DE2156339C3

DE2156339C3 - Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase

Info

Publication number: DE2156339C3
Application number: DE2156339A
Authority: DE
Inventors: Donald Sidney Winterslow Callow; Brian John Capel; Charles Gervase Thorngate Evans
Original assignee: UK Secretary of State for Social Services
Current assignee: UK Secretary of State for Social Services
Priority date: 1970-11-13
Filing date: 1971-11-12
Publication date: 1980-12-11
Also published as: IE35805B1; NL177502B; AT311286B; US3783102A; DE2156339A1; NL177502C; AU460436B2; DK128942B; DE2156339B2; JPS5543758B1; NL7115609A; CH569087A5; IE35805L; CA995610A; FR2117099A5; BE775286A; SE393815B; AU3569971A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase.

In der Deutschen Patentanmeldung P 19 42 833.2 vom 22.8.1969 wird die Isolierung von therapeutisch ■>> wirksamer L-Asparaginase aus Bakterienkulturen der Genus Erwinia, einer bekannten gegenüber Pflanzen pathogenen Gattung, beschrieben. Danach können die Bakterien auf oder in unterschiedlichen festen oder flüssigen Kulturmedien gezüchtet werden, sie sowohl 6ö chemisch einfach definierte Medien als auch komplexe Medien sein können, und es werden Beispiele angegeben, bei denen durch chargenweise Produktion von Erwinia in komplexen Medien L-Asparaginase-Ausbeuten von 8,2 ΙΕ/ml Kultur erhalten werden und μ über kontinuierliche Kulturen in komplexen Medien berichtet, die zu Ausbeuten von 24 ΙΕ/ml Kultur führen.

In der Deutschen Patentanmeldung P 20 31 759.3 vom 26.6.1970 wird ein Verfahren zur Erzielung höherer L-Asparaginase-Ausbeuten pro ml Kultur beschrieben, wonach dem Kulturmedium entweder bei chargenweiser oder kontinuierlicher Kultur wirksame Mengen von zumindest einer der Aminosäuren, Glutaminsäure, Serin, Threonin oder Asparaginsäure zugesetzt werden. Dabei werden Beispiele angegeben, nach denen L-Asparaginase-Ausbeuten von 44,5 ΙΕ/ml Kultur bei chargenweiser Züchtung und bis zu 80 ΙΕ/ml Kultur bei kontinuierlicher Züchtung erhalten wurden.

Es wurde nun festgestellt, daß unter ausgewählten Bedingungen für kontinuierliche Züchtung sogar noch höhere L-Asparaginase-Ausbeuten pro ml Kultur erhalten werden können. Eine solche Ai^beutesteigerung ist gerade im vorliegenden Falle außerordentlich interessant, da die Nachl'rage nach dem Enzym bei weitem seine derzeitige Verfügbarkeit Versteigt. L-Asparaginase wird für chemische Versuche zur Behandlung gewisser Typen von Leukämie und disseminiertem Karzinom verwendet

Das erfindungsgemäße Verfahren ist in den Ansprüchen definiert

Zu geeigneten Kohlenstoffquellen gr-hören Glycerin, Glucose, Mannit, Lactai und Citrat und andere Präkursoren, die zu Kreb's-Zyklus-Zwischenprodukten führen können. Glycerin oder Glucose werden dabei normalerweise als billige Kohlenstoffquellen, die gute L-Asparaginase-Ausbeuten liefern, bevorzugt Die Wirksamkeit der gewählten Kohlenstoffquellen in kontinuierlicher Kultur ist überraschend, da von diesen Materialien festgestellt wurde, daß sie bei chargenweiser Kultur eine variierende Hemmung der Enzymproduktion induzieren.

Die L-Asparaginase wird dann aus der Kultur durch irgendein geeignetes zellzerstörendes Verfahren und vorzugsweise nach der in der Deutschen Patentanmeldung P 19 42 900.6 vom 22.8.1969 vollständig beschriebenen Verfahrensweise extrahiert bzw. isoliert (dieses Verfahren umfaßt eine Zell-Lysis mit starkem Alkali).

Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann die nährende Kultur entweder auf einfachen Salzmedien basieren, bei denen die gewählte Kohlenstoffquelle praktisch allen für die Bakterien zur Verfügung stehenden Kohlenstoff bereitstellt oder durch ein komplexes Medium gebildet werden, bei dem die gewählte Kohlenstoffquelle andere bereits im Medium vorhandene Kohlenstoffquellen ergänzen kann.

Obgleich eine Mischung von zwei oder mehreren der gewählten Kohlenstoffqudlen enthaltene Nährmedium beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, wird bevorzugt, daß für die bakterielle Kultur in irgendeinem besonderen Stadium der kontinuierlichen Züchtung nur eine der gewählten Kohlenstoffquellen verfügbar ist.

Die erfindungsgemäße Verfahrensweise kann bei allen Bakterien der Genus Erwinia angewandt werden und insbesonere bei solchen Stämmen, wie sie in der bereits oben genannten Patentanmeldung P 19 42 833.2 vom 22,8.1969 angegeben werden. Besonders zweckmäßig ist die Anwendung eines Stammes von Erwinia carotovora, der beim National Collection of Plant Pathogenic Bacteria, England unter NCPPB 1066 niedergelegt ist und zu einer hohen spezifischen Aktivität führt, d. h. einem hohen Verhältnis von Enzymaktivität zu mg erzeugtem Protein.

Kontinuierliche Baktericnkulturverfahren gemäß der Erfindung werden normalerweise bei pH-Werten zwischen 5,5 und 8,0, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5

und Temperaturen von 20 bis 40⁰C, vorzugsweise 28 bis 38° C, durchgeführt Die Verdünnungsrate liegt üblicherweise bsi 0,05 bis 0,4, vorzugsweise bei 0,1 bis 0,3, wobei unter der Verdünnungsrpte das Verhältnis der durch das Kulturgefäß pro Stunde geleiteten Flüssigkeitsmenge zum Volumen der im Kulturgefäß enthaltenen Flüssigkeit zu verstehen ist Bei diesen Verdünnungsraten liegt die Konzentration der gewählten Kohlenstoffquelle im zugelieferten Kulturmedium bei 0,5 bis 5%, vorzugsweise 1 bis 3% (Gewicht/Volumen), so daß die begrenzte Stationärkonzentration im Kulturgefäß kleiner als etwa 0,1 mg/ml (vorzugsweise kleiner als 0,05 mg/ml) sein muß und unzureichend für die bei höheren Konzentrationen mögliche Unterdrückung der Bildung von L-Asparaginase.

Nachfolgend werden einige Beispiele für kontinuierliche Kulturverfahren gemäß der Erfindung beschrieben:

Beispiel 1

Eine Einzelkoloo»« von Erwinia carotovora (NCPPB 1066 S 10) von einer Oxoid-Agarzähiplatte (plate of Oxoid plate count agar) wurde in 4 ml tryptische Fleischbrühe gebracht und 6 Stunden lang bei 37° C bebrütet 1 ml dieser Kultur wurde dann zu 100 ml »Medium A« in einer konischen 500 ml-Flasche hinzugefügt Dieses Medium A hatte 'olgende Zusammensetzung:

NaH₂PO₄	10OmM
NH₄Cl	10OmM
KCl	5mM
Na₂SO₄	1OmM
Zitronensäure	2mM
Zn*+	WC5 mM
Fe³+	0,1 mM
Mn	0,05 mM
Cu	0,005 mM
Co	0,01 mM
B	0,005 mM
Mg	1,25 mM
Ca	0,ImM
Mo	0,01 mM
Glycerin	1% (Gew/Vol.)
pH -7

Zitronensäure und 1,5% (Gew/Vol.) Glycerin. Luft wurde mit 0,5 Vol/VoI/min zugeführt und die Rührgeschwindigkeit auf 1 i00 Upm festgesetzt Die Kulturentwicklung erfolgte 8 Stunden lang im Chargenbetrieb, wonach ein DurchfluDbetrieb mit dem spezifizierten Medium für eine kontinuierliche Kultur bei einem pH-Wert von 7,0 und einer Temperatur von 37° C sowie einer Verdünnungsrate von 0,14 h-' aufgenommen wurde. Nach 7 Kulturtagen betrug die mittlere L-Asparaginase-Produktion in den nachfolgenden 8 Tagen 178 IE/ml Kultur (mit einem Maximum von 210 ΙΕ/ml und einem Minimum von 143 ΙΕ/ml). Das mittlere Trockengewicht der Zellen betrug 8,0 mg/ml.

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Beispiel 2

Impfmasse wurde wie im vorstehenden Beispiel erzeugt und zu 900 ml Produktionsmedium in einem 1 I »Portion Fermenter« gegeben. (Das Produktionsmedium entsprach dem Medium A, jedoch mit Verminderung von NaH₂PO₄ auf 20 mH und Erhöhung des Giyceringehalts auf 2% (Gew/Vol.). Luft wurde mit 0,5 Vol/Vol/min zugeführt und die Rührgeschwindigkeit auf 750 Upm festgesetzt

Die Kultur wurde 9'/?. Stunden lang chargenweise entwickelt und dann unter Durchflußbetrieb für eine kontinuierliche Kultur bei einem pH-Wert von 7,0, einer Temperatur von 37° C und einer Verdünnungsrate von 0,10 h-' gebracht Nech 40 Tagen lag die mittlere Produktion von L-Asparaginase in den nachfolgenden 6 Tagen bei 113 ΙΕ/ml Kultur. (Das Maximum lag bei 119 ΙΕ/ml und das Minimum bei 105 ΙΕ/ml.) Das mittlere Trockengewicht der Zellen lag bei 8,2 mg/ml.

Diese Suspension wurde 18 Stunden lang bei 37°C auf einem Drehschüttler bebrütet und dann in einen 31 »Portion Fermenter« gegeben, wie er von Elsworth, Meakin, Pitt und Capel, J. Appl. Bact, 1956, 19, Seiten 262 — 278, beschrieben wird. Der »Portion Fermenter« enthielt 31 eines Mediums aus 50 g/l »Yeatex (light grade)« (Produkt der English Grains Co. Ltd.), 2 mM

Beispiel 3

Eine kontinuierliche Kultur von Erwinia carotovora (NCPPB 1066 S 10) wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 eingerichtet unter Verwendung eines einfachen Salzmediums (Medium A aber mit auf 20 mM vermindertem NaH₂PO₄ und 1% (Gew/Vol.) einer gewählten Kohlenstoffquelle, die durch Glycerin, Mannit oder Zitronensäure gebildet wurde). Kulturmedium mit der gleichen Zusammensetzung wurde kontinuierlich zur Kultur hinzugegeben bei einer Verdünnungsrate von 02 h-'. Die Temperatur lag bei 37°C und der pH-Wert wurde bei 7,0 gehalten.

Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Zusammenstellung wiedergegeben:

KohlenstolTquelle

L-Asparaginascgehall

(IE/ml Kultur)

Trockengewicht der der Zellen

(mg/ml)

Spezifische Aktivität

Glycerin

Zitronensäure

Mannit

84
38
10

4,0

2,1
4,2

30
26
3,4

Beispiel 4

Die Wirkung unterschiedlicher Verdünnungsraten und Konzentrationen der Kohlenstoffquelle wurde bei kontinuierlicher Kultur von Erwinia carotovora auf komplexen Medien wie in Beispiel 1 unter Anwendung von Glycerinkonzentrationen in zwei Bereichen und von zwei Verdünnungsraten nachgewiesen. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt:

L-Asparaginasegehalt

Kulturdauer 1,5% 1,75% Verdünnungs-

Glycerin Glycerin rate

(Tage) (h-1)

1 - 4	2	IE/ml	2	IE/ml	0,28
5	197	IE/ml	161	IE/ml	0,15
6-10	128	IE/ml	99	IE/nl '	0,15
11-15	104	IE/ml	80	IE/ml	0,15
16-20	100	IE/ml	78	IE/ml	0,15

Wie man sieht, führt die hohe Verdünnungsrate von 0,28 zu einem Glycerinpegel in der Kultur, der das übersteigt, was vollständig ausgenutzt werden kann, so daß die L-Asparaginase-Produktion auf einen Bereich von 2 IE/ml Kultur herabgedrückt wird. Obgleich dieser L-Asparaginasegehalt relativ gering ist, liegt er nichtsdestoweniger in der gleichen Größenordnung wie

bei einigen typischen bekannten Chargenkulturverfahren. So erhalten beispielsweise Peterson und Ciegler (App, Microbiol. VoI 18, 1969) eine Ausbeute von ί,35 IE/ml bei chargenweiser Kultur von Erwinia aroideae,

Beispiel 5

Das Verfahren gemäß Beispiel 1 wurde wiederholt •unter Anwendung einer Konzentration einer gewählten Kohlenstoffquelle (Glucose anstelle von Glycerin) in einem Bereich von 1,5% (Gew/VoL). Der L-Asparaginasegehalt und die spezifische Aktivität der Kultur waren praktisch mit den nach Beispiel 1 erhaltenen identisch.

Beispiel 6

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde unter Anwendung einer hohen Verdünnungsrate von 0,254 und einem Glycerinpegel in der Kultur und im kontinuierlich zugeführien Medium von 1,5% (Gew/VoL) wiederholt, wobei die Stationärkonzentration >::, der Kultur bei 0,01 mg/mi iag. Der Enzymgehall lag bei 110 IE/ml.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginase durch kontinuierliche Kultivierung von Bakterien der Gattung Erwinia, dadurch gekennzeichnet, daß der Kultur als Kohlenstoffquelle ein Zwischenprodukt des Krebs-Zyklus oder ein Vorläufer davon unter den Verfahrensbedingungen in einer begrenzten, quasistationären Konzentration von bis zu 0,1 mg/ml zugesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoffquelle Glycerin verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoffquelle Glucose verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoffquelle Citronensäure, ein Citrat oder Mannit verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoffquelle in einer Konzentration von bis zu 0,05 mg/ml eingesetzt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die begrenzte quasistationäre Konzentralion der Kohlenstoffquelle in der Kultur durch kontinuierliche Zufuhr von Kulturmedium, das etwa 0,5 bis 5% (G/V) Kohlenstoffquelle enthält, bei einer Verdünnungsrate von etwa 0,05 bis 0,4 pro Stunde erhalten wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das zugeführte Kulturmedium 1 bis 3% (G/V) Kohlenstoffquelle enthält und die Verdünnungsrate 0,1 bis 03 pro Stunde beträgt κ

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der kontinuierlichen Kultur etwa 5,5 bis 8,0 und vorzugsweise 6,5 bis 7,5 beträgt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, -to dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur auf etwa 20 bis 40⁰C und vorzugsweise 28 bis 38° C gehalten wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Bakterien die Species Erwinia carotovora verwendet wird.