DE1814735B2

DE1814735B2 - Antibiotikum sf-733

Info

Publication number: DE1814735B2
Application number: DE19681814735
Authority: DE
Inventors: Takashi; Ezaki Norio; Yokohama; Tsuruoka Takashi; Niwa Tomizo; Kawasaki; Akita Eiichi Tokio; Niida Taro Yokohama; Shomura (Japan). C07c 173-02
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1967-12-18
Filing date: 1968-12-14
Publication date: 1973-03-01
Also published as: DE1814735C3; FR1603553A; BE725674A; US3661892A; ES361544A1; AT290013B; MY7400158A; NL162135C; IL31223A; SE355378B; YU32708B; NL6818105A; DK122405B; NO128662B; CH545849A; YU297468A; NL162135B; IL31223A0; DE1814735A1; GB1254883A

Description

OH OH

10 beigefügten diesen Zeichnungen bedeutet

Fig 1 das Ultraviolettspektrum der amorphen

, ^SUF?gⁿ"da's⁷ Infrarotspektrum der amorphen Substanz SF-733 (KBr-Tablette),

Fi e 3 das Papierchromatogramm der amorphen Substanz SF-733 sowie der mit dieser Substanz verAntibiotika, , , . ... [ das Ultraviolettspektrum der kristallinen

lanz SF-733 in Form der freien Base,
_P _1K 5 das Infra.oispcktrum der kristallinen Substanz SF-733 in Form der freien Base.

Streptomyces thermoflavus SF-733 weist folgende Charakteristika auf:

20

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Antibiotikum, welches als SF-733 bezeichnet wird und welches durch Kultivierung eines bestimmten Stammes der Art Streptomyces hergestellt werden kann.

Dieses Antibiotikum besitzt eine starke wachstumshemmende Wirkung gegen Mikroorganismen ver-

1. Unter dem Mikroskop
1. Reichlich gebildetes, offen spiralförmiges LuU-

2 Sporen: oval bis elliptisch. Oberflächenstruktur stachlig. Größe 0,8 bis 1,0 x 1,1 bis 1,4 Mikron.

II. Eigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien

Kulturmedium

Sucrose-Czapek-Agar
(bebrütet bei 28°C)

Glycerin-Czapek-Agar
("bebrütet bei 28^CC)

Krrinskys Glukose-Asparagin-Agar
(bebrütet bei 28° C)

Ushinskys Glukose-Asparagin-Agar
(bebrütet bei 28° C)

Calciummalat-Agar
(bebrütet bei 28 C)

Glycerin-Calciummalat-Agar
(bebrütet bei 28 C)

Wachstum

dick, gut, faltig, in das Medium eindringend, gelbliche Cremefarbe, Rückseite hellbräunliche Cremefarbe

dick, gut, faltig, in das Medium eindringend, leicht gelblichbraun

gut, in das Medium eindringend, dunkle Cremefarbe, Rückseite bräunlichgelb

gut, in das Medium eindringend, bräunlichgelb mit Grünstich

nicht gut, leicht gelblich cremefarben

Gelb,
Kolonien

l.uftmyccl

sehr schwach, leicht
gelblichweiß

schwach,

weiß bis cremefarben

schwach,

cremefarben bis leicht
gelblichweiß

sehr starkes Wachstum,
pulverförmig, grünlichgelb, allmählich
von graustichig auf
gräulichbraun übergehend, Bildung von
grünlichgelben
Tupfen

schwach,
weiß

nichts bis schwach,
leichte Gelbfarbe

lösliches Pigment

nichts

leicht Gelb

nichts
nichts

Fortsetzung

Kulturmedium	Wachstum	Luftmycel	Lösliches Pigment
Stärke synthetischer Agar (bebrütet bei 28° C)	gut, in das Medium eindringend. Gelb, der Innenteil der Kolonie Braun mit Grünstich	sehr starkes Wachstum, pulverförmig, grün lichgelb, allmählich in gräulichbraun über gehend	leicht Gelb
Bouillon-Agar (bebrütet bei 28⁰C)	Kolonien, in das Me dium eindringend, dunkle Cremefarbe, Rückseite bräunlich gelb	nichts bis schwach, hellgelb	nichts
Glukose-Bouillon-Agar (bebrütet bei 28⁰C)	fein faltig, gelblichbraun	schwach, cremefarben	nichts
Kartoffelpfropf (bebrütet bei 28° C)	erhaben, fein faltig, leicht bräunlich cremefarben	schwach, weißlichgrau	nichts
Karottenpfropf (bebrütet bei 28^CC)	Kolonien, dunkle Cremefarbe	nichts	nichts
Tyrosin-Agar (bebrütet bei 28 C)	tief in das Medium eindringend, dunkle Cremefarbe	grau	nichts
Ei (bebrütet bei 37 C)	Kolonien, leicht bräunlichgelb	nichts	nichts
Loefflers koaguliertes Serum (bebrüte! bei 37 C) -	dunkle bräunlichgelbe Farbe	nichts	nichts
Bacto-Nitratbrühe (bebrütet bei 28 C)	als Bodensatz, farblos	nichts	nichts
Magermilch (bebrütet bei 37 C)	gelblichorangefarbener, das Glas an der Oberfläche berühren der Ring, Haupt menge am Boden abgesetzt	nichts	leicht bräunliche Orangefarbe; Reaktion des Me diums: pH-Wert 5,5
Gelatine (bebrütet bei 20 C)	farblos bis cremefarben	nichts	nichts
Cellulosemedium (bebrütet bei 28 C)	kein Wachstum

III. Physiologische Eigenschaften

Bildung von Schwefelwasserstoff.. . negativ

Bildung von Tyrosinase negativ

Bildung von Nitrit positiv

Koagulierung von Magermilch .... negativ

(28' C.

37 C) Peptonisieruim von Mauermilch . . . positiv

(37 C) Peptonisierung von Magermilch . . . nciiativ

(28 C)

Hydrolyse von Starke positiv

Verflüssigung von Gelatine negativ

Auflösung von Loefflers koagu-

liertem Serum positiv

(schwach,

37 C)

IV. Ausnutzung der Kohlenstoffquellen

(Pridham-Gottlicbs Basalmedium,
bebrütet bei 27 C)

1. Verwendet :Arabinose,Rhamnose. Glukose, Mannose, Galaktose, Saccharose, Laktose, Raffinose, Dextrin. Inulin, Stärke, Glycerin, Sorbit. Mannit, Maltose.
^Ί-. Zweifelhaft: Inosit, Natriumeitrat.

^ίκ> 3. Nicht verwendet: Xylose. Fructose, Duleil. Natriumacetal. Natriumsuccinat, Salicin, Cellulose.

V. Optimale Temperatur

C (gemessen mit einem Tempi'.ralurgradient^ilS Inkubator).

Die Eigenschaften des Stammes Streptomyces thermoflavus SF-733 können wie iolgt zusammengefaßt

werden: Spiralbildung im Luftmycel; Sporen mit stacheliger Struktur; cremefarbenes bis gelblichbraunes Wachstum auf synthetischen Medien, gelblichgrünes bis gräulichbraunes Luftmycel, Fehlen eines löslichen Pigmentes im allgemeinen, jedoch hellgelbes Pigment auf Glukose-Asparagin-Agar (U s h i η s k y) und Stärke-synthetischer-Agar, cremefarbiges bis gelblichbraunes Wachstum, dünnes Luftmycel und kein lösliches Pigment auf organischen Medien. Das hervorstechendste Merkmal des Stammes Streptomyces thermoflavus SF-733 ist darin zu sehen, daß die optimale Wachstumstemperatur mit 40 C verhältinsmäßig hoch liegt. Aus den vorstehenden Eigenschaften kann geschlossen werden, daß dieser Stamm SF-733 der flavus-Reihe der Gattung Streptomyces nahe verwandt ist. In dieser Reihe können Streptomyces flavus, Streptomyces flaveolus, Streptomyces flavovireus, Streptomyces flavogriseus, Streptomyces alboflavus, Streptomyces parvus, Streptomyces parvullus, Streptomyces kanamyceticus, Streptomyces griseoflavus und Streptomyces celluloflavus als nahe verwandte Stämme genannt werden. Unter diesen Arten sind Streptomyces kanamyceticus, Streptomyces flavogriseus, Streptomyces alboflavus und Striptomyces celluloflavus von dem Stamm SF-733 klar unterschieden, weil die Luftmycelien der ersteren keine Spiralen bilden, während in den Mycelien der letzteren große Mengen typischer offener Spiralen vorkommen. Streptomyces parvullus, welches Sporen vom glatten Typ bildet, unterscheidet sich von dem Stamm SF-733 insofern, als die Oberfläche der Sporen des letzteren stachelig ist. Streptomyces parvus und Streptomyces griseoflavus unterscheiden sich deutlich von dem Stamm SF-733, weil sie auf einem Cellulosemedium gut wachsen. Streptomyces flavus, Streptomyces flaveolus und Streptomyces flavovireus, welche als die typischen Stämme der flavus-Reihe angesehen werden können, sind dem Stamm SF-733 am nächsten verwandt, und zwar im Hinblick auf die verschiedenen Eigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien.

Diese drei Organismen unterscheiden sich jedoch von dem Stamm SF-733 in den folgenden Punkten: Die Sporen von Streptomyces flaveolus weisen eine haarige Oberfläche auf; im Gegensatz dazu haben die Sporen des Stammes SF-733 eine stachelige Oberfläche. Die Luftmycelien von Streptomyces flavus und Streptomyces flavovireus sind im wesentlichen gerade und bilden nur in einigen Fällen offene Spiralen, während das Luftmycel von SF-733 große Mengen offene Spiralen bildet. Darüber hinaus erzeugt Streptomyces flavovireus grünlichgelbe lösliche Pigmente auf synthetischem Agarmedium, wogegen der Stamm SF-733 kein lösliches Pigment bildet. Streptomyces flavus produziert kein Nitrat und seine optimale Kultivierungstemperatur beträgt 25° C; der Stamm SF-733 erzeugt dagegen Nitrat, und seine optimale Kultivierungstemperatur liegt mit 40° C verhältnismäßig hoch. Der Stamm SF-733 unterscheidet sich also deutlich von den vorstehend genannten drei Organismen, und zwar im Hinblick auf verschiedene wichtige Charakteristika.

Die neue antibiotische Substanz SF-733, die von dem Stamm Streptomyces thermoflavus SF-733 gebildet wird, ist ein typisches wasserlösliches basisches Antibiotikum mit einem breiten antibakteriellen Wirkungsspektrum; seine optische Drehung ist ( + ). Unter den bekannten Antibiotika gehören Neomycin, Paromomycin, Kanamycin, Gentamicin und Tenemycin in dieselbe Gruppe. Der Stamm SF-733 sollte daher im Hinblick auf die mykologische Verwandtschaft mit den Stämmen verglichen werden, die die genannten Antibiotika erzeugen. Es existieren zwei Gentamicin erzeugende Stämme, nämlich Micromonospora chinosspora und Micromonospora purpurea. Diese beiden Stämme gehören nicht zur Gattung Streptomyces, wodurch sie sich bereits deutlich von dem Stamm SF-733 unterscheiden. Weitere Neomycin erzeugende Stämme sind: Slreptomyces fradiae, Streptomyces albogriseolus; ein Paromomycin erzeugender Stamm ist Streptomyces rimosus forma paromomycine; ein Kanamycin erzeugender Stamm ist Streptomyces kanamyceticus; ein Tenemyun erzeugender Stamm ist Streptomyces tenebrarius; alle

sind von dem Stamm SF-733 deutlich unterschieden, und zwar im Hinblick auf ihre morphologischen higenschaften, die in der folgenden Tabelle zusammengestellt sind; die verschiedenen Stämme unterscheiden sich sowohl von dem Stamm SF-733 als auch untereinander.

Vergleich zwischen dem Stamm SF-733 und bekannten Streplomyccs-Arten, die rechtsdrchcnde wasserlösliche basische Antibiotika bilden

Antibiotika	Stumme	I iil'lmyccl	ONrllaclu do sporei	gi.i¹.;
Substanz	Stamm	Spiralen	stachelig
SF-733	SF-733
Neomycin	Streptomyces	gerade, u'·■>'.;	»lüii
	fradiae	flexibel, j
		keine j
		Spiralen ί
	Streptomyces	Spiralen ^! Ii !aüü
	albogri
	seolus
Paromomycin	Streptomyces	gerade. ■ ^i .',■
	rimosus	eeleiient-
	forma paro	lich
	momycinus	offen
		oder
		geschlos
		sen, spi
		ralig
Kanamycin	Streptomyces	gerade
	kanamyce
	ticus
Tenemycin*)	Streptomyces	Spiralen
	tenebrarius

*) (Seventh lntersrience Conference on Antimicrobial Auent
Chemotherapy. 25 bis 27. Oktober 1967. in Chicago.»

Auf Grund der vorstehenden mykologischen P
lung konnte festgestellt werden, daß der Stamm SF-'
f-^ln,-ⁿf^{Uer Mlkro}°rganismus ist, welcher ein was«
losliches basisches Antibiotikum bildet; der Mik
Organismus kann taxonomisch als neuer Stamm
navus-Reihe eingeordnet werden; er wurde als Str

tomyces thermoflavus nov. sp. bezeichnet. (Die Eigenschaften der zum Vergleich herangezogenen Streptomyces-Arten wurden dem Werk von Waksman »Actinomycetes«, Bd. 2. 1961, entnommen.)

Die Eigenschaften des Stammes SF-733 sind leicht veränderlich, wie dies auch bei anderen Strcptomyces-Arten zu beobachten ist. So lassen sich beispielsweise mit verschiedenen bekannten Mutagenen, wie Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen, Hochfrequenzwellen, radioaktiven Strahlen und Chemikalien künstliche Varianten und Mutanten von SF-733 erhalten. Alle natürlichen und künstlichen Varianten und Mutanten, die zu Streptomyces thermoflavus gehören und die Fähigkeit zur Bildung der Substanz SF-733 besitzen, können für die Zwecke der Erfindung verwendet werden.

Erfindungsgemäß kann der Stamm SF-733 in einem Kulturmedium gezüchtet werden, welches Nährstoffe enthält, die zur Züchtung üblicher Mikroorganismen verwendet werden. Als Nährstoffe können die für die Züchtung von Streptomyces üblicherweise eingesetzten Nährstoffe verwendet werden. Glukose, Stärke, Glycerin. Dextrin oder Sucrose sind beispielsweise als Kohlenstoffquelle geeignet. Sojabohnenmehl. Weizenkeime, Fleischextrakt, Pepton, Trockenhefe, Maisquellwasser, Schlempe. Ammoniumsulfat und Natriumnitrat sind als Stickstoffquelle geeignet. Gegebenenfalls können anorganische Salze, wie Calciurncarbonat, gewöhnliches Kochsalz. Kaliumchlorid oder -phosphat zugesetzt werden. Weiterhin können organische und anorganische Materialien, die das Wachstum des Stammes SF-733 unterstützen und die Bildung der Substanz SF-733 erleichtern, zugesetzt werden. Für die Züchtung des Stammes SF-733 hat sich die flüssige Kultur, insbesondere unter submersen aeroben Bedingungen als am günstigsten erwiesen. Für die Züchtung sind Temperaturen zwischen 25 und 40 C geeignet; am besten liegt die TernperatU! nahe bei 35 C. Die Bildung der Substanz SF-733 erreicht in 2 bis 5 Tagen ein Maximum, und zwar sowohl bei der Schüttelkultur als auch bei der Tankkultur.

Für die Prüfung von SF-733 können Mycinassay-Agar (pH-Wert 7,8) als Medium und Bacillus subtilis ATCC Nr. 6633 als Testorganismus verwendet werden.

hine lineare Beziehung zwischen dem Logarithmus der Konzentration der Substanz SF-733 und dem Durchmesser der Hemmzone gegen den Testorganismus konnte bei einer Konzentration von 1 bis 25 -'/mi beobachtet werden; die Durchmesser der Hemmzone betrugen unter dieser Bedingung jeweils 15 bis 25 mm (Platt en test).

Die Substanz SF-733 ist ein wasserlösliches basisches Antibiotikum, was sich klar auf Grund der nachstehend beschriebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften ergibt; die Substanz kann aus der Kulturbrühe mit Hilfe beliebiger bekannter Verfahren, wie sie üblicherweise für die Gewinnung bekannter wasserlöslicher basischer Antibiotika, wie Kanamycin oder Neomycin, angewandt werden, abgetrennt werden.

Die Substanz SF-733 kann leicht an Aktivkohle im alkalischen Bereich adsorbiert und mit wäßrigem Alkohol oder wäßrigem Aceton im sauren pH-Bereich wirksam eluiert werden.

Die Substanz SF-733 kann auch unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes als Adsorbens gereinigt werden. Ein geeignetes Ionenaustauscherharz ist beispielsweise ein Kationenaustauscherharz wie »Amberlite lRC-50« vom NH₄ ⁺-, Na'- oder H⁺-Typ. Die Eluierung wird üblicherweise mit wäßriger Säure-, Alkali- oder Salzlösung vorgenommen. Die Substanz SF-733 kann auch in Form eines Säureanlagcrungssalzes gefällt werden, indem man ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel zu einer wäßrigen Lösung gibt, die das Säureanlagerungssalz der Substanz SF-733 enthält.

Die so erhaltene rohe pulverförmige Substanz

ίο SF-733 kann durch lonenaustausch-Chromatographie mit »Dowex 1 χ 2« (OH -Typ) oder »Amberlite CG-50« (NH₄ ⁺-TyP) weiter gereinigt werden; nach der Reinigung liegt ein weißes amorphes Pulver vor, welches die Substanz SF-733 in Form der freien Base darstellt; die Reinheit und Einheitlichkeit des Produktes wurde durch Papierchromatographie, Hochspannungs-Papierelektrophorese und Dünnschichtchromatographie des N-Acetylderivates sichergestellt. Die amorphe freie Base der Substanz SF-733 ist im neutralen und alkalischen Bereich beständig, aber kaum beständig im sauren Bereich.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Substanz SF-733 werden im folgenden beschrieben. Die amorphe freie Base der Substanz SF-733 zersetzt sich unter Aufschäumen bei 178 bis 185'C; sie besitzt keinen definierten Schmelzpunkt. Die freie Base ist leicht löslich im Wasser, wenig löslich in Methanol und unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Butanol, Äthylacetat, Benzol. Hexan und Äther. Bei der Elektrophorese bewegt sie sich bei einem pH-Wert von 1,8 gegen die Kathode; aus der Titrationskurve kann nicht auf die Existenz von sauren Gruppen geschlossen werden. Diese Tatsachen beweisen, daß die freie Base eine basische Substanz ist. Ihr Ultraviolettabsorptionsspektrum ist in F i g. 1 dargestellt. Es konnte keine spezifische Absorption festgestellt werden. Ihr Infrarotabsorptionsspektrum ist in F i g. 2 dargestellt. Die Absorptionsbande, welche für Aminozucker-Antibiotika eigentümlich ist. konnte beobachtet werden.

Die spezifische optische Drehung der Substanz SF-733 (amorphe freie Base) in wäßriger Lösung \n\" ist f42°. Die Reaktionen gegen Ninhydrin. Molisch-Reagenz und Anthron sind positiv, die Reaktionen gegen Fehling- und Benedict-Lösung. Ferrichlorid, Maltol. Biuret. Tollens- und die Sakaguchi-Reaktion*) sind negativ. Das Molekulargewicht (geschätzt nach der Dampfdruck-Gleichgewichtsmethode) liegt bei 475; dieser Wert wird durch den Wert gestützt, der aus der Titrationskurve geschätzt werden kann (452 als viersäurige Base).

Bei der Elementaranalyse einer Probe der Substanz SF-733, die über Phosphorpentoxyd im Vakuum bei 110⁰C 20 Stunden getrocknet worden war. erhielt man folgende Werte: C = 44,16%. H = 7.55%, N = 11,92%, O = 36,21%; die Summenformel ist demnach Ci₇H₃₄N₄O₁₀ (theoretische Werte· C = 44,93%, H =: 7,54%, N = 12,33%, O = 35,20%, Molekulargewicht: 454,49). Die Untersuchungen hinsichtlich der chemischen Struktur haben ergeben, daß die Substanz SF-733 ein O-^-D-Ribofuranosyl-

*) Bei der Sakaguchi-Reaktion werden 5 ml der ?u prüfenden 5, Lösung mit 1 ml 10%iger NaOH versetzt. Anschließend fügt man 1 ml einer 0,02%igen wäßrigen Lösung von 8-Hydroxychinolin sowie mehrere Tropfen einer Lösung von Br₂ in 100 ml 5%iger NaOH zu. Beim Auftreten einer kräftigen Orangefärbung ist die Reaktion positiv.

309 509/531

(Γ—+5)- O-[«-2,6-diamino-2,6-dideoxy- i>-glucopyranosyl - (1-M)] - 2 - deoxystreptamin der Formel

NH,

HO

OH

HOH₂C

NH₁

OH

Bei der absteigenden Papierchromatographie unter Verwendung von n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser (6:4:1:3, Entwicklung 4Tage) und n-Butanol, welches mit 2% p-Toluolsulfonsäure enthaltendem Wasser gesättigt ist (Entwicklung 25 Stunden), Färbung mit Ninhydrin und Bioautographie unter Verwendung von Bacillus subtilis zeigt die Substanz SF-733 in jedem Lösungsmittelsystem einen einzigen

Fleck bei 8 cm bzw. 14,8 cm, gemessen vom Ausgangspunkt. Bei der Hochspannungs-Papierelektrophoresc (3300 V, pH-Wert = 1,8, 15 Minuten) bewegt sich die Substanz SF-733 ebenfalls 15 cm zur Kathode und zeigt einen einzelnen Fleck. Bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel unter Verwendung von tert.-Butanol/Essigsäure/Wasser (2:1:1), n-Butanol/ Essigsäure/Wasser (3:1:1) und n-Butanol/Pyridin/ Wasser (6:4:3) sowie 80%igem wäßrigem Methanol als Entwickler zeigt das N-Acetylderivat der Substanz SF-733 einen einzelnen Fleck bei R_f0,40, 0,16, 0,50 bzw. 0,70. Aus dieser Tatsache ergibt sich ebenfalls deutlich die Reinheit und Einheitlichkeit der Substanz SF-733.

Wie aus den vorstehenden Erläuterungen hervorgeht, ist die Substanz SF-733 ein wasserlösliches basisches Antibiotikum, welches sich bei der Prüfung der optischen Drehung als rechtsdrehend erweist. Von den bekannten Antibiotika sollen Neomycin, Paromonycin, Kanamycin, Gentamicin, Destomycin und Actinospektacin mit der Substanz SF-733 verglichen werden.

Die Substanz SF-733 wird mit diesen bekannten Antibiotika hinsichtlich ihrer optischen Drehung (1 abelle 1) und der Papierchromatographie (Tabelle Il und F i g. 3) verglichen.

In den Tabellen III und IV sind die R₁-WeUc der Substanz SF-733 sowie des N-Acetylderivates derselben im Dünnschichtchromatogramm an Kieseisäuregel aufgeführt.

Tabelle I

Substanzen

SF-733
Neomycin A

Neomycin B
Neomycin C
Paromomycin I
Paromomycin II
Kanamycin A
Kanamycin B
Kanamycin C
Gentamicin A

Gentamicin C₁
Gentamicin C₂
Destomycin A
Destomycin B

Hygromycin B
Actinospectacin
Kasugamycin
Capreomycin II

Spezifische optische

Drehung (in wäßriger Lösungl

+ 42 + 123-

+ 58^C

+ 82^C

+ 64'

+ 78^: + 12Γ + 135 + 126 + 146°

+ 158° + 160°

+19,2° +7,6* + 120°

+2,5° Literatur

Umezawa u.a. »Index of Antibiotics from Actinom cetes« (Tokyo University Publishing Society. 1%^Ί! S. 453

desgl., S. 454

desgl., S. 455

desgl., S. 492

desgl., S. 492
Kondo, »Journal of Antibiotics«, Reihe B, S. 262. I¹H !

desgl.,

desgl.

Umezawa u. a. »Index of Antibiotics from Actinomycetes« (Tokyo University Publishing Society. 1967). S. 308

desgl.

desgl., S. 250

Umezawa u. a. »Index of Antibiotics from Actinomycetes« (Tokyo University Publishing Society, 1967),

c λ cn

S."250

desgl., S. 335 desgl., S. 105 desgL,S.365 desgl., S. 192

	1 81	4	735	V	IV
11				O 12
Tabelle II				Tabelle

Substanzen	l.osungsmi Hnifenumg vom Origimil- punkl kml	(el H R 733*1	l.ösiiiiüsm lindern ιιημ vom Original punk I lern)	lld Λ R 733*)
Substanz SF-733 Kanamycin A Base B Base	8,0 8,0 6,0 8,5 77	1 1 0,75 1.06 0.96	14.8 10.0 18,5 14,4 19.2	1 0,68 1,25 0,97 1 30
C Base	3.4 3,5	0,43 0.41	17,6 17.5	1.18 1 18
Neomycin A Base	4.1 4.6 12,0	0.56 0.58 1.50	10,8 10,0 25.0	0.73 0.74 1.69
B Base
C Base
Paromomycin I Base
II Base
Gentamicin C Base

R₁--Werte des N-Acetylderivates der Substanz SF-733 im Dünnschichtchromatogramm an Kieselsäuregel

l.ösungsmitlclsysiem

t-Butanol — Essigsäure—Wasser (2:1:1)

n-Butanol — Essigsäure -Wasser(3:1:1)

n-Butanol —Pyridin — Wasser (6:4:3) ..

80% Methanol

R_r-Wer(e

0,40
0,16
0,50
0,70

Bemerkungen:

Lösungsmittel A:

n-Bulanol gesättigt mit Wasser, enthaltend 2% p-Toluolsulfon-

säure. absteigende Methode. Emwicklung für 25 Stunden. Lösungsmittel B:

n-Butanol/ Pyridin/Essigsäure/ Wasser (6:4:1 :3). absteigende

Methode, Entwicklung für 4 Tage. Prüfung:

Papierchromatographie mil Bacillus subtilis.

*) Verhältnis der Entfernung bezogen auf SF-733. Tabelle 111

R_f-Werte der Substanz SF-733 im Dünnschichtchromatogramm an Kieselsäuregel

Lösungsmittelsystem

Äthanol — NH₄OH-Wasser (8:1:1)...

10% wäßriges Ammoniumacetat — Methanol (l7l)

R_f-Werie

0.5

0.6 is festgestellt als dunkelbrauner Fleck beim Besprühen mit 10%iger Schwefelsäure und anschließendem Erhitzen.

Die Substanz SF-733 kann von der Kanamycin-Gruppe (A. B, C) der Gentamicin-Gruppe (A, C₁, C₂),

2u Neomycin Λ, Destomycin A, B, Hygromycin B, Actinospectacin, Kasugamycin und Capreomycin im Hinblick auf die spezifische optische Drehung wie in Tabelle I angegeben und von Neomycin B, C, Paromomycin I, II, Gentamicin C und Kanamycin A, B im Hinblick auf die R_rWerte bei der Papierchromatographie (Tabelle II, F i g. 3) klar unterschieden werden. Die Substanz SF-733 läßt sich weiterhin deutlich unterscheiden: von Capreomycin II, welches ein Uitraviolettabsorptionsmaximum aufweist, von Actinospectacin durch den analytischen Stickstoffwert, von Destomycin A. B und Hygromycin B durch Eigenheiten des antibakteriellen Wirkungsbereiches und deren höhere Toxizität. Von Tenemycin (Seventh Interscience Conference on Antimicrobial agent and chemotherapy, 1967. 25. bis 27. Oktober in Chikago) unterscheidet sich die Substanz SF-733 deutlich, weil der [α] ο -Wert des N-Acetylderivates des Tenemycins + 95 bis +130° ist, während der des N-Acetylderivates der Substanz SF-733 +40° ist. Aus dem vorstehenden Vergleich geht wiederum deutlich hervor, daß die Substanz SF-733 ein neues Antibiotikum ist, welches nicht mit anderen bekannten Antibiotika übereinstimmt.

Das antibakterielle Wirkungsspektrum der Substanz SF-733 gegen verschiedene Mikroorganismen ist im folgenden zusammengestellt.

Minimale inhibierende Konzentration nach der Brühe-Verdünnungsmethode

Testorganismen

Bacillus subtilis ATCC 6633

Bacillus cereus

Staphylococcus aureus 209-P .. Staphylococcus aureus 52-34...

Staphylococcus aureus 193

Staphylococcus aureus Smith .. Staphylococcus aureus Terajima

Sarcina lutea

Aerobacter aerogenes

Escherichia coli IAM 1253

Escherichia coli IAM 1239

Escherichia coli K-12

Mindesthcmmkonzentration	Kulturmedium
meg ml
0,39	Bouillonmedium
6,25	desgl.
3,125	desgl.
3,125	desgl.
3,125	desgl.
0,39	desgl.
0,19	desgl.
100,0	desgl.
12,5	desgl.
12,5	desgl.
12,5	desgl.
3,125	desgl.

Fortsetzune

Testorganismen

Mindesthemmkonzeniration
mcg/ml

Escherichia coli Chloramphenicol-resistant

Escherichia coli Streptomycin-resistent

Escherichia coli Streptothricin-resistent

Escherichia coli Kanamycin-resistent

Shigella dysenteriae

Shigella flexneri (Streptomycin-TetracyclinJ-resistent

Salmonella typhi

Salmonella typhi paratyphi A

Salmonella typhi paratyphi B

Klebsiella pneumoniae

Proteus vulgaris

i'seudomonas aeruginosa

Mycobacterium smegmates 607

Mycobacterium phlei

Candida albicans

Torula utilis

Saccharomyces cerevisiae '

Aspergillus niger

Aus der vorstehenden Tabelle geht klar hervor, daß die Substanz SF-733 einen breiten Wirkungsbereich besitzt und sowohl gegen gram-positive als auch gramnegative und säurebehandelte Bakterien wirksam ist.

Bei Versuchen zur Bestimmung der akuten Toxizitat durch intravenöse Injektion bei Mäusen konnte festgestellt werden, daß die Toxizität der Verbindung SF-733 sehr niedrig ist; der LD₅₀-Wert beträgt 1000 mg/kg für die freie Base und 500 mg/kg für das Sulfat der Verbindung; ein abnormer Verlauf nach der Injektion konnte nicht beobachtet werden.

Die amorphe freie Base der Substanz SF-733 kann durch folgendes Verfahren in kristalline Form übergeführt werden.

Die amorphe freie Base wird in Wasser gelöst und die so gewonnene Lösung wird zur Trockne eingedampft, wobei man Äthanol zufügt und das Wasser durch azeotrope Destillation entfernt; die Lösung kann auch zunächst zu einem Sirup eingeengt werden, dann mit Äthanol versetzt werden, so daß sich ein Niederschlag bildet, und erst dann zur Trockne eingedampft werden, wobei weiteres Äthanol zugesetzt und das Wasser durch azeotrope Destillation entfernt wird; auf diese Weise erhält man die Substanz SF-733 als weiße feste Substanz in Form eines Äthanolsolvates. Das weiße feste Äthanolsulvat der Substanz SF-733 zeichnet sich gegenüber der vollständig dehydratisierten amorphen freien ßase und der kristallisierten freien Base der Substanz SF-733 (die im folgenden erwähnt wird) durch seine höhere Löslichkeit in Methanol aus.

Das weiße, feste Athanolsolvat der Substanz SF-733. das wie vorstehend beschrieben erhalten worden ist. wird in einer ausreichenden Menge Methanol gelöst. Die Lösung wird abgestellt, wobei schnell Kristalle gebildet werden. Die gewünschte kristalline freie Base der Substanz SF-733 kann gewonnen werden, indem man die Kristalle abfiltriert, mit wenig Methanol wäscht und zunächst bei Raumtemperatur im Va-1,56
12,5
50
>100

5,25
12,5

3,125
12,5
12,5

6.25
25,0

> 100.0

125
6,25

> 100,0

> 100.0

> 100,0

Kulturmedium

Bouillonmedium

desgl.

desgl.
Glycerinmedium

desgl.
Sabouraub

desgl.

kuum und dann noch in einem Glasexsikkator ebenfall im Vakuum bei 6O⁰C 19 Stunden über Phosphorpentoxyd als Trockenmittel trocknet, um das an den Kristallen anhaftende Methanol zu entfernen.

Das Pulver, welches durch Gefriertrocknen einer wäßrigen Lösung der amorphen freien Base der Substanz SF-733 erhalten worden ist und eine ausreichende Menge Wasser absorbieren konnte, weist eine höhere Löslichkeit in Methanol auf als das vorstehend erwähnte weiße feste Äthanolsolvat, aber selbst wenn man dieses Pulver in Methanol löst und sich selbst überläßt, bildet sich nur eine kleine Menge eines Niederschlages, ohne daß Kristalle der freien Base der Substanz SF-733 erhalten werden können. Für die Kristallisation der freien Base der Substanz SF-733 muß das vorstehend beschriebene Verfahren angewandt werden, gemäß welchem das zu kristallisierende Material das Äthanolsolvatstadium durchlaufen muß welches Tür die Kristallisation wesentlich ist.

In der kristallinen Erscheinungsform besteht die freie Base der Substanz SF-733 aus weißen Nadeln odei kurzen Stäbchen, die unter Zersetzung und Aufschäumen bei 192 bis 195^CC schmelzen.

Die Elementaranalyse ergab folgende Werte C = 44,19%. H = 7,39%, N = 11,60%. O (aus dei Differenz) = 36,82%. Das Molekulargewicht beträgi nach der Dampfdruck-Gleichgewichtsmethode in wäßriger Lösung 440. während der nach der Titrations methode in wäßriger Lösung ermittelte Wert bei 47( liegt. Die Summenformel der freien Base der Verbin dung SF-733 in kristalliner Form ist C₁₇H₃₄N₄O₁, (theoretische Werte: C = 44,93%. H = 7.54% N = 12.33%. O = 35.20%. Molekulargewicht454.49) die chemische Struktur der Verbindung entsprich dem bereits erwähnten O-/>'-o-Ril>ol'uranosyl-(l —»5) O - [>< - 2.6 - diamino - 2.6 - didcoxy - η - glucopyranosyl (1—»4)]-2-deoxystreptamin. Die kristalline freie Basi der Substanz SF-733 ist dieselbe Verbindung wie dii

imorphe freie Base der Substanz SF-733; die beiden Produkte unterscheiden sich nur durch die äußere Erscheinungsform.

Die kristalline Form der freien Base der Substanz SF-733 ist rechtsdrehend und ihr [<*]? beträgt +42⁰C (C = 1. H₂O). Eine wäßrige Lösung der Base ist alkalisch. Bei der Analyse lassen sich aus der Titrationskurve keine sauren Gruppen ermitteln. Die vorliegende Substanz ist sicher basisch.

Das Ultraviolettspektrum der kristallinen freien Base der Substanz SF-733 in wäßriger Lösung (0.102%) ist in F i g. 4 dargestellt. Es konnte kein Absorptionsmaximum beobachtet werden mit Ausnahme der Endabsorption. In der Figur bedeuten die Zahlen an der Abszisse Wellenlängen (ηΐμ) und die Zahlen an der Ordinate das Maß der Absorption. Das Infrarotspektrum mit KBr-Tablette ist in Fig. 5 dargestellt. Es ist die für aminoglycosidische Antibiotika eigentümliche Absorption zu beobachten. In der Figur bedeuten die Zahlen an der Abszisse Wellenzahlen pro 1 cm und die Zahlen an der Ordinate den Transmissionsgrad (%).

Die kristalline freie Base der Substanz SF-733 ist in Wasser leicht löslich, in Methanol kaum löslich und in Äthanol sehr schwer löslich. Sie ist praktisch vollständig unlöslich in n-Propanol, n-Butanol, Aceton, Äthylacetat. Petroläther und Chloroform.

Die Reaktionen gegen Molisch-Reagenz, Anthron, Ninhydrin und fi-Naphtholschwefelsäure (Aldopentose-Reaktion) sind positiv; die Reaktionen gegen Anthron unter definierten Bedingungen (Hexose-, 6-Deoxyhexose-Reaktionen — vgl. Methods of Carbohydrate Chemistry, Bd. I, S. 490, 1963, Academic Press), Fehlingsche Lösung (kalt), Ferrichlorid, Brady-Reagenz (Reaktion mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin), Biuret, die Sakaguchi- und Maltol-Reaktion, sind negativ. Die kristalline freie Base der Substanz SF-733 kann in wäßriger Lösung bei Raumtemperatur durch Zugabe von konzentrierter Schwefelsäure carbonisiert werden; sie reduziert Kaliumpermanganatlösung bei Raumtemperatur.

Bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel G (Handelsprodukt der Firma Merck & Co.) läßt sich bei der Färbung mit Ninhydrin oder mit 10%iger Schwefelsäure (Carbonisierung beim Erhitzen) ein einzelner Fleck feststellen, der fast am Ausgangspunkt liegt, wenn als Lösungsmittelsystem Äthanol/konzentriertes Ammoniak-Wasser Wasser (8:1:1) und 10%ige wäßrige Ammoniumacetatlösung/Methanol (1:1) verwendet werden; die R_f-Werte liegen dann bei 0,5 bzw. 0,6. Bei der Papierchromatographie unter Verwendung von Bacillus subtilis beobachtet man einen einzelnen Fleck bei 8 cm und 14,8 cm vom Ausgangspunkt, wenn man als Lösungsmittelsysteme n-Butanol/Pyridin/ Essigsäure/Wasser (6:4:1:3) (absteigende Methode; 4 Tage) bzw. n-Butanol, welches mit 2% p-Toluolsulfonsäure enthaltendem Wasser gesättigt ist (absteigende Methode; 25 Stunden), verwendet. Bei der Hochspannungs-Papierelektrophorese bewegt sich die kristalline freie Base der Substanz SF-733 15 cm auf die Kathode zu und zeigt einen einzelnen Fleck 3300 V, pH 1.8, 15 Minuten, Ninhydrin-Färbung, Bioautographie mit Bacillus subtilis). Bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel unter Verwendung des N-Acety'-irrivatcs der freien Base von SF-733 Hißt sich ein einzelner Heck feststeller, wenn zum Färben 10%ige Schwefelsäure verwendet wird (Carbonisierung durch Erhitzen); die R_r-Wcrtc liegen bei 0,40, 0 16 0 50 bzw. 0,70, wenn als Lösungsmittelsysteme tert.-Butanol/Essigsäure/Wasser (2:1:1), -Butanol /Essigsäure/Wasser (3:1:1), n-Butanol/Pyridin/Wasser (6:4:3) und 80%iges Methanol verwendet werden.

Die antibakterielle Aktivität der kristallisierten Substanz SF-733 und das antibakterielle Wirkungsspektrum derselben sind in Tabelle I dargestellt; diese gelten auch für die amorphe Substanz SF-733. Auch ihre Beständigkeit und Toxizität sind im wesentliehen die gleichen.

Gegenüber den bekannten Antibiotika Kanamycin. Dihydrostreptomycin und Aminosidin weist die erfindungsgeniäße Verbindung folgende Vorteile auf.

Tabelle: V

Wirkungsspektrum und Toxizität von Antibiotikum

SF-733 im Vergleich zu Kanamycinsulfat (KM).

DihydiOstreptomycin (DHSM)

und Aminosidin (AMS)

1. Amibakterielle Wirkung in vitro

Beim Vergleich der antibakteriellen Wirkung vcn Antibiotikum SF-733 mit der von KM bei in vitro-Versuchen mit 40 Stämmen voin 12 Bakterien, 32 Stämmen von 9 Eumyceten und 23 Trichomonas vaginalis zeigte sich, daß die antibakterielle Wirksamkeit und das antibakterielle Spektrum von Antibiotikum SF-733 etwa der von KM entsprechen.

2. Antibakterielle Wirkung in vivo

Beim Vergleich der antibakteriell Wirkung von Antibiotikum SF-733 mit der von KM bei in vivo-Versuchen gegen Pneumococcus, Pneumobacillus unter anderem konnte festgestellt werden, daß die therapeutische Wirkung von KM etwa gleich der des erfindungsgemüßen Antibiotikums ist.

3. Störwirkungen auf das Gehör durch Antibiotikum SF-733, AMS und KM

Die Versuche wurden mit Gruppen mit je 10 Meerschweinchen durchgeführt.

A. 400 mg/kg Körpergewicht der Base von SF-733 und AMS wurden 60 Tage lang verabreicht. Bereits nach 2 Wochen war bei AMS eine Gehörstörung zu beobachten; bei SF-733 zeigte sich auch nach der vollen Behandlungszeit keine Ge-

hörstörung.

B. 400 bzw. 600 bzw. 800 mg je kg Körpergewicht der Substanz SF-733 und 400 mg je kg Körpergewicht KM wurden 60 Tage lang verabreicht; bei der KM-Bchandlung zeigte sich in allen

Fällen nach 18 Tagen eine Störung; bei der Behandlung mit SF-733 zeigte sich auch bei einer Dosis von 600 bzw. 800 mg pro kg Körpergewicht nach der vollen Zeit von 60 Tagen keine Gehörstörung.

Zusammenfassung

Das Antibiotikum SF-733 besitzt in vitro und in vivo etwa die gleichen antibakteriellen Eigenschaliai wie KM und AMS, jedoch eine deutlich geringere· Toxizität als diese.

Die vorliegende Erfindung wird an ll.mil der UA-genden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

/I

15 1 eines flüssigen Mediums (pH-Wert 7,0), welches ?.5% Glukose, 3,5% Sojabohnenmehl, 1,0% lösliches Pflanzenprotein und 0,25% NaCl enthielt, wurd^ mit einem Stamm Streptomyces thermoflavus SF-733 geimpft; die Züchtung erfolgte durch Schüttelkultur in einer Rüttelfermentiervorrichtung bei 28° C in 3 Tagen. 10 1 des Kulturfiltrates (200 y/ml), die durch Filtrieren der Kulturbrühe bei pH-Wert = 4,0 erhalten worden waren, wurden auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und auf eine Kolonne gegossen, die mit 1 1 »Amberlite IRC 50« (NH₄ ⁺ -Typ) gefüllt war, um die aktiven Bestandteile an dem Ionenaustauscberharz zu adsorbieren. Nach Waschen mit Wasser wurde die Kolonne mit 0,5 normalem wäßrigem Ammonaik eJurert. Die aktiven Fraktionen wurden im Vakuum eingeengt und der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhielt auf diese Weise 5,9 g eines rohen Pulvers, welches in 10 ml Wasser gelöst wurde; die Lösung wurde auf eine Kolonne gegeben, die mit 400 ml »Dowex 1 χ 2« (OH"-Typ) gefüllt war, und chrematographisch mit Wasser entwickelt; man erhielt auf diese Weise eine aktive Fraktion von 250 ml, die im Vakuum eingeengt wurde, so daß 2,1 g der Substanz SF-733 in Form eines hellgelben Pulvers erhalten wurden. 2.0 g des Pulvers wurden in 3 ml Wasser gelöst, auf eine Kolonne gegeben, die mil 100 ml »Amberlite CG 50« (NH₄ ⁺-Typ) gefüllt war, mit Wasser gewaschen und mit 0,2 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Es wurden 400 ml aktive Fraktion aufgefangen, die im Vakuum eingeengt und dann der Gefriertrocknung unterworfen wurde; man erhielt so 600 mg der freien Base der Substanz SF-733 in Form eines weißen Pulvers. Dieses Pulver wurde in etwa 5 ml Wasser gelösi, die Lösung wurde zu einem Sirup eingeengt und mit etwa 50 ml Äthanol versetzt. Die Mutterlauge und der weiße Niederschlag, die auf diese Weise gebildet worden waren, wurden im Vakuum zur Trockne eingedampft. 650 mg des dem Äthanolsolvat entsprechenden weißen Pulvers wurden in 6,5 ml Methanol gelöst. Die Lösung wurde unmittelbar nach dem Auflösen der Substanz trübe, worauf sich allmählich Kristalle ausschieden. Die Lösung wurde verschlossen und bei 30 C über Nacht abgestellt; nach dieser Zeit wurden die Kristalle auf einem Glasfilter aufgefangen und mit etwa 1 ml Methanol gewaschen. Die Kristalle wurden über Calciumchlorid als Trockenmittel bei Raumtemperatur im Vakuum gehalten und danach anschließend noch über Phosphorpentoxyd als Trockenmittel bei 60⁰C 19 Stunden im Vakuum getrocknet; auf diese Weise erhielt man 440 mg kristalline freie Base der Substanz SF-733; Ausbeute: 73%.

Beispiel 2

401 eines flüssigen Mediums (pH-Wert 7,0), welches 4.0% Stärke, 2,5% Sojabohnenmehl, 1,0% Weizenkeime und 0,25% NaCl enthielt, wurde mit dem Stamm Streptomyces thermoflavus SF-733 geimpft und in einer Rüttelfermentiervorrichtung bei 35ⁿC 2 Tage unter Schütteln kultiviert. 301 des Kulturfiltrats (Wert 350 y/ml), die durch Filtrieren der Kulturbrühe beim pH-Wert 9,0 erhallen worden waren, wurden auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und auf eine Kolonne gegeben, die mit 3 1 »Amberlile IRC 50« (Na ⁺ -Typ) gefüllt war; an dem Harz wurden 97% der aktiven Bestandteile adsorbiert. Nach dem Waschen mit Wasser wurde mit 0,5 n-HCl eluiert. 6,2 1 der aktiven Frak-Snwurden mit »Amberlite IR 45« (ÜJT-Typ, neutralisiert und unter Rühren nut 90 g Aktivkohle versetzt, wodurch fast alle aktiven Bestandteile un der Aktivkohle adsorbiert wurden. Die Aktivkohle wurde dann mit Wasser gewaschen und zweimal mit je 31 70%isem wäßrigem Aceton gewaschen, der mit Chlorwasserstoflsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt war- das Eluat wurde neutralisiert, eingeengt und der

Gefriertrocknung unterworfen 8,4 g des pulverformieen Hydrochlorides der rohen Substanz St--733 wurden in 12 ml Wasser gelöst; die Lösung wurde auf eine Kolonne gegeben, die nut 700 ml »Dowex 1 χ 1« (OH~-Typ) gefüllt war; die Kolonne wurde

chromatographisch mit Wasser entwickelt. 650 ml aktive Fraktion wurden aufgefangen, die im Vakuum eingeengt und dann der Gefriertrocknung unterworfen wurden; auf diese Weise erhielt man 4,2 g eines hellgelben Pulvers, bei welchem es sich um die Substanz

SF-733 in Form der freien Base handelte. 4.1 g dieses Pulvers wurden in einer kleinen Menge Wasser gelöst und dann auf eine Kolonne gegeben, die mit 100 ml »Amberlite CG 50« (NH₄ ⁺-TyP) gefüllt war; man erhielt auf diese Weise 3,4 g der freien Base der Substanz

SF-733 in Form eines weißen Pulvers.

Dieses Pulver wurde in 100 ml Wasser gelöst; die Lösung wurde im Vakuum unter Zugabe von Äthanol eingeengt, wobei schließlich das Wasser durch azeotrope Destillation entfernt wurde. 3,8 g der weißen, dem

,o Äthanolsolvat entsprechenden festen Substanz wurden in 38 ml Methanol gelöst; die Lösung wurde fest verschlossen über Nacht bei Raumtemperatur abgestellt damit sich Kristalle abscheiden. Die Kristalle wurden abfiltriert, mit 10 ml Methanol gewaschen und entsprechend der im Beispiel 1 beschriebenen Methode getrocknet. Auf diese Weise erhielt man 2,4 g der kristallinen freien Base der Substanz SF-733; Ausbeute: 71%.

Beispiel 3

Zu 10 ml der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Kulturbrühe wurde ein Filtrierhilfsmittel gegeben, worauf das Mycel abfiltriert wurde. 81 des Filtrates wurden auf einen pH-Wert von 8,5 bis 9,5 eingestellt und mit Aktiv-

kohle in einer Menge (80 g) versetzt, die 1 % des Filtrates ausmachte; das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt, wobei fast alle aktiven Bestandteile an der Aktivkohle adsorbiert wurden. Die Aktivkohle wurde dann abfiltriert, mit Wasser gewaschen und in 1,2] 70%igen wäßrigem Methanol suspendiert, welches mit 4 η-Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,C eingestellt worden war. Es wurde 30 Minuten gerührt um die aktiven Bestandteile zu extrahieren. Das FiI-trat wurde nach dem Abfiltrieren der Aktivkohle irr Vakuum eingeengt, worauf Aceton zugesetzt wurde, se daß man 28 g der rohen pulverförmigen Substanz SF-733 erhielt. Diese wurde in 35 ml Wasser gelöst die Lösung wurde mit 4 η-Schwefelsäure auf einer pH-Wert von 4,0 bis 4,5 eingestellt und auf eine Ko lonne gegeben, die mit 35 g pulverförmiger Aktivkohle gefüllt war; das Eluieren wurde mit 0,03 n-Schwefel säure vorgenommen. 300 ml aktive Fraktion wurder aufgefangen, mit »Amberlite IR 45« (OH~-Typ) au einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, im Vakuum einge engt und der Gefriertrocknung unterworfen; auf dies« Weise erhielt man 6,5 g rohes pulverförmiges Sulfa der Substanz SF-733.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:
Antibiotikum SF-733 der Formel

CH₂NH

NH₂

OH

HOH₂C

schiedenster Art, wie grampositive und gramnegative DathoS Bakterien und säurebeständige^Bakterien. ^P Der das Antibiotikum SF-733 bildende Mikroorganismus wurde aus einei Bodenprobe isobert, die in s TsTcity MIE Prefecture, Japan, gesammelt wurde; Lr Mikroorganismus wurde als Streptomyces therosneuerdings als Streptomyces ndosidificus.

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