CN117286060B

CN117286060B - 一株低温清酒广布乳杆菌及应用

Info

Publication number: CN117286060B
Application number: CN202311198623.XA
Authority: CN
Inventors: 范洪臣; 林枫翔; 侯莹; 韩雪; 秦琦
Original assignee: Harbin Meihua Biotechnology Co ltd
Current assignee: Harbin Meihua Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-09-15
Filing date: 2023-09-15
Publication date: 2024-05-14
Anticipated expiration: 2043-09-15
Also published as: CN117286060A

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株低温清酒广布乳杆菌及应用。本发明提了一种低温高产酸乳酸菌，其为清酒广布乳杆菌(Lactobacillus sakei)MH‑LS‑01，已于2023年05月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.27270。本发明的低温高产酸乳酸菌，适合北方低温酸菜发酵条件，且产酸量高，缩短了发酵时间，为高纬度、寒冷地区的酸菜发酵生产提供了良好的菌种资源。

Description

一株低温清酒广布乳杆菌及应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株低温清酒广布乳杆菌及应用。

背景技术

泡菜是以白菜、萝卜、黄瓜、甜椒等新鲜蔬菜为原料，添加食盐、水和调味料，利用蔬菜自身附着的微生物或添加人工培养的乳酸菌发酵剂，在厌氧环境下进行乳酸发酵而制成的酸性食品。泡菜不但味美爽口，而且具有丰富的营养，含有维生素、Ca、Fe、胡萝卜素、辣椒素、纤维素和蛋白质等多种丰富的营养成分，在中国很多地区都备受青睐。泡菜生产主要依靠乳酸菌的发酵作用。一般自然发酵的泡菜是以异型乳酸菌启动发酵，产生有机酸、过氧化氢和细菌素等物质，抑制其它杂菌的生长，同时产生乙醇、乙醛、甘露醇等风味物质，对泡菜特有风味的形成起决定性作用；之后同型乳酸菌逐渐成为优势菌，进一步降低环境pH值和抑制有害杂菌。

中国是传统的泡菜生产国，泡菜种类繁多，国内在这方面已经做了大量的工作，分离筛选出了许多生产性能优良的菌种，如植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、干酪乳杆菌、弯曲乳杆菌、短乳杆菌、嗜酸乳杆菌等。但也是由于我国泡菜的多样性，各种泡菜中具体存在何种乳酸菌仍然不清楚。

东北酸菜是我国东北地区人们主要以白菜为原料进行自然发酵重要的一种特色传统发酵食品，口感酸爽、脆嫩，风味独特，可生熟两吃。附着在蔬菜表面的天然本土微生物经过生长、代谢，菌群之间由竞争、互作形成优势菌群完成酸菜发酵过程。微生物的组成及作用与环境息息相关。传统发酵酸菜的微生物菌群涵盖了细菌和真菌两大类，且以细菌占绝对优势，而细菌中又以乳酸菌为优势菌，主要包括乳杆菌属、明串珠菌属等。乳酸菌具有诸多明确的益生功能，如可降胆固醇、抗糖尿病、抗肥胖、抗抑郁、抗氧化、可降解草酸盐防治肾脏疾病等，这些益生特性具有菌种和菌株特异性。东北地区冬天气温较低，气候及环境条件导致了东北酸菜发酵时间长，杂菌污染等不利条件。专利CN 111748490 A公开了一种清酒乳杆菌及其应用和饲料。所述清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)，其保藏号为CGMCCNO.19053。该发明从低温地区的辣白菜中提取能在低温环境下快速繁殖的优良乳酸菌。该申请中的清酒乳杆菌在20℃下具有较好的产酸效果，但是对更低温环境下的产酸效果有待验证。

由于白菜自身所携带的乳酸菌数量较少，无法在低温发酵过程中发挥作用，会严重影响酸菜的制备，因此需要额外添加乳酸菌才能保证生产出高品质的酸菜。目前市售的酸菜乳酸菌添加剂是常温乳酸菌，当气温低于此温度时，就会生长代谢迟缓，导致发酵延迟、甚至停滞，不适于黑龙江省酸菜发酵制备时的环境温度。而大面积修建发酵车间或提供持续供暖系统投入量大，不符合实际发展现状。因此，获得适应北方低温发酵条件的乳酸菌具有积极意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种低温高产酸乳酸菌，其为清酒广布乳杆菌(Lactobacillus sakei)MH-LS-01，已于2023年05月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.27270。本发明低温高产酸乳酸菌，适合北方低温酸菜发酵条件且产酸量高，为高纬度、寒冷地区的酸菜发酵生产提供了良好的菌种资源。

保藏说明：

生物材料：MH-LS-01；

分类命名：清酒广布乳杆菌(Lactobacillus sakei)；

保藏时间：2023年05月06日；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏编号：CGMCC NO.27270。

一方面，本发明提供了一种清酒广布乳杆菌(Lactobacillus sakei)MH-LS-01，已于2023年05月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.27270。

所述的清酒广布乳杆菌MH-LS-01为革兰氏染色为阳性，过氧化氢酶试验为阴性，菌落形态为白色、有隆起、不透明、表面湿滑、菌落边缘规则，菌株形态为杆状、单个或成对排列。

所述的清酒广布乳杆菌MH-LS-01的16S序列为SEQ ID NO.1。

又一方面，本发明提供了前述的清酒广布乳杆菌MH-LS-01的培养方法，包括将清酒广布乳杆菌MH-LS-01接种于培养基。

具体地，所述的培养基可以是MRS培养基。

进一步具体地，所述的MRS培养基的配方可以是：蛋白胨8-12g/L，牛肉粉3-7g/L，葡萄糖15-25g/L，酵母粉3-6g/L，乙酸钠3-7g/L，磷酸氢二钾1-3g/L，硫酸镁0.1-0.3g/L，柠檬酸三铵1-3g/L，硫酸锰0.05-0.1g/L，吐温-80 1-2mL/L。。

优选地，所述的MRS培养基的配方为：蛋白胨10.00g/L，牛肉粉5.00g/L，葡萄糖20.00g/L，酵母粉4.00g/L，乙酸钠5.00g/L，磷酸氢二钾2.00g/L，硫酸镁0.20g/L，柠檬酸三铵2.00g/L，硫酸锰0.05g/L，吐温-80 1.0mL/L。

又一方面，本发明提供了包含清酒广布乳杆菌MH-LS-01的发酵液、发酵沉淀或冻干粉。

又一方面，本发明提供了前述的清酒广布乳杆菌MH-LS-01或发酵液、发酵沉淀或冻干粉在制备发酵剂中的应用。

又一方面，本发明提供了前述的清酒广布乳杆菌MH-LS-01或发酵液、发酵沉淀或冻干粉的发酵剂。

又一方面，本发明提供了前述的清酒广布乳杆菌MH-LS-01或发酵液、发酵沉淀或冻干粉或发酵剂在食品发酵中的应用。

具体地，所述的发酵为低温发酵，所述的低温可以是5-15℃。

优选地，所述的低温为10℃。

具体地，所述的食品可以是泡菜，一些情况下也被称为泡酸菜、酸菜等。

进一步具体地，所述的泡菜原料为白菜、萝卜、黄瓜或甜椒中的一种或多种。

再一方面，本发明提供了一种泡菜的制作方法，包括向原料中投放前述的清酒广布乳杆菌MH-LS-01或发酵液、发酵沉淀或冻干粉或发酵剂进行发酵。具体地，清酒广布乳杆菌MH-LS-01投放量不低于5×10⁶cfu/mL。

优选地，清酒广布乳杆菌MH-LS-01投放量为5×10⁷cfu/mL。

具体地，发酵条件可以是5-20℃。

进一步具体地，所述的发酵为低温发酵，所述的低温可以是5-15℃；更具体可以是：5-8℃、5-10℃、8-10℃、8-12℃、8-15℃、10-12℃或10-15℃。

优选地，所述的低温可以是8-12℃。

进一步优选地，所述的低温为10℃。

更进一步优选地，所述的低温为10℃

本发明所取得的技术效果：

(1)本发明的清酒广布乳杆菌MH-LS-01能够在低温10℃条件下保持较好的发酵性能；至少可在NaCl浓度为0-8g/100mL条件下生长，耐盐；

(2)本发明的清酒广布乳杆菌MH-LS-01产酸量高，优于植物乳杆菌、肠膜明串珠菌和短乳杆菌等；

(3)本发明的清酒广布乳杆菌MH-LS-01为高纬度、寒冷地区的发酵生产提供了良好的菌种资源。

附图说明

图1为MH-LS-01的菌落形态、菌体显微镜图，其中A为菌落形态图；B为菌体显微镜图。

图2为10℃环境下MH-LS-01和植物乳杆菌72h内pH和总酸度变化图，其中A为pH变化图；B为总酸度变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1清酒广布乳杆菌(Lactobacillus sakei)MH-LS-01的筛选及鉴定

从大兴安岭地区呼玛县兴华镇农户酸菜缸中取上中下位置酸菜汤，放入无菌取样袋，保证厌氧环境，并置于冰盒中4℃保存备用。

MRS培养基的配方为：蛋白胨10.00g/L，牛肉粉5.00g/L，葡萄糖20.00g/L，酵母粉4.00g/L，乙酸钠5.00g/L，磷酸氢二钾2.00g/L，硫酸镁0.20g/L，柠檬酸三铵2.00g/L，硫酸锰0.05g/L，吐温-80 1.0mL/L

1、具体分离过程如下：

(1)初筛

将无菌取样袋中的样本接种到MRS固体培养基上，在无菌条件下挑取最先长出、且周围出现较大变色圈的菌落，采用平板划线法获得单菌落，再将分离出的、具有典型乳酸菌性状的菌种转移到含MRS固体培养基上，10℃下培养72h，多次重复这一过程。选择生长状况良好的菌株，对其进行革兰氏染色、过氧化氢酶试验，将革兰氏染色呈阳性反应、过氧化氢酶试验呈阴性反应且最先长出、变色圈大的菌株转接到MRS斜面固体培养基上保存备用。

(2)复筛

对照菌株：植物乳杆菌(CICC 21809)菌株为市售的乳酸菌冻干粉制剂用30℃左右的蒸馏水进行活化，随后无菌条件下，对其进行多次转接培养，最后选取生长状况良好的菌株，转接到MRS斜面固体培养基中备用。

在无菌条件下，将初步筛选的菌株与作为对照的植物乳杆菌分别取1接种环，置于灭过菌的MRS培养基中，摇晃混匀，将封瓶口在厌氧袋密封随后置于恒温培养箱中，并设置温度参数为10℃进行培养，定期(每隔24h)检测产酸情况，用酸度计测定72h内其pH值和总酸度(参照GB12456-2021方法检测)变化，选择产酸量最大的菌株，并命名为MH-LS-01。

在10℃条件下，MH-LS-01菌株和植物乳杆菌的pH整体都呈下降趋势；但MH-LS-01菌株的pH变化明显，在72h内由7.06下降到3.58；相比之下，作为对照的植物乳杆菌，其pH下降趋势略趋于平缓，在72h内，pH仅由7.06下降到6.84。

在10℃条件下，MH-LS-01菌株和植物乳杆菌的总酸度总体上都平稳增长，但MH-LS-01菌株的总酸度明显比对照植物乳杆菌的总酸度值大，见图2。

2、菌株的鉴定

MH-LS-01为革兰氏染色为阳性，过氧化氢酶试验为阴性，菌落形态为白色、有隆起、不透明、表面湿滑、菌落边缘规则，菌株形态为杆状、单个或成对排列，见图1。

将菌株MH-LS-01送往上海生工生物技术有限公司进行16S rDNA测序，MH-LS-01菌株的16S rDNA序列(SEQ ID NO.1)总长度为1434bp，经过BLAST对比分析，MH-LS-01的16SrDNA序列与清酒乳杆菌的序列相似性最高，故可确定MH-LS-01为清酒广布乳杆菌属。结合生理生化检测结果(表1)，参照《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》确定MH-LS-01为清酒广布乳杆菌。MH-LS-01可在NaCl浓度为0-8g/100mL条件下生长。

表1菌株生理生化反应表

七叶苷	-	蔗糖	+
				纤维二糖	+	棉子糖	-
麦芽糖	+	菊糖	+
				甘露醇	-	乳糖	+
水杨苷	+	液化明胶	-
				山梨醇	-	过氧化氢	+

符号说明：“+”，阳性；“-”，阴性。

实施例2MH-LS-01菌株在不同温度下的生长特性

将MH-LS-01菌株的菌种活化并接种于MRS肉汤培养基中，接种后放置于培养箱中培养12h，在超净工作台内稀释使乳酸菌数量为10⁸cfU/mL，按3％的比例将乳酸菌接种于MRS液体培养基中，于20℃条件下培养3d，5℃和10℃条件下培养7d，在600nm处测定OD值。以OD值＜0.05记为不生长，0.05＜OD值＜0.1记为微弱生长，0.1＜OD值＜0.5记为生长，OD值＞0.5记为生长良好。结果见表2，pH值为培养3d后的pH值。

表2

	OD值	pH值
			5℃	0.654	5.75
10℃	2.031	3.58
			20℃	2.400	3.58

实施例3培养基低温产酸对比试验

将清酒广布乳杆菌MH-LS-01、植物乳杆菌(CICC21809)、肠膜明串珠菌(CICC22179)和短乳杆菌(CICC20014)活化后均制成浓度为5×10⁶cfu/g的菌种液；再将清酒广布乳杆菌MH-LS-01、植物乳杆菌、肠膜明串珠菌和短乳杆菌菌种液分别取1mL接种于50mL灭过菌的pH值为6.2的MRS液体培养基中，摇晃混匀，放入厌氧袋，随后置于恒温培养箱中，并设置温度参数为10℃进行培养，定期检测MRS液体培养基pH值和总酸(参照GB12456-2021方法检测)如表3所示。

表3

以上数据表明，本发明的清酒广布乳杆菌MH-LS-01在10℃低温条件下具有更为优异的产酸效果。

实施例4白菜汁低温产酸对比试验

将清酒广布乳杆菌MH-LS-01、植物乳杆菌、肠膜明串珠菌和短乳杆菌活化后制成菌种液；再将清酒广布乳杆菌MH-LS-01、植物乳杆菌、肠膜明串珠菌和短乳杆菌分别按5×10⁶cfu/mL接入灭菌的白菜汁(pH自然)中混匀，然后置于10℃的恒温环境中进行发酵。分别在发酵第24-120h取样，测pH值和总酸。检测结果如表4所示。

表4

以上结果表明：低温发酵白菜汁时，本发明的清酒广布乳杆菌MH-LS-01相对于现有菌株，产酸能力更强，由此可以推断，本发明的菌株用于泡菜发酵时，产品发酵时间更短，风味更好。

对比例

清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)，其保藏号为CGMCC NO.19053；清酒乳杆菌ATCC 15521，保藏编号为ATCC NO.15521；清酒乳杆菌HNF4，保藏编号为CCTCCNO.M2020338。以上菌株参照本发明实施例4的方法设计实验，检测清酒乳杆菌(CGMCCNo.19053)白菜汁低温产酸效果，实验结果见表5。

表5

以上结果表明，对比例中的3中清酒乳杆菌在发酵72h的产酸量均不如本发明的MH-LS-01。因此，本发明提供的MH-LS-01更适合低温发酵，并且产酸能力强，发酵时间短。

Claims

1.一种清酒广布乳杆菌(Latilactobacillus sakei)MH-LS-01，其特征在于，已于2023年05月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNO.27270。

2.权利要求1所述的清酒广布乳杆菌MH-LS-01的培养方法，其特征在于，包括将清酒广布乳杆菌MH-LS-01接种于培养基。

3.包含权利要求1所述的清酒广布乳杆菌MH-LS-01的发酵液、发酵沉淀或冻干粉。

4.权利要求1所述的清酒广布乳杆菌MH-LS-01或权利要求3所述的发酵液、发酵沉淀或冻干粉在制备发酵剂中的应用。

5.包括权利要求1所述的清酒广布乳杆菌MH-LS-01或权利要求3所述的发酵液、发酵沉淀或冻干粉的发酵剂。

6.权利要求1所述的清酒广布乳杆菌MH-LS-01或权利要求3所述的发酵液、发酵沉淀或冻干粉或权利要求5所述的发酵剂在食品发酵中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的发酵为低温发酵，所述的低温为5-15℃。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的低温为10℃。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的食品为泡菜。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的泡菜原料为白菜、萝卜、黄瓜或甜椒中的一种或多种。

11.一种泡菜的制作方法，其特征在于，包括向原料中投放权利要求1所述的清酒广布乳杆菌MH-LS-01或权利要求3所述的发酵液、发酵沉淀或冻干粉或权利要求5所述的发酵剂进行发酵。

12.根据权利要求11所述的制作方法，其特征在于，清酒广布乳杆菌MH-LS-01投放量不低于5×10⁶cfu/mL。

13.根据权利要求12所述的制作方法，其特征在于，发酵条件为5-20℃。

14.根据权利要求13所述的制作方法，其特征在于，所述的发酵为低温发酵，所述的低温为5-15℃。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的低温为10℃。