DE2156339A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase - Google Patents
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Description
|p)pL-Ing. R. B E E T Z ββη.
IDIW K LAMPi^CHT
retapy of State for Social Services
'n Her Pritannic Majesty's Governirierit of
the United Kinpiom of Great Britain and
— — — — — —· — ·— — — — —■· ^ — ^ — —· — — — — a~ — — _ — _ -β — ^ _ __ — ^ mmm tmm ^ ^- ^,
Morthern Ireland, London (Großbritannien)
Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase
Die Erfindung Dezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase.
In der Deutschen Patentanmeldung P 19 42 833.2 vom
22.8.1969 wird die Isolierung von therapeutisch wirksamer L-Asparaginase aus Bakterienkulturen der Genus Erwinia, ei- "
ner bekannten gegenüber Pflanzen pathogenen Gattung, beschrieben« Danach können die Bakterien auf oder in unterschiedlichen
festen oder flüssigen Kulturmedien gezüchtet werden, die sowohl chemisch einfach definierte Medien als auch komplexe
iiödien sein können, und es werden Beispiele angegeben,
bei denen durch chargenweise Produktion von Erwinia in komplexen uedien L-Asparaginase-Ausbeuten von 8,2 ΙΕ/ml Kultur
293-(JX 3648/011) jiöHe
209822/0894
BAD ORIGINAL
erhalten werden und über kontinuierliche Kulturen in komplexen Medien berichtet, die zu Ausbeuten von 24 ΙΕ/ml Kultur
führen.
In der Deutschen Patentanmeldung P 20 31 759.3 vom 26.6.1970 wird ein Verfahren zur Erzielung höherer L-Asparaginase-Ausbeuten
pro ml Kultur beschrieben, wonach dem Kulturmedium entweder bei chargenweiser oder kontinuierlicher
Kultur wirksame Mengen von zumindest einer der Aminosäuren, Glutaminsäure, Serin, Threonin oder Asparaginsäure zugesetzt
werden. Dabei werden Beispiele angegeben, nach denen L-Asparaginase-Ausbeuten
von 44,5 IS/ml Kultur bei chargenweiser Züchtung und bis zu 80 IS/ml Kultur bei kontinuierlicher
Züchtung erhalten wurden.
Es wurde nun festgestellt, daß unter ausgewählten Bedingungen für kontinuierliche Züchtung sogar noch höhere
L-Asparaginase-Ausbeuten pro ml Kultur erhalten werden können. Eine solche Ausbeutesteigerung ist gerade im vorliegenden
Falle außerordentlich interessant, da die Nachfrage nach dem Enzym bei weitem seine derzeitige Verfügbarkeit übersteigt.
!-Asparaginase wird für chemische Versuche zur Behandlung gewisser Typen von Leukämie und diaseminiertem
Karzinom verwendet.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von !-Asparaginase
ist dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien der Genus Erwinia in kontinuierlicher Kultur mit einer begrenzten
Stationärkonzentration einer gewählten Kohlenstoffquelle züchtet, die ein Kreb's-Zyklus-Zwischenprodukt (Kreb's cycle
intermediate) oder ein Präkursor desselben unter den Verfahrensbedingungen
ist.
209822/0894
Zu geeigneten Kohlenstoffquellen gehören Glycerin, Glucose, kannit, Lactat und Gitrat und andere Präkursoren, die
zu Kreb's-Zyklus-Zwischenprodukten führen können. Glycerin oder Glucose werden dabei normalerweise als billige Kohlenstoffquellen,
die gute L-Asparaginase-Ausbeuten liefern, bevorzugt. Die Wirksamkeit der gewählten Kohlenstoffquellen
in kontinuierlicher Kultur ist überraschend, da von diesen Materialien festgestellt wurde, daß sie bei chargenweiser
Kultur eine variierende Hemmung der Enzymproduktion induzieren.
Die L-Asparaginase wird dann aus der Kultur durch irgendein
geeignetes zeilzerstörendes Verfahren und vorzugsweise nach der in der Deutschen Patentanmeldung P 19 42 900.6
von 22o8.1969 vollständig beschriebenen Verfahrensweise extrahiert
bzw. isoliert (Dieses Verfahren umfaßt eine ZeIl-Lysis
mit starkem Alkali).
Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann die nährende Kultur entweder auf einfachen Salzmedien basieren, bei denen
die gewählte Kohlenstoffquelle praktisch allen für die bakterien
zur Verfugung stehenden Kohlenstoff bereitstellt oder durch ein komplexes kedium gebildet werden, bei dem die gewählte Kohlenstoffquelle andere bereits im kedium vorhandene
Konienstoffquellen ergänzen kann.
Obgleich eine ilischung von zwei oder mehreren der gewählten
L.uhlenstoffquellen enthaltende i>iährmedium beim erfindungsgemäßen
Verfahren verwendet werden können, wird bevorzugt, daß für die bakterielle Kultur in irgendeinem besonderen
Stadium der kontinuierlichen Züchtung nur eine dei*
gewählten Kohlenstoffquellen verfügbar ist.
209822/0894
Die erfindungsgemäße Verfahrensweise kann bei allen Bakterien der Genus üärwinia angewandt v/erden und insbesondere
bei solchen Stämmen, wie sie in der bereits oben genannten Patentanmeldung P 19 42 833.2 vom 22.8.1969 angegeben
werden. Besonders zweckmäßig ist die Anwendung eines Stammes von Brwinia carotovora, der beim National Collection
of Plant Pathogenic Bacteria, England unter iiCPPB 1066 niedergelegt ist und zu einer hohen spezifischen Aktivität
führt, d.h. einem hohen Verhältnis von ünzymaktivität zu
mg erzeugtem Protein.
Kontinuierliche Bakterienkulturverfahren gemäß der 3rfindung
werden normalerweise bei pH-Werten zwischen 5,5 und 8,0, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5 und Temperaturen von
20 bis 400C, vorzugsweise 28 bis 380C durchgeführt. Die Verdünnungsrate
liegt üblicherweise bei 0,05 bis 0,4, vorzugsweise bei 0,1 bis 0,3, wobei unter der Verdünnungsrate das
Verhältnis der durch das Kulturgefäß pro Stunde geleiteten Plüssigkeitsmenge zum Volumen der im Kulturgefäß enthaltenen
Flüssigkeit zu verstehen ist. Bei diesen Verdünnungsraten liegt die Konzentration der gewählten Kohlenstoffquelle im
zugelieferten Kulturmedium bei 0,5 bis 5 $, vorzugsweise
1 bis 3 io (G-ewicht/Volumen), so daß die begrenzte Stationärkonzentration
im Kulturgefäß kleiner als etwa 0,1 mg/ml (vorzugsweise kleiner als 0,05 mg/ml) sein muß und unzureichend
für die bei höheren Konzentrationen mögliche Unterdrückung der Bildung von L-Asparaginase.
Nachfolgend werden einige Beispiele für kontinuierliche Kultiurverfahren gemäß der Erfindung beschrieben:
209822/0894
.β ei sj)iel 1
yjine ainzeikolonie von Erwinia carotovora (NCPPB 1066
S10) von einer Oxoid-Agarzählplatte (plate of Oxoid plate
count agar) wurde in 4 ml tryptische Fleischbrühe gebracht und 6 Stunden lang bei 37°G bebrütet. 1 ml dieser Kultur
wurde dann zu 100 ml 'Medium A" in einer konischen 500 ml
Piasehe hinzugefügt. Dieses Medium A hatte folgende Zusammensetzung:
NaH2PO4 | 100 | lillu" |
MH4Ol | 100 | mM |
KCl | 5 | mM |
Ma2SC. | 10 | DlM |
Zitronensäure | 2 | mM |
Zn2+ | 0,025 | ralvi |
Pe3+ | 0,1 | mM |
hn | 0,05 | mM |
Gu | 0,005 | mM |
Co | 0,01 | mivi |
B | 0,005 | mM |
-g | 1,25 | iiiM |
Ca | 0,1 | mM |
LiO | 0,01 | mM |
Glycerin | V/o ( | Gew./Vol.) |
pH - 7 |
Diese Suspension wurde 18 Stunden lang bei 37 G auf einem Drehschüttler bebrütet und darm in einen 3 1 "Portion
Fermenter" gegeben, wie er von Elsworth, Meakin, Pitt und Üapel, J. Appl-, Bact., 1956 _1_9 Seiten 262-278 beschrieben
wird. Der "Portion Fermenter" enthielt 3 1 eines Mediums
209822/0894
aus 50 g/l "Yeatex (light grade)" (Produkt der English G-rains
Co. Ltd.), 2 mM Zitronensäure und 1,5 $ (Gewo/Vol.) Glycerin.
Luft wurde mit 0,5 Vol/Vol/min zugeführt und die Fahrgeschwindigkeit
auf 1100 Upm festgesetzt. Die Kulturentwicklung
erfolgte 8 Stunden lang im Chargenbetrieb, wonach ein Durchflußbetrieb mit dem spezifizierten Medium für eine kontinuierliche
Kultur bei einem pH-Wert von 7,0 und einer
ο —1
Temperatur von 37 C sowie einer Verdünnungsrate von 0,14 h
aufgenommen wurde. Nach 7 Kulturtagen betrug die mittlere
I-Asparaginase-Produktion in den nachfolgenden 8 Tagen 178 ΙΕ/ml Kultur (mit einem IJaximum von 210 IE/inl und einem
kinimum von 14-3 ΙΕ/ml). Das mittlere Trockengewicht der Zellen
betrug 8,0 mg/ml.
Impfinasse wurde wie im vorstehenden Beispiel erzeugt und zu 900 ml Produktionsmedium in einem 1 1 "Portion irermenter"
gegeben (Das Produktionsmedium entsprach dem kedium A,
jedoch mit Verminderung von HaH2PO. auf 20 mK und Erhöhung
des Glyceringehalts auf 2 <$>
(G-ewo/Vol.). Luft wurde mit
0,5 Vol/Vol/min zugeführt und die Rührgeschwindigkeit auf 750 Upm festgesetzt.
Die Kultur wurde 9 1/2 Stunden lang chargenweise entwickelt und dann unter Durchflußbetrieb für eine kontinuierliche
Kultur bei einem pH-Wert von 7,0, einer Temperatur von 370C und einer Verdünnungsrate von 0,10 h~ gebracht,, Nach
40 Tagen lag die mittlere Produktion von L-Asparaginase in
den nachfolgenden 6 Tagen bei 113 ΙΕ/ml Kultur. (Das Maximum lag bei 119 ΙΕ/ml und das Minimum bei 105 IE/inl). Das mittlere
Trockengewicht der Zellen lag bei 8,2 mg/ml.
209822/089Λ
21S6339
.Beispiel 3
Eine kontinuierliche Kultur von Erwinia carotovora
(MJPPB 1066 S10) wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 eingerichtet unter Verwendung eines einfachen
Salzmediums (Medium A aber mit auf 20 mM vermindertem NaHp
und 1 io (Gewo/Vol.) einer gewählten Kohlenstoff quelle, die
durch Glycerin, Mannit oder Zitronensäure gebildet wurde). Kulturmedium mit der gleichen Zusammensetzung wurde kontinuierlich
zur Kultur hinzugegeben bei einer Verdünnungsrate von 0,2 h~ . Die Temper;
wurde bei 7,0 gehalten.
wurde bei 7,0 gehalten.
von 0,2 h . Die Temperatur lag bei 370C und der pH-Wert
Me Ergebnisse sind in der nachfolgenden Zusammenstellung wiedergegeben:
L-Asparaginase- Trockenge- Spezifische Kohlenstoff- gehalt wicht der Aktiviquelle
(IE/ml Kultur) Zellen (mg/ml) tat
Glycerin 84 4,0 30
Zitronensäure 38 2,1 26
Ilannit 10 4,2 3,4
.Beispiel 4
Die Wirkung unterschiedlicher Verdünnungsraten und Konzentrationen der Kohlenstoffquelle wurde bei kontinuierlicher
Kultur von Erwinia carotovora auf komplexen Medien wie in Beispiel 1 unter Anwendung von Glycerinkonzentrationen
in zwei Bereichen und von zwei Verdünnungsraten nachgewiesen. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielii
209822/0894
215B339
L-Asparaginasegehalt
KuItür- | 1 ,5/y Glycerin | 1 ,75/i Glycerin | ' Verdünnungs |
dauer | rate | ||
(Tage) | 2 IS/ml | 2 IE/ml | (h-1) |
1 - 4 | 197 IE/ml | 161 IE/ml | 0,28 |
5 | 128 IE/ml | 99 IE/ml | 0,15 |
6-10 | 104 Iü/ml | 80 IE/ml | Il |
11 - 15 | 100 IE/ml | 78 IE/ml | Il |
16 - 20 | H | ||
Wie man sieht, führt die hohe Verdünnungsrate von 0,28 zu einem Glycerinpegel in der Kultur, der das übersteigt, was
vollständig ausgenutzt werden kann, so daß die L-Asparaginase-Produktion
auf einen Bereich von 2 IE/ml Kultur herabgedrückt wird. Obgleich dieser I-Asparaginasegehalt relativ
gering ist, liegt er nicht sdestov/eniger in der gleichen Grössenordnung
wie bei einigen typischen bekannten Chargenkulturverfahren. So erhalten beispielsweise Peterson und Giegler
(Appo Microbiol. VoI, JjB, 1969) eine Ausbeute von 1,35 IE/ml
bei chargenweiser Kultur von Erwinia aroideae.
P Beispiel 5
Das Verfahren gemäß Beispiel 1 wurde wiederholt unter
Anwendung einer Konzentration einer gewählten Kohlenstoffquelle (Glucose anstelle von Glycerin)in einem Bereich von
1,5 i° (Gew./Vol.)· Der 1-Asparaginasegehalt und die spezifische
Aktivität der Kultur waren praktisch mit den nach Beispiel 1 erhaltenen identisch.
209822/0894
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde unter.Anwendung
einer hohen Verdünnungsrate von 0,254 und einem Crlycerinpegel
ill der ivultur und im kontinuierlich zugeführten Medium
von 1,5 fi (GeWo/Vol.) wiederholt, wobei die Stationärkonzentration
in der Kultur bei 0,01 mg/ml lag. Der Enzymgehalt lag bei 110 IE/ml.
2 0 9 8 2 2/0894
BAD ORIGINAL
Claims (1)
- 2Ί5Β339- ίο -Patentansprüche1. Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien der Genus Erwinia in kontinuierlicher Kultur mit begrenzter Stationärkonzentration einer gewählten Kohlenstoffquelle züchtet, die ein Kreb's-Zyklus-Zwisehenprodukt oder ein Präkursor eines solchen unter den Verfahrensbedingungen ist.2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoffquelle durch zumindest eine Verbindung aus der Gruppe Glycerin, Glucose, Zitronensäure oder öitrat, Milchsäure oder Lactat oder kannit gebildet wird.3> Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die begrenzte Stationärkonzentration der gewählten Kohlenstoffquelle in der Kultur bis zu etwa 0,1 mg/"ml und vorzugsweise bis zu etwa 0,05 mg/ml beträgt.4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die begrenzte Stationärkonzentration in der Kultur durch kontinuierliche Zufuhr von Kulturmedium erhalten wird, das zwischen etwa 0,5 und 5 i» (Gew./Vol.) der gewählten Kohlenstoffquelle bei einer Veraünnungsrate zwischen etwa 0,05 und 0,4 pro Stunde und insbesondere 1 bis 3 5* (Gewo/Vol.) der gewählten Kohlenstoffquelle bei einer Verdünnungsrate zwischen 0,1 und 0,3 pro Stunde enthält.5o Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der kontinuierlichen209822/0894Kultur zwischen etwa 5,5 und 8,0 und vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5 liegt.6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur zwischen etwa 20 und 400G und vorzugsweise zwischen 28 und 380C gehalten wird.7ο Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die gezüchteten Bakterien zur
Art der Brwinia carotovora gehören.,209822/089 4
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