DE2156339A1

DE2156339A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase

Info

Publication number: DE2156339A1
Application number: DE19712156339
Authority: DE
Inventors: Donald Sydney Winterslow Salisbury; Capel Brian John; Evans Charles Gervase Thorngate; Salisbury; Wiltshire Callow (Großbritannien). C12d 13-06
Original assignee: UK Secretary of State for Social Services
Current assignee: UK Secretary of State for Social Services
Priority date: 1970-11-13
Filing date: 1971-11-12
Publication date: 1972-05-25
Also published as: US3783102A; CH569087A5; FR2117099A5; AU3569971A; SE393815B; DE2156339C3; AU460436B2; AT311286B; CA995610A; NL177502B; NL177502C; DE2156339B2; IE35805L; BE775286A; NL7115609A; JPS5543758B1; DK128942B; IE35805B1

Description

|p)pL-Ing. R. B E E T Z ββη. IDIW K LAMPi^CHT

Dr.-Ing. R-B^ETZJr. M0ach«n22,Stein«fcKfrtr. 1β 293-17- 3O9P 12.11.1971

retapy of State for Social Services 'n Her Pritannic Majesty's Governirierit of

the United Kinpiom of Great Britain and — — — — — —· — ·— — — — —■· ^ — ^ — —· — — — — a~ — — _ — _ -β — ^ _ __ _— ^ _{mmm tmm} ^ ^_- ^, Morthern Ireland, London (Großbritannien)

Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase

Die Erfindung Dezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase.

In der Deutschen Patentanmeldung P 19 42 833.2 vom 22.8.1969 wird die Isolierung von therapeutisch wirksamer L-Asparaginase aus Bakterienkulturen der Genus Erwinia, ei- " ner bekannten gegenüber Pflanzen pathogenen Gattung, beschrieben« Danach können die Bakterien auf oder in unterschiedlichen festen oder flüssigen Kulturmedien gezüchtet werden, die sowohl chemisch einfach definierte Medien als auch komplexe iiödien sein können, und es werden Beispiele angegeben, bei denen durch chargenweise Produktion von Erwinia in komplexen uedien L-Asparaginase-Ausbeuten von 8,2 ΙΕ/ml Kultur

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BAD ORIGINAL

erhalten werden und über kontinuierliche Kulturen in komplexen Medien berichtet, die zu Ausbeuten von 24 ΙΕ/ml Kultur führen.

In der Deutschen Patentanmeldung P 20 31 759.3 vom 26.6.1970 wird ein Verfahren zur Erzielung höherer L-Asparaginase-Ausbeuten pro ml Kultur beschrieben, wonach dem Kulturmedium entweder bei chargenweiser oder kontinuierlicher Kultur wirksame Mengen von zumindest einer der Aminosäuren, Glutaminsäure, Serin, Threonin oder Asparaginsäure zugesetzt werden. Dabei werden Beispiele angegeben, nach denen L-Asparaginase-Ausbeuten von 44,5 IS/ml Kultur bei chargenweiser Züchtung und bis zu 80 IS/ml Kultur bei kontinuierlicher Züchtung erhalten wurden.

Es wurde nun festgestellt, daß unter ausgewählten Bedingungen für kontinuierliche Züchtung sogar noch höhere L-Asparaginase-Ausbeuten pro ml Kultur erhalten werden können. Eine solche Ausbeutesteigerung ist gerade im vorliegenden Falle außerordentlich interessant, da die Nachfrage nach dem Enzym bei weitem seine derzeitige Verfügbarkeit übersteigt. !-Asparaginase wird für chemische Versuche zur Behandlung gewisser Typen von Leukämie und diaseminiertem Karzinom verwendet.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von !-Asparaginase ist dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien der Genus Erwinia in kontinuierlicher Kultur mit einer begrenzten Stationärkonzentration einer gewählten Kohlenstoffquelle züchtet, die ein Kreb's-Zyklus-Zwischenprodukt (Kreb's cycle intermediate) oder ein Präkursor desselben unter den Verfahrensbedingungen ist.

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Zu geeigneten Kohlenstoffquellen gehören Glycerin, Glucose, kannit, Lactat und Gitrat und andere Präkursoren, die zu Kreb's-Zyklus-Zwischenprodukten führen können. Glycerin oder Glucose werden dabei normalerweise als billige Kohlenstoffquellen, die gute L-Asparaginase-Ausbeuten liefern, bevorzugt. Die Wirksamkeit der gewählten Kohlenstoffquellen in kontinuierlicher Kultur ist überraschend, da von diesen Materialien festgestellt wurde, daß sie bei chargenweiser Kultur eine variierende Hemmung der Enzymproduktion induzieren.

Die L-Asparaginase wird dann aus der Kultur durch irgendein geeignetes zeilzerstörendes Verfahren und vorzugsweise nach der in der Deutschen Patentanmeldung P 19 42 900.6 von 22o8.1969 vollständig beschriebenen Verfahrensweise extrahiert bzw. isoliert (Dieses Verfahren umfaßt eine ZeIl-Lysis mit starkem Alkali).

Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann die nährende Kultur entweder auf einfachen Salzmedien basieren, bei denen die gewählte Kohlenstoffquelle praktisch allen für die bakterien zur Verfugung stehenden Kohlenstoff bereitstellt oder durch ein komplexes kedium gebildet werden, bei dem die gewählte Kohlenstoffquelle andere bereits im kedium vorhandene Konienstoffquellen ergänzen kann.

Obgleich eine ilischung von zwei oder mehreren der gewählten L.uhlenstoffquellen enthaltende i>iährmedium beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, wird bevorzugt, daß für die bakterielle Kultur in irgendeinem besonderen Stadium der kontinuierlichen Züchtung nur eine dei* gewählten Kohlenstoffquellen verfügbar ist.

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Die erfindungsgemäße Verfahrensweise kann bei allen Bakterien der Genus üärwinia angewandt v/erden und insbesondere bei solchen Stämmen, wie sie in der bereits oben genannten Patentanmeldung P 19 42 833.2 vom 22.8.1969 angegeben werden. Besonders zweckmäßig ist die Anwendung eines Stammes von Brwinia carotovora, der beim National Collection of Plant Pathogenic Bacteria, England unter iiCPPB 1066 niedergelegt ist und zu einer hohen spezifischen Aktivität führt, d.h. einem hohen Verhältnis von ünzymaktivität zu mg erzeugtem Protein.

Kontinuierliche Bakterienkulturverfahren gemäß der 3rfindung werden normalerweise bei pH-Werten zwischen 5,5 und 8,0, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5 und Temperaturen von 20 bis 40⁰C, vorzugsweise 28 bis 38⁰C durchgeführt. Die Verdünnungsrate liegt üblicherweise bei 0,05 bis 0,4, vorzugsweise bei 0,1 bis 0,3, wobei unter der Verdünnungsrate das Verhältnis der durch das Kulturgefäß pro Stunde geleiteten Plüssigkeitsmenge zum Volumen der im Kulturgefäß enthaltenen Flüssigkeit zu verstehen ist. Bei diesen Verdünnungsraten liegt die Konzentration der gewählten Kohlenstoffquelle im zugelieferten Kulturmedium bei 0,5 bis 5 $, vorzugsweise 1 bis 3 io (G-ewicht/Volumen), so daß die begrenzte Stationärkonzentration im Kulturgefäß kleiner als etwa 0,1 mg/ml (vorzugsweise kleiner als 0,05 mg/ml) sein muß und unzureichend für die bei höheren Konzentrationen mögliche Unterdrückung der Bildung von L-Asparaginase.

Nachfolgend werden einige Beispiele für kontinuierliche Kultiurverfahren gemäß der Erfindung beschrieben:

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.β ei sj)iel 1

yjine ainzeikolonie von Erwinia carotovora (NCPPB 1066 S10) von einer Oxoid-Agarzählplatte (plate of Oxoid plate count agar) wurde in 4 ml tryptische Fleischbrühe gebracht und 6 Stunden lang bei 37°G bebrütet. 1 ml dieser Kultur wurde dann zu 100 ml 'Medium A" in einer konischen 500 ml Piasehe hinzugefügt. Dieses Medium A hatte folgende Zusammensetzung:

NaH₂PO₄	100	lillu"
MH₄Ol	100	mM
KCl	5	mM
Ma₂SC.	10	DlM
Zitronensäure	2	mM
Zn²⁺	0,025	ralvi
Pe³⁺	0,1	mM
hn	0,05	mM
Gu	0,005	mM
Co	0,01	mivi
B	0,005	mM
-g	1,25	iiiM
Ca	0,1	mM
LiO	0,01	mM
Glycerin	V/o (	Gew./Vol.)
pH - 7

Diese Suspension wurde 18 Stunden lang bei 37 G auf einem Drehschüttler bebrütet und darm in einen 3 1 "Portion Fermenter" gegeben, wie er von Elsworth, Meakin, Pitt und Üapel, J. Appl-, Bact., 1956 _1_9 Seiten 262-278 beschrieben wird. Der "Portion Fermenter" enthielt 3 1 eines Mediums

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aus 50 g/l "Yeatex (light grade)" (Produkt der English G-rains Co. Ltd.), 2 mM Zitronensäure und 1,5 $ (Gewo/Vol.) Glycerin. Luft wurde mit 0,5 Vol/Vol/min zugeführt und die Fahrgeschwindigkeit auf 1100 Upm festgesetzt. Die Kulturentwicklung erfolgte 8 Stunden lang im Chargenbetrieb, wonach ein Durchflußbetrieb mit dem spezifizierten Medium für eine kontinuierliche Kultur bei einem pH-Wert von 7,0 und einer

ο —1

Temperatur von 37 C sowie einer Verdünnungsrate von 0,14 h aufgenommen wurde. Nach 7 Kulturtagen betrug die mittlere I-Asparaginase-Produktion in den nachfolgenden 8 Tagen 178 ΙΕ/ml Kultur (mit einem IJaximum von 210 IE/inl und einem kinimum von 14-3 ΙΕ/ml). Das mittlere Trockengewicht der Zellen betrug 8,0 mg/ml.

Beispiel 2

Impfinasse wurde wie im vorstehenden Beispiel erzeugt und zu 900 ml Produktionsmedium in einem 1 1 "Portion irermenter" gegeben (Das Produktionsmedium entsprach dem kedium A, jedoch mit Verminderung von HaH₂PO. auf 20 mK und Erhöhung des Glyceringehalts auf 2 <$> (G-ewo/Vol.). Luft wurde mit 0,5 Vol/Vol/min zugeführt und die Rührgeschwindigkeit auf 750 Upm festgesetzt.

Die Kultur wurde 9 1/2 Stunden lang chargenweise entwickelt und dann unter Durchflußbetrieb für eine kontinuierliche Kultur bei einem pH-Wert von 7,0, einer Temperatur von 37⁰C und einer Verdünnungsrate von 0,10 h~ gebracht,, Nach 40 Tagen lag die mittlere Produktion von L-Asparaginase in den nachfolgenden 6 Tagen bei 113 ΙΕ/ml Kultur. (Das Maximum lag bei 119 ΙΕ/ml und das Minimum bei 105 IE/inl). Das mittlere Trockengewicht der Zellen lag bei 8,2 mg/ml.

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.Beispiel 3

Eine kontinuierliche Kultur von Erwinia carotovora (MJPPB 1066 S10) wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 eingerichtet unter Verwendung eines einfachen Salzmediums (Medium A aber mit auf 20 mM vermindertem NaHp und 1 io (Gewo/Vol.) einer gewählten Kohlenstoff quelle, die durch Glycerin, Mannit oder Zitronensäure gebildet wurde). Kulturmedium mit der gleichen Zusammensetzung wurde kontinuierlich zur Kultur hinzugegeben bei einer Verdünnungsrate von 0,2 h~ . Die Temper;
wurde bei 7,0 gehalten.

von 0,2 h . Die Temperatur lag bei 37⁰C und der pH-Wert

Me Ergebnisse sind in der nachfolgenden Zusammenstellung wiedergegeben:

L-Asparaginase- Trockenge- Spezifische Kohlenstoff- gehalt wicht der Aktiviquelle (IE/ml Kultur) Zellen (mg/ml) tat

Glycerin 84 4,0 30

Zitronensäure 38 2,1 26

Ilannit 10 4,2 3,4

.Beispiel 4

Die Wirkung unterschiedlicher Verdünnungsraten und Konzentrationen der Kohlenstoffquelle wurde bei kontinuierlicher Kultur von Erwinia carotovora auf komplexen Medien wie in Beispiel 1 unter Anwendung von Glycerinkonzentrationen in zwei Bereichen und von zwei Verdünnungsraten nachgewiesen. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielii

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L-Asparaginasegehalt

KuItür-	1 ,5/y Glycerin	1 ,75/i Glycerin	' Verdünnungs
dauer			rate
(Tage)	2 IS/ml	2 IE/ml	(h-1)
1 - 4	197 IE/ml	161 IE/ml	0,28
5	128 IE/ml	99 IE/ml	0,15
6-10	104 Iü/ml	80 IE/ml	Il
11 - 15	100 IE/ml	78 IE/ml	Il
16 - 20		H

Wie man sieht, führt die hohe Verdünnungsrate von 0,28 zu einem Glycerinpegel in der Kultur, der das übersteigt, was vollständig ausgenutzt werden kann, so daß die L-Asparaginase-Produktion auf einen Bereich von 2 IE/ml Kultur herabgedrückt wird. Obgleich dieser I-Asparaginasegehalt relativ gering ist, liegt er nicht sdestov/eniger in der gleichen Grössenordnung wie bei einigen typischen bekannten Chargenkulturverfahren. So erhalten beispielsweise Peterson und Giegler (Appo Microbiol. VoI, JjB, 1969) eine Ausbeute von 1,35 IE/ml bei chargenweiser Kultur von Erwinia aroideae.

P Beispiel 5

Das Verfahren gemäß Beispiel 1 wurde wiederholt unter Anwendung einer Konzentration einer gewählten Kohlenstoffquelle (Glucose anstelle von Glycerin)in einem Bereich von 1,5 i° (Gew./Vol.)· Der 1-Asparaginasegehalt und die spezifische Aktivität der Kultur waren praktisch mit den nach Beispiel 1 erhaltenen identisch.

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Beispiel 6

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde unter.Anwendung einer hohen Verdünnungsrate von 0,254 und einem Crlycerinpegel ill der ivultur und im kontinuierlich zugeführten Medium von 1,5 fi (GeWo/Vol.) wiederholt, wobei die Stationärkonzentration in der Kultur bei 0,01 mg/ml lag. Der Enzymgehalt lag bei 110 IE/ml.

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Claims

2Ί5Β339

- ίο -

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien der Genus Erwinia in kontinuierlicher Kultur mit begrenzter Stationärkonzentration einer gewählten Kohlenstoffquelle züchtet, die ein Kreb's-Zyklus-Zwisehenprodukt oder ein Präkursor eines solchen unter den Verfahrensbedingungen ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoffquelle durch zumindest eine Verbindung aus der Gruppe Glycerin, Glucose, Zitronensäure oder öitrat, Milchsäure oder Lactat oder kannit gebildet wird.

3> Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die begrenzte Stationärkonzentration der gewählten Kohlenstoffquelle in der Kultur bis zu etwa 0,1 mg/"ml und vorzugsweise bis zu etwa 0,05 mg/ml beträgt.

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die begrenzte Stationärkonzentration in der Kultur durch kontinuierliche Zufuhr von Kulturmedium erhalten wird, das zwischen etwa 0,5 und 5 i» (Gew./Vol.) der gewählten Kohlenstoffquelle bei einer Veraünnungsrate zwischen etwa 0,05 und 0,4 pro Stunde und insbesondere 1 bis 3 5* (Gewo/Vol.) der gewählten Kohlenstoffquelle bei einer Verdünnungsrate zwischen 0,1 und 0,3 pro Stunde enthält.

5o Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der kontinuierlichen

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Kultur zwischen etwa 5,5 und 8,0 und vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5 liegt.

6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur zwischen etwa 20 und 40⁰G und vorzugsweise zwischen 28 und 38⁰C gehalten wird.

7ο Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die gezüchteten Bakterien zur
Art der Brwinia carotovora gehören.,

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