KR100450277B1

KR100450277B1 - 베타-1,3-글루칸을 고농도로 생산하는 신균주

Info

Publication number: KR100450277B1
Application number: KR10-2002-0034360A
Authority: KR
Inventors: 김미경; 이인영
Original assignee: 주식회사 더멋진 바이오텍
Priority date: 2002-06-19
Filing date: 2002-06-19
Publication date: 2004-09-24
Also published as: KR20030097174A

Abstract

본 발명은 미생물 다당류인 베타-글루칸을 고수율로 생산하는 신균주에 관한 것으로서, 좀더 상세하게는 애그로박테리움(Agrobacterium)속 균주로부터 돌연변이방법을 이용하여 베타-글루칸을 고농도로 생산하는 변이주를 선별하였으며 이 균주로부터 120시간 배양하여 모균주보다 20%이상의 다당을 고농도로 생산할 수 있다.

Description

베타-1,3-글루칸을 고농도로 생산하는 신균주{Novel microorganism producing β-1,3 glucan}

본 발명은 애그로박테리움(Agrobacterium) 속 균주로부터 돌연변이 방법을 이용하여 제조한 고농도로 베타-글루칸을 생산하는 신균주에 관한 것이다.

미생물이 생산하는 다당은 그들이 가지는 구조적인 차이와 물성에 의해 다양한 산업분야에서 활용되고 있다. 그중에서 베타-글루칸은 버섯류, 효모, 곰팡이, 식물 등에서 존재하는 탄수화물 고분자 다당(polysaccharide)으로서 인체의 면역기능을 강화하며, 혈압과 혈당치 등을 일정하게 유지시키는 생체 항상성을 조절하는 기능과 항암 효능을 보인다는 것이 널리 알려져 왔기 때문에 많은 연구가 되어 왔다(한국특허 1999-0081593, 한국특허 1999-0081595, Biol. Pharm. Bull. 18(10) 1320-1327, 1995; Immunology and Cell Biology 77:395-403, 1999). 특히 미생물이 생산하는 베타-글루칸은 물에 불용성이며 열을 가하면 젤이 되는 특징이 있어 공업용 소재, 농업용 소재, 식품 소재, 의약품 소재 등 산업적으로 사용될 잠재력이 크게 증대되고 있다.

베타-글루칸을 생산하는 미생물은 1962년 일본 오사카대학의 하라다 교수 등에 의해 토양으로부터 분리되어 알칼리제네스 패칼리스 믹소제네스 변이주(Alcaligenes faecalisvar.myxogenes)균주로 명명되었다(Agro. Biol. Chem., 1966, 30, 746-769). 이후 베타-글루칸 생산능이 높은 여러 돌연변이 균주가 개발되었으며, 이 중에서 베타-글루칸 생산능이 높은 우라실 요구주인 알칼리제네스 패칼리스 믹소제네스 아종(Alcaligenes faecalissubsp.myxogenes) IFO 13140 균주가 개발되었으며 이 균주로부터 변이된 우라실 비요구주인 애그로박테리움 (Agrobacteriumsp.) ATCC 31749와 애그로박테리움(Agrobacteriumsp.) ATCC 31750균주가 생산성이 높은 균주로 보고되어 있다(미국특허 제 4,355,106호). 이들 균주로부터 고농도의 다당을 생산하고자 글루칸 생산조건을 개선하는 여러 연구들이 수행되어 왔다. 특히 2단계 연속조업방식으로 1단계에서는 질소원 등 세포 성장을 유도하고 2단계에서는 질소원은 없으나 탄소원의 농도를 충분히 하여 글루칸 생성을 유도한 결과 최대 글루칸 생성양은 50시간에 7g/L로 생산되었다. 그 후 Lee 등은 ATCC 31750 균주를 이용하여 연속조업방식이 아닌 2단계 회분식 배양방법과 설탕을 탄소원으로 하여 120시간에 60g/L의 글루칸을 생산하였다(한국특허 제 316467호).

본 발명의 목적은 애그로박테리움 속 ATCC 31750균주로부터 돌연변이방법을 이용하여 모균주보다 베타-글루칸을 포함한 기능성 다당류 생산성이 높은 균주를 선별하여 이 균주로부터 생리활성이 있는 베타-글루칸을 고농도로 생산하려는 것이다.

도 1은 애그로박테리움 속 균주로부터 베타-글루칸의 생산경향을 시간에 따라 나타낸 그래프이다.

도 2는 애그로박테리움 속 균주로부터 추출, 분리정제한 다당의 적외선 스펙트럼(FT-IR)을 분석한 결과이다.

도 3은 애그로박테리움 속 균주로부터 추출, 분리정제한 다당의 탄소핵자기공명 스펙트럼(¹³C-NMR)을 분석한 결과이다.

도 4는 애그로박테리움 속 균주로부터 추출, 분리정제한 다당의 면역증강활성 결과이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 미생물 균주 돌연변이 방법에 따라 MNNG라는 돌연변이 유발물질(mutagen)을 사용하여 사멸율을 99.9%로 하여 다당 생산능이 우수한 균주를 개발하였으며, 이 균주로부터 생산된 다당을 분리 정제하여 구성 단당류 및 구조적 특징을 조사하여 다당이 베타-글루칸임을 확인하였고, 변이주가 생성하는 베타-글루칸이 면역증강활성이 있는 물질임을 확인하였다.

본 발명은 균주 돌연변이 단계, 돌연변이된 균주 선별단계, 선별된 균주로부터 고농도 다당생성을 위한 발효배양단계, 배양액으로부터 다당을 분리정제하여 구조 분석하는 단계, 면역증강능 물질임을 확인한 단계로 구성되어 있다.

본 발명자들은 먼저 애그로박테리움(Agrobacteriumsp.) ATCC 31750에 강력한 돌연변이 유발물질인 MNNG를 처리하여 돌연변이 균주를 얻고, 염색시약인 아닐린 블루(Aniline blue)와 한천(agar)이 첨가된 고체 배지에서 푸른색의 진한 정도와 다당 생산 정도로 돌연변이 균주들을 일차 선별하였다.

일차 선별된 돌연변이 균주를 플라스크 배양을 통해 다당 생산능이 우수한 변이주를 선별하였으며, 선별된 변이주는 고농도 다당 생산을 달성하고자 수크로스, 효모 추출물 및 펩톤으로 구성된 영양배지(pH 7.0)에 접종하여 30℃에서 17시간 배양한 다음, 그 배양액을 통기량 0.5 vvm, 교반속도 600 rpm이며 탄소원인 수크로스의 농도 50-160 g/L, 질소원으로 암모늄의 초기농도 0.5-2.5 g/L, 인산의 초기농도 0.5-1.0 g/L, 그리고 무기염을 포함하는 발효배지에서 pH를 5.5-7.5로 조절하면서 120시간 이내에 글루칸 다당을 생산하도록 하였다. 고농도로 생산된 다당을 분리, 정제하여 구조 분석과 면역증강 활성 확인을 수행하였다.

이하, 본 발명의 구성을 실시예를 통하여 더욱 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래 실시예의 기재에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 균주 돌연변이 및 돌연변이 균주 선별

모균주인 애그로박테리움(Agrobacteriumsp.) ATCC 31750을 YP 액체배지 (yeast extract 5g/L, bacto peptone 5g/L, sucrose 20g/L), pH 7.0, 30℃ 조건에서 15-17시간 배양하였다. 배양액 30ml를 원심분리 후 상등액은 버리고 수확된 세포에 사이트레이트 완충용액(citrate buffer)으로 배지 성분을 제거하기 위해 세포를 두 번 세척하였다. 원심분리하여 얻어진 세포에 사이트레이트 완충용액 (citrate buffer, pH 5.5)과 돌연변이 유발물질인 MNNG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 1mg/ml 농도로 첨가하여 140 rpm, 30℃에서 1시간 동안 반응하여 99.9% 치사율을 갖는 조건의 돌연변이주를 얻었다.

MNNG로 처리된 균주를 아닐린 블루(Aniline blue)가 첨가된 YP 고체배지 (0.005 % 아닐린 블루, 효모 추출물 1 g/L, 박토펩톤 1g/L, 수크로스 20g/L)에 적당한 농도로 희석하여 도말한 후 30℃에서 48시간 배양하였다. 균주의 선별은 고체배지에서 나타나는 콜로니의 푸른색의 진한 정도와 다당 생성능을 모균주와 비교하여 우수한 균주로 선별하였다.

선별된 돌연변이 균주들은 5회 이상의 반복계대를 통해 아닐린 블루가 첨가된 배지에서 모균주와 비교하여 푸른색의 진한 정도와 다당 생산능을 조사하여 푸른색의 진한 정도와 다당 생산능이 각 계대마다 재현성을 나타내는 균주를 최종적으로 선별하였다.

선별된 균주들은 다당생산을 유도하는 액체배지 (100g/L 수크로스, 4.42 g/L NH₄Cl, 1.44 g/L KH₂PO₄, 6g/L CaCO, 0.5 g/L MgSO₄, 1ml/L 미량 원소)에서 pH 7.0, 30℃로 3일간 배양한 후 소모한 당은 환원당 정량으로 확인하였으며 생산된 다당은건조무게를 측정하여 모균주에 비해 생산성이 우수한 균주를 선별하였다.

실시예 2. 돌연변이 균주의 특징

본 발명에 사용한 균주의 형태학적 특징과 생리학적 특징은 다음과 같다. 형태학적 특징으로는 모균주와 변이주 모두 그램 음성(Gram negative) 균주로서 세포모양은 막대형이며 고체배지에서 모균주의 모양은 주름이 지고, 거친표면과 돌출된 콜로니를 형성하는 반면, 변이주는 모균주에 비해 윤기가 나며 아닐린 블루가 포함된 배지에서 모균주 콜로니가 연한 푸른색을 나타내는 반면 본 발명의 변이주는 진한 푸른색을 나타내었다.

선별된 변이주는 미생물 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자은행 (KCTC)에 2002년 3월 12일자로 애그로박테리움(Agrobacteriumsp.) R259 KCTC 10197BP 균주로 기탁하였다. 생리학적인 특성은 API 20NE 킷트를 이용한 실험 결과 다음 표 1과 같이 나타났다.

실시예 3. 선별된 균주의 액체 배양

본 발명에서는 미생물을 수크로스, 효모 추출물 및 펩톤으로 구성된 영양배지(pH 7.0)에 접종하여 30℃에서 17시간 배양한 다음, 그 배양액을 통기량은 0.5 vvm, 교반 속도는 600 rpm이며 탄소원인 수크로스의 농도가 140 g/L, 질소원으로 암모늄의 초기농도가 1.5 g/L, 인산의 초기농도가 1.0 g/L, 그리고 무기염을 포함하는 발효배지에서 세포성장단계에서는 pH를 7.0으로 조절하면서 배양하며, 질소원이 고갈되고 글루칸이 생성되는 시기에는 pH를 5.5이하로 조절하여 글루칸을 생산하도록 하였다. 또한, 배양시간은 5일동안으로 하였다.

그 결과는 도 1과 같다. 5일동안의 배양결과 글루칸의 생성량은 75g/L이었으며 이러한 결과는 모균주에 비해 생산성이 20% 이상 향상된 결과이다.

실시예 4. 베타-글루칸의 분리정제 및 순도 측정

배양이 끝난 발효액을 적절한 농도로 희석하여 5000rpm, 15℃, 15분동안 원심분리하여 얻은 침전물에 3N NaOH를 가해 녹인 후 원심분리하여 상등액을 얻었다. 이 상등액에 3N HCl을 처리하여 중화한 후 원심분리하여 얻은 침전물에 증류수를 가해 다시 원심분리하여 침전물을 얻었다. 침전물은 3회 반복하여 원심분리에 의해 염을 제거한 후 동결건조하여 다당을 얻었다. 건조된 다당을 1mg/ml에 6N 염산을 가하여 121℃에서 1시간동안 멸균기에서 가수분해시킨 후 환원당 정량방법을 이용하여 순도를 측정한 결과 93 %이상의 순도를 나타내었다.

실시예 5. 베타-글루칸의 구성당

실시예 4에서 얻어진 다당을 90% 포름산(HCOOH)으로 가수분해하고 소디움 브로마이드(NaBH₄)로 환원시킨 다음 무수초산(acetic acid)으로 아세틸화 (acetylation)시켜 알디톨 아세테이트(alditol acetate)로 만들어 GC-MS(Gas Chromatography- Mass Spectrophotometer)를 이용하여 분석하였다. 사용된 기기는 휴렛팩커드(HP 5890 GC)를 사용하였으며 컬럼은 DB-1 (0.32mm x 30m)을 사용하였다.

실험 결과는 표 2에서 표시된 바와 같이 불용성 베타-글루칸의 골격을 이루는 단당은 글루코오스 단당으로만 구성되어 있음이 확인되었다.

실시예 6. 베타-글루칸의 구조 조사

베타-글루칸의 경우 작용기 주파수 영역의 흡수파장이 나타나는 890, 1200, 1250, 1370, 2920 cm^-1에서 흡수 띠를 보여준다. 실시예 4에서 얻어진 분리, 정제된 다당을 이용하여 FT-IR로 분석한 결과 변이주로부터 얻어진 분리정제된 다당에서 IR 스펙트럼은 890cm^-1에서 특징적인 흡수 띠를 보여주는데, 이것은 구성 단당인 D-글루코피라노스(glucopyranose)가 베타-컨피규레이션(configuration)을 가질 때 보여주는 흡수 띠이며, 알파-D-글루코피라노스로부터 볼 수 있는 840cm^-1의 흡수띠는 보이지 않았다(도 2). 그리고 정확한 탄소수와 그 결합구조를 관찰하기 위해 탄소 핵자기 공명 스펙트럼(¹³C NMR 스펙트럼) 분석 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이 40ppm에서 용매인 다이메칠 설폭사이드(DMSO, Dimethy Sulfoxide)가 관찰되었고 103.1 ppm에서 C1이 72.8 ppm에서 C2, 86.2 ppm에서 C3, 68.4 ppm에서 C4, 76.3ppm에서 C5, 60.9 ppm에서 C6가 동일한 양으로 검출되었다. 이러한 결과는 본 발명의 애그로박테리움(Agrobacteriumsp.) R259 KCTC 10197BP 균주가 생산하는 다당류가 베타, 1-3글루코오스 단당류의 긴사슬 결합양식을 가진 선형 베타-글루칸임을 보여주는 것이다.

실시예 7. 베타-글루칸의 면역증강 활성

베타-글루칸은 생체 내의 면역기구인 임파구의 증식 또는 활성에 영향을 줌으로써 외부인자에 대한 면역성을 증가시키고, 이러한 결과는 암세포의 증식억제 및 파괴를 초래하는 것으로 알려져 있다. 이러한 작용은 직접적인 세포독성에 기인하는 것이 아니라 면역 활성에 의하여 매개되는 것으로 생체 내의 부작용이 적은 장점이 있다.

실시예 4에서 얻어진 고순도 다당에 대하여 면역 증강 활성을 확인하였다. 인체 말초단핵세포(PBMC-Periperal Blood Mononuclear Cell)를 분리해서 농도를 달리한 다당을 처리하여 인체말초 단핵세포의 인터페론에 미치는 영향을 조사한 결과 다당을 처리한 경우는 대조구에 비해 인터페론의 분비를 촉진하는 것으로 나타났다. 이러한 인터페론의 분비는 대식세포(Macrophage), 자연살해 세포(NK cell), 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)를 활성화하며 결과적으로 면역증강능을 가지게 되는 결과가 된다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

본 발명에서는 애그로박테리움(Agrobacterium) 속 균주를 돌연변이 방법을이용하여 고농도의 베타-글루칸을 생산하는 균주를 얻을 수 있었으며 이러한 다당은 고부가가치 산업으로 용도가능성을 확대시킬 수 있다.

Claims

베타-1,3-글루칸을 고농도로 생산하는 신균주 애그로박테리움(Agrobacteriumsp.) R259 KCTC 10197BP.
제1항에 있어서, 상기 신균주는 아닐린 블루가 포함된 배지에서 푸른색을 띠는 것을 특징으로 하는 신균주 애그로박테리움(Agrobacteriumsp.) R259 KCTC 10197BP.