SU1760986A3 - Способ получени 4 @ -дезокси-13(S)-дигидро-4 @ -йододоксорубицина - Google Patents

Abstract

Использование: микробиологическа  промышленность, производство антибиотиков . Сущность изобретени : дл  получени  4 -дезокси-13(5)-дигидро-4 -йододоксоруби цина используют штамм Streptomyces peucetlus DSM 2444. Последний выращивают при 27-30°С в течение 3-5 дней в жидкой питательной среде, содержащей источники азота и углерода и минеральные соли, в присутствии 4 -диокси 4 йододоксиоу5ицина в форме его хлоргидрата в конечной концентрации 0,1 мг/мл среды. Полученнуо культу- ральную жидкость раздел ют, и отделенный мицелий экстрагируют ацетоном. Жидкую фазу экстрагируют смесью дихлорметана и метанола в объемном соотношении 9:1 при рН 8 0. Полученные экстракты объедин ют и концентрируют при пониженном давлении до сухого состо ни . Затем концентрат раствор ют в дихлорметане и хроматогра- фируют на колонке из силикагел , забуфе- ренного до рН 7,0. Целевой продукт элюируют последовательно смесью дихлорметана , метанола и воды при объемном соотношении 95:5:0,25 л 90:10:0,5. Второй элюат концентрируют в присутствии Н-про- панола, выдел ют целевой продукт и перевод т в форму его хлоргидрата. 1 з.п. ф-лы, 2 табл. «« Р.

Description

ш

N4

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности, в частности производству антибиотиков.

Дл  осуществлени  способа используют штамм Streptomyces peucetlus M 87 F.I. Штамм получен селекцией путем воздействи  на исходный штамм S. peucetlus подвида aureus ATCC 31428 нитрозогуанидином. Штамм зарегистрирован под каталожным номером DSM 2444 в немецкой коллекции микроорганизмов, Западна  Германи .

Штамм примен ют дл  стереоселектив- ного восстановлени  функциональной группы кетона в 13-положении 4 -дезокси-4

-йододоксорубицина:

О ОН

он

QH ОСИ О ОН о

н3с-7-0 7 (I)

, Ј-

NH.

Р Ю 00

сь

W

(О

с получением специфически 4 -дезокси-13- (5)-дигидро-4 -йодоксорубицина, одного из

двух возможных при С-13 стереоизомерных 4 -дезокси-13-дигидро-4 -иододоксорубиц иное. Новое соединение формулы (II) называемое далее как FCE 24883,  вл етс  полезным в качестве противоопухолевого средства и про вл ет активность на экспериментальных опухол х, сравнимую с активностью 4 -дезоксо-4 -иододоксоруби- цина формулы (I). Субстратом дл  микробно- го стереоселективного восстановлени   вл етс  полусинтетический аналог доксорубицина.

Получают целевой продукт формулы (И);

О ОН О

он

ОСН3

Морфологи  г утанжого шта i M 37 F.1 не отличаетс  ot таковой мате HI rwo г.т г , т S nri.cetius ATCC 3 И98, p . &,ef т к-зк I bv; к. четко различаю1 - по сво- . |И гультуральт (ч биохимически- х рак- )0рисп|кам. Так, мутантный шгамм ч F 1 .о продуцирует на агаровой среде oi соло- чеь ;о-/кептого до /шмонио-жt /i ion гво римого пигмента, который  влт тс  характерным дл  м  РОИМО-ого штзггэ 3 peucelius ATCC 31428.

Кроме того, мутангмый илами M 87 F.1. может избирательно превращать сое/жжение (I) в соединение (II), югд как материнский шммм S. peucetius ATCC не избирателен в зтом отношении Оно с ойст- во мутанта М 87 F 1 с«о высоко полезным , как описано в

Счереоизбирательное йиопреобра ова- нче м Гчьпь ос,щесгплень тшожа- ющеис  лыури S. peueenus M 87 F.I. поп добавлении соединени  d) в качестве субстрата в купьтур льн.,... (.,vu в инку- баи-ючнсм периоде

Ccit г 4ненпе () може быт- пемэв форме гидрох орида поело г ЗРЦИИ в стерильной дистиллироааншл чидо. Культуру выращивают в питательной следе, содержащей источник углерода, например усваипасмыи углевод, и источник d3uia, r.e. усваиваемое соединение азота или белковый материал. Предпочтительные источники углерода включают глюкозу, сахарозу, глицерол, крахмал, кукурузный крахмал, декстрин , мелассу и тому подобные. Предпоч

тительные источники азота включают настой от замачивани  зерна, дрожжевой экстракт , пивные дрожжи, соевую муку, муку из сем н хлопка, кукурузную муку, казеин,

5 рыбную муку, сухие остатки дистилл ции, животный пептон, м сной экстракт, соли аммони  и др. Может быть выгодно использовано сочетание таких источников углерода и азота.

10Процесс биопревращени  может длитьс  примерно от 72 часов до 8 дней Инкуба- ционна  температура в процессе биопревращени  может быть в интервале примерно от25°Сдо 37°С, предпочтительно

15 29°С. Содержимое бродильных сосудов аэрируют взбалтыванием при 250 оборотах в минуту или перемешиванием стерилизованным воздухом, чтобы способствовать росту микроорганизма и таким образом

20 повысить оффективность процесса превращени 

Ход реакции микробного превращени  контоопируют вз тием образцов бродильной среды при различных временных интер25 аачзх и экстракцией при рЫ 8,0 смесью ФшюрмсгеЖ-метанол в отношении 9:1. Когда пробу органического экстракта подвергают то ч кос; оймой хроматографии, использу  в качестве элюента смесь хлороформа, ме30 грмола, уксусной кислоты и воды о отношении 80:20.7.3 по объему, соединение FCE 24883 (II) по вл етс  при значении Rf среды 0,, тогда как 4-дезо; си-4 йододоксоруби- цп i С) наход т при Rf О,GO. Ко in юстгенное

определение двух ачтрс циклиноы г.ожет быть осуществлено то ослоичой хроматографии с упом нутой вмше злюиру- ющей системой, соскабливанигм и внмыва- нием метанолом соответствующих зон

40 красным окраширанием и конечным спектрометрическим определением пр 496 нанометрах ,

Весь ферментациоь а и Сулюн, з юто- ром соединение (I) подвергаетс  превраще45 нию в соединение FCE 24883 (II), фильтруют с помощью диатомовой земли. Отфильтрованный красный мицелий экстрагируют смешивающимс  с водой органическим растворителем, аким как метанол и дру50 гие низшие гчиргы, диоксан, ацетонитрил и предпочтитет но ацетон. Экстракты г/ицели  собирают, концентрируют пои пониженном давлении и объедин ют с профильтрованной ферментационной жидкостью, устанав55 ливают рН 8,0, затем экстрагируют несмешивающимс  с водой органическим растворителем, таким как н-бутанол, хлороформ , дихлорметан или предпочтительно смесь дихлорметан-метанол в отношении 9:1. Органические экстракты содержат соединемие FCE 24883 (II) вместе с соединением (I) и небольшими количествами других продуктов разложени .

Органический экстракт концентрируют при пониженном давлении досуха и остаток раствор ют в дихлорметане и хроматогра- фируют на колонке силикагел , стабилизированного буфером с рН 7,0, градиентом смеси дихлорметан-метанол-вода. Соединение () вымывают первым смесью в отношении 95:5:0,25, затем соединение FCE 24883 (1) смесью в отношении 90:10:0,5. Из объединенных фракций после промывки водой, концентрировани  до небольших объемов в присутствии н-пропанола, добавлени  эквивалента хлористоводородной кислоты и избытка н-гексана, получают преципитат чистого FCE 24883 () в виде гидрохлорида (III)

н он

ОСгЪ О

W

Н3С-т0 7

NH, HC1

FCE 24883 (II) как свободное основание растворимо в пол рных органических растворител х и водных спиртах, тогда как его гидрохлорид (III) растворим в воде, но мало растворим в органических растворител х . Гидрохлорид соединени  СЕ 24883 имеет следующие физико-химические свойства:

Точка плавлени : 200°С (разлагаетс ):

удельное вращение а о29 + 188° (с 0,05, метанол).

Спектр поглощени  в УФ и видимой области: /We 232, 254, 290 и 480 нанометров (EI% 492, 370, 127. 163);

ИК-спектр (КВг): пики при следующих частотах: 3400, 2970, 2920, 1610, 1580, 1472, 1440, 1410, 1380, 1355, 1320, 1280, 1235, 1210, 1110, 1080, 1060, 1030, 1010,985,965, 940, 920; 900, 890, 870, 860, 830, 810, 785, 755, 730, 710, 540, 480, 450 и 415

Спектр ЯМР на  драх 1Н (ДМСО-de, 200 МГц, 22°С) млн.д: 14,03 (широкий синглет, 2Н, ОН-б, ОН-11), 7,6-7.0 (м, ЗН, Н-1, Н-2, Н-3), 5,26(м, 1Н, Н-1).4,96(д, J 5,2 Гц, 1Н, ОН-13),4,92(м, 1Н.Н-7), 4,55 (м, 1Н, Н-4),4,51 (т, J 6,7 Гц, 1, ОН-14). 4,20 (с, 1Н, ОН-9). 3,97 (с, ЗН, 4-ОСНз), 3,76 (ддд, J 3,5, 6,7, 11,0 Гц, 1Н, СН(Н)-ОН), 3.60 (д.кв., J 1,0,

6,0 Гц, Н-5), 3,48 (ддд, J 7,2, 6,7. 11.0 Гц, 1Н, СН(Н)-ОН); 3,37 (ддд: J - 5,2, 3,5. 7,2 Гц. 1Н, Н-13), 3,02 (м, 1Н, Н-3), 2,81 (м, 2К, СН2- 10), 2,15(дд, J 2,0, 15,3 Гц. 1Н, Н-8е), 1.97

(дд, J 6,0, 15,3 Гц, 1Н. Н-8 акс). 1.7-1,9 (м, 2Н, СН2-2) и 1,14 (д. J 6,0 Гц). ЗН. СН3-5); молекул рна  формула: СгтНзоМю-НС. m/Z в D эквиваленте к свободному основанию: 656 (МН)+; 655 (М) и 410 (, соответствую0 щие агликону.

Селективна  жидкостна  хроматографи  высокого давлени  позвол ет разделить (два максимума с временем задержки 18,8 и 10,3 минут) два стереоизомерных

5 спирта приС-13, присутствующих в образце синтетического 4 -дезокси-13-дигидро-4 - иододоксорубицина, полученного восстановлением йода боргидридом натри .

Использу  тот же метод жидкостной

0 хроматографии высокого давлени , получают соединение FCE 24883 (II) как отдельный пик с временем задержки 19,3 минуты, соответствующим времени медленно движущемс  составл ющей синтетического

5 13-дигидропроизводного,

Метод жидкостной хроматографии высокого давлени . Колонка: лве секции RP сферисорб S 30DS2 (С18 3/1, разделение фаз Великобритани ) размером 150 х 4.5 мм.

0 соединенные в р д; температура .45СС; мобильна  фаза А; 0,05 М водного КНаРСм, подкисленного до рН 3,0 смесью НзРОз-ме- танол в отношении 80:2 по объему; подвижна  фаза В: метанол; про вление,

5 изократное за 30 минут (42% А + 58% В); скорость потока 0,6 мл/мин; детектирован е: 254 нанометра,

Кислотный гидролиз соединени  (II) (0,2 н. хлористоводородна  кислота, 80°С,

0 30 минут) дает красный осадок соответствующего агликона, тогда как сахарна  компонента , а именно 3-амино-2,3,4.6-тетраде- зокси-4-иод-Ьликсогексогексоза, присутствует в водной фазе и идентифицирована в

5 сравнении с аутентичный образцом, полученным при кислотном гидролизе соединени  ().

Цитотоксическую активность соединени  FCE 24883 испытывают in vitro на клет0 ках Helan P 388 в сравнении с соединением (I) и доксорубицином. Вы влено, что соединение (II) не менее активное, чем4 -дезокси- 4 -йододоксорубицин (I) и доксирубицин (табл. 1).

5Активность in vivo соединени  FCE

24883 (II) испытывают против рассе нного лейкоза Гросса. Мышам линии СЗН ввод т внутривенно инъекцию 2-10° клеток на мышь, обрабатывают соединени ми и изучают 24 часа после опухолевой инъекции.

При оптимальной дозе соединение FCE 24883 (II) более активное, чем доксоруби- цин, и такое же активное, как 4 -дезокси-4 - -йододоксорубицин (I), с малой токсичностью, про вленной при активных дозах. Противоопухолевую активность соединени  (II), оцененную как среднее врем  выживани  обработанных животных над контрольными мышами, можно сравнить с активностью соединени  (I) и доксорубицина (табл, 2).

Способ иллюстрируетс  следующими примерами.

П р и м е р 1. Культуру микроорганизма Streptomyces peucetius штамм М 87 F.1. (D М 2444) выращивают 14 дней при 28°С на скошенном агаре бледующей поддерживающей среды (Среда А): глюкоза 3%, пивные дрожжи 1,2%; NaCI 0,1%; КНзРСм 0,05%, СаСОз 0,1%; MgSCM 0,005%; FeSCM TI-kO 0,0005%,-ZnS04-7H20 0,0005%; CuS04 5H20 0,0005%; агар 2%, водопроводна  вода до 100 мл, рН 0,7. Стерилизацию провод т нагреванием в автоклаве в течение 20 минут .

Споры выращенной культуры собирают и суспендируют в 3 мл стерильной дистиллированной воды. Этой суспензией засевают 60 мл жидкой питательной среды, содержащейс  в 300 мл колбах Эрленмейе- ра: пивные дрожжи 0,3%, пептон 0,5%, Сз(МОз) 4Н20 0,05%, водбпроводна  вода до 100 мл. Стерилизацию провод т нагреванием в автоклаве при 120°С в течение 20 минут, рН этой среды после стерилизации устанавливают между 6,8 и 7,0. Инокулиро- ванные колбы встр хивают два дн  при температуре 28°С на роторной мешалке при 250 об/мин, описывающей окружность диаметром 7 см. 1,5 мл культуры, выращенной описанным способом, высевают в 300 мл колбы Эрленмейера, содержащие 50 мл следующей биотрансформирующей среды: дрожжевой экстракт 1,5%, К2РСМ 0,25%, глюкоза 1.5%, водопроводна  вода до 100 мл, рН 6,9. Стерилизацию провод т нагреванием в автоклаве при 115°С в течение 20 минут. Раствор глюкозы стерилизуют отдельно и добавл ют к каждой стерилизованной колбе в нужной концентрации.

Затем содержимое колб инкубируют при 28°С в услови х, описанных дл  фазы посева, в течение 24 часов. В это врем  в каждую колбу добавл ют по 1,0 мл раствора соединени  (I) в стерилизованной воде в концентрации 5 мг/мл. Встр хиваемые колбы инкубируют еще два дн  и получают 70%-ое превращение соединени  (I) в соединение (II).

П р и м е р 2. Культуру микроорганизма S. peucetius штамм М 87 F.1. выращивают

на твердой питательной среде, как описано в примере 1. Споры трех скошенных агаров объедин ют и собирают в 10 мл стерильной дистиллированной воды. Полученную таким

образом суспензию высевают в 2-х л опрокидывающиес  колбы с круглым дном, содержащие 500 мл посевной среды, описанной в примере 1. Колбу инкубируют 48 часов на роторной мешалке, вращающейс 

0 со скоростью 120 об/мин и описывающей окружность диаметром 7 см, при температуре 28°С. Весь посевной материал инокулиру- ют в 10 л бродильный чан из нержавеющей стали, содержащий 7,5 л биотрансформиру5 ющей среды, описанной в примере 1 и стерилизованной вод ным паром при 120°С в течение 30 минут. Раствор глюкозы стерилизуют отдельно и добавл ют в стерилизованный бродильный чан в соответствующей

0 концентрации. Культуру выращивают при 28°С при помешивании с 230 об/мин и аэрации потоком воздуха со скоростью 1 л/л среды/мин. Через 48 часов добавл ют субстратное соединение в концентрации,

5 описанной в примере 1, и после инкубировани  культуры в течение 3-х дней получают 60%-ную конверсию соединени  (I) в соединение (II).

П р и м е р 3. Цельное сусло (5 л) из

0 ферментации, полученной по примеру 2, фильтруют с использованием 2% диатомовой земли в качестве фильтра. Влажный осадок на фильтре экстрагируют ацетоном (3 л). После фильтрации провод т две дополни5 тельных экстракции ацетоном дл  достижени  полного выделени  красных пигментов. Объединенные ацетоновые экстракты концентрируют при пониженном давлении и концентрат (1 л) объедин ют с профильт0 рованным бульоном и исчерпывающе экстрагируют при рН 8,0 смесью дихлорме- тан-метанол в отношении 9:1. Органический экстракт, содержащий соединени  (i) и (II) с теми же продуктами распада, концентриру5 ют досуха при пониженном давлении. Остаток , растворенный в дихлорметане, хроматографируют на колонке силикагел , стабилизированного буфером с рН 7,0 (М/15 фосфатный буфер), градиентом смеси

0 дихлорметан-метанол-вода. После вымывани  некоторых продуктов распада элюиру- ют соединение I смесью в отношении 95:5:0,25 с последующим элюированием соединени  FCE 24883 (II) смесью в отноше5 нии 90:10:0,5

Из объединенных фракций после промывки водой, концентрации до небольшого объема в присутствии н-пропанолз, добавлени  одного эквивалента хлористоводородной кислоты и избытка н-гексана

получают чистое соединение FCE 24883 (II) 0,30,60%-ный выход, в форме гидрохлорида (т.пл. 200°С, разлагаетс ). Повтор   процесс , выдел ют также нетрансформированное соединение I (0.13 г, 26%) в виде гидрохлорида.

П р и м е р 4. Образец соединени  FCE 24883 (II) 200 мг раствор ют Р 0,2 н. водной хлористоводородной кислоте (50 мл) и нагревают 30 минут при 100ЭС. Кристаллический красный осадок (0,12 г) агликона собирают фильтрацией, промывают водой и сушат. Масс-спектр: т/е 416 (М4). Агликон идентифицирован как 13-(3)-дигидроадриа- мицинон сравнением с аутентичным образцом .

рмула изобретени  1. Способ получени  4 -дезокси-13(5)- дигидро-4 -йододоксорубмцина формулы

О ОН

ОСИ

In vitro активность 13-/5/-дигидро-4 -йододоксируоицина (соединение II, FCE 24883) в сравнении с 4 -дезокси-4 -йододоксирубицином (соединение I, FCE 21954) и

доксорубицином (Дх)

a)доза, дающа  50% снижение числа клеток в сравнении с контрольными необработанными животными

b)клетки зпителиоидной карциномы шеи человека

c)Р388 - лейкозные клетки

0

5

0

5

заключающийс  в том. что штамм Streptomycps peucetius DSM 2444 культивируют в аэробных услови х в питательной среде, содержащей источники азота и углерода и минеральные соли, в присутствии 4 -дезокси-4 -йододоксирубицина в форме его хлоргидрата в конечной концентрации 0,1 мг/мл среды при температуре 27-30°С, полученную культуральную жидкость раздел ют , отделенный мицелий экстрагируют ацетоном, а жидкую фазу смесью дихлорме- танз и метанола в объемном соотношении 9:1 при рН 8,0, далее полученные экстрайты объедин ют и концентрируют при пониженном давлении до сухого состо ни , затем концентрат раствор ют в дихлорме- гаке и хрсматографируют на колонке из си- ликагел , забуференного до рН 7,0, злкжруют последовательно смесью дих- лорметана, метанола и воды при объемном соотношении 95:5:0,25 и 90:10:0,5 соответственно , полученный второй злю т концентрируют в присутствии н-пропанола, выдел ют целевой продукт и перевод т в форму em хлоргидрзта.

2. Способ по п. 1,отличающийс  тем, что культивирование ведут 3-5 дней.

Таблица 1

Таблица 2

Активность 13-/5/-дигидро-4 -йододоксирубицина (соединение II, FCE 24883) в сравнении с 4 -деэокси-4 -йододоксирубицином (соединение I, РСЕ21954)и доксорубицином (Дх)

против рассе нного лейкоза Гросса

a)Мышей линии СЗН иньекцировэли внутривенно 2x106 лейкозных клеток и обрабатывали внутривенно соединени ми через один день после опухолевой инъекции.

b)(Среднее врем  выживани  обработанных мышей/среднее врем  выживани  контрольных животных) х 100.

c)оценено по результатам вскрыти  погибших мышей.

Claims (2)

Фло рмула изобретения

1. Способ получения 4’ -дезокси-13(5)дигидро-4’-йододоксорубицина формулы

О ОН 0 заключающийся в том, что штамм Streptomyc<=s peucetlus DSM 2444 культивируют в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники азота и углерода и минеральные соли, в присутствии 4' -дезокси-4’-йододоксирубицина в форме его хлоргидрата в конечной концентрации 0,1 мг/мл среды при температуре 27-30°С, полученную культуральную жидкость разде10 ляют, отделенный мицелий экстрагируют ацетоном, а жидкую фазу смесью дихлорметанз и метанола в объемном соотношении 9:1 при pH 8,0, далее полученные экстракты объединяют и концентрируют при 15 пониженном давлении до сухого состояния, затем концентрат растворяют в дихлормегаке и хроматографируют на колонке из силикагеля, забуференного до pH 7,0, элюируют последовательно смесью дих20 лорметана, метанола и. воды при объемном соотношении 95:5:0,25 и 90:10:0,5 соответственно, полученный второй элюят концентрируют в присутствии н-пропанола, выделяют целевой продукт и переводят в 25 форму его хлоргидрата,

2. Способ по л, 1,отличающийся тем, что культивирование ведут 3-5 дней.

³⁰

Таблица 1

In vitro активность 13-/5/-дигидро-4’ -йододоксирубицина (соединение II, FCE 24883) в сравнении с 4' -дезокси-4'-йододоксирубицином (соединение I, FCE 21954) и доксорубицином (Дх)

Соединение ИДбо ингиб. доза (нанограмм/мл)^а П&а Р388^{a) b) с)} Дх 10,8 8 FCE 21954(1) 10,4 2,1 FCE 24883 (II) 8 3,5

a) доза, дающая 50% снижение числа клеток в сравнении с контрольными необработанными животными

b) клетки эпителиоидной карциномы шеи человека

c) Р388 - лейкозные клетки

Таблица 2

Активность 13-/S/-ди гидро-4' -йододоксирубицина (соединение II, FCE 24883) в сравнении с 4'-дезокси-4’-йододоксирубицином (соединение I. FCE21954)n доксорубицином (Дх) против рассеянного лейкоза Гросса

Соединение Доза ^а) (мг/кг) Дх 10 13 16,9 FCE 21954(1) 4 5,2 6,8 FCE 24883 (II) 4 5,2 6,8 8,8

Т/С%^Ь) Токсич. ^ci гибель 200 (200, 200) 0,20 225 (230, 220) 0,20 250 (260, 240) 2/20 240(240, 240) ‘ 0/20 260 (260, 260) 4/20 145(160, 130) 10/20 180(180) 0/10 220 (220, 220) 0/20 220 (220, 220) 0/20 140(140) 5/9

a) Мышей линии СЗН инъекцировали внутривенно 2х10⁶ лейкозных клеток и обрабатывали внутривенно соединениями через один день после опухолевой инъекции.

b) (Среднее время выживания обработанных мышей/среднее время выживания контрольных животных) х 100.

c) оценено по результатам вскрытия погибших мышей.