CN114698767A - 一种清除饲料霉菌毒素的生物制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种清除饲料霉菌毒素的生物制剂及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。所述生物制剂由以下重量份的原料组成：复合微生物发酵产物2‑4份、酵母细胞壁提取物4‑6份；杜仲叶提取物4‑6份。其中，复合微生物发酵产物由嗜热链球菌、戊糖片球菌和布氏乳杆菌混合发酵而成，能够在短时间内获得大量活菌，为生物降解霉菌毒素奠定基础；酵母细胞壁提取物通过物理途径对饲料中的霉菌毒素进行吸附，杜仲叶提取物将霉菌毒素的生物降解和物理降解途径实现耦联；本发明将复合微生物发酵产物、酵母细胞壁提取物和杜仲叶提取物复配使用，能同时从生物途径和物理途径发挥清除饲料中霉菌毒素的作用，达到1+1＞2的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种清除饲料霉菌毒素的生物制剂及其制备方法和应用。
背景技术
霉菌毒素是由霉菌产生的有毒次级代谢产物（Hisako等，2013），目前大约有100多种真菌产生300多种霉菌毒素。霉菌毒素广泛存在于农产品、饲料和动物饲粮中，给食品工业、饲料工业和畜牧业及人类健康带来了重大危害，并造成了巨大的经济损失。
饲料中常见且危害较大的霉菌毒素有黄曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEA）和呕吐毒素（DON）等。这三种霉菌毒素能够降低机体免疫力，具有致癌性、基因毒性和生殖毒性等，可严重危害机体健康；而且三者共存的概率较高，具有叠加毒性，其危害也更大。Rodrigues等对来自美洲、欧洲、亚洲的7049份饲料（玉米、豆粕、小麦、DGGS）和全价饲料进行分析，结果发现AFB1、ZEA和DON的阳性检出率分别为33%、45%和59%，其中81%的样品至少含有一种霉菌毒素。
饲料中霉菌毒素的来源主要有两个方面：一是作物生长过程中由于霉菌污染所导致的谷物内霉菌毒素含量升高；二是在谷物的收获、干燥、运输、贮藏和加工过程中，由于操作不规范导致霉菌生长繁殖，产生霉菌毒素。对于饲料中已经产生的霉菌毒素，只有通过脱毒和解毒技术来消除霉菌毒素对动物的危害。饲料中霉菌毒素的脱毒和解毒技术主要包括物理、化学和生物学方法。其中，物理方法主要靠蒙脱石等的吸附功能，但存在吸附谱窄、解吸附及吸附维生素和矿物元素等营养物质的缺点；化学方法通常会影响饲料的营养品质和适口性，降低饲料利用率，并存在安全隐患，难以大规模在生产中应用；生物学方法包括微生物降解法和酶解法，具有高效、特异性强、环境友好、污染小的特点，近年来成为人们研究的热点。
随着分子生物学、基因工程和微生物基因组学的发展，一些具有降解能力的微生物种群被发现，对生物降解霉菌毒素也进行了深入的研究。霉菌毒素生物降解的作用机制主要是将霉菌毒素降解成其他更小分子的物质，或转化霉菌毒素的有毒化学结构使之降解毒素。一般而言，一种微生物或一种酶可能会针对某一种霉菌毒素具有良好的降解作用，要想得到对多种霉菌毒素都具有良好的降解作用，就需要多种菌、多种酶或多种菌与多种酶的配合。目前已有研究利用多种益生菌组合，与植物提取物或与来自真菌分泌的霉菌毒素降解酶配伍，可有效的同步降解多种霉菌毒素。但由于微生物种类繁多，不同微生物对霉菌毒素的脱毒能力不同，并且不同微生物之间存在拮抗、共生、竞争等多种复杂的关系；另外，还受微生物、植物提取物及霉菌毒素降解酶的品种、特性、功能、配伍和生产工艺等条件的限制，因此，对于饲料中多种霉菌毒素的清除仍需要深入研究。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种清除饲料霉菌毒素的生物制剂及其制备方法和应用。本发明的生物制剂对饲料中的AFB1、ZEA和DON三种霉菌毒素均具有显著的清除效果，保证了饲料的用料安全。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种清除饲料霉菌毒素的生物制剂，由以下重量份的原料组成：
复合微生物发酵产物2-4份、酵母细胞壁提取物4-6份；杜仲叶提取物4-6份；
所述复合微生物发酵产物由如下方法制备而成：
将嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）混合接种于发酵培养基，在36-38℃发酵培养8-12h，离心，收集菌体沉淀，干燥，制备得到复合微生物发酵产物；
所述酵母细胞壁提取物由如下方法制备而成：
将酿酒酵母干粉加入到氢氧化钠溶液中，超声处理30-60min，离心，收集沉淀，沉淀依次用水、无水乙醇和乙醚进行洗涤，干燥，制备得到酵母细胞壁提取物；
所述杜仲叶提取物由如下方法制备而成：
将杜仲叶干燥粉碎，以pH=5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液作为提取溶剂，60-70℃水浴提取2-3h，过滤，滤液浓缩、干燥，制备得到杜仲叶提取物。
上述复合微生物发酵产物的制备方法中，优选的，所述发酵培养基中含有葡萄糖5g/L、酵母粉5g/L、酪蛋白胨10g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L、七水硫酸亚铁0.03g/L。
上述复合微生物发酵产物的制备方法中，优选的，嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）按体积比1:1:1进行混合接种。
上述复合微生物发酵产物的制备方法中，优选的，所述嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），其中，嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）的菌种编号为CICC 6221，戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）的菌种编号为CICC 22738，布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）的菌种编号为CICC 20293。
优选的，所述复合微生物发酵产物中的活菌数≥109cfu/g。
本发明通过发酵制备的复合微生物发酵产物，其对微生物菌体进行了富集，复合微生物发酵产物中的活菌数高，其为霉菌毒素的降解提供了有效的菌种资源。而且，本发明所采用的嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）三株菌株之间无拮抗作用，且菌株的发酵性能相近，通过对发酵培养基的优化，实现了对三株菌的混合发酵。
上述酵母细胞壁提取物的制备方法中，优选的，所述氢氧化钠溶液的质量浓度为2-3%；酿酒酵母干粉与氢氧化钠溶液加入量的比为1g：（8-10）ml。
上述酵母细胞壁提取物的制备方法中，优选的，超声处理的功率为200-400W。
对于酵母细胞壁提取物的制备，本发明采用的是碱法+超声处理的方式，通过超声解聚打断敏感化学键来降低相对分子质量，形成不同分子量层级的多糖结构，从而提高了其结合霉菌毒素的能力。
上述杜仲叶提取物的制备方法中，优选的，干燥粉碎后的杜仲叶与磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液加入量的比为1g：（12-14）ml。
优选的，所述生物制剂由以下重量份的原料组成：
复合微生物发酵产物2份、酵母细胞壁提取物4份；杜仲叶提取物4份。
本发明的第二方面，提供上述清除饲料霉菌毒素的生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
将上述复合微生物发酵产物、酵母细胞壁提取物和杜仲叶提取物按重量配比混合均匀，即制备得到本发明的生物制剂。
本发明的第三方面，提供上述生物制剂在清除饲料霉菌毒素中的应用。
上述应用中，优选的，所述饲料包括但不限于：玉米、玉米酒精糟及可溶物（DDGS）、玉米副产物、麸皮、次粉、米糠等。
上述应用中，所述霉菌毒素包括：AFB1、ZEA和DON。
上述应用中，清除饲料霉菌毒素的方法可以为：将上述生物制剂添加到待处理的饲料中；生物制剂的添加量为饲料重量的0.1%-1%。
本发明的有益效果：
本发明将复合微生物发酵产物、酵母细胞壁提取物和杜仲叶提取物复配使用，能同时从生物途径和物理途径发挥清除饲料中霉菌毒素的作用，达到1+1＞2的效果。其中，复合微生物发酵产物由嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）混合发酵而成，三种菌株之间无拮抗作用，且营养需求、好氧性、培养温度等相近，将其混合发酵培养能够在短时间内获得大量活菌，为生物降解霉菌毒素提供了基础；而且，这三种菌株之间对于霉菌毒素的降解具有协同增效的作用；酵母细胞壁提取物能够通过物理途径对饲料中的霉菌毒素进行吸附，杜仲叶提取物与复合微生物发酵产物和酵母细胞壁提取物进行复配，能够将霉菌毒素的生物降解和物理降解途径实现耦联；而且，杜仲叶提取物和酵母细胞壁提取物中的多糖成分还能为复合微生物发酵产物中菌株生长提供养分；上述三种成分共同作用，从而提高了饲料中霉菌毒素的降解效果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如前所述，饲料中普遍存在2种或2种以上的霉菌毒素污染，这些霉菌毒素的叠加毒性远大于单一毒素的作用。因此，关于消除霉菌毒素危害的研究受到越来越广泛的关注。
对于饲料中霉菌毒素的清除，目前虽然有将微生物与物理吸附剂、植物提取物或者霉菌毒素降解酶组合使用的报道。但是，由于微生物和植物提取物的功能复杂多样，不同微生物之间，微生物与植物提取物、物理吸附剂或霉菌毒素降解酶之间也存在复杂的作用关系。因此，开发高效配伍的用于清除饲料中霉菌毒素的复合生物制剂仍是当前的技术难点所在。
基于此，本发明首先探究了益生菌作为生物脱毒方法对霉菌毒素的降解效果。考虑到饲料领域的特殊要求，本发明对《饲料添加剂目录》中允许添加的微生物降解AFB1、ZEA和DON的能力进行了考察，从中筛选出对AFB1、ZEA和DON中的至少一种具有较好降解能力的9种菌。然后进一步采用滤纸片法考察了这9种菌之间相互作用关系，以确定不同菌株混合培养、组合使用的可行性。结果发现：嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）三株菌株之间在共培养菌株生长方面有积极作用甚至协同作用。
由此，本发明选择嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）组合使用，并进一步考察了上述三株菌组合后对AFB1、ZEA和DON的降解效果，结果发现：将菌种编号为CICC6221的嗜热链球菌、菌种编号为CICC 22738的戊糖片球菌和菌种编号为CICC 20293的布氏乳杆菌按一定比例进行混合发酵形成的复合微生物发酵产物，与单一菌株相比，其能显著提高对AFB1、ZEA和DON三种霉菌毒素的降解效果，具有协同增效作用。
酵母细胞壁提取物是以酿酒酵母为原料经提取制备得到，其以多糖为主要成分。酵母细胞壁提取物可以通过氢键和范德华力叠合作用与多种霉菌毒素形成多糖-毒素复合物，防止毒素被肠道吸收。本发明采用的是碱法+超声处理的方式来制备酵母细胞壁提取物，通过超声解聚打断敏感化学键来降低相对分子质量，形成不同分子量层级的多糖结构，从而提高了其结合霉菌毒素的能力，体外吸附试验表明：与单纯采用减法制备的酵母细胞壁提取物相比，通过本发明方法制备的酵母细胞壁提取物对霉菌毒素的吸附性能显著提高。
杜仲叶提取物也是饲料添加剂品种目录中允许添加的物质，其有效成分包括绿原酸、多糖等，其中，绿原酸成分能够与复合微生物发酵产物协同降解霉菌毒素；多糖成分则能与酵母细胞壁提取物协同吸附霉菌毒素。
本发明在获复合微生物发酵产物、酵母细胞壁提取物和杜仲叶提取物之后，尝试将其组合使用，考察复合之后对于饲料中霉菌毒素的降解效果。结果发现：复合后形成的复合生物制剂其降解饲料中霉菌毒素的能力明显提升。推测其复合作用机理应该为：复合微生物发酵产物主要通过生物途径发挥降解效果；酵母细胞壁提取物则通过物理途径吸附霉菌毒素；杜仲叶提取物则将这两种途径耦合在一起。即：复合微生物发酵产物、酵母细胞壁提取物和杜仲叶提取物三者复配，在降解饲料中的霉菌毒素方面具有显著的协同增效作用，由此提出了本发明。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：
嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），其中，嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）的菌种编号为CICC6221，戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）的菌种编号为CICC 22738，布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）的菌种编号为CICC 20293。
AFB1、ZEA购自Sigma公司，DON购自上海源叶生物科技有限公司。
黄曲霉毒素B1（AFB1）ELISA检测试剂盒购自上海科顺生物科技有限公司；ZEN毒素多参数定量检测试剂盒（上转发光法）、呕吐毒素多参数定量检测试剂盒（上转发光法）购自北京热景生物技术股份有限公司。
发酵培养基：将5g葡萄糖、5g酵母粉、10g酪蛋白胨、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰、0.03g七水硫酸亚铁，用蒸馏水溶解，配成1L溶液；调节pH至6.5。
实施例1：复合微生物发酵产物的制备
将嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）的种子液按体积比1:1:1混合接种于发酵培养基中，接种量为5%（体积分数），在37℃发酵培养8h，离心，收集菌体沉淀，低温干燥，制备得到复合微生物发酵产物。
实施例2：酵母细胞壁提取物的制备
将酿酒酵母干粉10g加入到100ml质量浓度为2%的氢氧化钠溶液中，超声处理60min，超声功率为200W，3000r/min离心15min，收集沉淀，沉淀依次用水、无水乙醇和乙醚进行洗涤，喷雾干燥，制备得到酵母细胞壁提取物。
实施例3：杜仲叶提取物的制备
将杜仲叶干燥粉碎，取10g干燥粉碎后的杜仲叶，加入120ml pH=5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，65℃水浴提取3h，过滤，滤液浓缩、干燥，制备得到杜仲叶提取物。
实施例4：清除饲料霉菌毒素的生物制剂的制备
1、原料组成（按重量份计）：
复合微生物发酵产物2份、酵母细胞壁提取物4份；杜仲叶提取物4份；
其中，复合微生物发酵产物由实施例1制备；酵母细胞壁提取物由实施例2制备；杜仲叶提取物由实施例3制备。
2、制备方法：
将上述复合微生物发酵产物、酵母细胞壁提取物和杜仲叶提取物按重量配比混合均匀，即制备得到清除饲料霉菌毒素的生物制剂。
实施例5：清除饲料霉菌毒素的生物制剂的制备
1、原料组成（按重量份计）：
复合微生物发酵产物4份、酵母细胞壁提取物6份；杜仲叶提取物6份；
其中，复合微生物发酵产物由实施例1制备；酵母细胞壁提取物由实施例2制备；杜仲叶提取物由实施例3制备。
2、制备方法：
将上述复合微生物发酵产物、酵母细胞壁提取物和杜仲叶提取物按重量配比混合均匀，即制备得到清除饲料霉菌毒素的生物制剂。
实施例6：清除饲料霉菌毒素的生物制剂的制备
1、原料组成（按重量份计）：
复合微生物发酵产物3份、酵母细胞壁提取物5份；杜仲叶提取物5份；
其中，复合微生物发酵产物由实施例1制备；酵母细胞壁提取物由实施例2制备；杜仲叶提取物由实施例3制备。
2、制备方法：
将上述复合微生物发酵产物、酵母细胞壁提取物和杜仲叶提取物按重量配比混合均匀，即制备得到清除饲料霉菌毒素的生物制剂。
对比例1：
将嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）的种子液接种于发酵培养基中，接种量为5%（体积分数），在37℃发酵培养8h，离心，收集菌体沉淀，低温干燥，制备得到微生物发酵产物A。
对比例2：
将戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）的种子液接种于发酵培养基中，接种量为5%（体积分数），在37℃发酵培养8h，离心，收集菌体沉淀，低温干燥，制备得到微生物发酵产物B。
对比例3：
将布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）的种子液接种于发酵培养基中，接种量为5%（体积分数），在37℃发酵培养8h，离心，收集菌体沉淀，低温干燥，制备得到微生物发酵产物C。
对比例4：
将酿酒酵母干粉10g加入到100ml质量浓度为2%的氢氧化钠溶液中，在90℃下反应3h，3000r/min离心15min，收集沉淀，沉淀依次用水、无水乙醇和乙醚进行洗涤，喷雾干燥，制备得到酵母细胞壁提取物A。
试验例1：复合微生物发酵产物对霉菌毒素的降解效果考察
参考“嗜热链球菌等六种微生物对AFB1降解能力的研究”（饲料工业，2020年第41卷第7期）和“综合利用玉米深加工副产物固态发酵饲料的研究”（大连理工大学硕士学位论文，2021年）的方法考察本发明制备的复合微生物发酵产物对霉菌毒素（AFB1、ZEA和DON）的降解效果。具体方法如下：
1、试验方法：
试验组1：将实施例1制备的复合微生物发酵产物添加到含有AFB1、ZEA和DON的LB液体培养基中，添加量为LB液体培养基重量的0.1%，LB液体培养基中AFB1的浓度为50μg/L，ZEA的浓度为150μg/L，DON的浓度为2000μg/L；在恒温震荡培养箱中37℃震荡培养24h。
试验组2：将对比例1制备的微生物发酵产物A添加到含有AFB1的LB液体培养基中，添加量为LB液体培养基重量的0.1%，LB液体培养基中AFB1的浓度为50μg/L，ZEA的浓度为150μg/L，DON的浓度为2000μg/L；在恒温震荡培养箱中37℃震荡培养24h。
试验组3：将对比例2制备的微生物发酵产物B添加到含有AFB1的LB液体培养基中，添加量为LB液体培养基重量的0.1%，LB液体培养基中AFB1的浓度为50μg/L，ZEA的浓度为150μg/L，DON的浓度为2000μg/L；在恒温震荡培养箱中37℃震荡培养24h。
试验组4：将对比例3制备的微生物发酵产物C添加到含有AFB1的LB液体培养基中，添加量为LB液体培养基重量的0.1%，LB液体培养基中AFB1的浓度为50μg/L，ZEA的浓度为150μg/L，DON的浓度为2000μg/L；在恒温震荡培养箱中37℃震荡培养24h。
以AFB1的浓度为50μg/L、ZEA的浓度为150μg/L、DON的浓度为2000μg/L的未加微生物发酵产物的LB液体培养基作为对照，每个处理3个重复。
培养结束后，5000r/min离心5min，取上清液，采用黄曲霉毒素B1（AFB1）ELISA检测试剂盒对上清液中AFB1的含量进行测定，按下式计算AFB1的降解率。
AFB1的降解率(%)=[（24h对照组AFB1的含量-24h试验组AFB1的含量）/24h对照组AFB1的含量] ×100%。
采用ZEN毒素多参数定量检测试剂盒（上转发光法）对上清液中ZEA的含量进行测定，按下式计算ZEA的降解率。
ZEA的降解率(%)=[（24h对照组ZEA的含量-24h试验组ZEA的含量）/24h对照组ZEA的含量] ×100%。
采用呕吐毒素多参数定量检测试剂盒（上转发光法）对上清液中DON的含量进行测定，按下式计算DON的降解率。
DON的降解率(%)=[（24h对照组DON的含量-24h试验组DON的含量）/24h对照组DON的含量] ×100%。
（2）试验结果：
各组对AFB1、ZEA和DON的降解效果测定结果见表1。
表1：微生物发酵产物对霉菌毒素的降解率
| 组别 | AFB<sub>1</sub>的降解率（%） | ZEA的降解率（%） | DON的降解率（%） |
| 对照组 | - | - | - |
| 试验组1 | 91.6±1.2 | 96.5±2.0 | 92.4±1.8 |
| 试验组2 | 47.3±0.8 | 52.1±1.2 | 44.5±1.0 |
| 试验组3 | 16.2±0.4 | 23.2±0.8 | 17.0±0.5 |
| 试验组4 | 20.5±0.6 | 16.5±0.4 | 22.6±0.8 |
由表1的结果可以看出：不同种类的微生物对霉菌毒素的降解效果存在差异，本发明所选用的嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）对AFB1、ZEA和DON三种霉菌毒素均有一定的降解效果。而且，将这三种微生物共同发酵后的微生物发酵产物对这三种霉菌毒素的降解效果具有协同增效作用。
试验例2：酵母细胞壁提取物体外吸附试验
1、试验方法：
参考“酵母细胞壁提取物对霉菌毒素体外吸附试验”（饲料广角，2012年第9期）的方法考察本发明制备的酵母细胞壁提取物对霉菌毒素的体外吸附效果。具体方法如下：
分别精确称取10mg实施例2和对比例4制备的酵母细胞壁提取物于10ml刻度离心管中，加入ZEA标准品溶液，用已调节好的pH为6.8的缓冲液定容至10ml，使刻度离心管中ZEA的初始浓度为2.5μg/mL；每个处理3个重复。另设未添加酵母细胞壁提取物的对照管3支，在37℃恒温振荡水浴锅中，以5000r/min振荡吸附3h。吸附结束后，于5000rpm下离心10min，采用ZEN毒素多参数定量检测试剂盒（上转发光法）测定上清液中ZEA含量，用下式计算酵母细胞壁提取物对霉菌毒素ZEA的吸附率。
吸附率（%）=100（C0-C）/C0
C0表示吸附前的霉菌毒素浓度；C表示吸附前的霉菌毒素浓度。
2、试验结果：
不同方法制备的酵母细胞壁提取物体外吸附霉菌毒素测定结果见表2。
表2：体外吸附试验结果
| 组别 | 吸附率（%） |
| 实施例2 | 74.6% |
| 对比例4 | 65.2% |
结果表明：通过超声处理可以提高酵母细胞壁提取物对霉菌毒素的吸附效果。
试验例3：本发明的生物制剂在清除饲料中霉菌毒素的应用研究
1、试验方法：
（1）样品准备：
饲料选择玉米，按照GB/T 14699.1-2005《饲料采样》制备样品，并用粉碎机粉碎后过20目筛备用。
（2）样品测定：
从准备的样品中取样，采用黄曲霉毒素B1（AFB1）ELISA检测试剂盒、ZEN毒素多参数定量检测试剂盒（上转发光法）、呕吐毒素多参数定量检测试剂盒（上转发光法）分别测定样品中AFB1、ZEA和DON的含量。本试验例中所使用的饲料中的AFB1含量为38μg/kg，ZEA的含量为420μg/kg，DON的含量为1500μg/kg，均超出了饲料霉菌毒素的最高限量标准。
（3）样品处理：
将准备的样品随机分成4组，进行如下处理：
处理1：向样品中添加实施例1制备的复合微生物发酵产物并混合均匀，添加量为样品重量的0.1%。
处理2：向样品中添加实施例2制备的酵母细胞壁提取物并混合均匀，添加量为样品重量的0.2%。
处理3：向样品中添加实施例3制备的杜仲叶提取物并混合均匀，添加量为样品重量的0.2%。
处理4：向样品中添加实施例4制备的生物制剂并混合均匀，添加量为样品重量的0.5%。
各处理的其他条件保持一致，处理24h，检测处理后的样品中的AFB1、ZEA和DON含量，并计算清除率。
霉菌毒素清除率（%）=[（处理前霉菌毒素含量-处理后霉菌毒素含量）/处理前霉菌毒素含量] ×100%。
2、试验结果：
不同处理后的饲料的霉菌毒素清除率的测定结果见表3。
表3：饲料中霉菌毒素清除率测定结果
| 处理 | AFB<sub>1</sub>的清除率（%） | ZEA的清除率（%） | DON的清除率（%） |
| 处理1 | 43.2±1.2 | 50.5±1.5 | 42.6±1.5 |
| 处理2 | 30.5±1.0 | 32.8±1.0 | 28.5±0.8 |
| 处理3 | 15.0±0.5 | 12.5±0.2 | 20.6±0.5 |
| 处理4 | 93.2±2.0 | 97.0±1.2 | 94.5±1.0 |
结果表明：将复合微生物发酵产物、酵母细胞壁提取物和杜仲叶提取物复配后形成的生物制剂与上述原料单独使用相比，对饲料中霉菌毒素的清除效果有了显著提高。
综合上述试验结果可以看出：本发明制备的生物制剂具有清除饲料中霉菌毒素的能力。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种清除饲料霉菌毒素的生物制剂，其特征在于，由以下重量份的原料组成：
复合微生物发酵产物2-4份、酵母细胞壁提取物4-6份；杜仲叶提取物4-6份；
所述复合微生物发酵产物由如下方法制备而成：
将嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）混合接种于发酵培养基，在36-38℃发酵培养8-12h，离心，收集菌体沉淀，干燥，制备得到复合微生物发酵产物；
所述酵母细胞壁提取物由如下方法制备而成：
将酿酒酵母干粉加入到氢氧化钠溶液中，超声处理30-60min，离心，收集沉淀，沉淀依次用水、无水乙醇和乙醚进行洗涤，干燥，制备得到酵母细胞壁提取物；
所述杜仲叶提取物由如下方法制备而成：
将杜仲叶干燥粉碎，以pH=5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液作为提取溶剂，60-70℃水浴提取2-3h，过滤，滤液浓缩、干燥，制备得到杜仲叶提取物。
2.根据权利要求1所述的清除饲料霉菌毒素的生物制剂，其特征在于，所述发酵培养基中含有葡萄糖5g/L、酵母粉5g/L、酪蛋白胨10g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L、七水硫酸亚铁0.03g/L。
3.根据权利要求1所述的清除饲料霉菌毒素的生物制剂，其特征在于，所述嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，其中，嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）的菌种编号为CICC 6221，戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）的菌种编号为CICC 22738，布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）的菌种编号为CICC 20293。
4.根据权利要求1所述的清除饲料霉菌毒素的生物制剂，其特征在于，所述氢氧化钠溶液的质量浓度为2-3%；酿酒酵母干粉与氢氧化钠溶液加入量的比为1g：（8-10）ml。
5.根据权利要求1所述的清除饲料霉菌毒素的生物制剂，其特征在于，酵母细胞壁提取物的制备方法中，超声处理的功率为200-400W。
6.根据权利要求1-5任一项所述的清除饲料霉菌毒素的生物制剂，其特征在于，由以下重量份的原料组成：
复合微生物发酵产物2份、酵母细胞壁提取物4份；杜仲叶提取物4份。
7.权利要求1-6任一项所述的清除饲料霉菌毒素的生物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将复合微生物发酵产物、酵母细胞壁提取物和杜仲叶提取物按重量配比混合均匀，即制备得到清除饲料霉菌毒素的生物制剂。
8.权利要求1-6任一项所述的生物制剂在清除饲料霉菌毒素中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述霉菌毒素包括：AFB1、ZEA和DON。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，清除饲料霉菌毒素的方法为：将权利要求1-6任一项所述的生物制剂添加到待处理的饲料中；生物制剂的添加量为饲料重量的0.1%-1%。
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| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20220705 Assignee: Hebei Jiulonghe Agricultural Development Co.,Ltd. Assignor: SHANDONG JIANYUAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO.,LTD. Contract record no.: X2024980016697 Denomination of invention: A biological agent for eliminating feed mycotoxins, its preparation method, and application Granted publication date: 20220823 License type: Common License Record date: 20240930 |