CN114081189A

CN114081189A - 黑曲霉菌株酶制剂提高豌豆膳食纤维纯度的方法

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Publication number: CN114081189A
Application number: CN202111174189.2A
Authority: CN
Inventors: 孙凤丹; 张涛
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2021-10-09
Filing date: 2021-10-09
Publication date: 2022-02-25
Anticipated expiration: 2041-10-09
Also published as: CN114081189B

Abstract

本发明属于发酵工程与酶工程的生物技术领域。本发明提供了一种黑曲霉菌株酶制剂提高豌豆膳食纤维纯度的方法，包括如下步骤：(1)制备黑曲霉菌株酶制剂；(2)按照质量比10:0.5‑3:87‑89.5将豌豆膳食纤维、黑曲霉菌株酶制剂和水配置成悬浊液；(3)酶解2‑3h，酶解结束高温灭酶10min；(4)压滤、水洗、干燥得高纯度豌豆膳食纤维。本发明提高了豌豆加工行业副产物膳食纤维的纯度，有效的降低杂质含量，对膳食纤维质量改善效果明显。

Description

黑曲霉菌株酶制剂提高豌豆膳食纤维纯度的方法

技术领域

本发明属于发酵工程与酶工程的生物技术领域。

背景技术

黑曲霉是一种产酶的常见丝状真菌，对营养要求较低，只要培养基中含有碳源、氮源及磷、镁、钾、硫等元素就能生长。黑曲霉是被美国FDA批准的，可用于食品工业生产的安全菌株，可生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等的重要酶制剂法的生产菌株。黑曲霉生产的酶制剂具有用量大、应用范围广、安全性好的特点，已愈来愈受到重视。

豌豆的营养成分以淀粉、蛋白及纤维为主，目前豌豆淀粉、蛋白资源得到充分利用，而具有重要营养和经济价值的纤维资源浪费严重。豌豆纤维具有良好的持水性、乳化性及增稠性，能提高食品保水性、融化稳定性等，广泛应用于肉制品、速冻食品、糖果饮料及米面制品等；作为一种功能性食品，豌豆纤维有助于预防肥胖、防止结肠癌、心脏病等多种疾病。

膳食纤维是指能抗人体小肠消化吸收的、而在人体大肠能部分或者全部发酵的、可食用的植物性成分，化学本质是碳水化合物及其相类似物质，按溶解性分为水溶性膳食纤维和水不溶性膳食纤维两大类。豌豆不溶性膳食纤维是豌豆加工行业的副产物，产品质量不太稳定，市场需求标准一般≥70％，其主要杂质为豌豆淀粉(20-25％)和豌豆蛋白(8-15％)，为降低膳食纤维中杂质含量，可以添加适量的黑曲霉发酵制备酶制剂，提高膳食纤维的总体质量。

发明内容

本发明的目的是应用黑曲霉发酵制备酶制剂提高豌豆膳食纤维纯度的方法，克服现有豌豆行业副产品膳食纤维纯度低的技术问题，该方法黑曲霉液体发酵稳定高产酶制剂，并提高膳食纤维的纯度，该方法简单易行、成本低且纯度提高明显。

本发明提供的产酶制剂的黑曲霉菌株，菌株保藏号为CGMCC NO.3.316，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该菌株发酵培养得到以淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等多种酶混合的酶制剂，适当浓缩纯化酶解膳食纤维中淀粉、蛋白等杂质，膳食纤维洗涤干燥即得纯化的产品。

本发明的目的是通过以下技术方案实现目标：黑曲霉菌株酶制剂提高豌豆膳食纤维纯度的方法，包括如下步骤：(1)制备黑曲霉菌株酶制剂；(2)按照质量比10:0.5-3:87-89.5将豌豆粗膳食纤维、黑曲霉菌株酶制剂和水配置成悬浊液；(3) 酶解2-3h，酶解结束高温灭酶10min；(4)压滤、水洗、干燥得高纯度豌豆膳食纤维。

在本发明的具体实施例中，所述酶解的条件为：温度55-60℃、ph4.5-5.5、150rpm。

在本发明的具体实施例中，所述制备黑曲霉菌株酶制剂的方法包括：(1)将保藏的黑曲霉菌株活化得活化斜面；(2)将活化斜面制得种子培养液；(3)将种子培养液发酵制得发酵液；(4)将发酵液制得黑曲霉菌株酶制剂。

在本发明的具体实施例中，所述将保藏的黑曲霉菌株活化得活化斜面的方法为：在无菌条件下，将保藏的黑曲霉菌株接于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基， 25-30℃培养3-4天，获得活化斜面。

在本发明的具体实施例中，所述将活化斜面制得种子培养液的方法为：用无菌水冲洗已活化斜面，稀释孢子悬液至10⁶-10⁸个/mL后，加入玻璃珠分散均匀；在500mL锥形瓶中装入100mL察氏培养基，将孢子悬液以体积比为5％-10％的量接种于察氏培养基，25℃-30℃，转速150rpm培养1-2天，获得种子培养液。

在本发明的具体实施例中，所述将种子培养液发酵制得发酵液的方法包括：摇瓶种子培养液按照接种量体积比为5％-10％的量接入发酵培养基，恒温25℃ -30℃，通风1-3vvm，控制转速100-450rpm，利用碱液补料控制发酵液pH4.5-6.0，发酵65-70h，获得发酵液。

在本发明的具体实施例中，所述将发酵液制得黑曲霉菌株酶制剂的方法包括：(1)将发酵液用板框压滤得到除去菌丝体的澄清粗酶液，10K超滤膜低温浓缩至原体积1/20-1/10倍，并加水清洗浓缩液中色素、盐、及代谢产物，获得浓缩液；(2)将浓缩液低温离心去除不溶物，获得澄清浓缩液；(3)往澄清浓缩液加入稳定剂、防腐剂，获得黑曲霉菌株酶制剂。

在本发明的具体实施例中，所述稳定剂为甘油。

在本发明的具体实施例中，所述防腐剂为对羟基苯甲酸丙酯0.1g/L、山梨酸钾1g/L和NaCl 0.2g/L。

在本发明的具体实施例中，压滤、水洗、干燥得高纯度豌豆膳食纤维的方法包括：(1)酶解液板框压滤除去水相，添加8-10倍水混合均匀，温度25℃-50℃，调节pH至8-9，水洗30min，压滤；(2)再添加8-10倍水混合均匀，调节pH 至7.0，水洗30min，压滤；干燥，粉碎，即得产品。

本发明以豌豆淀粉或/和蛋白质的主要副产品为原料，生产出高纯的膳食纤维，提高了豌豆利用率，解决了膳食纤维的亟待解决的纯度问题。

附图说明

图1黑曲霉菌株平板菌落形态图。

图2酶解pH对酶解反应的影响图。

图3酶解温度对酶解反应的影响图。

图4膳食纤维纯化产品图。

具体实施方式

结合具体的实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明优选实施方式，不是对本发明的限定。

淀粉酶是能分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、糖化酶及葡萄糖苷酶等，它们相互独立各司其职，形成一个综合的分解淀粉的酶系。淀粉酶是一种诱导霉，只有在底物存在时才生成，黑曲霉分泌的淀粉酶降解淀粉成葡萄糖作为碳源，为其生长代谢提供基础的物质。

淀粉酶活力：1ml液体酶，于60℃、pH4.5条件下，1min生成1μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位，即1U＝1μmol/min。

淀粉酶活性测定方法：将可溶性淀粉加热溶解后，加入乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH4.5)配制成10mg/ml可溶性淀粉溶液。取5ml可溶性淀粉溶液至于15ml 具塞试管中，置于60℃恒温水浴锅中预热5min，加入稀释酶液0.5mL，准确加热30min后，沸水浴中煮沸5min，取出，冷却至室温，试管溶液转入至100ml 容量瓶中，冲洗试管三次，所有液体混合蒸馏水定容至100ml，摇匀。少量上清液离心，取25μl至全自动生化分析仪中，测定葡萄糖浓度，计算淀粉酶酶活。

蛋白酶能切断蛋白质分子内部的肽键，使蛋白质分子变成小分子多肽和氨基酸的酶。

蛋白酶活性定义：1ml液体酶，于40℃、pH3.0条件下，1min水解酪蛋白释放1μg酪氨酸即为1个酶活力单位，即1U＝1μg/min。

蛋白酶活性测定方法：称取一定量标准酪蛋白加入缓冲液(pH3.0乳酸-乳酸钠)，沸水浴中加热煮沸30min，并不时搅拌至全部溶解，配置成10g/L酪蛋白溶液。每次吸取稀释酶液1mL，分别加入到2个试管中，其中一个为空白对照。吸取酪蛋白溶液1ml，加入到1个试管，酶液和底物在40℃预热2min，精确保温10min，然后加入0.4M的三氯乙酸2mL，终止酶反应，溶液出现混浊，静止 10min，用慢速定性滤纸过滤。取过滤液1mL，加入0.4M碳酸钠5mL。再加入 Folin试剂1mL，40℃保温显色20min。在680nm波长测定其吸光值。空白处理：在酶液中先加入0.4M的三氯乙酸，磁力震荡5S，再加入1mL底物溶液，40℃保温10min，其余操作与样品处理相同。

实施例1

1、菌种活化

在无菌条件下，将保藏的黑曲霉菌株，菌株保藏号为CGMCC NO.3.316，该菌株购买于中国普通微生物保藏管理中心，该菌株保藏编号为NO.3.316，拉丁学名为Aspergillusniger，中文译名为黑曲霉，原始编号为黄海316，保藏时间为1952年1月1日，将该菌株接于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面培养基，25-30℃培养箱培养3-4天，待长出黑色成熟孢子后如附图1，获得活化斜面，冰箱4℃保存。

所述的黑曲霉菌株是一株产酶制剂的黑曲霉菌株，菌株保藏号为CGMCCNO.3.316，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

所述PDA斜面培养基配制方式如下：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水煮沸20-30min，纱布过滤，滤液加20g葡萄糖和15-20g琼脂充分溶解后，补足水分至1L，趁热分装试管，加塞、包扎，121℃灭菌20min左右取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。

2、种子培养液

用无菌水冲洗已活化斜面，稀释孢子悬液至10⁶-10⁸个/mL后，加入玻璃珠分散均匀；在500mL锥形瓶中装入100mL察氏培养基，将孢子悬液以5％-10％ (v/v)接种于察氏培养基，25℃-30℃，转速150rpm培养1-2天，获得种子培养液。

所述察氏培养基成分(g/L)及配制方式如下：蔗糖30，硝酸钠3，磷酸氢二钾1，硫酸镁0.5，氯化钾0.5，硫酸亚铁0.01，蒸馏水1000mL，加热溶解，分装后121℃灭菌20min。

3、发酵液

摇瓶种子培养液按照接种量体积比为5％-10％(v/v)的量接入发酵培养基，依据表1和表2对发酵培养基碳源、氮源添加量进行调整，依据发酵液酶活性和使用效果确定氮源豆粕1％质量体积比(w/v)和碳源豌豆淀粉2.5％质量体积比 (w/v)满足工艺需求，无机盐离子浓度、种类不变，恒温25℃-30℃，根据生长情况控制转速100-450rpm和通风1-3vvm，利用碱液补料控制发酵液pH5.0，发酵周期65h-70h，获得发酵液。

所述发酵培养基成分(g/L)及配制方式如下：淀粉15-40，豆粕5-30，磷酸氢二钾0.5，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，氯化钾0.5，硫酸亚铁0.01，加热溶解，装罐后121℃灭菌30min。

对发酵液中的酶活性进行检测，结果见表1和表2。

表1不同碳源对酶活性的影响，氮源豆粕1％。

表2不同氮源对酶活性的影响，碳源豌豆淀粉2.5％。

综合评估原料的来源、成本、颜色、效果，选择豌豆淀粉作为碳源，选择豆粕作为氮源，发酵65h左右，淀粉酶活性基本达到5.0-7.0U/ml范围，蛋白酶活力大于100U/mL。

3、酶制剂的制备

将发酵液用板框压滤得到除去菌丝体的澄清粗酶液，10K超滤膜低温浓缩至原体积1/20-1/10倍，并加水清洗浓缩液中色素、盐、及代谢产物，获得浓缩液；将浓缩液低温离心去除不溶物，获得澄清浓缩液；往澄清浓缩液加入稳定剂、防腐剂，获得黑曲霉菌株酶制剂，低温保存。

所述稳定剂为甘油，加入量为10-20％(m/v)，所述防腐剂为对羟基苯甲酸丙酯0.1g/L、山梨酸钾1.0g/L和NaCl 0.2g/L。

4、膳食纤维的酶解反应条件优化

将生产线获得的粗豌豆膳食纤维折干重，按照膳食纤维：黑曲霉菌株酶制剂：水＝10:1:89质量比配置成悬浊液，温度40-70℃，pH3.0-7.0，转速100-200rpm，酶解2h，酶解后高温灭酶10min。

淀粉水解产物是葡萄糖，因此杂质淀粉水解程度可以用酶解液中葡萄糖的含量作为评估酶水解进度的快速分析指标，葡萄糖含量越高说明淀粉水解的程度越高，葡萄糖含量不变说明淀粉水解基本结束。

蛋白酶酶解产物是氨基酸，氨基酸快速准确的测定依靠液相或者其它复杂的分析手段，难以作为酶解过程的依据。

酶解pH对酶解反应的影响，添加等量酶液的悬浊液分别在pH3.0、pH4.0、 pH5.0、pH6.0和pH7.0的缓冲液中加热酶解反应，考察不同酶解pH对酶解液中葡萄糖含量的影响，结果如表3和附图2。

表3酶解液在不同pH、不同时间点葡萄糖含量(g)

由表3和附图2知，pH4-5葡萄糖含量最高，pH＞6或者pH＜3酶解液中葡萄糖含量显著降低，40min内pH5.0葡萄糖含量达到最大，继续延长酶解反应时间，酶解过程反应速度随着反应时间的延长降低，淀粉酶解反应2h，pH5.0为最适pH。

酶解温度对酶解反应的影响，添加等量酶液的的悬浊液分别在40℃、50℃、 60℃和70℃的水浴摇床中进行酶解反应，考察不同酶解温度对酶解液中葡萄糖含量的影响，结果如表4和附图3。

表4酶解液在不同温度、不同时间点葡萄糖含量(g)

由表4和附图3知，在40-60℃范围内，随着反应温度的增加，酶解液中葡萄糖含量逐渐增加，温度继续增加含量稍有降低；适当延长酶解时间，可以增加淀粉的酶解程度，不过第2h酶解效果基本只能达到第1h酶解效果的30％左右，原因是随着淀粉的水解，淀粉含量越来越低，不能够充分和酶发生酶促反应。综上，60℃是淀粉酶解的最适温度。

实施例2：膳食纤维的纯化

样品1制备：将生产线获得粗豌豆膳食纤维折干重，按照豌豆膳食纤维：黑曲霉菌株酶制剂：水＝10:0.5:89.5质量比配置成悬浊液，温度55℃、ph5.5、150rpm 条件下酶解2h，酶解结束高温灭酶10min。

将酶解悬浊液板框压滤除去水相，添加10倍水混合均匀，调节pH至8.0，常温水洗30min，压滤；再添加10倍水混合均匀，调节pH至7.0，常温水洗30min，压滤；干燥，粉碎，测定，结果如表5。

样品2制备：将生产线获得粗豌豆膳食纤维折干重，按照豌豆膳食纤维：黑曲霉菌株酶制剂：水＝10:3:87质量比配置成悬浊液，温度60℃、ph4.5、150rpm 条件下酶解3h，酶解结束高温灭酶10min。

将酶解悬浊液板框压滤除去水相，添加8倍水混合均匀，调节pH至9.0， 50℃水洗30min，压滤；再添加8倍水混合均匀，调节pH至7.0，50℃水洗30min，压滤；干燥，粉碎，测定，结果如表5。

以未做任何处理的粗膳食纤维为对照，处理后纯化的膳食纤维如附图4。

表5样品主要营养成分的干基含量

项目	测试方法	对照	样品1	样品2
					水分，％	GB/T5009.3	7.65	4.21	4.56
蛋白质(干基)，％	GB/T5009.5	12.9	10.97	7.56
					淀粉(干基)，％	GB/T5009.9	24.3	7.4	5.0
膳食纤维(干基)，％	GB/T5009.88	61.41	82.91	89.83
					吸水性g/g	企业标准	3.5	5.4	5.7

本发明以豌豆生产副产品粗膳食纤维为原料，将黑曲霉液体发酵制备的酶制剂应用到除杂过程，酶解处理后膳食纤维纯度增加20％-30％，功能性重要指标吸水性提高50％-60％左右，为高纯度膳食纤维的开发提供新方法。

本方法有以下优势：

本发明解决的第一个问题是提供一种黑曲霉发酵制备酶制剂，该菌株生产酶制剂活性高，生产原料主要是农副产品廉价易得，易于实现产业化。

本发明解决的第二个问题是将黑曲霉制备的酶制剂经过适当的浓缩纯化应用于豌豆加工行业副产物膳食纤维提纯上，有效的降低杂质含量，对膳食纤维质量改善效果明显。

Claims

1.黑曲霉菌株酶制剂提高豌豆膳食纤维纯度的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备黑曲霉菌株酶制剂；

(2)按照质量比10:0.5-3:87-89.5将豌豆膳食纤维、黑曲霉菌株酶制剂和水配置成悬浊液；

(3)酶解2-3h，酶解结束高温灭酶10min；

(4)压滤、水洗、干燥得高纯度豌豆膳食纤维。

2.依据权利要求1所述黑曲霉菌株酶制剂提高豌豆膳食纤维纯度的方法，其特征在于，所述酶解的条件为：温度55-60℃、ph4.5-5.5、150rpm。

3.依据权利要求1所述黑曲霉菌株酶制剂提高豌豆膳食纤维纯度的方法，其特征在于，所述制备黑曲霉菌株酶制剂的方法包括：

(1)将保藏的黑曲霉菌株活化得活化斜面；

(2)将活化斜面制得种子培养液；

(3)将种子培养液发酵制得发酵液；

(4)将发酵液制得黑曲霉菌株酶制剂。

4.依据权利要求3所述黑曲霉菌株酶制剂提高豌豆膳食纤维纯度的方法，其特征在于，所述将保藏的黑曲霉菌株活化得活化斜面的方法为：

在无菌条件下，将保藏的黑曲霉菌株接于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，25-30℃培养3-4天，获得活化斜面。

5.依据权利要求3所述黑曲霉菌株酶制剂提高豌豆膳食纤维纯度的方法，其特征在于，所述将活化斜面制得种子培养液的方法为：

用无菌水冲洗已活化斜面，稀释孢子悬液至10⁶-10⁸个/mL后，加入玻璃珠分散均匀；

在500mL锥形瓶中装入100mL察氏培养基，将孢子悬液以体积比为5％-10％的量接种于察氏培养基，25℃-30℃，转速150rpm-200rpm培养1-2天，获得种子培养液。

6.依据权利要求3所述黑曲霉菌株酶制剂提高豌豆膳食纤维纯度的方法，其特征在于，所述将种子培养液发酵制得发酵液的方法包括：

摇瓶种子培养液按照接种量体积比为5-10％的量接入发酵培养基，按照发酵液酶活性和使用效果确定质量体积比加入1％的豆粕和2.5％的豌豆淀粉满足工艺需求，恒温25-30℃，控制转速100-450rpm，通风1-3vvm，利用碱液补料控制发酵液pH4.5-6.0，发酵65-70h，获得发酵液。

7.依据权利要求3所述黑曲霉菌株酶制剂提高豌豆膳食纤维纯度的方法，其特征在于，所述将发酵液制得黑曲霉菌株酶制剂的方法包括：

(1)将发酵液用板框压滤得到除去菌丝体的澄清粗酶液，10K超滤膜低温浓缩至原体积1/20-1/10倍，并加水清洗浓缩液中色素、盐、及代谢产物，获得浓缩液；

(2)将浓缩液低温离心去除不溶物，获得澄清浓缩液；

(3)往澄清浓缩液加入稳定剂、防腐剂，获得黑曲霉菌株酶制剂。

8.依据权利要求7所述黑曲霉菌株酶制剂提高豌豆膳食纤维纯度的方法，其特征在于，所述稳定剂为甘油。

9.依据权利要求7所述黑曲霉菌株酶制剂提高豌豆膳食纤维纯度的方法，其特征在于，所述防腐剂为羟基苯甲酸丙酯0.1g/L、山梨酸钾1.0g/L和NaCl0.2g/L。

10.依据权利要求1所述黑曲霉菌株酶制剂提高豌豆膳食纤维纯度的方法，其特征在于，所述压滤、水洗、干燥得高纯度豌豆膳食纤维的方法包括：

(1)酶解液板框压滤除去水相，添加8-10倍水混合均匀，温度25℃-50℃，调节pH至8-9，水洗30min，压滤；

(2)再添加8-10倍水混合均匀，调节pH至7.0，水洗30min，压滤；干燥，粉碎，即得产品。