DE2156339B2

DE2156339B2 - Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase

Info

Publication number: DE2156339B2
Application number: DE2156339A
Authority: DE
Inventors: Donald Sidney Winterslow Callow; Brian John Capel; Charles Gervase Thorngate Evans
Original assignee: UK Secretary of State for Social Services
Current assignee: UK Secretary of State for Social Services
Priority date: 1970-11-13
Filing date: 1971-11-12
Publication date: 1980-04-17
Also published as: DE2156339C3; NL7115609A; CH569087A5; BE775286A; AU460436B2; AU3569971A; DK128942B; US3783102A; AT311286B; FR2117099A5; NL177502C; SE393815B; IE35805L; DE2156339A1; IE35805B1; NL177502B; JPS5543758B1; CA995610A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase.

In der Deutschen Patentanmeldung P 19 42 833.2 vom 22.8.1969 wird die Isolierung von therapeutisch wirksamer L-Asparaginase aus Bakterienkulturen der Genus Erwinia, einer bekannten gegenüber Pflanzen pathogenen Gattung, beschrieben. Danach können die Bakterien auf oder in unterschiedlichen festen oder flüssigen Kulturmedien gezüchtet werden, sie sowohl chemisch einfach definierte Medien als auch komplexe Medien sein können, und es werden Beispiele angegeben, bei denen durch chargenweise Produktion von F.rwinia in komplexen Medien L-Asparaginase-Ausbeuten von 8.2 ΙΕ/ml Kultur erhalten werden und über kontinuierliche Kulturen in komplexen Medien berichtet, die zu Ausbeuten von 24 IE/ml Kultur fuhren.

In der Deutschen Patentanmeldung P 20 31 759.3 vom

26.6.1970 wird ein Verfahren zur Erzielung höherer L-Asparaginase-Ausbeuten pro ml Kultur beschrieben, wonach dem Kulturmedium entweder bei chargenweiser oder kontinuierlicher Kultur wirksame Mengen von zumindest einer der Aminosäuren, Glutaminsäure, Serin, Threonin oder Asparaginsäure zugesetzt werden. Dabei werden Beispiele angegeben, nach denen L-Asparaginase-Ausbeuten von 44,5 I E/ml Kultur bei chargenweiser Züchtung und bis zu 80 IE/ml Kultur bei kontinuierlicher Züchtung erhalten wurden.

Es wurde nun festgestellt, daß unter ausgewählten Bedingungen für kontinuierliche Züchtung sogar noch höhere L-Asparaginase-Ausbeuten pro ml Kultur erhalten werden können. Eine solche Ausbeutesteigerung ist gerade im vorliegenden Falle außerordentlich interessant, da die Nachfrage nach dem Enzym bei weitem seine derzeitige Verfügbarkeit übersteigt. L-Asparaginase wird für chemische Versuche zur Behandlung gewisser Typen von Leukämie und disscrninicrtcrn Karzinom verwendet.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist in den Ansprüchen definiert.

Zu geeigneten Kohlenstoffquelltn gehören Glycerin, Glucose, Mannit, Lactat und Citrat und andere Präkursoren, die zu Kreb's-Zyklus-Zwischenprodukten führen können. Glycerin oder Glucose werden dabei normalerweise als billige Kohlenstoffquellen, die gute L-Asparaginase-Ausbeuten liefern, bevorzugt Die Wirksamkeit der gewählten Kohlenstoffquellen in kontinuierlicher Kultur ist überraschend, da von diesen Materialien festgestellt wurde, daß sie bei chargenweiser Kultur eine variierende Hemmung der Enzymproduktion induzieren.

Die L-Asparaginasc wird dann aus der Kultur durch irgendein geeignetes zellzerstörendes Verfahren und vorzugsweise na. ή der in der Deutschen Patentanmeldung P 19 42 900.6 vom 22.8.1969 vollständig beschriebenen Verfahrensweise extrahiert bzw. isoliert (dieses Verfahren umfaßt eine Zeil-Lysis mit starkem Alkali).

Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann die nährende Kultur entweder auf einfachen Salzmedien basieren, bei denen die gewählte Kohlenstoffquelle praktisch allen für die Bakterien zur Verfügung stehenden Kohlenstoff bereitstellt oder durch ein komplexes Medium gebildet werden, bei dem die gewählte Kohlenstoffquelle andere bereits im Medium vorhandene Kohlenstoffquellen ergänzen kann.

Obgleich eine Mischung von zwei oder mehreren der gewählten Kohlenstoffquellen enthaltende Nährmedium beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, wird bevorzugt, daß für die bakterielle Kultur in irgendeinem besonderen Stadium der kontinuierlichen Züchtung nur eine der gewählten Kohlenstoffquellen verfügbar ist.

Die erfindungsgemäße Verfahrensweise kann bei allen Bakterien der Genus Erwinia angewandt werden und insbesonere bei solcnen Stämmen, wie sie in der bereits oben genannten Patentanmeldung P 19 42 833.2 vom 22.8.1969 angegeben werden. Besonders zweckmäßig ist die Anwendung eines Stammes von Efwiniä carotovora, der beim National Collection of Plant Pathogenic Bacteria, England unter NCPPB 1066 niedergelegt ist und zu einer hohen spezifischen Aktivität führt, d. h. einem hohen Verhältnis von Enzymaktivität zu mg erzeugtem Protein.

Kontinuierliche Bakterienkulturverfahren gemäß der Erfindung werden normalerweise bei pH-Werten /wischen 5,5 und 8.0, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5

und Temperaturen von 20 bis 40° C, vorzugsweise 28 bis 38° C, durchgeführt. Die Verdünnungsrate liegt üblicherweise bei 0,05 bis 0,4, vorzugsweise bei 0,1 bis 03, wobei unter der Verdünnungsrate das Verhältnis der durch das KulturgefäQ pro Stunde geleiteten Flüssigkeitsmenge zum Volumen der im Kulturgefäß enthaltenen Flüssigkeit zu verstehen ist. Bei diesen Verdünnungsraten liegt die Konzentration der gewählten Kohlenstoffquelle im zugelieferten Kulturmedium bei 0,5 bis 5%, vorzugsweise 1 bis 3% (Gewicht/Volumen), so daß die begrenzte Stationärkonzentration im Kulturgefäß kleiner als etwa 0,1 mg/ml (vorzugsweise kleiner als 0,05 mg/ml) sein muß und unzureichend für die bei höheren Konzentrationen mögliche Unterdrückung der Bildung von L-Asparaginase.

Nachfolgend werden einige Beispiele für kontinuierliche Kulturverfahren gemäß der Erfindung beschrieben:

Beispiel 1

Eine Eänzeücoianie von Erwinia carotovora (NCPPB 1066 S 10) von einer Oxoid-Agarzählplatte (plate of Oxoid plate count agar) wurde in 4 ml tryptische Fleischbrühe gebracht und 6 Stunden lang bei 37° C bebrütet. 1 ml dieser Kultur wurde dann zu 100 ml »Medium A« in einer konischen 500 ml-Flasche hinzugefügt Dieses Medium A hatte folgende Zusammensetzung:

NaH₂PO₄

NH4CI

KCI

Na₂SO₄

Zitronensäure

Mn

Cu

Co

Mg

Ca

Mo

Glycerin

pH - 7

10OmM
10OmM

5mM
lOirM

2mM

y,025 ν tM

0,1 mM

0,05 mM

0,005 mM

0,01 mM

0,005 mM

1,25 mM

0,1 mM

0,01 mM

I % (Gew./Vol.)

Zitronensäure und 1,5% (GewVVol.) Glycerin. Luft wurde mit 0,5 Vol/Voi/min zugeführt und die Rührgeschwindigkeit auf 1100 Upm festgesetzt. Die Kulturentwicklung erfolgte 8 Stunden lang im Chargenbetrieb, wonach ein Durchflußbetrieb mit dem spezifizierten Medium für eine kontinuierliche Kultur bei einem pH-Wert von 7,0 und einer Temperatur von 37° C sowie einer Verdünnungsrate von 0,14h-' aufgenommen wurde. Nach 7 Kulturtagen betrug die mittlere L-Asparaginase-Produktion in den nachfolgenden 8 Tagen 178 IE/ml Kultur (mit einem Maximum von 210 ΙΕ/ml und einem Minimum von 143 ΙΕ/ml). Das mittlere Trockengewicht der Zellen betrug 8,0 mg/ml.

Diese Suspension wurde 18 Stunden lang bei 37°C auf einem Drehschültler bebrütet und dann in einen 3 I »Portion Fermenier« gegeben, wie er von Elsworth, Meakin, Pitt und Capel, J. Appl. Bact., 1956, 19, Seiten 262 — 278, beschrieben wird. Der »Portion Fermenter« enthielt 31 eines Mediums aus 50 g/l »Yeatex (light grade)« (Produkt der English Grains Co. Ltd.), 2 mM

Beispiel 2

Impfmasse wurde wie im vorstehenden Beispiel erzeugt und zu 900 ml Produktionsmedium in einem 1 I »Portion Fermenter« gegeben. (Das Produktionsmedium entsprach dem Medium A, jedoch mit Verminderung von NaH₂PO₄ auf 2OmH und Erhöhung des Glyceringehalts auf 2% (GewVVoI.). Luft wurde mit 0,5 Vol/Vol/min zugeführt und die Rührgeschwindigkeit auf 750 Upm festgesetzt

Die Kultur wurde V/2 Stunden lang chargenweise entwickelt und dann unter Durchflußbetrieb für eine kontinuierliche Kultur bei einem pH-Wert von 7,0, einer Temperatur von 37° C und einer Verdünnungsrate von 0,10 h-¹ gebracht Nach 40 Tagen lag die mittlere Produktion von L-Asparaginase in den nachfolgenden 6 Tagen bei 113 ΙΕ/ml Kultur. (Das Maximum lag bei 119 ΙΕ/ml und das Minimum bei 105 IE/ml.) Das mittlere Trockengewicht der Zellen lag bei 8,2 mg/ml.

Beispiel 3

Eine kontinuierliche Kultur von Erwinia carotovora (NCPPB 1066 S 10) wurde nach dem Reichen Verfahren wie in Beispiel 1 eingerichtet unter Verwendung eines einfachen Salzmediums (Medium A aber mit auf 20 mM vermindertem NaH₂PO₄ und 1% (GewyVol.) einer gewählten Kohlenstoffquelle, die durch Glycerin. Mannit oder Zitronensäure gebildet wurde). Kulturmedium mit der gleichen Zusammensetzung wurde kontinuierlich zur Kultur hinzugegeben bei einer Verdünnungsrate voiy 0,2 h~'. Die Temperatur lag bei 37°C und der pH-Wert wurde bei 7,0 gehalten.

Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Zusammenstellung wiedergegeben:

KohlcnslolTqucllc

L-Asparaginascgchiill (ΙΕ/ml Kultur)

Trockengewicht der
der /eilen

(mg/ml)

Spezifische
Aktivität

Glycerin	84
Zitronensäure	38
Mannit	IO

30
26

3,4

Beispiel 4

Die Wirkung unterschiedlicher Verdünnungsraten und Konzentrationen der Kohlenstnffquclle wurde bei kontinuierlicher Kultur von F.rwinia carotovora auf komplexen Medien wie in Beispiel 1 unter Anwendung von Glycerinkonzentrationen in zwei Bereichen und von zwei Verdünnungsraten nachgewiesen. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt:

L-Asparaginasegehalt

Kulturdauer 1,5% 1,75% Verdünnung*·

Glycerin Glycerin rate

(Tage) (h-1)

1 - 4

6- 10
11-15
10-20

2 IE/ml
197IE/ml
128 IE/ml
104 IE/ml
100 IE/ml

2 IE/ml

161 IE/ml

99 IE/nl

80IE/mi

78 IE/ml

0,28 0,15 0,15 0,15 0,15

Wie man sieht, führt die hohe Verdünnungsrate von 0,28 zu einem Glycerinpegel in der Kultur, der das übersteigt, was vollständig ausgenutzt werden kann, so daß die L-Asparaginase-Produktion auf einen Bereich von 2 IE/ml Kultur herabgedrückt wird. Obgleich dieser L-Asparaginasegehalt relativ gering ist, liegt er nichtsdestoweniger in der gleichen Größenordnung wie bei einigen typischen bekannten Chargenkulturverfahren. So erhalten beispielsweise Peterson und Ciegler (App. Microbiol. VoI 18, 1969) eine Ausbeute von 1,35 IE/ml bei chargenweiser Kultur von Erwinia aroideae.

Beispiel 5

Das Verfahren gemäß Beispiel 1 wurde wiederholt unter Anwendung einer Konzentration einer gewählten Kohlenstoffquelle (Glucose anstelle von Glycerin) in in einem Bereich von 1,5% (GewyVol.). Der L-Asparaginasegehalt und die spezifische Aktivität der Kultur waren praktisch mit den nach Beispiel 1 erhaltenen identisch.

Beispiele

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde unter Anwendung einer hohen Verdünnungsrute von 0,254 und einem Glycerinpegel in der Kultur und im kontinuierlich zugeführten Medium von 1,5% (GewyVol.) wiederholt, wobei die Stationärkonzentratk- ■>. in der Kultur bei 0,01 mg/'mi lag. Der Enzymgehalt lag bei' i0 IE/ml.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase durch kontinuierliche Kultivierung von Bakterien der Gattung Erwinia, dadurch gekennzeichnet, daß der Kultur als KohTenstoffquelle ein Zwischenprodukt des Krebs-Zyklus oder ein Vorläufer davon unter den Verfahrensbedingungen in einer begrenzten, quasistationären Konzentration von bis ι ο zu 0,1 mg/ml zugesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoffquelle Glycerin verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- ι ί zeichnet, daß als Kohlenstoffquelle Glucose verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoffquelle Citronensäure, ein Citrat oder iriannii verwendet wird. 2»

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoffquelle in einer Konzentration von bis zu 0,05 mg/ml eingesetzt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 2i dadurch gekennzeichnet, daß die begrenzte quasistationäre Konzentration der Kohlenstoffquelle in der Kultur durch kontinuierliche Zufuhr von Kulturmedium, das etwa 0,5 bis 5% (G/V) Kohlenstoffquelle enthält, bei einer Verdünnungsrate von etwa 0,05 bis in 0,4 pro Stunde erhalten wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das zugeführte Kulturmedium ! bis 3% (G/V) Kohlenstoffquelle enthält und die Verdünnungsrate 0.1 bis 0,3 pro Stunde beträgt. r»

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der kontinuierlichen Kultur etwa 5,5 bis 8,0 und vorzugsweise 6,5 bis 7,5 beträgt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, -tu dadurch gekennzeichnet, dnß die Temperatur auf etwa 20 bis 40⁰C und vorzugsweise 28 bis 38° C gehalten wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche I bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Bakterien die r. Species Erwinia carotovora verwendet wird.