CN116042427A - 一种长双歧杆菌及其筛选方法和二裂酵母发酵产物溶胞物的制备方法 - Google Patents
一种长双歧杆菌及其筛选方法和二裂酵母发酵产物溶胞物的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种长双歧杆菌，其特征在于，所述长双歧杆菌具有细胞修复、缓解炎症作用，所述长双歧杆菌为长双歧杆菌Bifidobacterium longum，株号Di4，于2021年8月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.23160。本发明还公开了该长双歧杆菌的筛选方法和二裂酵母发酵产物溶胞物的制备方法。本发明的长双歧杆菌对氧气不敏感，可以在有氧条件下生长，所述二裂酵母发酵产物溶胞物具有良好的皮肤修复、缓解炎症功能。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体而言，涉及一种长双歧杆菌及其筛选方法和二裂酵母发酵产物溶胞物的制备方法。
背景技术
皮肤是人体的第一道生理屏障，健康的皮肤能够抵御外界污染、刺激、损伤和日光侵害，同时还具有保湿及调节作用。然而，由于生活环境、饮食作息习惯和护肤方式等原因，皮肤屏障极易受损，使得皮肤自身防御能力不足进而导致皮肤出现肌肤屏障受损、锁水能力下降、水油平衡被打破，更容易产生过敏、发红、发痒、脱皮、发炎爆痘冒粉刺、细纹皱纹增多、皮肤暗沉等一系列皮肤问题。
双歧杆菌是一种重要的肠道有益微生物，在母乳喂养儿肠道内大量存在，双歧杆菌作为一种生理性有益菌，对人体健康具有生物屏障、营养作用、抗肿瘤作用、免疫增强作用、改善胃肠道功能、抗衰老等多种重要的生理功能。
二裂酵母发酵产物溶胞物(Bifida Ferment Lysate)，是经长双歧杆菌发酵后处理得到的生理溶胞产物，主要成分为细胞代谢产物、胞质片段、多糖、蛋白质、核酸与多肽等。大量的体外实验证实了二裂酵母发酵产物中的多种氨基酸、蛋白质和各类分子介质具有调节平衡肌肤、调节免疫机能的功效，也同样是人类皮肤细胞的重要组成成分及营养分子；多糖、维生素等分子及长双歧杆菌胞质代谢物具有一定的保湿、抗氧化、抗衰老作用，并能够防止紫外线等外源刺激的损害，促进损伤DNA的修复。二裂酵母发酵产物溶胞物，会产生包括维他命群、矿物质、氨基酸等有益护肤的小分子，是一种只用于护肤的优质酵母精华。其可以加强角质层的代谢，还能捕获自由基，抑制脂质的过氧化，具有美白、抗衰老的功能。其中富含的营养物质，有滋养皮肤的功能。这些优势使得二裂酵母发酵产物广泛应用于护肤产品中以改善肤质，具有极大的市场前景。
目前市场上利用发酵技术生产的化妆品有很多，其中比较有代表性的品牌有雅诗兰黛小棕瓶、SK-Ⅱ神仙水、海蓝之谜等，因具有上述独特的优势，这类发酵化妆品已经成为继天然植物提取化妆品后的又一大市场发展的新方向。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种长双歧杆菌及其筛选方法和二裂酵母发酵产物溶胞物的制备方法。本发明所述的长双歧杆菌对氧气不敏感，可以在有氧条件下生长，所述二裂酵母发酵产物溶胞物具有良好的皮肤修复、缓解炎症功能。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明的一个方面提供了一种长双歧杆菌，所述长双歧杆菌具有细胞修复、缓解炎症作用，所述长双歧杆菌为长双歧杆菌Bifidobacterium longum，株号Di4，于2021年8月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.23160。
本发明的目的及解决其技术问题还通过采用以下技术方案来实现。
本发明的另一个方面提供了一种筛选长双歧杆菌的方法，该方法包括以下步骤：
S1：样品采集，将样品经溶解和梯度稀释后加入到灭菌的平板中；
S2：配置样品培养基；
S3：将上述样品培养基倒入所述平板中混合，厌氧培养，挑选平板上菌落长势较好的菌株，进行基因序列比对，确定菌株类别，筛选出具有过氧化氢耐受性的长双歧杆菌；
S4：将验证为长双歧杆菌的菌株在MRS固体培养基上划线，挑单克隆，进行基因序列比对，确保是长双歧杆菌后再重复以上划线步骤，直至得到无杂菌的单一长双歧杆菌。
S5：将上述得到的单一长双歧杆菌接到MRS液体培养基中，有氧培养，挑选其中长势最好的长双歧杆菌，备用。
优选地，步骤S1中所述样品采集自健康婴儿粪便。
优选地，步骤S2中所述样品培养基按照如下方法制备：向50-50℃的MRS培养基加入过氧化氢溶液，使培养基中起始的过氧化氢浓度为0.5mmol/L，即得到样品培养基。
优选地，所述MRS培养基为：蛋白胨0.8-2％，牛肉膏0.5-2％，酵母膏0.25-0.8％，葡萄糖1.5-3％，柠檬酸胺0.1-0.3％，乙酸钠0.25-0.75％，吐温80 0.1％和琼脂2％，调节pH为6.3-6.8，加蒸馏水至1000mL，115℃灭菌20min制得。
优选地，步骤S3中所述厌氧培养条件为：温度22-40℃，时间16-48h。
优选地，步骤S5中所述有氧培养条件为：温度22-40℃，时间16-48h。
本发明的目的及解决其技术问题还进一步采用以下技术方案来实现。
本发明的又一个方面提供了一种根据长双歧杆菌制备二裂酵母发酵产物溶胞物的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将长双歧杆菌接种到MRS固体培养基上，22-40℃下进行活化培养16-48h，得到活化的长双歧杆菌，将活化的长双歧杆菌接种到MRS液体培养基中，22-40℃下培养16-48h，得到长双歧杆菌液，作为种子；
(2)将长双歧杆菌菌液接种于发酵液中进行发酵，得到长双歧杆菌发酵液；
(3)将发酵好的长双歧杆菌离心收集菌体，将菌体清洗后重悬，然后处理后灭菌，即制得二裂酵母发酵产物溶胞物。
优选地，步骤(2)中所述发酵液配方为：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，葡萄糖2％，柠檬酸胺0.2％，乙酸钠0.5％，吐温80 0.1％，在发酵过程中用NaOH调节pH至6.8。
优选地，步骤(2)中所述发酵条件为：温度25～37℃，时间20～50h；步骤(3)中采用生理盐水或者PBS清洗菌体，采用高压均质或加溶酶菌进行处理。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：由于长双歧杆菌是严格厌氧细菌，在培养的过程中很容易因为氧气的存在而失活，为了克服长双歧杆菌对氧气的敏感，降低二裂酵母发酵产物溶胞物的生产成本，本发明提供了一种长双歧杆菌及其筛选方法及二裂酵母发酵产物溶胞物的制备方法。本发明所述的长双歧杆菌对氧气不敏感，可以在有氧条件下生长，所述二裂酵母发酵产物溶胞物具有良好的皮肤修复、缓解炎症功能。
由本发明的长双歧杆菌发酵得到的二裂酵母发酵产物溶胞物不仅具有较好的皮肤修复功能，还具有较好的缓解炎症功能。实际使用时，可以将本发明的二裂酵母发酵产物溶胞物添加到用于皮肤修复和缓解炎症的化妆品、护肤品或医药品中，例如：化妆水、乳液、膏霜、面膜、精华液、粉底、粉底液、遮瑕霜、防晒霜、口服液、颗粒剂、片剂、丸剂、散剂、胶囊剂或滴丸剂等。在化妆品、护肤品或医药品中还可添加辅料，例如：油脂、表面活性剂、多元醇类、保湿剂、消泡剂、增稠剂、防腐剂、抗氧化剂、酸碱调节剂、润滑剂、乳化剂或粘合剂等，应用范围广。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例及附图详细说明如后。
附图说明
图1示出了根据本发明实施例2制备的二裂酵母发酵产物溶胞物的皮肤修复功能测试细胞形态图，其中，左图为对比例，中间为实施例加样5μL，右图为实施例加样10μL；
图2示出了根据本发明实施例2制备的二裂酵母发酵产物溶胞物的抗炎功能Q-PCR结果图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1长双歧杆菌的筛选
本实施例中的长双歧杆菌为一类具有细胞修复、缓解炎症作用，所述长双歧杆菌命为长双歧杆菌Bifidobacterium longum，株号Di4，于2021年8月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.23160。其具体筛选方法步骤如下：
1、采集健康婴儿粪便样品，用无菌水溶解，梯度稀释，加入到灭菌的平板中；
2、向50-50℃的MRS培养基加入过氧化氢溶液，使培养基中起始的过氧化氢浓度为0.5mmol/L，得到样品培养基。其中，MRS培养基配方为：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，葡萄糖2％，柠檬酸胺0.2％，乙酸钠0.5％，吐温80 0.1％和琼脂2％，调节pH为6.3，加蒸馏水至1000mL，115℃灭菌20min制得。
3、向步骤1的所述平板中倾入所述样品培养基并混匀，37℃下厌氧培养48h，挑选平板上菌落长势较好的菌株，进行基因序列比对，确定菌株类别，从而筛选出具有过氧化氢耐受性的长双歧杆菌。
4、将验证为长双歧杆菌的菌株在MRS固体培养基上划线，37℃厌氧培养24h，挑单克隆，进行基因序列比对，确保是长双歧杆菌后再重复以上划线步骤，直至得到无杂菌的单一长双歧杆菌。
5、将筛选单一的长双歧杆菌接到液体MRS培养基中，37℃有氧条件下静置培养24h，挑选其中长势最好的长双歧杆菌进行后续实验。
实施例2二裂酵母发酵产物溶胞物的制备
由根据实施例1的方法筛选出的长双歧杆菌制备二裂酵母发酵产物溶胞物，其具体制备步骤如下：
1.将长双歧杆菌接种到MRS固体培养基上，37℃厌氧条件下进行活化培养24h，得到活化的长双歧杆菌，将活化的长双歧杆菌接种到MRS液体培养基中，37℃下有氧培养24h，得到长双歧杆菌液作为种子。
2.将长双歧杆菌菌液接种于发酵液中，接种量为10％，在37℃下发酵30h，得到长双歧杆菌发酵液，其中，发酵液培养基配方：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，葡萄糖2％，柠檬酸胺0.2％，乙酸钠0.5％，吐温80 0.1％，在发酵过程中用NaOH调节pH至6.8。
3.将发酵好的长双歧杆菌6000rpm离心20min收集菌体，用0.9％的生理盐水清洗菌体一次后，用0.9％的生理盐水重悬菌体到100OD/ml，采用高压均质的方式处理长双歧杆菌，然后巴氏灭菌，即得二裂酵母发酵产物溶胞物。
实施例3二裂酵母发酵产物溶胞物的皮肤修复功能测试
根据实施例2制得的二裂酵母发酵产物溶胞物对皮肤修复作用测定方法如下：
1.细胞培养与传代，当细胞汇合度达到90％细胞汇合度的时候可以将细胞进行传代，去除上清后用PBS将细胞清洗1-2次，加适量胰酶进行消化细胞8min左右，然后添加完全培养基终止消化，此时细胞可以进行1:3-1:6传代，传代后将细胞放在5％CO2，37℃培养箱中进行培养。
2.细胞铺板，观察细胞状态及汇合率后细胞铺板，细胞消化后离心，用台盼蓝染色细胞，在显微镜下细胞计数，铺好的细胞板在培养箱中静置培养24h。
3.加测试样品，观察细胞密度是否达到实验要求汇合度，加测试样品，从测试第一孔开始添加10ul，然后2倍稀释，最后一孔为对比例，不加任何试剂，加样后继续在培养箱中静置培养24h。
4.加药及检测，每孔加10ulMTT后培养箱中静置避光培养4h，去除上清，每孔添加150ul DMSO溶剂，在水平震荡仪上震荡10min以充分溶解，溶解后样品再在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
测定结果见图1(左图为对比例，中间为实施例加样5μL，右图为实施例加样10μL)和表1。
表1二裂酵母发酵产物溶胞物的皮肤修复功能测试结果
| 样品名称 | 相对增殖率10ul(％) | 相对增殖率5ul(％) |
| 对比例 | 147 | 116 |
| 实施例 | 186 | 158 |
从表1和图1可以看出，与对比例即不加任何试剂相比，添加本发明制备的二裂酵母发酵产物溶胞物后具有较好的皮肤修复功能。
实施例4二裂酵母发酵产物溶胞物的抗炎功能测试
根据实施例2制得的二裂酵母发酵产物溶胞物的抗炎作用测定方法如下：
1.细胞培养与传代，当细胞汇合度达到90％细胞汇合度的时候可以将细胞进行传代，去除上清后用PBS将细胞清洗1-2次，加适量胰酶进行消化细胞8min左右，然后添加完全培养基终止消化，此时细胞可以进行1:3-1:6传代，传代后将细胞放在5％CO2，37℃培养箱中进行培养。
2.细胞铺板，观察细胞状态及汇合率后细胞铺板，细胞消化后离心，用台盼蓝染色细胞，在显微镜下细胞计数，铺好的细胞板在培养箱中静置培养24h。
3.紫外刺激细胞，将细胞板放置在紫外线灯箱内，控制UVB灯管距离台面15cm，使用UVB分别细胞进行辐射，剂量10mJ/cm2。
4.加测试样品，观察细胞密度是否达到实验要求汇合度，加测试样品50ul，对照不加任何试剂，加样后继续在培养箱中静置培养24h。
5.Q-PCR，胰酶消化收集细胞，RNA提取，cDNA反转录，Q-PCR机器分析。
结果见图2。从图2可以看出，与不加任何试剂的对比例相比较，添加本发明制备的二裂酵母发酵产物溶胞物后具有较好的缓解炎症功能。
综上所述，由本发明的长双歧杆菌发酵得到的二裂酵母发酵产物溶胞物不仅具有较好的皮肤修复功能，还具有较好的缓解炎症功能。实际使用时，可以将本发明的二裂酵母发酵产物溶胞物添加到用于皮肤修复和缓解炎症的化妆品、护肤品或医药品中，例如：化妆水、乳液、膏霜、面膜、精华液、粉底、粉底液、遮瑕霜、防晒霜、口服液、颗粒剂、片剂、丸剂、散剂、胶囊剂或滴丸剂等。在化妆品、护肤品或医药品中还可添加辅料，例如：油脂、表面活性剂、多元醇类、保湿剂、消泡剂、增稠剂、防腐剂、抗氧化剂、酸碱调节剂、润滑剂、乳化剂或粘合剂等，应用范围广。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种长双歧杆菌，其特征在于，所述长双歧杆菌具有细胞修复、缓解炎症作用，所述长双歧杆菌为长双歧杆菌Bifidobacterium longum，株号Di4，于2021年8月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.23160。
2.一种筛选权利要求1所述的长双歧杆菌的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1：样品采集，将样品经溶解和梯度稀释后加入到灭菌的平板中；
S2：配置样品培养基；
S3：将上述样品培养基倒入所述平板中混合，厌氧培养，挑选平板上菌落长势较好的菌株，进行基因序列比对，确定菌株类别，筛选出具有过氧化氢耐受性的长双歧杆菌；
S4：将验证为长双歧杆菌的菌株在MRS固体培养基上划线，挑单克隆，进行基因序列比对，确保是长双歧杆菌后再重复以上划线步骤，直至得到无杂菌的单一长双歧杆菌。
S5：将上述得到的单一长双歧杆菌接到MRS液体培养基中，有氧培养，挑选其中长势最好的长双歧杆菌，备用。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述样品采集自健康婴儿粪便。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述样品培养基按照如下方法制备：向50-50℃的MRS培养基加入过氧化氢溶液，使培养基中起始的过氧化氢浓度为0.5mmol/L，即得到样品培养基。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述MRS培养基为：蛋白胨0.8-2％，牛肉膏0.5-2％，酵母膏0.25-0.8％，葡萄糖1.5-3％，柠檬酸胺0.1-0.3％，乙酸钠0.25-0.75％，吐温80 0.1％和琼脂2％，调节pH为6.3-6.8，加蒸馏水至1000mL，115℃灭菌20min制得。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述厌氧培养条件为：温度22-40℃，时间16-48h。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S5中所述有氧培养条件为：温度22-40℃，时间16-48h。
8.一种根据权利要求1所述的长双歧杆菌制备二裂酵母发酵产物溶胞物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将长双歧杆菌接种到MRS固体培养基上，22-40℃下进行活化培养16-48h，得到活化的长双歧杆菌，将活化的长双歧杆菌接种到MRS液体培养基中，22-40℃下有氧培养16-48h，得到长双歧杆菌液，作为种子；
(2)将长双歧杆菌菌液接种于发酵液中进行发酵，得到长双歧杆菌发酵液；
(3)将发酵好的长双歧杆菌离心收集菌体，将菌体清洗后重悬，然后处理后灭菌，即制得二裂酵母发酵产物溶胞物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述发酵液配方为：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，葡萄糖2％，柠檬酸胺0.2％，乙酸钠0.5％，吐温80 0.1％，在发酵过程中用NaOH调节pH至6.8。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述发酵条件为：温度25～37℃，时间20～50h；步骤(3)中采用生理盐水或者PBS清洗菌体，采用高压均质或加溶酶菌进行处理。
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