JPH0258912B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規菌株に関し、更に詳しくはリゾ
ビウム属に属する新規変異株に関する。

環状β−１，２−グルカンは、植物の根粒の生
成を促進することが知られている（Plant and
Soil，64(3)、315〜324参照）。また、シクロデキ
ストリンの様に包装化合物として利用しうる。

この様な環状β−１，２−グルカンをリゾビウ
ム属に属する菌が生産することは知られている
（たとえば、Antonie van Leeuwenhoek，45，
165〜175（1979）、同47，481〜497（1981）および
昭和57年日本農芸化学会大会要旨集570頁参照）。

しかし、既知のリゾビウム属の菌は環状β−
１，２−グルカンの生産性が低く、また同時に細
胞外酸性多糖類を生産し、これが培養液の粘度を
増し、培養の為のばつ気を行うと発泡して培養操
作が困難になる。

本発明者らは、リゾビウム属に属する菌を用い
た環状β−１，２−グルカンの生産について研究
を重ねた結果、特定の変異株は環状β−１，２−
グルカンの生産性が高く、しかも細胞外酸性多糖
類を生産しないので培養に有利であることを見い
出し本発明を完成するに至つた。

すなわち、本発明の要旨は、細胞外酸性多糖類
またはその構成成分を生産しないリゾビウム・フ
アツセオリに関する。

本発明の新規菌株は、リゾビウム・フアツセオ
リ（Rhizobium phaseoli）RA−４と命名され、
公知のリゾビウム・フアツセオリAHU−1133か
ら突然変異処理により得られたものであり、受託
番号微工研菌第6725号として工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている。

リゾビウム・フアツセオリRA−４の菌学的性
質は、細胞外酸性多糖類を生産しない以外はリゾ
ビウム・フアツセオリAHU−1133と同じであ
る。

突然変異処理は、紫外線や高エネルギー放射線
の照射および化学薬品（たとえば、Ｎ−メチル−
N′−ニトロ−N′−ニトロソグアニジン）による
処理など既知の方法が採用できる。突然変異処理
した菌は、寒天平板培地上で培養し、出現したコ
ロニーから、大きさが比較的小さく、かつ表面の
光沢がないものを選ぶと細胞外酸性多糖類を生産
しない菌株が得られる。

次に、本発明の菌株リゾビウム・フアツセオリ
RA−４を用いた環状β−１，２−グルカンの製
造について説明する。

培地には、使用する微生物が資化しうる炭素源
（たとえば、グルコース、マンニトール、シユク
ロース、糖蜜など）、同化しうる窒素源（たとえ
ば、酵母エキス、ペプトン、コーンスチープリカ
ー、アンモニア、硫酸アンモニウム、硝酸アンモ
ニウムなど）および生育に必要な各種無機塩など
を包含させる。

培養は、通常好気的な条件下、たとえば振とう
培養法または通気撹拌培養法により、20〜40℃、
好ましくは25〜35℃、特に約30℃の培養温度で実
施するのが好ましい。この場合、培地のPHは５〜
８、好ましくは6.5〜7.5、特に約7.2に調整し、培
養時間は、少なくとも24時間であり、振とう培養
の場合は好ましくは３〜10日間、ジヤーフアーメ
ンターなどを使用する通気撹拌培養の場合は好ま
しくは３〜７日間である。この様な条件下の培養
により好収量で環状β−１，２−グルカンが得ら
れる。

醗酵終了後、遠心分離などの手段により除菌
し、濃縮し、エタノール等の有機溶媒を加えて再
び遠心分離して残存する菌体および多糖類など
（培地に含まれていたもの）を除き、上澄液にさ
らにエタノール等を加えると粗環状β−１，２−
グルカンが析出する。粗生物はゲル過などの常
法により精製すればよい。

本発明のリゾビウム・フアツセオリRA−４は
上述の様に細胞外酸性多糖類を生産しないので培
養液が粘稠にならず、ばつ気によつても液の発泡
が生じにくいので培養を効率的に行なえる。

次に実施例を示し、本発明を説明する。

実施例 １ リゾビウム・フアツセオリAHU−1133をYPG
培地（酵母エキス１ｇ／dl、ポリペプトン１ｇ／
dlおよびグルコース２ｇ／dl含有）により30℃で
24〜48時間生育させた後、Ｎ−メチル−N′−ニ
トロ−N′−ニトロソグアニジン200μg／mlを含む
0.05Mトリスマレエート緩衝液（PH6.0）中に10⁵
〜10⁷菌体／mlになる様に懸濁させ、30℃で30分
間振とうした。次いで、遠心分離（10000rpm×
５分間）を行ない、菌体を生理食塩水に懸濁し
た。さらに、生理食塩水で２回洗浄した後、約
10³〜10⁴菌体／mlになる様に生理食塩水に懸濁し
た。

得られた懸濁液0.1mlを寒天平板培地（グルコ
ース２ｇ／dl、NH₄Cl0.2ｇ／dl、KH₂PO₄0.21
ｇ／dl、Na₂HPO₄・12H₂O1.2ｇ／dl、
MgSO₄・7H₂O0.03ｇ／dl、Na₂SO₄0.05ｇ／dl、
酵母エキス0.1ｇ／dlおよび寒天２ｇ／dl）上に
塗布し、30℃で３〜４日間培養した。出現したコ
ロニーのうち、コロニーの大きさが比較的小さ
く、表面の光沢がないものを選択したところ、こ
の菌株は細胞外酸性多糖類を生産しないリゾビウ
ム・フアツセオリの１種であることがわかつた。
これをリゾビウム・フアツセオリRA−４（微工
研菌寄第6725号）と命名した。

実施例 ２ グルコース40ｇ、（NH₄）₂HPO₄1.5ｇ、
KH₂PO₄1.0ｇ、MgSO₄・7H₂O0.5ｇ、NaCl10
mg、CaCl₂10mg、MnCl₂・4H₂O10mg、CuSO₄・
5H₂O50μg、Na₂MoO₄・2H₂O20μg、
H₃BO₄10μg、ビオチン200μg、チアミン20μgお
よびCaCO₃5ｇを蒸留水１に溶解して培地とし
た。この培地100mlを1N硫酸または1N水酸化ナ
トリウムでPH7.2に調節した後、500ml三角フラス
コに注入し、殺菌した。

上記と同一組成の培地を用い、試験管で前培養
したリゾビウム・フアツセオリRA−４を上記三
角フラスコに接種し、培養温度30℃、220rpmで
回転振とう培養した。

６日間培養した後、培養液にアセトン150mlを
加え、遠心分離（5000rpm×５分間）し、上澄液
を30mlになるまで濃縮した。これにエタノール60
mlを加え、再び遠心（10000rpm×５分間）して
残存している菌体および多糖類などを沈降させた
後、上澄液にエタノール360mlを加えた。この際
析出した白色の粉状ないし繊維状の粗環状β−
１，２−グルカンを遠心分離（10000rpm×15分
間）により採集し、エタノールで２回洗浄した
後、40℃で真空乾燥して粗環状β−１，２−グル
カン132.2mgを得た。

次に、これをセフアデツクスＧ−25カラム（直
径26mm、カラム長500mm）を用いて純水で展開し、
環状β−１，２−グルカン分画110mlを得た。こ
の分画を10mlまで濃縮し、エタノール100mlを加
え、析出した白色粉状環状β−１，２−グルカン
を遠心分離（10000rpm×15分間）して採集し、
エタノールで２回洗浄した後、40℃で真空乾燥し
て純環状β−１，２−グルカン54.9mgを得た。
¹³C−NMRの結果を第１図に示す。ピーク位置
は、102.7、82.6、77.1、76.2、69.7および
61.5ppmであつた。なお内部基準として加えたジ
オキサンのピークは67.4ppmに見られる。

この培養において、培養液は終期においても全
く粘度の上昇はみられず、液は容易に流動し、発
泡も少なかつた。

前記生成物の一部をとり、常法により加水分解
した後、一部をペーパークロマトグラフイで、他
の一部をアルジトール・アセテート化してガスク
ロマトグラフイで分析したところ、いずれの場合
もグルコースのみが検出された。また、前記生成
物の旋光度は−5゜であつた。さらに常法により前
記生成物をメチル化した後、加水分解してアルジ
トール・アセテート化してGC−MSで分析した
ところ、このものはグルコースの１位および２位
で結合していると結論される結果を得た。

比較例 １ リゾビウム・フアツセオリRA−４の代りにリ
ゾビウム・フアツセオリAHU−1133を用いる以
外は実施例２と同様の手順を繰り返したところ、
純環状β−１，２−グルカン9.83mgが得られた。

なお、この培養では、培養終期に培養液の粘度
が上昇し、液全体の流動性が悪くなつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２で得たβ−１，２−グルカ
ンの ¹³C−NMR図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 細胞外酸性多糖類またはその構成成分を生産
   しないリゾビウム・フアツセオリ。 ２ リゾビウム・フアツセオリRA−４（微工研
   受託番号微工研菌寄第6725号）である特許請求の
   範囲第１項記載のリゾビウム・フアツセオリ。