NO156210B

NO156210B - Fremgangsmaate til fremstilling av monacolin k derivater.

Info

Publication number: NO156210B
Application number: NO802244A
Authority: NO
Inventors: Yoshio Tsujita; Kazuhiko Tanzawa; Masao Kuroda; Seigo Iwado; Kiyoshi Hamano; Akira Terahara; Sadao Sato
Original assignee: Sankyo Co
Priority date: 1979-07-27
Filing date: 1980-07-25
Publication date: 1987-05-04
Also published as: SE8005386L; IT1147763B; FR2462417B1; AT375334B; FI71300B; FR2462417A1; CH647749A5; NZ194445A; AU6083980A; FI802357A; NL8004303A; NO802244L; GB2055100A; FI71300C; ES8105781A1; NO156210C; DK322380A; DD153827A5; ES493726A0; DE3028284A1

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av forbindelser med formelen

hvor R er et alkalimetallatom, en lavere alkylgruppe eller en fenyllaverealkylgruppe.

Fra norsk patentsøknad 8004 51 er forbindelsen Monacolin K og fremstillingen av denne ved hjelp av mikroorganismer av slekten Monascus, særlig Monascus ruber stamme 1005 (FERM 4822) kjent. I søknaden er den verdifulle og uventede virkning av forbindelsen Monacolin K som antihyperkolesterolmiddel beskrevet. Fremstilling av Monacolin K ved hjelp av dyrking av forskjellige andre mikroorganismer av slekten Monascus er kjent fra britisk patentsøknad 8007240. Det har ifølge den foreliggende oppfinnelse vist seg at salter og estre av den frie syre som Monacolin K er lakton av, har en antihyperkolesterolvirkning av samme type som Monacolin K, men i sammenlignbar eller større grad. For enkelhets skyld vil disse forbindelser heretter bli benevnt "Monacolin K salter eller estre", og det vil forstås at dette uttrykket betegner salter og estrer av syren som Monacolin K er laktonet av.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kjennetegnes ved at mikroorganismen Monascus ruber SANK 18174 (Ferm.4957) eller Monascus ruber SANK 17075 (CBS 83270) dyrkes under aerobe betingelser i et egnet dyrkningsmedium som inneholder assimilerbare kilder for karbon og nitrogen under dannelse av Monacolin K som deretter overføres til salter og estere på vanlig måte.

Monacolin K saltene kan lettvint omdannes til Monacolin K selv eller til morsyren av Monacolin K ved surgjøring. Den resulterende Monacolin K eller syren vil omdannes til et salt i nærvær av et alkali, f.eks. et alkalimetallhydroksyd eller -karbonat. Denne omdannelse kan utføres kvantitativt og gjen-tatte ganger. Det har vist seg at omdannelse mellom Monacolin K eller dennes morsyre og metallsaltet er sterkt avhengig av pH i mediet som inneholder dem. Den kritiske pH-verdi er ca. 5,0. Under forutsetning av at metallioner er tilgjengelige foreligger Monacolin K alltid i form av et salt når pH er over 5,0. Når pH er under 5,0 vil på den annen side Monacolin K selv, morsyren av Monacolin K eller en blanding av disse to i varierende forhold være tilstede.

Monacolin K estrene som fremstilles ifølge den foreliggende oppfinnelse er de forbindelser som har den ovenfor angitte formel hvor R er en lavere alkylgruppe eller en fenyllaverealkylgruppe. Eksempler på slike alkylgrupper er metyl-, etyl-, propyl-, isopropyl-, butyl- og heksylgrupper.

Av estrene foretrekkes særlig metyl-, etyl-, butyl- samt bensylostrene.

Monacolin K saltene og estrene kan lettvint fremstilles ved saltdannelse eller forestring av Monacolin K selv eller av et reaktivt derivat av Monacolin K. Eksempler på egnete reaktive derivater omfatter morsyren av Monacolin K og, når det gjelder fremstillingen av estre, Monacolin K salter (f.eks. de klasser av salter som er beskrevet ovenfor, særlig natrium-, kalium-, magnesium-, aluminium-, jern-, sink-, kobber-, nikkel- eller koboltsaltet).

Monacolin K salter kan fremstilles ved enkel omsetning av Monacolin K eller dens morsyre med et oksyd, hydroksyd, karbonat eller bikarbonat, fortrinnsvis et hydroksyd eller karbonat, av det valgte metall. Forsiktighet bør vises for å sikre at reaksjonen utføres ved en pH-verdi på over 5,0, og fortrinnsvis på over 7,0, for å sikre fullstendig omdannelse av Monacolin K eller syren til det ønskete salt. Monacolin K som anvendes ved denne reaksjon vil fortrinnsvis være fremstilt slik som beskrevet i den ovennevnte norske og britiske patentsøknad ved dyrking av en sopp av slekten Monascus og isolering av Monacolin K fra dyrkingsmediet. Monacolin K kan isoleres fra saltdannelsen, eller, noe som foretrekkes, saltdannelsen utføres i løpet av isoleringen og rensingen av Monacolin K fra dyrkingsmediet, slik at Monacolin K isoleres i form av dets ønskete metallsalt. Uansett hvilken fremgangsmåte som velges kan metallsaltet isoleres fra reaksjonssmediet eller dyrkingsmediet ved metoder som er velkjente på området, inklusive de som vil bli beskrevet i det etterfølgende i forbindelse med isoleringen av Monacolin K metallsaltene fra kulturer av Monacolin K salt-produserende sopper.

Monacolin K estre kan fremstilles ved enkel forestring av Monacolin K eller et reaktivt derivat av denne. Reaksjonen kan utføres ved omsetning av en alkohol med formelen ROH eller et reaktivt derivat av denne, hvor R er en lavere eller en fenyllaverealkylgruppe, med Monacolin K eller dennes morsyre, fortrinnsvis i nærvær av et avvanningsmiddel, f.eks. et syrehalogenid som acetylklorid. Alternativt kan Monacolin K estrene fremstilles ved omsetning av et Monacolin K salt med et halogenid med formelen RX hvor R er en lavere alkylgruppe eller en fenyllaverealkylgruppe, og X er et halogenatom, fortrinnsvis et jodatom.

Disse mikroorgansimer er tilgjengelige fra anerkjente kultursamlinger, som er angitt med følgende koder:

Ferm: Fermentation Research Institute,

Agency of Industrial Science and

Technology, Ministry of International

Trade and Industry, Japan.

CES: Centraal Bureau voor Schimmel-

cultures, Netherlands.

Monascus rubser SANK 18174 er en sopp som i den senere tid er blitt isolert fra jord, og dens mikrobiologiske egenskaper er anført nedenfor:

Monascus ruber SANK ( FERM 4 957)

Denne stamme ble isolert fra jord fra Shakotan-cho, Shakotan-gun, Shiribeshi Shicho, Hokkaido-prefektur, Japan, og ble deponert den 27. april 1979 hos nevnte Fermentation Research Insitute under aksesjonsnummer 4957.

Vekst på potet-glukoseagar- og hveteagarmedier er tilsvarende til veksten for stamme SANK 15177 med unntagelse av at det fargende materiale som dannes er svakt lyserødt. Klei-stoteciene har en diameter på 20-70 |im, og stilkenes dimensjoner er 20-60 x 3,0-5,0 jam. Ascier er ikke iakttatt. Ascussporene er fargeløse og ellipseformete, og deres dimensjoner er 5,0-7,0 x 4,0-5,5 |im. Deres overflater er jevne. Sporene er forbundet med hverandre ovenfra og nedover og er fargeløse, og de fleste av dem er pæreformete og har dimensjoner på 6,0-9,5 x 6,0-10,0 ^m.

Basert på iakttagelse av deres ovenfor angitte karak-teristika er alle disse mikroorgansimer av van Tieghem blitt identifisert som stammer av Monascus ruber.

Mikrobiologiske egenskaper for Monascus ruber er rapportert i følgende litteratur: Takada, "Transactions of the Mico-logical Society of Japan", vol. 9, 1969, p. 125-130 [Materials for the Fungus Flora of Japan (7)] og van Tieghem, "Bull. Soc. Botan. France", vol. 31, 1884, p. 227. Ascussporedannelsen av stammen ble rapportert av Cole et al i "Canadian Journal of Botany", vol. 46, 19 68, p. 9 87: Conidium ontogeny in hypho-mycetes. The imperfect state of Monascus ruber and its meristem arthrospores.

Monacolin K salter fremstilles ved dyrking av mikroorganismene i et dyrkingsmedium under aerobe betingelser, under anvendelse av samme metoder som er velkjente på området for dyrking av sopp og andre mikroorgansimer. F.eks. kan den valgte stamme av Monascus først dyrkes på et egnet medium, og deretter kan de dannede mikroorganismer samles og innpodes i og dyrkes på et annet dyrkingsmedium til dannelse av det ønskete Monacolin K salt. Dyrkingsmediet som anvendes ved formeringen av mikroorganismen og dyrkingsmediet som anvendes ved fremstillingen av Monacolin K saltet kan være det samme eller forskjellig. Ethvert dyrkingsmedium som er kjent på området for dyrking av sopp kan anvendes under forutsetning av at det inneholder, de nødvendige assimilerbare karbonkilde og en assimilerbar nitrogenkilde. Eksempler på egnete kilder for assimilisert karbon er glukose, maltose, dekstrin, stivelse, laktose, sukrose samt glycerol. Av disse kilder er glukose og glycerol særlig foretrukket for fremstilling av Monacolin K salter. Eksempler på egnete kilder for assimilertbart nitrogen er pepton, kjøttekstrakt, gjær, gjærek-strakt, soyabønnemel, jordnøttmel, kornstøpvæske, riskli samt uorganiske nitrogenkilder. Av disse nitrogenkilder er pepton særlig foretrukket. Ved fremstilling av Monacolin K salter kan et uorganisk salt og/eller et metallsalt om nødvendig tilsettes til dyrkingsmediet. Dessuten kan det dersom det er nødvendig tilsettes en mindre mengde av et tungmetall. Ved fremstillingen av Monacolin K salter er det viktig at det er tilstede i dyrkingsmediet eller i soppen som svarer til metallsaltet som det er ønskelig å fremstille.

Det foretrekkes særlig at mikroorganismen først subdyrkes

på et potet-dekstroseagarmedium (f.eks. et produkt fra Difco Company) og deretter innpodes i og dyrkes på et annet dyrkingsmedium til dannelse av det ønskete Monacolin K salt.

Mikroorganismen dyrkes under aerobe betingelser ved dyrkingsmetoder som er velkjent på området, f.eks. fast kultur, rystet kultur eller kultur under lufting og rysting. Mikroorganismen vil vokse i et vidt temperaturområde, f.eks. fra 7

til 3 5°C, men særlig når mikroorganismen vokser med det formål å frembringe Monacolin K eller et Monacolin K salt ligger den mer foretrukne dyrkingstemperatur i området 2 0-3 0°C.

Under dyrkingen av mikroorganismen kan fremstillingen av Monacolin K saltet overvåkes ved å ta prøver av dyrkingsmediet

og måle den fysiologiske aktivitet for Monacolin K saltet i dyrkingsmediet ved prøver som vil bli beskrevet nedenfor.

Dyrking kan deretter fortsettes inntil en betydelig oppsamling

av Monacolin K salt er oppnådd i dyrkingsmediet. På dette tids-punkt kan Monacolin K saltet deretter isoleres og utvinnes fra dyrkingsmediet og vevene av mikroorganismen ved en vilkårlig egnet kombinasjon av isoleringsmetoder som velges med hensyn til dens fysiologiske og kjemiske egenskaper. F.eks. kan én eller alle av de følgende isoleringsmetoder benyttes: ekstraksjon av væsken fra dyrkingsmediet med et hydrofilt løsningsmiddel som dietyleter, etylacetat eller kloroform, ekstraksjon av organismen med et hydrofilt løsningsmiddel som aceton eller en alkohol, konsentrering f.eks. ved avdamping av alt eller noe av løsningsmidlet under senket trykk, oppløsning i et mer polart løsningsmiddel som aceton eller en alkohol, fjerning av forurensninger med et mindre polart løsningsmiddel som petroleumeter eller heksan, gelfiltrering gjennom en kolonne av et materiale som "Sephadex",

absorpsjonskromatografi med aktivkull eller silikagel, hurtig væskekromatografi, omdannelse til Monacolin K selv eller dennes morsyre, direkte rensing i form av metallsaltet samt andre liknende metoder. Ved å benytte en egnet kombinasjon av disse metoder kan det ønskete Monacolin K salt isoleres fra dyrkingsmediet som en ren substans.

Som beskrevet i ovennevnte patentsøknader kan Monacolin K selv fremstilles under anvendelse av mikroorganismene og metodene som er beskrevet ovenfor.

Den fysiologiske aktivitet for Monacolin K salter og estre kan prøves og bestemmes kvantitativt ved følgende prøver, som også kan benyttes i modifisert form for å overvåke fremstillingen av Monacolin K salter under fermenteringsprosessen ifølge oppfinnelsen .

1. Inhibering av kolesterolbiosyntese.

Slik som Monacolin K selv inhiberer Monacolin K salter og estre spesifikt virkningen av 3-hydroksy-3-metylglutaryl-CoA-reduktase, som er det hastighetsbestemmende enzym i biosyntesen av kolesterol. Tabell 1 nedenfor angir konsentrasjonene (i ng/ml) av forbindelsen ifølge oppfinnelsen som inhiberer virkningen av 3-hydroksy-3-metylglutaryl (HMG)-CoA-reduktase med 50% (ved måling ifølge metoden som er beskrevet i Analytical Biochemistry, vol. 31, 1969, p. 383),og konsentrasjonene (i ng/ml) av forbindelsen ifølge oppfinnelsen som inhiberer kolesterolbiosyntese med 50% (målt ved metoden i Journal of Biological Chemistry, vol. 247, 1972, p. 4914). De tilsvarende resultater for de kjente forbindelser ML-236B (som er en forbindelse som er kjent for å ha liknende type av virkning og fremstilles ved dyrking av mikroorganismer av slekten Penicillium som beskrevet i britisk patent-skrift 1.453.425) er også angitt. Konsentrasjonen av Monacolin K selv "som inhiberer kolesterolbios"yhtesé med 50% er også angitt. Det vil ses at mens konsentrasjonen av ML-236B som er nødvendig for å inhibere kolesterolbiosyntese med 50% er 10,0 ng/ml er den tilsvarende konsentrasjon for Monacolin K estrene av størrelses-orden 1 ng/ml (dvs. ca. 10 ganger bedre), og den tilsvarende konsentrasjon for natriumsaltet av Monacolin K er ca. 0,14 ng/ml (dvs. ca. 70 ganger bedre). Virkningene for saltene og estrene av Monacolin K er sammenliknbare med eller bedre enn virkningen for Monacolin K selv.

2. Senkning av blodkolesterolmengder

Dyrene som ble benyttet ved denne prøve var rotter av stammen Wistar Imamichi som hver hadde kroppsvekt på ca. 300 g. Prøvene ble utført med rottegrupper som hver besto av 5 dyr. Hvert dyr ble intravenøst injisert med 400 mg/kg "Triton" WR-1339, et materiale som er kjent for å øke blodkolesterol-mengden, mens det samtidig ble administrert oralt en av forbindelsene som er angitt i tabell 2 nedenfor i den mengde som er angitt i tabellen. 20 timer etter oral administrering ble rottene ofret ved blødning, og blodet og leverne ble samlet og deres kolesterolmengder ble bestemt på vanlig måte. Resultatene er angitt i tabell 2 som angir senkningen i blod- og lever-kolesterolmengder sammenliknet med en kontrollgruppe av rotter hvortil det bare var blitt administrert "Triton" WR-1339.

For sammenliknings skyld er de tilsvarende resultater angitt for Monacolin K selv og for ML-236B, men disse forbindelser ble administrert i betydelig større doser enn de som ble benyttet for forbindelsene ifølge oppfinnelsen for å oppnå en sammen-liknbar senkning av kolesterolmengdene.

Senkningen i blod- eller leverkolesterolmengde ble beregnet med følgende formel:

hvor: A = mengde i gruppe som ble behandlet bare med "Triton"

WR-1339,

B mengde i ubehandlet kontrollgruppe,

C = mengde i prøvegruppe.

3. Akutt toksisitet

Forbindelsene som ble prøvet var metyl-, etyl-, butyl-

og benzylestrene samt natrium- og kalsiumsaltene av Monacolin K. Det viste seg at 50% dødelig dose (LD,-q) for hver av disse forbindelser var minst 2000 mg/kg ved oral administrering og minst 500 mg/kg ved intraperitoneal administrering. Forbindelsene har således en meget lav toksisitet.

Disse resultater viser at forbindelsene ifølge oppfinnelsen inhiberer biosyntesen av kolesterol, og som et resultat av dette senker kolesterolmengdene i blod. De er således verdifulle medisiner ved behandlingen av hyperlipaemi og åreforkalkning.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan administreres oralt eller parenteralt i form av en kapsel, tablett, injiserbart preparat eller en vilkårlig annen formulering, selv om det van-ligvis foretrekkes å administrere dem oralt. Dosen vil variere avhengig av alderen og kroppsvekten til pasienten og hvor alvor-lig tilstanden er, men generelt er den daglige dose for en voksen fortrinnsvis fra 0,1 til 100 mg, helst fra 0,1 til 10 mg, når det gjelder Monacolin K salter og fra 0,5 til 100 mg, helst fra 0,5 til 10 mg, når det gjelder Monacolin K estre.

Fremstilling av forbindelsene ifølge oppfinnelsen vil bli ytterligere illustrert ved hjelp av de etterfølgende eksempler.

Eksempel 1

Natriumsalt av Monacolin K

300 liter av et dyrkingsmedium som hadde en pH på 5,5 før sterilisering og som inneholdt 5% vekt/volum glukose, 0,5% vekt/volum maisstøpvæske, 2% vekt/volum pepton samt 0,5% vekt/volum ammoniumklorid ble anbrakt i en 600 liter fermen-teringsbeholder og innpodet med organismen Monascus ruber SANK 18174 (Ferm. 4957) . Dyrkingen av organismen ble utført i 116 timer ved 26°C med en luftingshastighet på 300 liter pr. min.

og omrøring ved 190 omdr./min. Ved slutten av dette tidsrom ble pH i dyrkingsmediet som inneholdt organismen regulert til en verdi på 3,4 ved tilsetning av 6N saltsyre, og deretter ble mediet ekstrahert med 800 liter metanol. 6 kg "Hyflo Super Cel" ble tilsatt, og deretter ble ekstrakten filtrert under anvendelse av en filterpresse, hvorved det ble oppnådd 1100 liter metanolisk ekstrakt. Denne ekstrakt ble vasket med 200 liter av en mettet vandig løsning av natriumklorid og deretter med 180 liter etylcykloheksan. Den resulterende løsning ble ekstrahert med 600 liter etylendiklorid. 50 g tri-fluoreddiksyre ble tilsatt til etylendikloridekstrakten og fikk reagere ved 80°C i 30 min. Reaksjonsblandingen ble deretter vasket etter tur med 200 liter av en 2 prosentig vekt/volum vandig løsning av natriumbikarbonat og 200 liter av en 10 prosentig vekt/volum vandig løsning av natriumklorid. Blandingen ble deretter konsentrert ved inndamping under senket trykk, hvorved det ble oppnådd 135 g av en oljeaktig substans.

Denne oljeaktige substans ble løst i 400 ml metanol. 20 ml av den resulterende metanoliske løsning, som inneholdt 6,8 g av oljen, ble deretter underkastet preparativ, hurtig væskekromatografi under anvendelse av et system 500 fra Waters Co. Limited, utstyrt med en "Prepac" C^g-kolonne (kolonne med reversert fase). En 85:15 volumblanding av metanol og vann ble anvendt som fremkaller. Fremkalling ble utført ved en strømningshastighet på 200 ml/min. (fremkallingstid ca. 10 min.) ved å iaktta et differensialrefraktometer som var forbundet med kroppen, og fraksjonen som hadde hovedtoppen på differensialrefraktometeret ble fraskilt. Denne operasjon ble gjentatt, og de resulterende hovedtoppfraksjoner ble oppsamlet og konsentrert, hvorved det ble oppnådd 10,2 g av en oljeaktig substans. Denne oljeaktige substans ble løst i 30 ml metanol, og 6 ml av den metanoliske løsning, som inneholdt ca. 2 g av oljen, ble igjen underkastet samme preparative, hurtige væskekromatografi og fremkalt med en 80:20 volumblanding av metanol og vann ved en strømningshastig-het på 200 ml/min. Fraksjonen som viste hovedtoppen ble fraskilt. Denne operasjon ble gjentatt, og hovedtoppfraksjonene ble oppsamlet og konsentrert. Resten ble behandlet med vandig metanol, hvorved det ble oppnådd 1170 mg råkrystaller som ble rekrystallisert atskillige ganger fra etanol, hvorved det ble oppnådd 864 mg krystaller.

Til disse krystaller ble det tilsatt 19,4 ml av 0,1N vandig natriumhydroksyd, og blandingen ble omrørt ved 50-60°C i 3 timer. Uløselige stoffer ble avfiltrert, og filtratet ble lyofilisert til dannelse av 900 mg av natriumsaltet av Monacolin K som hadde følgende egenskaper:

1. Farge og form: Hvitt pulver

2. Elementæranalyse:

Beregnet: C: 64,84%, H: 8,38%, Na: 5,17%

Funnet: C: 64,78%, H: 8,55%, Na: 5,21%.

3. Molekylvekt:

444 jj/ed massespéktrometri (F.D. Mass.fJ .

4. Molekylformel:

5. UV-spektrum:

Som vist i fig. 1, X , :

^ maks

232 nm (log e = 4,30) ,

239 nm (log e = 4,36),

248 nm (log e = 4,19).

6. IR-spektrum (KBr-tabletter):

Som vist i fig. 1.

7. NMR-spektrum (D20):

Som vist i fig. 3.

8. Hurtig væskekromatografi:

Oppholdstid: 8,5 minutter,

Kolonne: "Microbondapac" C18,

60 volum% vandig metanol + 0,1% "PIC-A".

Strømningshastighet: 1,5 ml/min.

Som vist i fig. 4.

9. Løselighet:

Løselig i vann, uløselig i organiske løsningsmidler.

10.Spesifikk dreining:

[ajp<5> = +266° (c = 0,33, vann).

Eksempel 2

Natriumsalt av Monacolin K

300 liter av et dyrkingsmedium som hadde en pH på 7,4 før sterilisering og som inneholdt 1,5% vekt/volum løselig stivelse, 1,5% vekt/volum glycerol, 2,0% vekt/volum fiskemel og 0,2% vekt/ volum kalsiumkarbonat ble anbrakt i en 600 liters fermenterings-beholder og innpodet med organismen Monascus ruber SANK 17075

(CBS 832.70). Dyrking av organismen ble utført i 120 timer ved 26°C med en luftingshastighet på 300 liter pr. min. og omrøring ved 190 omdr./min. Dyrkingsmediet ble deretter filtrert i en filterpresse hvorved det ble oppnådd 35 kg (våtvekt) av organismen.

Til dette ble det tilsatt 100 liter vann, og blandingens pH-verdi ble regulert til 12 ved tilsetning av natriumhydroksyd under omrøring. Blandingen ble deretter hensatt ved romtemperatur i 1 time, hvoretter 2 kg "Hyflo Super Cel" ble tilsatt til blandingen, som deretter ble filtrert i en filterpresse. Filt-ratets pH ble regulert til en verdi på 10 ved tilsetning av saltsyre, og den resulterende blanding ble deretter adsorbert på en kolonne som inneholdt 5 liter "HP-20"-harpiks som ble vasket med 15 liter henholdsvis vann og en 10 volumprosentig vandig løsning av metanol. Kolonnen ble deretter eluert med 90 volumprosentig vandig metanol. Eluatet ble konsentrert til et volum på ca. 10 liter hvoretter dets pH ble regulert til 2 ved tilsetning av saltsyre, og blandingen ble ekstrahert med etylacetat. Ekstrakten ble vasket med en mettet vandig løsning av natriumklorid, tørket over vannfritt natriumsulfat og deretter konsentrert ved inndamping til tørr tilstand, hvorved det ble oppnådd 50 g av en oljeaktig substans som inneholdt Monacolin K syre. Til denne oljeaktige substans ble det tilsatt tilstrekkelig metanol til å gi et totalt volum på 100 ml. 20 ml av den resulterende løsning ble deretter underkastet preparativ, hurtig væskekromatografi under anvendelse av en kolonne med reversert fase (som beskrevet i eksempel 1), eluert med en 20 volumprosentig vandig løsning av metanol, som inneholdt 2% eddiksyre, ved en strømningshas-tighet på 200 ml/min. Fraksjonen som oppviste hovedtoppen på differensialrefraktometeret ble fraskilt (7-10 min.). De res-terende 80 ml av den metanoliske løsning ble deretter behandlet på samme måte. De resulterende hovedtoppfraksjoner ble oppsamlet, konsentrert og ekstrahert med etylacetat. Ekstrakten ble konsentrert til tørr tilstand etter tilsetning av heptan, hvorved det ble oppnådd 1,2 g av en oljeaktig substans.

Denne oljeaktige substans ble løst i 20 ml metanol og deretter underkastet hurtig væskekromatografi som beskrevet ovenfor, hvorved det ble oppnådd 150 mg Monacolin K syre. Til denne ble det tilsatt 2 ml metanol og 100 ml vann, pg den resulterende løsning ble regulert til en pH på 8,0 ved tilsetning av IN van-

dig natriumhydroksyd, hvorved det ble oppnådd en klar, vandig løsning. Denne løsning ble ført gjennom en kolonne som inneholdt 10 ml "HP-20"-harpiks, og deretter ble kolonnen vasket med 100

ml vann og eluert med 80 volumprosentig vandig metanol. Eluatet ble lyofilisert, hvorved det ble oppnådd 130 mg av natriumsaltet av Monacolin K i form av et hvitt pulver. Produktets egenskaper var de samme som de som angitt for produktet i eksempel 1.

Eksempel 3

Kalsiumsalt av Monacolin K

Dyrkingen, ekstraheringen, konsentreringen, den preparative, hurtige væskekromatografi samt rekrystallisasjon fra metanol som er beskrevet i eksempel 1 ble gjentatt. 500 mg av de resulterende krystaller ble deretter løst i 50 ml metylenklorid, og den resulterende løsning ble filtrert gjennom et milliporefilter. 20 ml mettet, vandig løsning.av kalsiumhydroksyd ble tilsatt til filtratet, og deretter ble blandingen omrørt kraftig ved romtemperatur. Når løsningens pH sank til under 8 ble det tilsatt en ytterligere 10 ml porsjon av mettet, vandig løsning av kalsiumhydroksyd, og omrøring ble fortsatt. Da pH ikke lenger sank (etter at totalt 50 ml av den vandige løsning av kalsiumhydroksyd var blitt tilsatt), ble det tilsatt destillert vann, og hele løsningen ble anbrakt i en skilletrakt. Den organiske fase ble oppsamlet og løsnings-midlet avdestillert. Resten ble opparbeidet med heptan, og deretter ble det oppnådd et pulver ved å utsette blandingen for ultralydbølger. Pulveret ble filtrert og tørket, hvorved det ble oppnådd 4 50 mg av kalsiumsaltet av Monacolin K i form av et hvitt pulver.

Dette kalsiumsalt hadde følgende egenskaper:

1. Molekylvekt: 882 (ved massespektrometri). 2. Molekylformel: (C24H37°6^2"Ca"

3. Smeltepunkt: 155-165°C (med spalting).

4. Spesifikk dreining:

[ajp<5> = +209° (c = 1,48, kloroform).

5. IR-spektrum (KBr):

Som vist i fig. 5.

6. NMR-spektrum (CD^OD): Som vist i fig. 6.

Eksempel 4

Metylester av Monacolin K

Dyrkingen, ekstraheringen, konsentreringen, den preparative, hurtige væskekromatografi samt rekrystallisasjon fra etanol som er beskrevet i eksempel 1 ble gjentatt, hvorved det ble oppnådd 864 mg Monacolin K. 200 mg av denne Monacolin K ble løst i 20

ml metanol, som på forhånd var awannet med "Molecular Sieve 3A". Etter tilsetning av noen få dråper acetylklorid ble løsningen omrørt ved romtemperatur i 3 timer. Løsningsmidlet ble avdestillert, og resten ble ekstrahert med 50 ml etylacetat. Ekstrakten ble etter tur vasket med 2% vekt/volum vandig løsning av natrium-, bikarbonat og en mettet vandig løsning av natriumklorid og deretter tørket over vannfritt natriumsulfat, hvoretter løsnings-midlet ble avdestillert. Resten ble adsorbert på en kolonne som inneholdt 10 g silikagel ("Wakogel" C-100) som på forhånd var behandlet med benzen. Fraksjonene som ble eluert med en 6:94 volumblanding av etylacetat og benzen ble oppsamlet, og løs-ningsmidlet ble avdestillert, hvorved det ble oppnådd 6 5 mg av metylesteren av Monacolin K som en fargeløs olje.

Dette produkt hadde følgende egenskaper:

1. Molekylvekt: 436,6 (ved massespektrometri).

2. Molekylformel: C25H40°6"

3. Spesifikk dreining:

[a] Q 5 = +208° (c = 1,05, metanol).

4. IR-spektrum: Som vist i fig. 7.

5. NMR-spektrum: Som vist i fig. 8.

Eksempel 5

Metylester av Monacolin K

Natriumsaltet av Monacolin K ble fremstilt slik som beskrevet i eksempel 2. 100 mg av dette natriumsalt ble deretter løst i 2 ml dimetylsulfoksyd, og deretter ble 50 pl metyljodid tilsatt til løsningen. Løsningen ble deretter kokt med tilbake-løpskjøling under omrøring ved 40-50°C i 5 timer i en reaksjons-beholder som var utstyrt med en tilbakeløpskjøler. Reaksjons-blandingen ble deretter fortynnet med 5 ml vann og ekstrahert med 10 ml metylenklorid. Løsningsmidlet ble avdestillert fra ekstrakten, og resten ble adsorbert på en kolonne som inneholdt 10 g silikagel ("Wakogel" C-100) som på forhånd var behandlet med benzen. Fraksjonene som ble eluert med en 4:96 volumblanding av etylacetat og benzen ble oppsamlet, og løsningsmidlet ble avdestillert, hvorved det ble oppnådd 35 mg av metylesteren av Monacolin K i form av en olje.

Eksempel 6

Etylester av Monacolin K

100 mg Monacolin K, som var fremstilt slik som beskrevet

i eksempel 1, ble løst i 15 ml etanol som på forhånd var av-vannet med "Molecular Sieve 3A", og noen få dråper acetylklorid ble tilsatt til løsningen. Blandingen ble deretter omrørt ved romtemperatur i 3 timer, hvoretter løsningsmidlet ble avdestillert, og resten ble ekstrahert med 50 ml etylacetat. Ekstrakten ble etter tur vasket med en 2% vekt/volum vandig løsning av. natriumbikarbonat og en mettet vandig løsning av natriumklorid og deretter tørket over vannfritt natriumsulfat. Etter avdestil-lering av løsningsmidlet ble resten adsorbert på en kolonne som inneholdt 10 g silikagel ("Wakogel" C-100) som på forhånd var behandlet med benzen. Fraksjonene som ble eluert med en 6:94 volumblanding av etylacetat og benzen ble oppsamlet, og løs-ningsmidlet ble avdestillert, hvorved det ble oppnådd 30 mg av etylesteren av Monacolin K i form av en fargeløs olje.

Egenskapene til denne forbindelse var følgende:

1. Molekylvekt: 450,6 (ved massespektrometri).

2. Molekylformel: <C>26H42°6'

3. IR-spektrum (CHCl3):

Som vist i fig. 9.

4. NMR-spektrum (CDCl3):

Som vist i fig. 10.

Eksempel 7

Butylester av Monacolin K

200 mg Monacolin K som var fremstilt slik som beskrevet i eksempel 1, ble løst i 20 ml butanol som på forhånd var awannet med "Molecular Sieve 3A". Etter tilsetning av noen få dråper acetylklorid til løsningen ble den resulterende blanding omrørt ved romtemperatur i 2 timer. Løsningsmidlet ble deretter avdestillert, og resten ble ekstrahert med 50 ml etylacetat. Ekstrakten ble vasket etter tur med en 2 prosentig vekt/volum vandig løsning av natriumbikarbonat og en mettet vandig løsning av natriumklorid. Løsningen ble deretter tørket over vannfritt natriumsulfat, og løsningsmidlet ble avdestillert. Resten ble adsorbert på en kolonne som inneholdt 10 g silikagel ("Wakogel" C-100) som på forhånd var behandlet med benzen. Fraksjonene som ble eluert med en 4:96 volumblanding av etylacetat og benzen ble oppsamlet, og løsningsmidlet ble avdestillert, hvorved det ble oppnådd 80 mg av butylesteren av Monacolin K i form av en fargeløs olje.

Denne forbindelse hadde følgende egenskaper:

1. Molekylvekt: 478,7 (ved massespektrometri).

2. Molekylformel: <C>28H46°6*

3. IR-spektrum (CHCl3): Som vist i fig. 11.

4. NMR-spektrum:

Som vist i fig. 12.

Eksempel 8

Benzylester av Monacolin K

200 mg Monacolin K som var fremstilt slik som beskrevet i eksempel 1, ble løst i 20 ml benzylalkohol som på forhånd var av-vannet med "Molecular Sieve 3A". Etter tilsetning av noen få

dråper acetylklorid til løsningen bie den resulterende blanding omrørt ved romtemperatur i 3 timer. Løsningsmidlet ble deretter avdestillert, og resten ble ekstrahert med 50 ml etylacetat. Ekstrakten ble etter tur vasket med en 2 prosentig vekt/volum vandig løsning av natriumbikarbonat og en mettet vandig løsning

av natriumklorid. Løsningen ble deretter tørket over vannfritt natriumsulfat, og løsningsmidlet ble avdestillert. Resten ble adsorbert på en kolonne som inneholdt 10 g silikagel ("Wakogel" C-100) som på forhånd var behandlet med benzen. Fraksjonene som ble eluert med en 4:96 volumblanding av etylacetat og benzen ble oppsamlet, og løsningsmidlet ble avdestillert, hvorved det ble oppnådd 70 mg benzylester av Monacolin K i form av en fargeløs olje.

Denne forbindelse hadde følgende egenskaper:

1. Molekylvekt: 512,6 (ved massespektrometri).

2. Molekylformel: C3iH4406-

3. IR-spektrum (CHCl^).

Som vist i fig. 13.

4. NMR-spektrum (CDC13).

Som vist i fig. 14.

Claims

Fremgangsmåte til fremstilling av forbindelser med

formelen

hvor R er et alkalimetallatom, en lavere alkylgruppe eller en fenyllaverealkylgruppe, karakterisert ved at mikroorganismen Monascus ruber SANK 18174 (Ferm.4957) eller Monascus ruber SANK 17075 (CBS 83270) dyrkes under aerobe betingelser i et egnet dyrkningsmedium som inneholder assimilerbare kilder for karbon og nitrogen under dannelse av Monacolin K som deretter overføres til salter og estere på vanlig måte.