
であり、25℃、12日間培養で得られる集落の直径は40〜
42mmに達する。集落はビロード状〜やや粉状を呈し、集
落表面は淡白色で、裏面も淡白色を呈する。菌糸は隔壁
を有し、培地中および培地上に伸長する。菌糸は直径が
1.5〜5.0μｍで、無色、平滑であり、分枝する。AB5350
株は、25℃で約１週間ほど培養すると、集落表面がやや
粉状を呈し、分生子の形成が観察される。分生子柄は気
生菌糸から直接、あるいは短い柄から生じ、分生子柄の
基部は亜球形状あるいはフラスコ状にふくらんでいる。
分生子柄の大きさは4.0〜10.0×2.0〜3.0μｍである。
分生子柄の先端は細く伸び、分生子形成に従ってジグザ
グ状を呈し、分生子柄の先端は長さ6.0〜20.0μｍ、幅
1.0〜1.5μｍである。分生子は単細胞で、無色、平滑、
球形あるいは幅広いだ円形を呈し、大きさが2.0〜4.0×
1.5〜3.0μｍであり、分生子柄の小突起状に出芽形成す
るシンポジオ型分生子である。

【００１５】麦芽エキス培地上におけるAB5350株の生育
は、コーンミール寒天培地上に比べやや遅く、25℃、12
日間の培養で集落の直径は21〜22mmに達する。集落は綿
毛状〜羊毛状を呈し、集落表面は白色で、裏面は淡黄白
色〜淡白色を呈する。ポテト・デキストロース寒天培地
上でのAB5350株の生育は、麦芽エキス培地上における生
育と同等で、25℃、12日間の培養で集落の直径は24〜25
mmに達する。集落は綿毛状〜羊毛状を呈し、集落表面は
白色で、裏面は淡黄白色〜淡白色を呈する。 (2) 生理的性質生育温度麦芽エキス寒天培地を用いて、5℃、10℃、15℃、20
℃、24℃、27℃、30℃および37℃の各温度で培養した結
果、AB5350株は10℃〜30℃まで何れの温度でも生育した
が、5℃および37℃では生育しなかった。生育最適温度
は24℃〜27℃と思われる。生育pH pHを3、4、5、6、7、8、9および10に調整した麦芽エキ
ス液体培地を用いて、25℃で培養した結果、AB5350株は
pH3〜10まで生育した。最適生育pHは、6〜8と思われ
る。

【００１６】以上の菌学的性質から、AB5350株の分類学
上の位置をジェイ・エイ・フォン・アークス著、ザ・ジ
ェネラ・オブ・ファンジャイ・スポルレイティング・イ
ン・ピュア・カルチャー、第３版、ジェイ・クレイマー
社、バダッツ、1981年（J.A. von Arx, The Genera of
Fungi Sporulating in Pure Culture, 3rd ed., J.Cra
mer, Vaduz, 1981）に従って検索した。その結果、本菌
株はボーベリア属に属することが認められ、本発明者ら
は、AB5350株をボーベリア・エスピー・AB5350（Beauve
ria sp. AB5350）と命名した。

【００１７】なお、AB5350株は独立行政法人産業技術総
合研究所生物寄託センターに寄託申請され、平成14年2
月19日、FERM P-18715号として受託されている。

【００１８】以上、TU-5350物質生産菌の一例としてのA
B5350株について説明したが、一般的には、菌類の菌学
上の性状は極めて変化しやすく、一定したものではない
ことがよく知られている。菌類は、自然的あるいは通常
行われている紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘発剤（例え
ば、N−メチル−N−ニトロ−N−ニトロソグアニジンお
よびエチルメタンスルホネート等）または遺伝子組換え
を用いる人為的変異手段により変異することは周知の事
実である。このような自然変異株ならびに人工変異株も
含め、ボーベリアに属し、TU-5350物質を生産する能力
を有する菌株は、すべて本発明に使用することができ
る。

【００１９】TU-5350物質の製造にあたって、本発明の
方法では、まず、ボーベリア属に属するTU-5350物質生
産菌を通常の微生物が利用しうる栄養物を含有する培地
中で培養する。TU-5350物質生産菌の培養においては、
微生物の培養に用いられる通常の培養方法が適用され
る。栄養源としては、TU-5350物質生産菌が資化しうる
炭素源および窒素源、ならびに無機塩などを適当な組成
で含有する培地であれば、天然培地、合成培地のいずれ
でも利用できる。

【００２０】資化しうる炭素源としては、グルコース、
シュクロース、ガラクトース、デキストリン、グリセロ
ール、澱粉、水飴、糖蜜、動・植物油等を利用できる。
また、窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、コーンステ
ィープリカー、綿実かす、肉エキス、ペプトン、酵母エ
キス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素などを
使用できる。そのほか必要に応じ、ナトリウム、カリウ
ム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐
酸、硫酸およびその他のイオンを生成することができる
無機塩類を添加することは有効である。また、TU-5350
物質生産菌の発育を助け、TU-5350物質の生産を促進す
るような無機物および（または）有機物を適当に添加す
ることができる。

【００２１】培養方法としては、好気的条件での培養
法、特に深部液体培養法が最も適している。培養に適当
な温度は、15〜30℃であるが、多くの場合24〜30℃で培
養する。TU-5350物質の生産は培地や培養条件によって
異なるが、振とう培養、タンク培養とも２〜１０日の間
でその蓄積が最高に達する。培養液中のTU-5350物質の
蓄積量が最高に達したときに培養を停止し、培養液から
発酵生産物を採取する一般的な方法に準じてTU-5350物
質の採取を行うのがよい。これらの培地の組成、培地の
液性、培養温度、撹拌速度および通気量等の培養条件
は、使用する菌株の種類および外部条件等に応じて、好
ましい結果が得られるように便宜調節あるいは選択す
る。液体培養において発泡がある場合はシリコン油、植
物油および界面活性剤等の消泡剤を便宜使用する。

【００２２】このようにして得られた培養物中に蓄積さ
れたTU-5350物質は、前述した物理化学的性状を有する
ので、その性状にしたがって培養物から回収し、分離精
製することが可能である。特に、以下の方法により効率
的に分離精製することができる。すなわち、蓄積したTU
-5350物質を培養物中から採取するに際しては、通常の
生理活性物質を培養物中から採取する方法が適用され
る。すなわち、培養物から濾過または遠心分離により菌
体を分離し、得られた培養ろ液から、イオン交換樹脂、
合成吸着樹脂、シリカゲル、シラナイズドシリカゲル、
アルミナ、セルロース、珪藻土、ゲル濾過剤、活性炭等
を用いるカラムクロマトグラフィーもしくは薄層クロマ
トグラフィーによる活性物質の吸脱着処理あるいは逆層
カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーなどを行う
ことによってTU-5350物質を分離することができる。

【００２３】第３の本発明によると、新規な微生物とし
て、前記のペプチド、TU-5350物質を生産できる特性を
持ち、かつ前記の菌学的な特徴を有するボーベリア・エ
スピー株AB5350株が提供される。

【００２４】第４の本発明によると、前記のペプチド、
TU-5350物質またはその塩を、有効成分として含有す
る、農園芸用殺虫剤が提供される。TU-5350物質を農園
芸用殺虫剤の有効成分として用いる場合には、その使用
目的に応じて単体でも用いることができるが、生物効果
を助長、あるいは安定化するためにTU-5350物質を適当
な担体および補助剤と混和して成る組成物を調製し、こ
れを適当な製剤とし、これを直接使用するかまたは必要
に応じて水で希釈して用いる。

【００２５】第５の本発明によると、前記のペプチド、
TU-5350物質またはその塩を有効成分として含有する医
薬組成物が提供される。本医薬組成物は急性膵炎治療剤
等の医薬品として期待される。TU-5350物質またはその
塩を医薬に有効成分として使用する場合には、単独でも
投与できるが、通常は担体、賦形剤と混合して散剤、錠
剤、軟膏剤、注射剤、経口剤、坐剤等の製剤として投与
する。配合される担体、賦形剤は製薬学的に許容される
ものであればいずれでもよく、その種類および組成は投
与経路や投与方法によって適宜選択する。投与量は、年
齢、体重等によって異なるが、通常は一日あたり成人に
対して前記のU5350物質の1mg〜1,000mg程度を経口的あ
るいは非経口的（例えば静脈に注射）に投与する。

【００２６】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明をより具体的に説
明するが、これは単なる一例であって、これによって本
発明が限定されるものではない。また、ここに例示しな
かった多くの変法あるいは修飾手段が用いられることは
言うまでもなく可能なことであり、有効な手段となり得
る。なお、実施例中に部とあるのは重量部を示してい
る。

【００２７】実施例１本例は、TU-5350物質の醗酵的製造例を例示する。TU-53
50物質生産菌の培養に用いた生産培地は、ブドウ糖 2.0
％、デキストリン 1.0％、ポリペプトン 0.5％、マルト
エキス 0.5％、酵母エキス 0.2％、炭酸カルシウウム
0.3％、Ｖ８ジュース（Cambel）の組成からなる（pH6.
5）。前記の生産培地100mlを分注した500ml容量バッフ
ル付き三角フラスコ50本（培地５Ｌ分）を121℃で20分
間滅菌した。滅菌された培地にフラスコ１本あたりボー
ベリア・エスピーAB5350株（FERM P-18715号）の斜面寒
天培養菌体の1〜2白金耳を植菌した。

【００２８】その後、ロータリーシェーカー（200rpm）
上で、25℃で４日間、回転振とう培養した。培養終了
後、得られた培養液を濾過することにより、培養濾液５
Ｌを得た。トリプシン阻害活性のある培養濾液をDiaion
HP-20カラムに吸着させ、蒸留水、30％メタノール水で
洗浄後、80％メタノール水で溶出させた。溶出液を減圧
濃縮後、凍結乾燥して粉末を得た(収量；2.245g；トリ
プシンの酵素活性を50％阻害する該粉末の濃度 IC₅₀＝3
00μg/ml)。

【００２９】次に、前記の粉末を水に溶解させ、その水
溶液を中性の状態でAmberlite IRC-50(H⁺)（登録商標）
カラムに通してTU-5350物質を吸着させた。カラムを蒸
留水で洗浄後、0.5N-NH₄OHで溶出させ、溶出液を減圧濃
縮後、凍結乾燥によって粗精製粉末を得た(収量；450m
g：トリプシンの酵素活性を50％阻害する該粉末の濃度I
C₅₀＝60μg/ml)。更に、この粗精製粉末を水に溶解し、
その水溶液をMCI GEL CHP-20P（登録商標）カラムに通
して活性物質を吸着させ、蒸留水、35％メタノール水で
洗浄後、55％メタノール水、80％メタノール水で段階的
に溶出させた。トリプシン阻害活性物質は、55％メタノ
ール水から80％メタノール水に移動層溶媒をきり代える
あたりで溶出された。その溶出液活性画分を減圧下に濃
縮、乾燥して白色粉末を得た(収量；140mg；IC₅₀＝16μ
g/ml)。

【００３０】その白色粉末を最終的に、CAPCELL PAC C
₁₈（10φ×250mm）カラム（登録商標）による分取HPLC
にかけることによって単一なTU-5350物質に精製された
(収量；23.38mg）。TU-5350物質の純品は、トリプシン
の酵素活性を50％阻害する濃度 IC₅₀が5.2μg/mlであっ
た。HPLC分析条件を以下に記す。展開溶媒：0.01％TFA（トリフルオロ酢酸）を含む20％
アセトニトリル水、流速：1.6ml/min 検出光：UV235nm 溶出時間： 17.5分このように精製単離したTU-5350物質は、上記HPLC及び
各種機器分析の結果、単一の純粋物質であることが確認
された。

【００３１】なお、各精製段階におけるTU-5350物質の
純度の指標は、トリプシン阻害活性の力価、すなわち後
記のトリプシン阻害率(％)を測定すことから算出した。
また、培養濾液からの単一な精製したTU-5350物質の収
率は、60％であった。トリプシン阻害率（％）の測定方
法は後記の試験例１に例示した。

【００３２】

【試験例】次に、本発明のTU-5350物質の生理活性を下
記の試験例により説明する。試験例１トリプシンに対するTU-5350物質の酵素阻害
活性の試験トリプシンは蛋白分解酵素の一種であり、例えば水に難
溶なカゼインに作用させると、カゼインが加水分解によ
り水に易溶なアミノ酸あるいは低分子ペプチドまで消化
分解される。カゼインの白濁した水溶液にトリプシンを
作用させた場合に、反応前のカゼインの白濁液がトリプ
シンと反応後、半透明な水溶液になる。このような性質
を利用して、トリプシンの酵素活性の阻害試験法を構築
した。

【００３３】すなわち、カゼインを寒天に封じ込めた寒
天平板培地(カゼイン平板培地)を作成し、次に、トリプ
シンを染み込ませた抗生物質力価検定用ろ紙ディスク
(直径8mm)をカゼイン平板培地におき、37℃で約一日作
用させると、ろ紙ディスクの周辺のカゼインが消化分解
し、半透明で円形の酵素反応ゾーンが形成する。トリプ
シンの酵素活性の阻害試験は、予め供試のトリプシンイ
ンヒビターを添加して一定時間トリプシンに作用させて
得た反応液を、抗生物質力価検定用ろ紙ディスク(直径8
mm)に染み込ませ、そのろ紙ディスクを上記カゼイン平
板培地上におき、平板培地上に形成される半透明で円形
の酵素反応ゾーンの直径を測定する。トリプシンインヒ
ビターの無添加の場合の試験区（対照区）の酵素反応ゾ
ーンの直径と、トリプシンインヒビターの添加の場合の
試験区（処理区）の酵素反応ゾーンの直径を比較するこ
とでトリプシンの残存活性の評価を行った。

【００３４】以下に、本試験例で行った試験方法を詳記
する。カゼイン平板培地は、１Ｌの20mM トリス−塩酸
緩衝液（pH7.5）にカゼイン500mgを懸濁させ、更に500m
Mの塩化カルシウム10mlと寒天15ｇを加え、120℃で20分
加圧滅菌後、シャーレに20ml分注して調製された。

【００３５】トリプシンインヒビターとトリプシンとの
反応液の調製は次のように行った。すなわち、1M 塩化
カルシウム 20μL、0.2M トリス−塩酸緩衝液（pH7.5）
20μLに100μg/ml濃度のトリプシン（ブタすい臓、和
光純薬製）20μLを加えて酵素溶液を調製し、このトリ
プシン溶液に対して、供試のトリプシンインヒビターを
蒸留水で適当に希釈したトリプシンインヒビター水溶液
140μLを加えた。その混合液の全量をトリス−塩酸緩衝
液で200μLにした後、37℃で15分間保温してトリプシン
とトリプシンインヒビターを反応させた（インヒビター
添加試験区）。他方、前記のトリプシン溶液に対してト
リプシンインヒビター無添加の蒸留水140μLを加えて37
℃で15分間保温してトリプシン含有の反応溶液（対照
液）を調製し、これをコントロール（無添加試験区）と
した。また、陽性比較対照区として、トリプシンインヒ
ビターとして知られているロイペプチン（Leupeptin；
和光純薬製）、大豆トリプシンインヒビター(和光純薬
製)及びニワトリ卵白トリプシンインヒビター(和光純薬
製)を用いて同様に試験した。

【００３６】次に、37℃で15分間保温後すぐの上記のト
リプシンインヒビターとトリプシンとの反応溶液40μL
を正確にはかりとり、これを直径8mmのろ紙ディスクに
染みこませ、このろ紙ディスクを上記カゼイン平板培地
上におき、37℃で20時間保温して、カゼインにトリプシ
ンを作用させた。20時間保温後、カゼイン平板培地上で
ろ紙ディスク周辺に形成される半透明で円形の酵素反応
ゾーンの直径を計測した。酵素反応ゾーンの直径から、
ペーパーディスクの直径（8mm）を引いた直径の差の値
は残存トリプシン活性と比例関係にある。従って、イン
ヒビターを添加した処理試験区の酵素反応ゾーンの直径
と、インヒビター無添加であったコントロール試験区の
酵素反応ゾーンの直径とを比べることによって、阻害さ
れなかったトリプシンの残存活性が算出されるので、次
の計算式からトリプシンインヒビターによるトリプシン
の酵素活性の阻害率（％）を求めることができた。

【００３７】トリプシン酵素活性の阻害率(％)＝100−
{〔インヒビター添加試験区の酵素反応ゾーンの直径か
らペーパーディスクの直径（8mm）を引いた値〕÷〔イ
ンヒビター無添加試験区の酵素反応ゾーンの直径からペ
ーパーディスクの直径（8mm）を引いた値〕}×100 また、トリプシン酵素活性の阻害率（％）は一定の濃度
範囲のトリプシンインヒビター濃度の対数値と比例関係
にあるので、トリプシンインヒビターの種々の濃度にお
けるトリプシン酵素活性の阻害率を求め、それらのデー
タを作図することによって、トリプシンの活性を50％阻
害するのに要するトリプシンインヒビター濃度（IC
₅₀値）を算定した。得られた試験結果の一例を次の表１
に示す。大豆及びニワトリ卵白トリプシンインヒビターは、それ
らの分子量が不明のためモル濃度でのIC_５０値を記載し
なかった。

【００３８】試験例２ヨトウガ幼虫にたいする殺虫及
び生育抑制試験本試験においては、供試幼虫としてヨトウガ孵化幼虫を
用い、餌にトリプシンインヒビターとしての本発明のTU
-5350物質を加え、摂餌によりTU-5350物質を幼虫にとり
こませた。このことによって得られる殺虫効果及び幼虫
の生育抑制効果を、肉眼的に観察する方法で試験した。
試験方法は以下のとおりである。

【００３９】人工飼料(インセクタLF、日本農産工業株
式会社製の商品名)にTU-5350物質を濃度1000ppmの配合
濃度になるように加えた。そのTU-5350物質添加飼料１
ｇを直径3.5cmのプラスチックシャーレに入れた。その
シャーレにヨトウガ孵化直後幼虫を20頭／シャーレの割
合で放虫し、27℃で８日間飼育した（処理区）。８日後
に、殺虫活性及び幼虫の生育抑制活性を調査した。この
調査に当って、生存している幼虫の体重を測定し、TU-5
350物質の無添加区（無処理区：コントロール）の幼虫
の体重と比較することによって幼虫生育抑制活性を評価
した。得られた結果の一例を次の表２に示した。

【００４０】表２に示すように、無処理区の生存虫数が15頭である
が、これに対し処理区では７頭である。TU-5350物質
は、明らかにヨトウガ幼虫に対し殺虫活性を示した。ま
た、処理区における生存幼虫の体重平均が、無処理区の
平均体重の３分の１以下であり、TU-5350物質はヨトウ
ガ幼虫に明らかな生育抑制効果を示した。

【００４１】

【発明の効果】本発明の新規トリプシンインヒビター、
AB5350物質は、以上に述べたようにトリプシン阻害活性
をもち且つ殺虫活性又は昆虫生育抑制活性を有すること
から、新規な農園芸用殺虫剤および医薬として有用であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｎ 9/99 9/99 Ｃ１２Ｐ 21/00 ＺＣ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:645 //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ａ６１Ｋ 37/64 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者平沢清神奈川県厚木市森の里三丁目８番２−305 号 (72)発明者手塚保行神奈川県厚木市森の里二丁目24番７号Ｆターム(参考） 4B064 AG23 CA05 CD01 CD10 CD13 CD20 CD21 DA12 4B065 AA57X AC14 CA24 CA48 4C084 AA01 AA02 AA06 AA07 BA02 BA04 BA08 BA19 CA05 DC34 MA28 MA31 MA35 MA43 MA52 MA66 ZA662 ZC202 4H011 AC01 BA01 BB19 BC18 DA11 DD07 DH11 4H045 AA10 AA20 AA30 BA09 CA15 DA56 EA06 FA73 GA22 GA23

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】トリプシンに対する阻害活性を有し且つ
下記の物理化学性状と下記のアミノ酸配列部分構造を有
する新規ペプチド、TU-5350物質。 (1) 外観；白色粉末 (2) 比旋光度（[α]_D ²⁵）； −268°(c 0.07、H
₂O)： (3) 融点； 270〜280℃（分解） (4) 分子量； 3697.5 (5) 紫外線吸収スペクトル（H₂O）；λ_maxnm(ε) 22
3(83677)、280(10563、肩吸収) (6) 赤外線吸収スペクトル（KBr錠剤法）；υ_max(cm
^-1) 3100〜3650、2926、1645、1541 (7) 構成アミノ酸の種類は下記の13種である：Thr、Se
r、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Ile、Leu、Phe、Lys、Tr
p、Arg (8) 本TU-5350物質は35個のアミノ酸残基よりなるアミ
ノ酸配列を有し、そのN末端の部分構造は下記の配列を
有する：（N末端）Ser−Gly−Ile−Cys−Trp−Arg−Ala−Cys−P
he−Pro−Ser−Pro−Pro−Ser−Cys−Pro−Glu−Gly−L
eu−Glu−Ala−Glu−Gln−Lys−* 但し、上記の式中で * は未確定の10個のアミノ酸残基
よりなるアミノ酸配列を表す。
【請求項２】ボーベリア（Beauveria）属に属し、請
求項１に記載の新規ペプチド、TU-5350物質を生産する
能力を有する微生物を培地中で培養し、その培養物中に
新規ペプチド、TU-5350物質を生成蓄積せしめ、次いで
その培養物から該TU-5350物質を採取することを特徴と
する、新規ペプチド、TU-5350物質の製造法。
【請求項３】請求項１に記載の新規ペプチド、TU-535
0物質を生産できる特性を持ち、かつ後記する菌学的特
徴を有するボーベリア・エスピー AB5350（Beauveria s
p.AB5350）株。
【請求項４】請求項１に記載の新規ペプチド、TU-535
0物質またはその塩を有効成分とする農園芸用殺虫剤。
【請求項５】請求項１に記載の新規ペプチド、TU-535
0物質またはその塩を有効成分として含有することを特
徴とする、トリプシンの過剰蓄積に起因した疾病の治療
用の医薬組成物。