JPH038756B2 - - Google Patents

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JPH038756B2
JPH038756B2 JP57193119A JP19311982A JPH038756B2 JP H038756 B2 JPH038756 B2 JP H038756B2 JP 57193119 A JP57193119 A JP 57193119A JP 19311982 A JP19311982 A JP 19311982A JP H038756 B2 JPH038756 B2 JP H038756B2
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JP
Japan
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glucan
cyclic
polysaccharides
agrobacterium radiobacter
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JP57193119A
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Tokuya Harada
Tadashi Higashiura
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Daikin Industries Ltd
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Daikin Industries Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

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  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規菌株に関し、更に詳しくはアグ
ロバクテリウム属に属する新規変異株に関する。
環状β−１，２−グルカンは、植物の根粒の生
成を促進することが知られている（Plant and
Soil，64(3)，315〜324参照）。また、シクロデキ
ストリンの様に包接化合物として利用しうる。
この様な環状β−１，２−グルカンをアグロバ
クテリウム属に属する菌が生産することは知られ
ている（たとえば、J.Biol.Chem.，143，491
（1942）、J.Am.Chem.Soc.，72，5024（1950）お
よびCarbohydrate Research，82，366（1980）
参照）。
しかし、既知のアグロバクテリウム属の菌は環
状β−１，２−グルカンの生産性が低く、また同
時に細胞外酸性多糖類を生産し、これが培養液の
粘度を増し、培養の為のばつ気を行うと発泡して
培養操作が困難になる。
本発明者らは、アグロバクテリウム属に属する
菌を用いた環状β−１，２−グルカンの生産につ
いて研究を重ねた結果、特定の変異株は環状β−
１，２−グルカンの生産性が高く、しかも細胞外
酸性多糖類および／または細胞外水不溶性多糖類
を生混しないので培養に有利であることを見い出
し本発明を完成するに至つた。
すなわち、本発明の要旨は、 細胞外酸性多糖類もしくはその構成成分およ
び／または細胞外水不溶性多糖類を生産しない新
規アグロバクテリウム・ラジオバクターに関す
る。特にそのうちの一菌株は、アグロバクテリウ
ム・ラジオバクター（Agrobacterium
radiobacter）A1−５と命名され、公知のアグロ
バクテリウム・ラジオバクターIFO12665から突
然変異処理により得られたものであり、受託番号
微工研菌寄第6771号として工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託されている。
アグロバクテリウム・ラジオバクターA1−５
の菌学的性質は、細胞外酸性多糖類および細胞外
水不溶性多糖類を生産しない以外はアグロバクテ
リウム・ラジオバクターIFO12665と同じである。
突然変異処理は、紫外線や高エネルギー放射線
の照射および化学薬品（たとえば、Ｎ−メチル−
N′−ニトロ−N′−ニトロソグアニジン）による
処理など既知の方法が採用できる。突然変異処理
した菌は、寒天平板培地上で培養し、出現したコ
ロニーから、大きさが比較的小さく、かつ表面の
光沢がないものを選ぶと細胞外酸性多糖類およ
び／または細胞外水不溶性多糖類を生産しない菌
株が得られる。
次に、本発明の新規菌株を用いた環状β−１，
２−グルカンの製造について説明する。
培地には、使用する微生物が資化しうる炭素源
（たとえば、グルコース、マンニトール、シユク
ロース、糖蜜など）、同化しうる窒素源（たとえ
ば、酵母エキス、ペプトン、コーンスチープリカ
ー、アンモニア、硫酸アンモニウム、硝酸アンモ
ニウムなど）および生育に必要な各種無機塩など
を包含させる。
培養は、通常好気的な条件下、たとえば振とう
培養法または通気撹拌培養法により、20〜40℃、
好ましくは25〜35℃、特に約30℃の培養温度で実
施するのが好ましい。この場合、培地のPHは５〜
８、好ましくは6.5〜7.5、特に約7.2に調整し、培
養時間は、少なくとも24時間であり、振とう培養
の場合は好ましくは３〜10日間、ジヤーフアーメ
ンターなどを使用する通気撹拌培養の場合は好ま
しくは３〜７日間である。この様な条件下の培養
により好収量で環状β−１，２−グルカンが得ら
れる。
醗酵終了後、遠心分離などの手段により除菌
し、濃縮し、水溶液の２倍容量のエタノール等の
有機溶媒を加えて再び遠心分離して残存する菌体
および多糖類など（培地に含まれていたもの）を
除き、上澄液にさらに水溶液の10〜15倍容量のエ
タノール等を加えると粗環状β−１，２−グルカ
ンが析出する。粗製物はゲル過などの常法によ
り精製すればよい。
本発明の新規菌株は、上述の様に細胞外酸性多
糖類および／または細胞外水不溶性多糖類を生産
しないので培養液が粘稠にならず、ばつ気によつ
ても液の発泡が生じにくいので培養を効率的に行
なえる。
次に実施例を示し、本発明を説明する。
実施例 １ アグロバクテリウム・ラジオバクター
IFO12665をYPG培地（酵母エキス１ｇ／dl、ポ
リペプトン１ｇ／dlおよびグルコース２ｇ／dl含
有）により30℃で24〜48時間生育させた後、Ｎ−
メチル−N′−ニトロ−N′−ニトロソグアニジン
200μｇ／mlを含む0.05Mトリスマレエート緩衝液
（PH6.0）中に105〜107菌体／mlになる様に懸濁さ
せ、30℃で30分間振とうした。次いで、遠心分離
（10000rpm×５分間）を行ない、菌体を生理食塩
水に懸濁した。さらに、生理食塩水で２回洗浄し
た後、約103〜104菌体／mlになる様に生理食塩水
に懸濁した。
得られた懸濁液0.1mlを寒天平板培地（グルコ
ース２ｇ／dl、NH4Cl0.2ｇ／dl、KH2PO40.21
ｇ／dl、Na2HPO4・12H2O1.2ｇ／dl、MgSO4・
7H2O0.03g／dl、Na2SO40.05ｇ／dl、酵母エキス
0.1ｇ／dlおよび寒天２ｇ／dl）上に塗布し、30
℃で３〜４日間培養した。出現したコロニーのう
ち、コロニーの大きさが比較的小さく、表面の光
沢がないものを選択したところ、この菌株は細胞
外酸性多糖類および細胞外水不溶性多糖類を生産
しないアグロバクテリウム・ラジオバクターの１
種であることがわかつた。これをアグロバクテリ
ウム・ラジオバクターA1−５（微工研菌寄第6771
号）と命名した。
実施例 ２ グルコース40ｇ（NH4）2HPO41.5ｇ、
KH2PO41.0ｇ、MgSO4・7H2O0.05ｇ、BaCl10
mg、CaCl210mg、MnCl2・4H2O10mg、CuSO4・
5H2O50μｇ、Na2MoO4・2H2O20μｇ、
H3BO410μｇおよびCaCO35ｇを蒸留水1lに溶解
して培地とした。この培地100mlを1N硫酸または
1N水酸化ナトリウムでPH7.2に調節した後、500
ml三角フラスコに注入し、殺菌した。
上記と同一組成の培地を用い、試験管で前培養
したアグロバクテリウム・ラジオバクターA1−
５を上記三角フラスコに接種し、培養温度30℃、
220rpmで回転振とう培養した。
６日間培養した後、培養液にアセトン150mlを
加え、遠心分離（5000rpm・５分間）し、上澄液
を30mlになるまで濃縮した。これにエタノール60
mlを加え、再び遠心（10000rpm×５分間）して
残存している菌体および多糖類などを沈降させた
後、上澄液にエタノール360mlを加えた。この際
析出した白色の粉状ないし繊維状の粗環状β−
１，２−グルカンを遠心分離（10000rpm×15分
間）により採集し、エタノールで２回洗浄した
後、40℃で真空乾燥して粗環状β−１，２−グル
カン303.8mgを得た。この時の菌体量は乾物とし
て130mgであつた。
次に、これをセフアデツクスＧ−25カラム（直
径26mm、カラム長500mm）を用いて純水で展開し、
環状β−１，２−グルカン分画110mlを得た。こ
の分画を10mlまで濃縮し、エタノール100mlを加
え、析出した白色粉状環状β−１，２−グルカン
を遠心分離（10000rpm×15分間）して採集し、
エタノールで２回洗浄した後、40℃で真空乾燥し
て純環状β−１，２−グルカン235.3mgを得た。
このものの13C−NMRにおけるピーク位置は、
102.8、102.6、83.3、82.6、77.1、76.3、69.6およ
び61.5ppmであつた。なおジオキサンのピークは
67.4ppmに見られる。このチヤートを第１図に示
す。また、赤外分析チヤートを第２図に示す。
この培養において、培養液は終期においても全
く粘度の上昇はみられず、液は容易に流動し、発
泡も少なかつた。
前記生成物の一部をとり、常法により加水分解
した後、一部をペーパークロマトグラフイで、他
の一部をアルジトール・アセテート化してガスク
ロマトグラフイで分析したところ、いずれの場合
もグルコースのみが検出された。また、前記生成
物の旋光度は−5゜であつた。さらに常法により前
記生成物をメチル化した後、加水分解してアルジ
トール・アセテート化してGC−MSで分析した
ところ、このものはグルコースの１位および２位
で結合していると結論される結果を得た。
比較例 １ アグロバクテリウム・ラジオバクターA1−５
の代りにアグロバクテリウム・ラジオバクター
IFO12665を用いる以外は実施例２と同様の手順
を繰り返したところ、純環状β−１，２−グルカ
ン156.5mgが得られた。また、この時の菌体量は
乾物として104mgであつた。
なお、この培養では、培養終期に培養液の粘度
が上昇し、液全体の流動性が悪くなつた。
【図面の簡単な説明】
第１図および第２図は、それぞれ実施例２で得
た環状β−１，２−グルカンの13C−NMRチヤ
ートおよび赤外分析チヤートである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 細胞外酸性多糖類もしくはその構成成分およ
    び／または細胞外水不溶性多糖類を生産しない新
    規アグロバクテリウム・ラジオバクター。 ２ 新規菌株がアグロバクテリウム・ラジオバク
    ターA1−５である特許請求の範囲第１項記載の
    菌株。
JP57193119A 1982-11-01 1982-11-01 新規菌株 Granted JPS5982092A (ja)

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US06/544,998 US4673644A (en) 1982-11-01 1983-10-24 Novel strains of agrobacterium and preparation of cyclic (1→2)-.beta.
EP83110845A EP0108365B1 (en) 1982-11-01 1983-10-29 Novel strains and preparation of cyclic (1-2)-beta-d-glucan
DE8383110845T DE3378060D1 (en) 1982-11-01 1983-10-29 Novel strains and preparation of cyclic (1-2)-beta-d-glucan

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JPS5982092A (ja) 1984-05-11
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EP0108365B1 (en) 1988-09-21
US4673644A (en) 1987-06-16
DE3378060D1 (en) 1988-10-27

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