NO144064B - Fremgangsmaate ved fremstilling av aclacinomycinene a og b - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte av den

art som er angitt i kravets ingress.

En rekke anthracyklinglykosider har blitt funnet i det

dyrkede brygget fra Streptomyces. Blandt disse er særlig daunomycin og adriamycin fulgt med spesiell interesse på kreftkjemoterapiens område og allerede anvendt klinisk mot menneskelige tumorer. I videreføringen av studiet av antitumorantibiotika fant de foreliggende oppfinnere nye forbindelser og etter karakterisering og rensing basert på deres fysiko-

kjemiske egenskaper, fastslo de at disse antibiotika

som bærer navnet aclacinomyciner A og B, er nye forbindelser som viser lav kardiotoksisitet og potensiell antitumor-

virkning hos forskjellige animalske tumorer, og de oppnådde fremgangsmåter for deres produksjon og isolering.

Farmitalias US-patent på adriamycin (B-I06FI, 14-hydroksy-

daunomycin) .er 3,59o,o28 og karakteriserer produktet ved struktur, og redegjor for dets direkte fermentering ved S. peuceticus var. caesius. Farmitalia fikk også utstedt US 3.8o3.124 for kjemisk omdannelse av daunomycin til ad-

riamycin, for direkte fermentering av daunomycin ( som antibiotika Fl 1762) ved S. peuceticus se GB l.oo3.383.

Farmitalias daunomycin . (GB l.oo3.383) kan være det samme

som Rhone-Poulencs 13o57 R.P. ( tidligere rubidomycin og Daunoribicin (GB 985.598, 1.188.262, 1.241.75o og se US 3.616.242)

og er "antagelig" identisk med Cibas danubomycin (US 3.o92.55o,

GB 9ol.83o). Se også US 3.686.163. på dihydrodaunomycin.

Cinerubin A og cinerubin B er omfattet i GB 846.13o og se også

US 3.864.48o og Keller-Schierlein et al "Antimicrobial Agents

and Chemotherapy',' side 68 (197o) og "Chemical Abstracts",

54, 1466i (196o).

For videre illustrerende og summariske redegjorelser av anthracyklin-antibiotika se "Index of Antiobiotics from Actinomycetes^

Hamao Umezawa, Editor-in-chief, University Park Press,

State College, Pennsylvania, USA (1967) som folger:

Tekstboken "Antibiotika", vol.l, "Mechanism of Action", utgitt av David Gottlieb og Paul D. Shaw, Springer-Verlag New York, Inc. N.Y. N.Y. (1967) på sidene 19o-21o inneholder en oversikt av A. DiMarco med titlen "Baunomycin and Related Antibiotics".

"Information Bulletin", nr. lo, International Center of Information of Antibiotics i samarbeid med WHO, des. 1972, Belgia, gir oversikt over anthracykliner og deres derivater.

For en beskrivelse av Streptomyces galilaeus se

"Arch. fur Mikrobiol., 31, 356 (1958) og "International Journal of Systematic Bacteriology", 22, 298, (1972).

Denne beskrivelse på side 37 referer seg til redegjorelse av K. Eckardt et al. over galirubiner, se "Chemical Abstracts'1

64, 3896g og 67, 9o573z.

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av antitumorvirksomme aclacinomyciner A og B. Disse forbindelser tolir fremstilt ved dyrkning av en aclacinomycin-produserende stamme av Streptomyces galilaeus i en vandig karbohydratopplosning som inneholder organiske nitrogennæringsstoffer under aerobe betingelser under vannet inntil en vesentlig mengde av aclacinomycin A og B

er oppstått i nevnte opplosning. Aclacinomycin A og B som er fremstilt i slik dyrkede brygg kan ekstraheres og renses ved konvensjonelle metoder som anvendes for ekstraksjon og rensing av vannopploslige antiobiotika. Fremgangsmåten er sær-preget ved det som er angitt i kravets karakteriserende del.

Ved foreliggende fremgangsmåte ernolaes aerfor antitumorantibiotika aclacinomycin A som

(a) hemmer effektivt ved vekåten av bukvattesot og faste

former av Ehrlich carcinoma, Sarcoma 18o, lymphoma 6o3HED og leukemia LI21o og P388 i mus , hepatomas i rotter og waccina virus Heha celler. (b) forhindrer effektivt veksten av forskjellige gram-positive bakterier og gjærsopper,

(c) kan isoleres som et gult mikrokrystallinsk pulver,

(d) er opploslig i organiske opplosningsmidler såsom

metanol, kloroform, etanol, etylacetat, aceton og benzen,

lite opploslig i vann, men uopploslig i eter, heksan,

og petroleumeter,

(e) har et smeltepunkt på 129°C - 135°C, og er optisk aktivt

med /q724 = +29° (C: l,o, CHCl-j) ,

(f) oppviser ultrafiolett og synlig absorpsjonsmaksima ved

229,5, 258, 29o og 434 (J-m i metanol,

229,5, 258, 29o og 434 ^m i o,1 N HCl-metanol,

239,5, 288, 314 og 523 txm i o, 1 N NaOH-metanol,

(g) viser karakteristiske absorpsjonsmaksima i infrarbdt spektrum ved 33oo, 3o8o, 294o, 286o, 174o, 164o, 162o, 154o, 146o, 145o, 1415, 1385, 1295, 125o, 122o, 1195, 1165, 1125, llo5, lo9o, lolo, 96o, 93o, 89o, 84o, 815, 76o, 73o, 58o og 45o cm<-1>, (h) gir rhodosamin ved sur hydrolyse, 2-deoksyfukose, cinerulose A, 1-deoksypyrromycin og aklavinon,

(i) er et svakt basisk anthracyklinglykosid med summe-

formelen C42H54NOi5'°9 antitumorantibiotika aclacinomycin B som (a) effektivt hemmer veften hos leukemia L121o og P388 hos mus

og vaccinia virus i HeLa celler,

(b) effektivt hemmer veksten gram-positive bakterier og gjærsopper ,

(c) kan isoleres som et gult mikrokrystalinsk pulver,

(d) er opplbselig i metanol, etylacetat, kloroform,

etanol, aceton og benzen, litt opploslig i vann, men uopp-løselig i eter, cykloheksan, heksan og petroleumeter,

(e) har et smeltepunkt på 135°C - 145°C, bg er optisk aktivt

ved Zq7p4 + 3° (C:l,o, CHC13),

(f) viser ultrafiolette og synlige absorpsjonsmaksima

ved 229,5, 257,5, 29o og 443 Hm i metanol

229,5, 257,5, 29o og 433 |im i o, 1 N HCl-metanol,

238, 286 til 289, 315 og 525 (im i o, 1 N NaOH-metanol,

(g) viser karakteristiske absorpsjonsmaksima i det infrarode spektrum ved 33oo, 3o7o, 294o, 285o, 275o, 174o, 164o, 162o, 154o, 1465, 1445, 141o, 138o, 129o, 1245, 1215, 116o, 112o, lo95, lo5o, lolo, 96o, 92o, 88o, 84o, 82o, 8o5, 75o, 725,

7oo, 6oo, 58o og 45o cm ~^

(h) gir aklavinon, rhodosamin, 2-deoksyfukose, 1-deoksy-pyrromycin og det samme metylerte disaccarid som cinerubin B ved sur hydrolyse eller partiell hydrolyse i metanol

(i) er et svakt basisk anthracyklinglykosid med summeformel <C>42<H>52<N0>15'

Mengden av aclacinomycin A og,B dannet av den nevnte organisme i nær ing smed i et, kan gjenvinnes ved

opplosningsmiddelekstraksjon, opplosningsmiddelfelling, konsentrasjon, gelfiltrasjon, motstromsfordelingsekstraksjon, geletering med metallioner og adsorpsjon etterfulgt av eluering fra en ionebytterharpiks, adsorbent i form av silikatmateriale eller syntetisk adsorbent.

Beskrivelse av tegninger.

Fig. 1 viser ultrafiolett adsorpsjonsspektrum for aclacinomycin A hvor A indikerer Tcurven i metanol, B indikerer kurven i o, 1 N HCl-metanol, C indikerer kurven i 0,1 N NaOH-metanol. Fig. 2 er det infrarode absorpsjonsspektrum for aclacinomycin A

presset i kaliumbromid.

Fig. 3 er NMR spektret av aclacinomycin A i CDC13 (loo MHz, intern standard: TMS). Fig. 4 er ultrafiolett absorpsjonsspektrum for aclacinomycin B hvor A viser kurven i metanol, B viser kurven i 0,1 N HCl-metanol, C viser kurven i o,1 N NaOH-metanol. Fig. 5 viser det infrarode absorpsjonsspekteret av aclacinmycin B presset i kaliumbromid. Fig. 6 er NMR-spektret for aclacinomycin B i CDCl-^ (loo MHz, intern standard: TMS).

Aclacinomycin A og B forlenger markert levetiden og bedrer tilstanden hos mus inokulert med leukemia L121o og P388

og lymphoma 6C3HED-celler, og viser hoy letal dose. (LD^Q)

for rotter, mus og kaniner og ekstremt lav kardiotoksisitet hos hamstere. Særlig forårsaker forbindelsene en bemerkelsesverdig hemmende effekt på veksten av forskjellig tumorceller under dyrkning som resul^tat av spesifikk hemming av RNA-syntese, og viser også sterk antimikrobiell virkning mot bakterier

og gjærsopper.

Aclacinomycin A og B oppnås som gult mikrokrystallinsk pulver som har summeformlene C42H54°i5N oa- C42H52<"'l5N ^v. og gir aklavinon, rhodosamin, 2-deoksyfykose, 1-deoksypyrromycin og cinerulose A fra aclacinomycin A, og aklavinon, rhodosamin, 2-deoksyfukose, 1-deoksypyrromycin og det samme metylerte disaccarid som cinerubin B fra aclacinomycin B ved sur hydrolyse eller partiell hydrolyse i metanol, de nevnte

substanser som er opploslige i metanol, etanol, kloroform,

- -aceton, etylacetat> benzen- og lignende, lite opploslige i vann, men uopplsolige i heksan, cykloheksan, eter og petroleumeter, og viser karakteristiske absorpsjonsmaksima i det infrarode området som tablett med kaliumbrom og i ultrafiolett og

synlig lys som vist i fig. 1,2,4 og 5 og har en NMR absorpsjons-spekter utstrakt som vist i fig. 3 og 6, har spesifikk dreining i kloroform og. smeltepunkt hhv. på+29° og 129°C til 135°C for aclacinomycin A og +3° og 135°C til 145°C for aclacinomycin B resp.

Skjont en rekke anthracyklinglykosidantibiotika er velkjente f.eks. adriamycin, daunomycin, carminomycin, rhodomycin, pyrromycin, aklavin etc, er aclacinomycinene fremstilt ved fremgangsmåten ifolge denne oppfinnelse klart forskjellig fra enhver av dem karakterisert ved summeformel, nedbrytnings-produkter ved nevnte sure hydrolyse, ultrafiolett, synlig, infrarodt og NMR-absorpsjonsspektra og lignende, som ovenfor beskrevet. Videre er deres hoye antitumorvirkning og bemerkelsesverdig lave kardiotoksisitet karakteristika som ikke vises av noen av anthracyklinglykosid-antitumorantibiotika.

Organismen som produserer antibiotika aclacinomycinene

A og B ble isolert fra en jordprove opptatt ved Osaki, Shinagawa-ku, Tokyo, Japan. En kultur av MA144-M1 ble deponert i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland og i Fermentation Research Institute, Japan og

inngikk" i deres permanente samlinger av mikroorganismer som A.T.C.C. nr. 311133 og FERM No. 2455, resp..

Stammen No. MA144-M1 har folgende egenskaper:

(1) Morfologiske egenskaper:

Under mikroskopet observerer man vel^utviklede åpne

spiraler fra et forgrenet substratmycel. Ingen kranser,

og den modne sporekjeden er middels lang med mer enn lo sporer. Sporene er ellipsodale og måler o,4 - o,8um x o,8 - 1,6 M-m, og overflaten er glatt.

(2) Egenskaper for forskjellige media:

Beskrivelsen i paranteser folger fargestandarden

"Color Harmony Manual" utgitt av Container Corporation of America, USA. (a) på glukose-aspartjinagar, inkubert ved 27°C lys gulbrun vekst ( 3gc, Lt. Tan), intet luftmycel,

intet opploslig pigment.

(b) Hos sukrose-aspaoginagar, inkubert ved 27°C fargelost til lys gulbrun vekst (3gc. Lt. Tan), intet luftmycel,

intet opploslig pigment.

(c) Hos glycerin-asparginagar (ISP medium No. 5),

inkubert ved 27°C: gulaktig orange (4ic, SUntan)

til brun (51 g., Cocoa Brown) vekst, hvitt til lysegrått (2fe, Covert Gray) lyftmycel, brunt opploslig pigment.

(d) På stivelse-uorganiske salteragar (ISP medium No. 4) inkubert ved 27°C: blek orange (3ea, Lt. Melon Yellow)

til blek gulbrun (3ie, Camel) vekst, lys grå (2fe, Covert Gray) til grå (e, Grey) luftmycel, bruntopploslig pigment.

(e) På tyrosinagar (ISP medium No. 7), inkubert ved 27°C: brungrå (31i, Beaver) til brun (41g, Toast Tan) luft-

mycel, sort opploslig pigment.

(f) På næringsagar, inkubert ved 27°C: fargelost til

gråbrun vekst, ingen luftmycel, brunt opploslig pigment.

(g) På gjærekstrakt-maltekstraktagar (ISP medium No. 2), inkubert ved 27°C: lysbrun (41e, Maple) til brun (4ng, Lt. Brown) vekst, lys grå (3fe, Sil ver Gray) til gra (3iH,

Beige Gray) luftmycel, brurt opploslig pigment.

(h) På havremelagar (ISP medium No. 3), inkubert ved 27°C: fargelost til lys gulbrun (2gc, Bamboo) vekst, lys grå (3fe, Si-lver Gray) luftmycel, brunt opploslig pigment. (i) På-glycerin-nitratagar, inkubert ved 27°C: fargelost til lys gulbrun (3gc, Lt. Tan) eller lys olivengrå (2 db, parchment) vekst, intet luftmycel, intet opploslig pigment (j) På stivelseagar, inkubert ved 27°C: lys gulbrun (3gc, Lt. Tan) vekst, grå ( e, Gray) luftmycel, svakt brunt opploslig pigment. (k) På kalsium-malatagar, inkubert ved 27°C: fargelos vekst, gråhvit (b, Oyster white) til lys brungrå (3dc, Natural) luftmycel, intet opploslig pigment. (1) På gelatinstav, inkubert ved 2o°Ci lys brun til lys gulbrun vekst, hvitt luftmycel, brunt opploslig pigment,

(m) På glukose-pepton-gelatin-stav, inkubert ved 27°C:

lys brun til brun vekst, intet luftmycel, brunt opploslig pigment.

(n) På skummet melk, inkubert ved 37°C: lys brun til brun vekst, intet luftmycel, brunt opploslig pigment.

3) Fysioligiske egenskaper:

(a) Veksttemperaturen ble undersokt på maltose-gjær-ekstraktagar (maltose 1%, gjaerekstrakt o. 4%, agar 3,5%, pH

6,o) ved 2o, 24, 27, 3o, 37 og 5o°C. Optimal temperatur for vekst var 27°C til 37°C og ingen vekst ved 5o°C.

(b) Gelatinsmeltning på 15% gelatinstav ved 2o°C:

og på glukose-pepton-gelatinstav ved 27°C: ved det forste medium ble gelatinsmelting svakt observert ved 14 dagers inkubasjon, men på sistnevnte svak eller moderat smelting etter 7 dagers inkubasjon. (c) Hydrolyse av stivelse i stivelse-uorganisk saltagar ved 27°C: svak hydrolyse ble observert etter 5 dagers inkubasjon. (d) Peptonisering og koagulering av skummet melk ved 37°C: moderat til sterk peptonisering begynte etter 5 dagers inkubasjon og endte ved rundt 17 dager. Ingen

koagulering.

(e) Melanindannelse på tyrosinagar (ISP medium No. 7), tyrosin-gjærekstrakt-brygg (ISP medium No. 1) og pepton-gjærekstrakt-jernagar (ISP medium No. 6) ved 27°C:

positiv i alle media.

(f) Smelting av kalsiummalat på kalsiummaltagar ved 27°C; sterk positiv. (g) Nitratreduksjon ved peptonagar inneholdende l,o% natriumnitrat (ISP medium No. 8) ved 27°C: positiv. (h) Forbruk av karbohydrater fra Pridham-Gottlieb basal medium (ISP medium No. 9) inkubert ved 27°C: Rikelig vekst ved L-arabinose, D-xylose, glukose, D-fruktose, sukrose, inositol, L-rhamnose og raffinose, ingen vekst ved D-mannitol.

En summering av ovenstående karakteristika av No. MA144-M1 gir at stammen tilhorer arten Streptomyces og er en kromogen type og produserer et brunt opploslig pigment på forskjellige agar-medier. Luftmycel danner åpne spiraler, men ingen kranser. Sporeoverflaten er glatt. Veksten på forskjellige medier

blir funnet til å være vanligvis lys gulbrunt til brunt, men

oliven i noen få medier, og luftmycelet er lysegrått. Nitrat blir redusert til nitritt. Den proteolytiske virkning er svak til middels og hydrolyse av stivelse er temmelig svak. Melanin produseres på tyrosinagar, tyrosingjærekstraktbrygg og pepton-gjærekstrak-jernagar.

Blandt kjente typer av Streptomyces, stammen nr. MA-144-M1 ligner Streptomyces galilaeus.

Referanse 1: Archiv fur Mikrobiologie, 31, 356, 1958.

Referanse 2: International Journal of Systematic Bacteriology,

22, 298, 1972.

Med særlig oppmerksomhet med hensyn til differansiering basert på morfologi, fargen av luftmycelene og andre fysiologiske egenskaper, ble forskjellen mellom den foreliggende stamme og standardstammen av Streptomyces galilaeus ISP 5481 som forelå, undersokt ved parallelle kulturer. Resultatene er som folger: Resultatene viser at den foreliggende stamme står i nær overensstemmelse med Streptomyces galilaeus ISP 5481 i morfologi og fargen på veksten og mycelet på forskjellige medier og fysikologiske egenskaper. Videre eksisterer likheter mellom begge stammene i fermenteringsproduktene, dvs. at cinerubin som kan produseres av Streptomyces galilaeus er ett av bi-produktene av den foreliggende stammen. Derfor kan stammen nr. MA144-M1 identifiseres som Streptomyces galilaeus.

Som ved de kjente antibiotika kan det ventes at hoyere produksjon av aclacinomycin kan oppnås ved seleksjon av hoyt produktive stammer etter utvalg av enkelte kolonier,

gjennom behandling av en aclacinomycinproduserende stamme med forskjellige mutaCgener eller ved de genetiske fremgangsmåter for rekombinasjon, transformasjon eller transduksjon.

Aclacinomyciner blir fremstilt ved dyrkning av Streptomyces galil^aeus under egnede betingelser. De alminnelige fremgangsmåter anvendt for dyrkning av andre actinomyceter er anvendbare for dyrkning av Streptomyces galilaeus. Et fermen-tasjonsbrygg som inneholder aclacinomycin fremstilles ved å inokulere sporer eller mycel av aclacinomycinproduserende organismen i et egnet medium og så dyrke den under aerobe betingelser. Skjont dyrkning på et fast medium er mulig for produksjon av aclacinomycin er neddykkede aerobe kulturer særlig fordelaktige for produksjon av store mengder av antibiotika. Mediet som består av kjente typer av næringskilder for actinomyceter er brukbare. Mediet inneholder fortrinnsvis kommersielt tilgjengelige produkter slik som glycerin, glukose, stivelse, dekstrin, maltose, molasser, oljer, fetter, lipider og lignende som karbonkilder i enten renset eller rå tilstand, og som nitrogenkilder, kommersielt tilgjengelige produkter

slik som sojabbnnemel, maltekstrakt, pepton, gjærekstrakt,

destillasjons.rester, fiskemel, glutenmel, maislut, bomulls-froolje, kasein, hydrolyserte proteinsubstanser, nitrater, ammoniumsalter, urea og lignende, og uorganiske salter såsom natriumklord, kaliumklorid, kaliumfosfat, magnesiumsulfat, kalsiumkarbonat og sporelementer av tungmetallsalter slik som kopper, sink, mangan,jern og lignende. I den beluftede dypkulturen anvendes en antiskum såsom flytende paraffin, sbyabonneolje, fett eller silikon. Enhver fermenter.ings-temperatur kan anvendes innen området 2o°C - 35°C, hvor en aclacinomycinproduserende organisme kan vokse, skjont det foretrukne temperaturområdet er 25° - 3o°C. pH for kulturen ligger mellom 5 - 8,0.

Med mindre ellers spesifisert er metoden for dyrkningen og bestemmelsesmetoden som folger:

(1) Rystekultur: loo ml medium i en Sakaguchi flaske eller

5o ml medium i en Erlenmeyer flaske på 5oo ml blir sterilisert ved 12o°C i 15 min. Sporer eller mycel fra en aclacinomycin-produserende organisme blir inokulert i det sterile mediet fra en agarplatekultur ved en platinalokke og kultivert ved 28°C i 4 dager på en rettlinjet eller roterende rystemaskin. (2) Tankkultur: loo liter medium fremstilles i en 2oo liter fermenteringstank og blir sterilisert ved 12o°C i 15 min.

Det steriliserte medium blir inokulert med 2 liter av dyrket brygg fremstilt ved foregående rystekultur i 2 dager. Fermenteringen i tanken foregår under beluftning av 5o liter steril luft pr. min., og roring ved 16o r.p.m i 2 dager. Silkonolje og flytende parafin anvendes som antiskumningsmiddel.

(3) Bestemmelse av aclacinomycin: : TLC-kromatoscanner-

metode: aclacinomyciner A og B blir ekstrahert fra det dyrkede brygg, mycel eller filtrert kultur med aceton, etylacetat eller kloroform-metanol-blanding og dryppes på silikagelplaten (Kieselgel 60F2134, Merck Co.) med 5 mm diameter. Etter 15 min. metning i kromatografikammeret,

blir tynnsjiktskromatografiplaten utviklet med stigende aceton til 15 cm ved romtemperatur. Flekker tilsvarende aclacinomycin A og B bestemmes ved optisk tetthet ved 43o |im ved anvendelse

Shimadzu Dual-tfave length TLC Scanner, Model CS-9oo,

under en definert betingelse, Sikk-Sakk-scanning ved 43o M-m-7oo \ im, 1, 25 x 1,25 ^m åpning, lo mm/min. "scan"og"Ghart"-hastighet. Standardkurvene for renset aclacinomycin A og B opptas forut og varierer fra o,2 - 15 mcg/flekk.

Den aclacinomycinproduserende stamme ble forst dyrket i rystekultur i det folgende medium.

Basismediumet består av 1% glukose, 1% potetsstivelse, 1,5% "Prorich" (soyabonnemel, produkt fra Ajinomoto Co.), o,l%KH2P04, o,1% MgS04.7H20, o,3%NaCl, o,ooo7% CuS04.5H20, o,oool% FeS04.7H20, 0,0008% MnCl2.4H20 og o,ooo2% ZnS04.5H20 og justert til pH 7,o.

Det dyrkede brygg viste på 4. dag en akkumulering på 45 meg/ ml aclacinomycin A og 15 mcg/ml aclacinomycin B.

Aclacinomycin A og B ble dyrket i mediet som inneholdt forskjellige karbon- og nitrogenkilder under rystende betingelser som vist ved eksemplene beskrevet i det folgende: (1) Forskjellige karbonkilder ble satt til basismediumet som bestå av 1,5% "Prorich" og andre salter som folger: (2) Forskjellige nitrogenkilder ble satt til basismediet bestående av 1% glukose, 1% potetsstivelse og andre som folger: (3) Når konsentrasjonen av karbon- og nitrogenkilder i basismediet ble variert, akkumulerte aclacinomycin A og B som folger:

Resultatene ovenfor er bare eksempler og det kan sies at karbonkilder slike som glukose, stivelse, maltose og sukrose er fordelaktige for fremstilling av aclacinomycin og nitrogenkilder slik som soyabonnemel, gjærekstrakt, kjottekstrakt og pepton er velegnet.

Når fermenteringen ble utfort ved 28°C i rystekultur ved bruk

av ett av de egnede medier ved pH 6,9, f.eks. 2% glukose, 2% potetsstivelse, 2,5% "Meat", o,1% KH2P04, o,1% MgS04.7H20, o,ooo7% CuS<0>4.5H20, o,oool% FeS04.7H20, 0,0008% MnS04.4H20 og o,ooo2% ZnS04.5H20, falt pH i mediet til 5,25 til 5,lo etter 2o timer

og veksten av mycelet oket ved lo timer etter inoculering.

Deretter steg pH til 7,o -7,5 etter 3 dager og aclacinomycin A og B nådde et maksimum f.eks. 46 mcg/ml av A og 23 mcg/ml av B

i brygget. For å isolere aclacinomycin kan antibiotikaene ekstraheres med et egnet opplosningsmiddel enten fra det dyrkede brygg "in toto" uten filtrasjon av mycelmassen eller fra mycelet og væskekulturen forut separert ved filtrasjon. Mesteparten av antibiotikumet sitter i filterkaken som består av mycel blandet med de diatoméjord. Deretter mases filterkaken og rores i et organisk opplosningsmiddel for å ekstrahere ut antiobiotika.

Egnede opplosningsmidler er alkoholer slik som metanol, etanol, butanol, ketoner slike som aceton, metyletylketon,

halogenerte hydrokarboner som kloroform, metylenklorid, benzen, eller vandige oppløsninger av organiske eller uorganiske syrer slik som eddiksyre, saltsyre, svovelsyre. Det foretrekkes aceton, etylacetat, blandinger av organiske opplosningsmidler slik som alkoholer og vann-ublandbare ketoner og vandige opplosninger av uorganiske eller organiske syrer.

For å ekstrahere antibiotikaene i filtratet er det fordelaktig

å tilsette en dobbel volumdel av et organisk opplosningsmiddel ikke-blandbart med vann slik som butanol, kloroform, etylacetat, butylacetat eller benzen, til det svakt surgjorte eller nøytra-liserte filtratet. Blandt separasjonsmetodene for aclacinomycin kan de effektive utfores med motstroms fordelingskromatografi ved anvendelse av kiselsyre, aluminium "Sephadex LH2o"

(Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) eller syntetiske adsorbenter, adsorpsjon på aktivt kull og lignende, og kombinasjon av opplosningsmiddelekstraksjon og disse metodene.

Antibiotikaene kan ekstraheres direkte fra det dyrkede brygg

ved ovennevnte metoder uten separasjon fra mycelet.

Etter konsentrasjon in vacuo, innstilles ekstraktene på en pH mellom 5 og 7 og re-ekstraheres med et opplosningsmiddel ikke blandbart med vann, f.eks. n-butanol, amylalkohol, etylacetat, kloroform, benzen, metylenklorid, metylpropylketon og lignende.

Fra den ikke-vann-blandbare organiske oppløsningen utvinnes det aktive råproduktet som et gult pulver ved oppkonsentrering i vakuum til et lite volum og felling med upolare opplosningsmidler, f.eks. mettede hydrokarboner slik som n-heksan, cykloheksan og petroleter eller etere såsom dietyleter og dipropyleter.

For å fjerne andre fargede substanser slik som cinerubin A og B

fra det aktive råprodukt og oppnå rent aclacinomycin A og B

må videre rensing utfores ved kolonnekromatografi ved anvendelse av forskjellige adsorbenter slik som kiselsyre, alumina,

"Sephadex LH2o" ved ionebytte slik som svakt sure harpikser og polystyren-divinylbenzen kryssbundne matriksharpikser slik som "Amberlite XAD", ved geletering med forskjellige metaller

slik som kopper, jern, jern(II), iern(III), kalsium og magnesium-ioner, og ved kombinasjoner av minst én eller flere fremgangsmåter valgt fra metodene gelatisering med metallioner, felling med opplosningsmidler, opplosningsmiddelekstraksjon, motstrdms-fordeling etc.

For eksempel når det rå aclacinomycinene A og B ble opplost

i en liten mengde kloroform, helt på en kiselsyrekolonne

og deretter eluert med kloroform-metanol-blanding, ble aclacinomycin B fraksjonen forst eluert med eh 5o:l kloroform-metanol-

blanding og deretter aclacinomycin A med ovenstående blanding i forholdet 3o:l - 2o:l. Eluatene av aclacinomycinene A og B

ble hver for seg konsentrert i vakuum og ble videre atskilt fullstendig fra cinerubin A og B og en liten mengde av fargede forurensninger ved hjelp av kolonnekromatografi på syntetisk adsorbent, f.eks. CoiLumn Lite (Al203.Mg0.2Si02.4H20, Fuji Chemical Cp.), Floridil (activated magnesium silicate,

Floridin Co.) hydroksylapatet, eller ved tilsetning av

1 x lo<-3> til lx lo<-2> M CuS04, FeCl3, FeSC>4 eller MgSC>4 for å danne gelatkomplekser av cinerubin A og B fulgt av kolonne-kromatograf i på "Sephadex LH 2o". De resulterende opplosninger av rent aclacinomycin A og B kan konsentreres i vakuum til torrhet, og også bli lyofilisert alene eller med minst én substans utvalgt fra serum albumin, globulin, gelatin, glycerin, sukkere, aminosyrer, uorganiske eller organiske syrer etc.

Aclacinomyciner A og B oppnådd ved en kombinasjon av de

ovenfor nevnte metoder og beskrevet i eksemplene nedenfor ble vist å være rene og enhetlige ved en flekk i tynnsjiktskromatografi ved anvendelse av forskjellige opplosningsmiddelsystemer, konstant smeltepunkt og dekstrorotasjon, elementæranalyse? karakteristiske topper på ultrafiolett synlig NMR og infrarbdt adsorpsjonsspektrum og har de folgende egenskaper:

Aclacinomycin A:

Svakt basis og lipofilt gult pulver eller mikrokrystallinsk pulver. Elementæranalysen gir folgende resultater:

Molekylar vekt = 813.

Smeltepunkt og dekstrorotasjon (/ cc/^) for 1% opplosning i kloroform var resp. 129 - 135 C og +29 . Absorpsjonsspekteret i ultrafiolett og i de synlige regioner (fig. 1) viser bånd ved folgende bølgelengder:

Tablettert med kaliumbromid gir det infrarode spekteret folgende karakteristiske bånd (fig. 2) ved de folgende bolgetall i cm"<1>: 33oo, 3o8o, 294o,,286o, 276o, 174o, 164o, 162o, 154o, 146o, 145o, 1415,, 1385, 1295, 125o, 122o, 1195, 1165, 1125, llo5, lo9o, lolo, 96o, 93o, 89o, 84o, 815, 76o, 73o, 58o. og 45o. Proton-NMR-spekteret ble opptatt på en "Varian XL-loo-15" spektrofotometer som opererte i Fourier transformasjons modus ved loo MHz som vist i fig. 3.

Antibiotikumet aclacinomycin A er opploslig i metanol, etanol, kloroform, etylacetat, aceton, benzen, dimetylsulfoksyd (DMSO)

og metylcellosolv, er lite opploslig i vann men eruopploslig i etyleter, heksan, cykloheksan og petroleter. Den vandige opplosning er gul og slår om til rødbrun i konsentrert svovelsyre. Med alkoholisk magnesiumacetat utviser denne oppløsningen en purpurrød farge og slår om til rod purpur med alkali.

Aclacinomycin B:

Svakt basisk,, lipofil og gult pulver eller mikrokrystallinsk pyIver. Elementæranalysen gir folgende resultater:

Molekylarvekt = 811

Smeltepunktet er 135°C til 145°C og dekstrorotasjon

(/°é7d 24 ) er + 3 o. Absorpsjonsspekteret i de ultrafiolette og i det synlige områder ( fig. 4) viser bånd ved folgende bølge-lengder :

Det infrarode spekteret (fig. 5) viser karakteristiske absorpsjons-bånd ved folgende bølgelengder i cm<->"<1>" (KBr) : 33o, 3o7o, 294o,

285o, 275o, 174o, 164o, 162o, 154o, 1465, 1445, 141o, 138o,

129o, 1245, 1215, 116o, 112o, lo95, lo5o, lolo, 96o, 92o, 88o,

84o, 82o, 75o, 725, 7oo, 6oo, 58o og 45o. NMR for aclacino-

mycin B er vist i fig. 6.

Antibiotikumet er opploslig i metanol, etanol, kloroform, etylacetat, aceton og vandig syre, er lite opploslig i vann men er uoppløselig i heksan, cykloheksan og etere. Den vandige opplosning er gul og endrer seg til dyp rodlig purpur i konsentrert svovelsyre. Denne oppløsningen viser purpurrød i alkoholisk magnesiumacetat og gir rod purpur i alkalisering.

Aclacinomyciner A og B har folgende Rf-verdier på silikagel tynnsjiktskromatogrammer ved anvendelse av forskjellige opplosningsmiddelsystemer.

Ved partiell hydrolyse eller metanolyse med fortynnet

saltsyre eller i metanol inneholdende 5% saltsyre i 1 - 2

timer ved romtemperatur gir aclacinomycinene A og B metylerte disakkarider og 1-deoksypyrromycin. De fysikokjemiske egenskaper såsom absorpsjonsspekteret i infr.arodt, ultrafiolette, synlige områder og NMR, smeltepunkt og dekstrorotasjon for det metylerte disakkarid erholdt fra aclacinomycin B var i full overensstemmelse med dem fra metylert disakkarid erholdt fra partiell sur hydrolyse av cinerubin B^Helvetica Chimica

Acta, _55, 467-48o, 1972), og 1-deoksypyrromycin ble også identifisert med data fra rhodomycin (Chem. Ber. 38 , 1762, 1955, Naturwiss., 48, 716, 1961), cinerubin (Chem. Ber. 92, 1868,

1959) og pyrromycin (Chem. Ber. 92, 19o4, 1959). på grunnlag NMR-spekteret, massespektrum av aglycon og nærvær av

rhodosamin i det sure hydrolysat.

Aclacinomyciner A og B spaltes til et noytralt aglycon og to eller tre reduserende sukkere ved hydrolyse med o,3 N svovelsyre i 3 timer ved 85°C. Aglyconet danner orange gule krystaller med

■ smeltepunkt 171 - 174°C og inneholder oksygen, karbon og hydrogen. Elementæranalyse,infrarodt, ultrafiolett og NMR-spektrum, fragment ionetopper i masse-spektrum og andre egnskaper demonstrer at aglyconet fra aclacinomycin A og B

er aklavinon (Tetrahedron Letters,_8, 28, 196o, Naturwiss.,

47, 135, 196o, Naturwiss. 42, 154, 1955, Naturwiss. 5o, 92, 1963). Videre, ifolge sammenlignende analyse av sukkerene i det sure hydrolysatet av aclacinomycin A og B og cinerubiner A og B ved tynnsjiktskromatografi har aclacinomycin A det samme rhodosamin, 2-deoksyfukose, og cinerulose A som cinerubin A og aclacinomycin B har det samme rhodosamin og 2-deoksyfukose som cinerubin B.

Utfra ovennevnte resultater er strukturene for aclacinomyciner

A og B i den foreliggende oppfinnelse som folger:

Aclacinomvcins struktur hvori R for aclacinomycin 'betyr eller for aclacinomycin B betyr:

Aclacinomycinene A og B ( ifolge deres fysikokjemiske egenskaper og strukturer som ovenfor beskrevet og ved sammenligning med kjente antibiotika rapportert i publikasjonene) tilhorer gruppen antracyklinglykosider og lignende med cinerubiner A og B, rutilantin, aklavin, requinomycin og galirubiner.

Cinerubin og rutalantin er forskjellige fra de foreliggende antibiotika derved at dets aglycon er £-pyrromycinonon (Tetrahedron Letters, 16, 17, 1959). Blandt de antiobiotika

som har aklavinon som aglycon, er requinomycin (J. Antibiotics, 25, 393, 1972) og aklavin (J. Bacteriol., 72, 9o, 1956)

ikke identiske med de foreliggende antibiotika i.sukkerdelen og summeformelen basert på elementæranalyse. Galirubiner som produseres av Streptomyces galilaeus er mest lik de foreliggende antibiotika. K. Eckardt har rapportert at fire bestanddeler av galirubin ( galirubin D, C, B og A) er isolert fra mycelet av Streptomyces galilaeus og at galirubin A var <S-pyrromycinon glycosid,B var aklavinon glycosid, galirubinon C var - pyrromycinon og galirubinon D var 7-deoksyaklavinon. Med hensyn til de systemiske egenskaper hos galirubin B som har aklavinon som aglycon, har ikke rapporten klart utfort dens detaljerte rensemetode, kromatografiske egenskaper, smeltepunkt, elementæranalyse, absorpsjonsspektret i infrarodt, ultrafiolett, synlige områder og NMR, og bare fastslått at to sukkerflekker ble oppdaget i det sure hydrolysat av galirubin B ved papirkromato-grafi.

er

Derfor/aclacinomycinene A og B, som har aklavinon som aglycon og tre sukkere, klart forskjellige fra galirubin B ifolge de ovenfor angitte egenskaper. Det er verifisert at de foreliggende antibiotika er nye substanser oppdaget av de foreliggende oppfinnere.

Terapeutisk anvendbare ikke-toksiske salter og deoksy-ribonuklein-syre, .(DNA)-komplekser av antibiotika aclacinomyciner A og B

kan avledes fra organiske og uorganiske syrer , f.eks. saltsyre, fosforsyre, svovelsyre, eddiksyre, propionsyre, oleinsyre, palmitinsyre, sitronsyre, ravsyre, glutaminsyre, pantotensyre og DNA isolert fra kalvethymus, HeLa-celler, menneskelige embryoceller, E. coli og andre dyr og mikroorganismer.

Aclacinomycinene A og B's biologiske egenskaper er som folger: (1) Det antimikrobiske spektrum for aclacinomyciner A og B ble fastslått ved fortynning av brygget som folger: (2) Antitumor virkning: Videre viser antibiotika aclacinomycin A og B markert hemmende virkning på eksperimentelle animalske tumorer av ascitsle og faste tumorer. Denne antitumorvirkning kan klarerst demonstreres i leukemi hos mus og hepatomas hos rotter. F.eks. når BDF. mus som veier 18 - 22 g blir 6 5 inokulert med 1 x lo celler av P388 celler eller 5 x lo celler av L121o celler intraperitonealt og aclacinomycin A og B og aclacinomycin A-DNA-kompleks blir tilfort intraperitonealt en gang daglig over lo dager etter hverandre 24 timer etter inokulering, forlenges overlevningstiden for musen merkbart i en storrelse på over 15o% i doseområdet o,5 - 5 mg/kg kroppsvekt pr. dag sammenlignet med kontroll-musene som ikke mottok noe antibiotika, som vist i den folgende tabell:

Når CH3/He mus som veier 2o - 23 g blir inokulert med 1 x lo<7 >celler av lymfoma 6C3HED/OG intraperetonealt eller med 5 x lo^ celler av lymfoma 6C3HED/OG subkutant og aclacinomycin A blir administrert intraperiotnealt en gang daglig i lo påfolgende dager 3 timer etter inokuleringen,viser aclacinomycin A markert hemming av veksten av scitisk eller fast 6C3HED/OG tumor som vist i den folgende tabell.

Mus blir inokulert intraperitonealt med en suspensjon av

L121o leukemiceller og behandlet med opplosninger av forskjellige konsentrasjoner ac aclacinomycin A og 1, 5 og 9 dager påfolgende tumorinplantasjonen. Den folgende tabell hvor de oppnådde resulter er sammenfattet, viser at aclacinomycin A gitt i doseringer på 6 og 3 mg/kg/dag, betraktelig har foroket den midlere overlevningstid for de behandlede mus.

Donryu rotter podet med ascitisk hepatoma AH44 ble behandlet intraperiotnealt i lo påfolgende dager med 2 mg/ kg/dag aclacinomycin A. Mens kontrollrottene hadde en gjennomsnittlig overlevningstid på 14,5 dager etter tumorinplantasjonen, var de behandlede rotter i live tredve dager etter eksperimentet.

3) Akutt toksisitet: LD^Q-verdier for en enkelt injeksjon av aclacinomycin A eller B er sammenfattet i den folgende tabell:

Akutte hjerteendringer i elektrokardiogrammene for hamstere

ble ikke indusert av en enkelt intravenos tilforsel på

25 mg/kg av aclacinomycin A eller B.

4) Antibiotikaene hemmer fullstendig veksten av dyrkede pattedyr-tumorceller, vaccinia virus i HeLa celler, og spesifikt er RNA syntesen i en ekstremt lav konsentrasjon. Når L121o celler ble inokulert i mediet, Rosewell Memorial Park Institute 164o, som inneholdt lo% kalveserum og det ble

tilsatt forskjellige konsentrasjoner av aclacinomycin A og

14

B og som en precursor, C-thymidin, -leucine eller

o 14

uridin og sa inkubert ved 37 C i 6o min. i C-inbygnings-eksperimentet og 3 dager i veksteksperimentet, ble nuclein-syre-biosyntesen og aelleveksten hemmet over 5o% ved under 1 mcg/ml aclacinomycin i mediet, som vist i den folgende tabell:

I betraktning av de forannevnte egenskaper for aclacinomycin A og aclacinomycin B, har man fastslått at disse substansene er nye antibiotika som er forskjellige fra alle kjente antibiotika.

Aktuelle eksempler for fremstilling og rensing av aclacinomycinene A og B er beskrevet fortløpende.

EKSEMPEL 1

Et vandig medium med folgende sammensetning ble fremstilt:

loo ml av dette mediet ble sterilsert ved 12o°C i 15 min. i en 5oo ml Sakguchi-rysteflaske som var inokulert fra en agar-skålkultur med Streptomyces galilaeus MA144-Ml ved platina-lok-ke . Inkubasjonen pågikk i 48 timer ved 28°C på en rettlinjet ryster, lo 1 av det forut steriliserte mediet i en 2o 1 rustfritt stål fermenteringstank ble inokulert aseptisk med 2oo ml av såkulturen ovenfor. Fermenteringen ble utfort ved 28°C i 32 timer under roring (24o rpm) og luftinnblåsing (5 l/min.). Det oppnådde dyrkede brygg ble justert til pH

4, 5, blandet med et adsorberende siiikajordmateriale og filtrert fra mycelet. Filtratet og den atskilte kaken ble ekstrahert separat. Kaken ble suspendert i aceton ( 3 1 pr.

kg våt kake), rort i 2 timer og filtrert, og kaken ble videre ekstrahert med aceton en gang til. Det således oppnådde ekstraktet ble inndampet til et tiende dels volum i vakuum. Filtratet fra dyrkning ble justert til pH 6,8 og ekstrahert to ganger med en tredjedels volum etylacetat,og etylacetatekstraktene ble konsentrert til en tiende dels volum i vkuum.

2o g av den resulterende oljeaktige substans ble blandet med 2o g kiselsyre (Mallinckrodt Chem. Co.), satt på en kolonne med 4o cm lengde og diameter på 4,5 cm fyllt med kiselsyre,

og eluert med en benzen-aceton-metanol-blanding. Det forste eluat som ble eluert med l:l:o blanding ble kastet og de aktive fraksjoner eluert med l:3:o og l:3:o,3 blandinger ble samlet og inndampet til torrhet i vakuum. 11,5 g av denne råsubstansen ble så opplost i en liten mengde etylacetat og satt på samme kiselsyrekolonne som ovenfor. Etter å ha kastet de forste d.uatene av 1:1 og 2:1 benzen-aceton-blandingene, ble aclacinomycin B-fraksjonen forst eluert ved ovennevnte blandinger av 1:3 og 1:5 forhold og aclacinomycin A fraksjonene ble eluert med l:5:o,5 og 1:5:1 benzen-aceton-metanol-blandinger. Eluatene ble torket over tort natriumsulfat og inndampet til torrhet i vakuum. 4,8 g av rå aclacinomycin A og 3,5 g aclacinomycin B ble erholdt som gult pulver.

EKSEMPEL 2

2,o rå aclacinomycin B erholdt som i eksempel 1 ble blandet med 3 g kiselsyre, satt på en kolonne med 15 cm lengde og 2 cm diameter fyllt med 25 g kiselsyre, og aclacinomycin B-fraksjonen ble eluert med klororform inneholdende 1% metanol og konsentrert til et lite volum i vakuum. 4o mg aclacinomycin B ble oppnådd som gult pulver fra den konsentrerte opplosning ved tilsetning av noe n-heksan.

EKSEMPEL 3

2,o g rå aclacinomycin A erholdt som i eksempel 1 ble opplost i en liten mengde kloroform, og tilfort en kolonne med 2o cm lengde og 2 cm i diameter fyllt med 3o g kiselsyre. Etter å vasket ut pigmentene inneholdende aglykon og aclacinomycin B og andre urenheter med kloroform og 1,5% metanol-holdig kloroform, ble aclacinomycin-A-fraksjonene eluert med 2% metanol-holdig kloroform, og konsentrert til torrhet i vakuum. Resultatet ga 53 mg gult pulver aclacinomycin A.

EKSEMPEL 4

Råe aclacinomyciner A og B oppnådd som i eksempelen 1 og 3 inneholder enda en liten mengde cinerubin A og B som ble dannet i brygget under dyrkningen som i eksempel 1, og det urene cinerubin A eller B kan fjernes ved geletering med forskjellige metallioner.

25o mg rå pulver aclacinomycin A oppnådd som i eksempel 3 ble opplost i 2o ml kloroform og 2o ml av 1% CuS04-oppl6sning ble tilsatt. Etter at opplosningen ble kraftig rystet og fikk stå 1 time, ble kloroformfasen som var atskilt fra den vandige fasen tilsatt lo _ 3M EDTA (etylendiamin-tetraeddiksyre)-opplosning og denne blandingen ble kraftig rystet 1 min. og deretter ble kloroformfasen atskilt og vasket med vann to ganger under rystning. Klorofromekstraktet ble torket over tdrt natriumsulfat og konsentrert i vakuum, og tilsetning av noe n-heksan forte til utfelling av 12o mg rent aclacinomycin A.

EKSEMPEL 5

3oo mg rå aclacinomycin B oppnådd som i eksempel 1 ble opplost i lo ml metylcellosolve og tilsatt 1 ml av en loo mg/ ml CuSO^-opplosning. Etter å ha stått over natten ble noe utfelling ventrifugert fra og deretter ble det som flot ovenpå konsentrert til det halve volum i vakuum og kromatografert under anvendelse av en kolonne med loo cm lengde og 4 cm i diameter fyllt med "Sephadex LH2o" i metanol. Det forst forurensningen og purpurfarget cinerubin B-Cu-kompleks ble kastet og påfolgende gule fraksjoner samlet, satt til lo _ 3M EDTA-opplosning og konsentrert til en tredjedel i vakuum. Aclacinomycin B ble ekstrahert fra konsentratet med kloroform og konsentrert til torrhet i vakuum. 128 mg rent aclacinomycin B ble oppnådd.

EKSEMPEL_6

Vandig medium med folgende sammensetning ble fremstilt:

5o ml av dette mediet ble sterilsert ved 12o°C i 15 min. i

en 5oo ml Erlenmeyer kolbe som ble inokulert med 1 ml frossent dyrket brygg av Streptomyces galilaeus MA-144-M1. Inkuberingen ble utfort 48 timer ved 3o° på en roterende ryster, lo 1 av det samme medium i en 2o 1 rustfritt stål fermenteringstank ble aseptisk inokulert med 2oo ml av kulturen ovenfor. Etter inkubasjon ved 3o°C i 18 timer under roring (3oo rpm) og luftinnblåsning ( 5 l/min.), ble lo 1 av det dyrkede brygg tilsatt til 6oo 1 av det ovenfor steriliserte medium i en 1 kiloliters rustfritt ståltank og inkubert ved 3o° i 48 timer under luftinnblåsning ( 2oo l/min.) og roring (18o rpm).

Det oppnådde dyrkede brygg (57o 1) ble justert til

pH 5,o ved tilsetning av 25o ml 3o% H^SO^, blandet med en adsorberende silikatjord og de 53,5 kg kake således erholdt ble suspendert i 7o 1 aceton, rort 3 timer og filtrert. Kaken ble videre ekstrahert med 85 1 aceton en gang til. Ekstraktene ble inndampet til 4o 1 i vakuum og tilsatt 25 1 etylacetat. Etylacetatfasen ble atskilt og konsentrert til lii vakuum. Den rå aclacinomycinblandingen som falt ut ved tilsetning av 1 1 n-heksan til ovennevnte kons entrat ble oppsamlet og vasket med n-heksan-etylacetat-blanding (5o:l) to ganger, og 15,5 g orangegult pulver ble isolert.

Dette rå pulveret ble opplost i 2oo ml etylacetat og satt på en kolonne av 3 5 cm lengde og 7 cm diameter fyllt med 7oo g "Column-Lite" og eluert med etylacetat-metanol-blanding (1:1). De gule fraksjoner som inneholdt aclcinomycin A ble inndampet til torrhet i vakuum. 12.4 g rått aclacinomycin A

_ 3

ble opplost i loo ml kloroform og tilsatt til 5o m lo M EDTA i o,ol M fosfatbuffer (pH 6,8). Etter kraftig rystning for å fjerne resterende metallioner ble kloroformfasen vasket to ganger ved rysting med vann, torket over tort natrium sulfat og inndampet til torrhet ivakuum. 11,1 g aclacinomycin A ble erholdt som gult pulver.

"Sephadex LH-2o" er en lypofil uopplbslig molekylar-sil-

type kromatografimateriale dannet ved kryssbinding av dekstran og markedsfort av Pharmacia, Uppsala, Sverige. "Sephadex LH-2o" anvendt i de foregående eksempler kan erstattes av andre lignende gelfiltrasjbnsmaterialer, f.eks. "Sephadex G25 til G2oo" "Sepharose 4B og 6B" (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) og"Bio-Gel Al,5m" (Bio Rad Co.). Foretrekne gel-filtrasjonsmidler omfatter karboksymetyl-substituerte kryssbundne dekstrangeler som beskrevet i kolonnene 3 og 4 i US-patent nr. 3.819.836.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av aclacinomycinene A og B med formel

   hvori R for aclacinomycin A betyr eller for aclacinomycin B betyr eller en blanding derav, karakterisert ved at man dyrker Streptomyces galilaeus A.T.C.C. 31133 under neddykkede aerobe betingelser i et næringsmedium inneholdende en karbonkilde og en nitrogenkilde, ved en temperatur på 20-35°C og en pH på 5-8 for å danne nevnte aclacinomyciner i mediet, idet man gjenvinner nevnte aclacinomyciner fra <dy>rkningsmediet0g fraksjonerer i henholdsvis aclacinomycinene A og B og eventuelt renser disse på i og for seg kjent måte.