DE2156339B2 - Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase - Google Patents
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase.
In der Deutschen Patentanmeldung P 19 42 833.2 vom
22.8.1969 wird die Isolierung von therapeutisch wirksamer L-Asparaginase aus Bakterienkulturen der
Genus Erwinia, einer bekannten gegenüber Pflanzen pathogenen Gattung, beschrieben. Danach können die
Bakterien auf oder in unterschiedlichen festen oder flüssigen Kulturmedien gezüchtet werden, sie sowohl
chemisch einfach definierte Medien als auch komplexe Medien sein können, und es werden Beispiele
angegeben, bei denen durch chargenweise Produktion von F.rwinia in komplexen Medien L-Asparaginase-Ausbeuten
von 8.2 ΙΕ/ml Kultur erhalten werden und über kontinuierliche Kulturen in komplexen Medien
berichtet, die zu Ausbeuten von 24 IE/ml Kultur fuhren.
26.6.1970 wird ein Verfahren zur Erzielung höherer L-Asparaginase-Ausbeuten pro ml Kultur beschrieben,
wonach dem Kulturmedium entweder bei chargenweiser oder kontinuierlicher Kultur wirksame Mengen von
zumindest einer der Aminosäuren, Glutaminsäure, Serin, Threonin oder Asparaginsäure zugesetzt werden.
Dabei werden Beispiele angegeben, nach denen L-Asparaginase-Ausbeuten von 44,5 I E/ml Kultur bei
chargenweiser Züchtung und bis zu 80 IE/ml Kultur bei
kontinuierlicher Züchtung erhalten wurden.
Es wurde nun festgestellt, daß unter ausgewählten Bedingungen für kontinuierliche Züchtung sogar noch
höhere L-Asparaginase-Ausbeuten pro ml Kultur erhalten werden können. Eine solche Ausbeutesteigerung
ist gerade im vorliegenden Falle außerordentlich interessant, da die Nachfrage nach dem Enzym bei
weitem seine derzeitige Verfügbarkeit übersteigt. L-Asparaginase wird für chemische Versuche zur
Behandlung gewisser Typen von Leukämie und disscrninicrtcrn Karzinom verwendet.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist in den Ansprüchen definiert.
Zu geeigneten Kohlenstoffquelltn gehören Glycerin, Glucose, Mannit, Lactat und Citrat und andere
Präkursoren, die zu Kreb's-Zyklus-Zwischenprodukten führen können. Glycerin oder Glucose werden dabei
normalerweise als billige Kohlenstoffquellen, die gute L-Asparaginase-Ausbeuten liefern, bevorzugt Die
Wirksamkeit der gewählten Kohlenstoffquellen in kontinuierlicher Kultur ist überraschend, da von diesen
Materialien festgestellt wurde, daß sie bei chargenweiser Kultur eine variierende Hemmung der Enzymproduktion
induzieren.
Die L-Asparaginasc wird dann aus der Kultur durch irgendein geeignetes zellzerstörendes Verfahren und
vorzugsweise na. ή der in der Deutschen Patentanmeldung
P 19 42 900.6 vom 22.8.1969 vollständig beschriebenen
Verfahrensweise extrahiert bzw. isoliert (dieses Verfahren umfaßt eine Zeil-Lysis mit starkem Alkali).
Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann die nährende Kultur entweder auf einfachen Salzmedien basieren,
bei denen die gewählte Kohlenstoffquelle praktisch allen für die Bakterien zur Verfügung stehenden
Kohlenstoff bereitstellt oder durch ein komplexes Medium gebildet werden, bei dem die gewählte
Kohlenstoffquelle andere bereits im Medium vorhandene Kohlenstoffquellen ergänzen kann.
Obgleich eine Mischung von zwei oder mehreren der gewählten Kohlenstoffquellen enthaltende Nährmedium
beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, wird bevorzugt, daß für die bakterielle
Kultur in irgendeinem besonderen Stadium der kontinuierlichen Züchtung nur eine der gewählten
Kohlenstoffquellen verfügbar ist.
Die erfindungsgemäße Verfahrensweise kann bei allen Bakterien der Genus Erwinia angewandt werden
und insbesonere bei solcnen Stämmen, wie sie in der bereits oben genannten Patentanmeldung P 19 42 833.2
vom 22.8.1969 angegeben werden. Besonders zweckmäßig
ist die Anwendung eines Stammes von Efwiniä carotovora, der beim National Collection of Plant
Pathogenic Bacteria, England unter NCPPB 1066 niedergelegt ist und zu einer hohen spezifischen
Aktivität führt, d. h. einem hohen Verhältnis von Enzymaktivität zu mg erzeugtem Protein.
Kontinuierliche Bakterienkulturverfahren gemäß der Erfindung werden normalerweise bei pH-Werten
/wischen 5,5 und 8.0, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5
und Temperaturen von 20 bis 40° C, vorzugsweise 28 bis 38° C, durchgeführt. Die Verdünnungsrate liegt üblicherweise
bei 0,05 bis 0,4, vorzugsweise bei 0,1 bis 03, wobei
unter der Verdünnungsrate das Verhältnis der durch das KulturgefäQ pro Stunde geleiteten Flüssigkeitsmenge
zum Volumen der im Kulturgefäß enthaltenen Flüssigkeit zu verstehen ist. Bei diesen Verdünnungsraten liegt
die Konzentration der gewählten Kohlenstoffquelle im zugelieferten Kulturmedium bei 0,5 bis 5%, vorzugsweise
1 bis 3% (Gewicht/Volumen), so daß die begrenzte Stationärkonzentration im Kulturgefäß kleiner als etwa
0,1 mg/ml (vorzugsweise kleiner als 0,05 mg/ml) sein muß und unzureichend für die bei höheren Konzentrationen
mögliche Unterdrückung der Bildung von L-Asparaginase.
Nachfolgend werden einige Beispiele für kontinuierliche Kulturverfahren gemäß der Erfindung beschrieben:
Eine Eänzeücoianie von Erwinia carotovora (NCPPB
1066 S 10) von einer Oxoid-Agarzählplatte (plate of
Oxoid plate count agar) wurde in 4 ml tryptische Fleischbrühe gebracht und 6 Stunden lang bei 37° C
bebrütet. 1 ml dieser Kultur wurde dann zu 100 ml »Medium A« in einer konischen 500 ml-Flasche
hinzugefügt Dieses Medium A hatte folgende Zusammensetzung:
NaH2PO4
NH4CI
KCI
Na2SO4
Mn
Cu
Co
Mg
Ca
Mo
Glycerin
pH - 7
10OmM
10OmM
10OmM
5mM
lOirM
lOirM
2mM
y,025 ν tM
0,1 mM
0,05 mM
0,005 mM
0,01 mM
0,005 mM
1,25 mM
0,1 mM
0,01 mM
I % (Gew./Vol.)
Zitronensäure und 1,5% (GewVVol.) Glycerin. Luft
wurde mit 0,5 Vol/Voi/min zugeführt und die Rührgeschwindigkeit auf 1100 Upm festgesetzt. Die Kulturentwicklung
erfolgte 8 Stunden lang im Chargenbetrieb, wonach ein Durchflußbetrieb mit dem spezifizierten
Medium für eine kontinuierliche Kultur bei einem pH-Wert von 7,0 und einer Temperatur von 37° C sowie
einer Verdünnungsrate von 0,14h-' aufgenommen wurde. Nach 7 Kulturtagen betrug die mittlere
L-Asparaginase-Produktion in den nachfolgenden 8 Tagen 178 IE/ml Kultur (mit einem Maximum von 210
ΙΕ/ml und einem Minimum von 143 ΙΕ/ml). Das mittlere
Trockengewicht der Zellen betrug 8,0 mg/ml.
Diese Suspension wurde 18 Stunden lang bei 37°C auf
einem Drehschültler bebrütet und dann in einen 3 I »Portion Fermenier« gegeben, wie er von Elsworth,
Meakin, Pitt und Capel, J. Appl. Bact., 1956, 19, Seiten
262 — 278, beschrieben wird. Der »Portion Fermenter« enthielt 31 eines Mediums aus 50 g/l »Yeatex (light
grade)« (Produkt der English Grains Co. Ltd.), 2 mM
Impfmasse wurde wie im vorstehenden Beispiel erzeugt und zu 900 ml Produktionsmedium in einem 1 I
»Portion Fermenter« gegeben. (Das Produktionsmedium entsprach dem Medium A, jedoch mit Verminderung
von NaH2PO4 auf 2OmH und Erhöhung des Glyceringehalts
auf 2% (GewVVoI.). Luft wurde mit 0,5 Vol/Vol/min zugeführt und die Rührgeschwindigkeit auf
750 Upm festgesetzt
Die Kultur wurde V/2 Stunden lang chargenweise
entwickelt und dann unter Durchflußbetrieb für eine kontinuierliche Kultur bei einem pH-Wert von 7,0, einer
Temperatur von 37° C und einer Verdünnungsrate von 0,10 h-1 gebracht Nach 40 Tagen lag die mittlere
Produktion von L-Asparaginase in den nachfolgenden 6 Tagen bei 113 ΙΕ/ml Kultur. (Das Maximum lag bei 119
ΙΕ/ml und das Minimum bei 105 IE/ml.) Das mittlere
Trockengewicht der Zellen lag bei 8,2 mg/ml.
Eine kontinuierliche Kultur von Erwinia carotovora (NCPPB 1066 S 10) wurde nach dem Reichen Verfahren
wie in Beispiel 1 eingerichtet unter Verwendung eines einfachen Salzmediums (Medium A aber mit auf 20 mM
vermindertem NaH2PO4 und 1% (GewyVol.) einer
gewählten Kohlenstoffquelle, die durch Glycerin. Mannit oder Zitronensäure gebildet wurde). Kulturmedium
mit der gleichen Zusammensetzung wurde kontinuierlich zur Kultur hinzugegeben bei einer
Verdünnungsrate voiy 0,2 h~'. Die Temperatur lag bei
37°C und der pH-Wert wurde bei 7,0 gehalten.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Zusammenstellung wiedergegeben:
KohlcnslolTqucllc
L-Asparaginascgchiill
(ΙΕ/ml Kultur)
Trockengewicht der
der /eilen
der /eilen
(mg/ml)
Spezifische
Aktivität
Aktivität
Glycerin | 84 |
Zitronensäure | 38 |
Mannit | IO |
30
26
26
3,4
Die Wirkung unterschiedlicher Verdünnungsraten und Konzentrationen der Kohlenstnffquclle wurde bei
kontinuierlicher Kultur von F.rwinia carotovora auf komplexen Medien wie in Beispiel 1 unter Anwendung
von Glycerinkonzentrationen in zwei Bereichen und von zwei Verdünnungsraten nachgewiesen. Dabei
wurden folgende Ergebnisse erzielt:
L-Asparaginasegehalt
Kulturdauer 1,5% 1,75% Verdünnung*·
Glycerin Glycerin rate
(Tage) (h-1)
1 - 4
6- 10
11-15
10-20
11-15
10-20
2 IE/ml
197IE/ml
128 IE/ml
104 IE/ml
100 IE/ml
197IE/ml
128 IE/ml
104 IE/ml
100 IE/ml
2 IE/ml
161 IE/ml
99 IE/nl
80IE/mi
78 IE/ml
0,28 0,15 0,15 0,15 0,15
Wie man sieht, führt die hohe Verdünnungsrate von 0,28 zu einem Glycerinpegel in der Kultur, der das
übersteigt, was vollständig ausgenutzt werden kann, so daß die L-Asparaginase-Produktion auf einen Bereich
von 2 IE/ml Kultur herabgedrückt wird. Obgleich dieser L-Asparaginasegehalt relativ gering ist, liegt er
nichtsdestoweniger in der gleichen Größenordnung wie bei einigen typischen bekannten Chargenkulturverfahren.
So erhalten beispielsweise Peterson und Ciegler (App. Microbiol. VoI 18, 1969) eine Ausbeute von 1,35
IE/ml bei chargenweiser Kultur von Erwinia aroideae.
Das Verfahren gemäß Beispiel 1 wurde wiederholt unter Anwendung einer Konzentration einer gewählten
Kohlenstoffquelle (Glucose anstelle von Glycerin) in in einem Bereich von 1,5% (GewyVol.). Der L-Asparaginasegehalt
und die spezifische Aktivität der Kultur waren praktisch mit den nach Beispiel 1 erhaltenen
identisch.
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde unter Anwendung einer hohen Verdünnungsrute von 0,254 und einem
Glycerinpegel in der Kultur und im kontinuierlich zugeführten Medium von 1,5% (GewyVol.) wiederholt,
wobei die Stationärkonzentratk- ■>. in der Kultur bei 0,01
mg/'mi lag. Der Enzymgehalt lag bei' i0 IE/ml.
Claims (10)
1. Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase durch kontinuierliche Kultivierung von Bakterien
der Gattung Erwinia, dadurch gekennzeichnet,
daß der Kultur als KohTenstoffquelle ein
Zwischenprodukt des Krebs-Zyklus oder ein Vorläufer davon unter den Verfahrensbedingungen in einer
begrenzten, quasistationären Konzentration von bis ι ο zu 0,1 mg/ml zugesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoffquelle Glycerin verwendet
wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- ι ί
zeichnet, daß als Kohlenstoffquelle Glucose verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoffquelle Citronensäure,
ein Citrat oder iriannii verwendet wird. 2»
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoffquelle
in einer Konzentration von bis zu 0,05 mg/ml eingesetzt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 2i
dadurch gekennzeichnet, daß die begrenzte quasistationäre Konzentration der Kohlenstoffquelle in der
Kultur durch kontinuierliche Zufuhr von Kulturmedium, das etwa 0,5 bis 5% (G/V) Kohlenstoffquelle
enthält, bei einer Verdünnungsrate von etwa 0,05 bis in 0,4 pro Stunde erhalten wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das zugeführte Kulturmedium ! bis 3%
(G/V) Kohlenstoffquelle enthält und die Verdünnungsrate 0.1 bis 0,3 pro Stunde beträgt. r»
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der
kontinuierlichen Kultur etwa 5,5 bis 8,0 und vorzugsweise 6,5 bis 7,5 beträgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, -tu
dadurch gekennzeichnet, dnß die Temperatur auf etwa 20 bis 400C und vorzugsweise 28 bis 38° C
gehalten wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche I bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Bakterien die r.
Species Erwinia carotovora verwendet wird.
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