CN110973353A - 一种固态发酵苜蓿草粉饲料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种固态发酵苜蓿草粉饲料及其制备方法和应用。该饲料包含以下重量份的原料：苜蓿草粉1～3份、营养液1～3份、黑曲霉菌‑绿色木霉菌‑粗糙链孢霉菌的复合菌培养液0.18～0.54份、热带假丝酵母菌悬液0.06～0.18份。该饲料经过配制培养基、细菌培养、细菌混合、发酵等过程制备得到。其具体可应用在饲喂28日龄断奶仔猪。本发明有效降解了苜蓿中纤维素含量，也增加了粗蛋白的含量，进而提高其在饲料中的应用价值，从而为个人和企业带来可观的经济效益。

Description

一种固态发酵苜蓿草粉饲料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于饲料制备技术领域，具体涉及一种固态发酵苜蓿草粉饲料及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，“人畜争粮”情况愈发严重，一方面由于人口数量不断增加，而耕地面积不断减少，加上饲料占粮食总产量的比例增量远大于粮食总产量自身增量；另一方面，畜牧业一直以来多以低纤维的谷物和动植物蛋白配制饲料，加之动物蛋白来源有限且价格昂贵。因此，开辟质优价廉的饲料原料的同时提高我国现有饲料资源的利用率是缓解这一矛盾的关键环节。众所周知，苜蓿为多年生优质豆科牧草，被誉为“牧草之王”，茎叶中含有丰富的蛋白质、矿物质、多种维生素及氨基酸，其作为植物蛋白质原料在配合饲料或混合饲料的应用前景广阔，但较高含量的纤维素也严重制约了其在饲料生产上的应用。因此，对苜蓿草粉进行固态发酵，降低纤维素含量的同时提高粗蛋白质含量，进而提高营养价值，以期达到降低饲料成本，缓解“人畜争粮”现状的目的。
目前，国内外学者对发酵苜蓿的研究较少。有限的研究中，苜蓿多被直接干燥后作为青干草或青贮饲料直接饲喂动物，但其粗纤维含量较高，加之动物体内缺乏降解纤维素的酶类，无法依靠自身降解纤维素，动物直接采食后导致养分消化率下降；也有部分研究会对其进行发酵后饲喂，但多采用单一菌株对苜蓿进行发酵，这种发酵后的苜蓿可大幅度提高其蛋白质含量尤其是可溶性蛋白质，但对纤维素等难降解物质分解效果较差，限制了其在畜牧业中的应用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种固态发酵苜蓿草粉饲料及其制备方法和应用。本发明的技术方案为：
第一个方面，本发明提供一种固态发酵苜蓿草粉饲料，包含以下重量份的原料：苜蓿草粉1～3份、营养液1～3份、黑曲霉菌-绿色木霉菌-粗糙链孢霉菌的复合菌培养液0.18～0.54份、热带假丝酵母菌悬液0.06～0.18份。
优选的，所述固态发酵苜蓿草粉饲料，包括以下重量份的原料：苜蓿草粉1份、营养液1份、黑曲霉菌-绿色木霉菌-粗糙链孢霉菌的复合菌悬液0.18份、热带假丝酵母菌悬液0.06份。
进一步的，所述苜蓿草粉饲料还包括螺旋藻粉0.5～2份、酵母硒0.05～0.2份和益生菌1～2份。
进一步的，所述营养液的组成为：每1L蒸馏水中含有(NH4)2SO4 5g、KH2PO4 1g、CaCl2 0.6g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.5g、ZnSO4 0.5g、MnSO4 0.5g、CoCl2·6H2O0.5g。
进一步的，所述黑曲霉-绿色木霉-粗糙链孢霉的复合菌培养液的组成为：每1L蒸馏水中含有黑曲霉(H)菌悬液1mL、绿色木霉(L)菌悬液1mL、粗糙链孢霉菌(C)菌悬液1mL、葡萄糖10g、可溶性淀粉15g、蛋白胨0.75g、KH2PO4 1.5g、(NH4)2SO4 2.5g、MgSO4 0.75g。
优选的，所述复合菌培养液中孢子数为1×106CFU/mL。
进一步的，所述热带假丝酵母菌(J)培养液的组成为：每1L蒸馏水中含有热带假丝酵母菌悬液1mL、蛋白胨5g、葡萄糖10g、酵母粉3g、麦芽提取物3g。
优选的，所述热带假丝酵母菌培养液中孢子数为1×106CFU/mL。
第二个方面，本发明提供上述固态发酵苜蓿草粉饲料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，配制综合PDA培养基和麦芽汁琼脂培养基；
步骤2，将黑曲霉菌(H)、绿色木霉菌(L)和粗糙链孢霉菌(C)分别接种至综合PDA培养基进行活化，以及将热带假丝酵母菌接种于麦芽汁琼脂培养基进行活化；活化后分别使用无菌水冲洗平板上的菌丝或孢子，即得单菌株菌悬液；
步骤3，将黑曲霉菌(H)、绿色木霉菌(L)和粗糙链孢霉菌的单菌株菌悬液分别接种于液体培养基一中培养，将热带假丝酵母菌菌悬液接种于液体培养基二中培养，分别得到黑曲霉菌(H)、绿色木霉菌(L)、粗糙链孢霉菌(C)以及热带假丝酵母菌(J)的菌悬液，最后将黑曲霉菌、绿色木霉菌、粗糙链孢霉菌三种菌株的菌悬液混合成黑曲霉菌-绿色木霉菌-粗糙链孢霉菌的复合菌悬液；
步骤4，将灭菌苜蓿草粉、营养液、黑曲霉菌-绿色木霉菌-粗糙链孢霉菌的复合菌悬液和热带假丝酵母菌悬液配料，先将黑曲霉菌-绿色木霉菌-粗糙链孢霉菌的复合菌悬液和营养液混匀，再加入到灭菌苜蓿草粉中混合均匀，得到混合发酵料；
步骤5，将混合发酵料进行一次发酵，发酵结束后加入热带假丝酵母菌的培养液进行二次发酵，然后烘干既得。
进一步的，所述步骤1中综合PDA培养基的配制方法为：取200g土豆，洗净去皮切成小块，加水1000mL煮沸25min；纱布过滤，得到土豆渗滤液，滤液加水补至1000mL，得到质量体积比为20％的马铃薯汁1L，和葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g、维生素B1 8mg、琼脂20g混匀后加热溶解，溶解后于121℃灭菌30min，灭菌完毕后取出保温50-60℃，静置冷却固化既得。
进一步的，所述步骤1中麦芽汁琼脂培养基的配制方法为：按质量分别称取以下组分：蛋白胨5g、葡萄糖10g、酵母粉3g、麦芽提取物3g、琼脂20g，称量完成后加入1L蒸馏水混匀，使用pHS-3C型号的pH测定仪(上海精密科学仪器有限公司，上海)测定原始pH值，并使用1mol/L NaOH调节pH至6.2，加热溶解，溶解后于121℃灭菌30min，灭菌完毕后取出保温50-60℃，静置冷却固化既得。
进一步的，所述液体培养基一的组成为：每1L蒸馏水中含有葡萄糖10g、可溶性淀粉15g、蛋白胨0.75g、KH2PO4 1.5g、(NH4)2SO4 2.5g、MgSO4 0.75g。
进一步的，所述液体培养基二的组成为：每1L蒸馏水中含有蛋白胨5g、葡萄糖10g、酵母粉3g、麦芽提取物3g。
优选的，所述步骤3中培养的条件为：于28℃恒温160～170r/min振荡培养，待其孢子数量达到1×106CFU/mL后停止震荡。
优选的，所述步骤4中苜蓿灭菌的条件为：121℃灭菌30min。
优选的，所述步骤5中一次发酵的条件为：先于28℃发酵2d，并且在0h时搅拌1次，之后每隔12h搅拌1次。
优选的，所述步骤5中二次发酵的条件为：于28℃发酵1d。
进一步的，所述步骤5中烘干温度为35～45℃。
第三个方面，本发明提供上述固态发酵苜蓿草粉饲料及其制备方法在饲喂28日龄断奶仔猪中的应用。
本发明的有益效果体现在以下3点：
1)本发明所选产纤维素酶的菌株分别为粗糙链孢霉、黑曲霉、绿色木霉，三种霉菌均属真菌界，外观均呈丝状，菌丝上布满大量孢子，生长过程中可产生较丰富的纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等酶类，有利于降解苜蓿中纤维素等不易被动物所利用的成分；与此同时，本发明所选热带假丝酵母菌可在发酵后期，利用发酵产物还原糖快速繁殖，同时产生大量的菌体蛋白；通过三种霉菌的协同作用，可有效降解饲料中的纤维素含量，使纤维素含量由25.31％降低至23.25％；添加热带假丝酵母菌后，粗蛋白含量由15.56％增加至18.68％。既有效降解了苜蓿中纤维素含量，也增加了粗蛋白的含量，进而提高其在饲料中的应用价值，从而为个人和企业带来可观的经济效益。
2)本发明与传统的利用单一菌株或添加酶制剂进行发酵相比，复合菌株通过协同作用能够产生丰富的胞外酶，同时也节约成本。
3)本发明适用于大型养殖场、饲料厂的配套项目加以推广。
附图说明
图1为本发明实施例2中热带假丝酵母菌悬液的生长曲线。
图2为本发明实施例2中绿色木霉菌、黑曲霉菌和粗糙链孢霉菌菌悬液的生长曲线。
具体实施方式
本发明实施例采用的益生菌购自大益生物科技有限公司，其主要成分为双歧杆菌。
本发明实施例采用的黑曲霉菌(H)、绿色木霉菌(L)和热带假丝酵母菌(J)购自广东省微生物菌种保藏中心(菌种GDM编号分别为3.576、3.141、2.6)。
本发明实施例采用的粗糙链孢霉、普通酵母菌和乳酸杆菌均购自北纳创联生物科技有限公司(菌种编号分别为BNCC 336675、BNCC142268、BNCC106633)。
本发明实施例采用的苜蓿草粉指饲料原料苜蓿草粉，购置于宁夏固原宝发农牧有限责任公司，粒度大小为6mm。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
最适降解纤维素的发酵菌株组合的筛选
本发明共选取3种菌株(黑曲霉菌(H)、绿色木霉菌(L)、粗糙链孢霉菌(C))。共有7种组合，它们分别为H、L、C、HL、HC、LC、HLC，每种组合按照正交设计表接种于固态培养基对苜蓿草粉进行发酵，选取接种量、料水比、发酵时间、发酵温度为发酵因素，每个因素设置3个水平，采用L9(34)正交表(表2)进行四因素三水平的正交发酵试验，共9个组，每组3个重复。黑曲霉菌(H)、绿色木霉菌(L)、粗糙链孢霉菌(C)生长曲线如图2所示，培养72h后达到平台期，菌体干重达0.3841g。正交试验设计见表1和表2。
表1正交试验设计
Figure BDA0002353268570000061
注:A表示接种量(0％)，B表示料水比(W/V)，C表示发酵时间(d)，D表示发酵温度(℃)。
表2 L9(3 4)交互作用表
Figure BDA0002353268570000062
Figure BDA0002353268570000071
注:A表示接种量(0％)，B表示料水比(W/V)，C表示发酵时间(d)，D表示发酵温度(℃)，大写字母对应数字表示试验水平。
按照上述实验设计将所得发酵产物放置于-80℃保存并测定其纤维素酶活，随后分别在单菌落、双菌落、三菌落组合中挑选出纤维素酶活由高至低前三位测定其纤维素含量。
各菌株及菌株组合对发酵苜蓿草粉纤维素酶活及纤维素含量影响如表3所示。
表3各菌株及菌株组合对纤维素酶活及纤维素含量的影响
Figure BDA0002353268570000072
注:H为黑曲霉菌，HL为黑曲霉菌、绿色木霉菌组合，HLC为黑曲霉菌、绿色木霉菌、粗糙链孢霉菌组合；H7、H8、H9分别表示黑曲霉菌交互作用试验号(如表2所示)，下同；数值为三个重复的平均值计算；同列数据肩标无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同。
试验结果表明，与苜蓿草粉组相比，发酵苜蓿组纤维素酶活性性极显著提高(P<0.01)，其中双菌落组(HL)纤维素酶活性最高(HL4:50.08U/mL)，其次是单菌落组中H8(45.39U/mL)，仅次于HL4组。此外，单菌落组中H9的粗纤维(Crude Fiber,CF)、中性洗涤纤维(Neutral Detergent Fiber,NDF)、酸性洗涤纤维(Acid Detergent Fiber,ADF)含量均极显著降低(P<0.01)，其中CF和NDF含量均为单菌落组中最低，分别为22.0％和34.12％。双菌落组中HL4酶活性最高(50.08
U/mL)，但HL7的CF含量极显著降低(P<0.01)，NDF含量显著降低(P<0.05)，均为双菌落组中最低。三菌落组合(HLC)发酵中，与苜蓿草粉组相比，HLC8中纤维素酶活性极显著升高(P<0.01)，CF、ADF含量均极显著降低(P<0.01)，其中CF、NDF和ADF含量分别为22.65％、32.32％、15.84％。综上所述，拟选H9、HL7、HLC8菌种组合模式作为后续添加酵母的固态发酵模式。
实施例2
最适产菌体蛋白的发酵菌株组合的筛选
如图1所示，热带假丝酵母菌在培养8h后进入生长对数期，24h后达平台期，菌落数达2.76×108CFU/mL。黑曲霉菌(H)、绿色木霉菌(L)、粗糙链孢霉菌(C)生长曲线如图2所示，培养72h后达到平台期，菌体干重达0.3841g。根据四种菌生长曲线规律，将上述H9、HL7、HLC8三种菌株组合，按照实施例1的试验条件对苜蓿草粉重新发酵，于发酵结束后立即加入热带假丝酵母菌悬液并搅拌混匀，同时按照相同试验条件再发酵1d，所得发酵产物中粗蛋白质含量最高，粗纤维含量最低组合，即为最适发酵组合。
所述酵母菌悬液添加量、粗蛋白质、粗纤维等含量变化如表4所示。
表4不同固态发酵模式下发酵苜蓿草粉粗蛋白和粗纤维含量变化
Figure BDA0002353268570000091
注：“-”表示未添加或无；数值为三个重复的平均值计算。
由表4可知，与苜蓿草粉组相比，发酵苜蓿草粉组粗蛋白质含量极显著增加(P<0.01)，其中HLC8+J中粗蛋白质质含量最高，达到15.67％，增加了5.71％；酸性洗涤纤维呈下降趋势(P<0.1),其中H9+J酸性洗涤纤维含量最低(19.85％)，下降了1.78％。三组粗纤维和中性洗涤纤维含量均未达到统计学显著水平(P>0.1)。综上，拟选HLC8+J作为固态发酵苜蓿草粉的最佳菌种组合。
对比例1
选取并按照上述实施例1中HLC8的试验条件重新发酵，HLC8+J组、HLC8+普通酵母菌组和HLC6+乳酸杆菌组在发酵后分别加入热带假丝酵母菌、普通酵母菌悬液和乳酸杆菌悬液并混匀，同时按照相同的试验条件发酵1d；上述比对实施例1所得发酵产物粗蛋白质、粗纤维等成分的含量变化如表5所示。
表5添加不同酵母菌对粗蛋白质及粗纤维含量的影响
Figure BDA0002353268570000092
Figure BDA0002353268570000101
注：“-”表示未添加或无；“HLC8+J”表示复合菌悬液发酵2d+热带假丝酵母菌悬液发酵1d；“(HLC8+普通酵母菌)和(HLC8+乳酸杆菌)”分别表示复合菌悬液发酵2d+普通酵母菌1d，复合菌悬液发酵2d+乳酸杆菌1d。
表5表明，与HLC8+J组相比，HLC8+普通酵母菌组和HLC8+乳酸杆菌组粗蛋白质含量显著降低(P<0.001)，粗纤维含量显著增加(P<0.05)。综上，本实验条件下，选取热带假丝酵母菌作为最适产粗蛋白质菌株。
实施例3
在挑选出菌种组合(HLC8+J)后，本实施例提供一种固态发酵苜蓿草粉饲料，包括以下重量份的原料：苜蓿草粉1份、营养液1份、黑曲霉菌-绿色木霉菌-粗糙链孢霉菌的复合菌悬液0.18份、热带假丝酵母菌悬液0.06份。其中，所述营养液的组成为：每1L蒸馏水中含有(NH4)2SO4 5g、KH2PO4 1g、CaCl2 0.6g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.5g、ZnSO4 0.5g、MnSO4 0.5g、CoCl2·6H2O 0.5g。所述黑曲霉-绿色木霉-粗糙链孢霉的复合菌培养液的组成为：每1L蒸馏水中含有黑曲霉(H)菌悬液1mL、绿色木霉(L)菌悬液1mL、粗糙链孢霉菌(C)菌悬液1mL、葡萄糖10g、可溶性淀粉15g、蛋白胨0.75g、KH2PO4 1.5g、(NH4)2SO4 2.5g、MgSO40.75g。所述复合菌培养液种孢子数为1×106CFU/mL。所述热带假丝酵母菌(J)培养液的组成为：每1L蒸馏水中含有热带假丝酵母菌悬液1mL、蛋白胨5g、葡萄糖10g、酵母粉3g、麦芽提取物3g。所述热带假丝酵母菌培养液中孢子数为1×106CFU/mL。
该固态发酵苜蓿草粉饲料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，配制综合PDA培养基和麦芽汁琼脂培养基；其中综合PDA培养基的配制方法为：取200g土豆，洗净去皮切成小块，加水1000mL煮沸25min；纱布过滤，得到土豆渗滤液，滤液加水补至1000mL，得到质量体积比为20％的马铃薯汁1L，和葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g、维生素B1 8mg、琼脂20g混匀后加热溶解，溶解后于121℃灭菌30min，灭菌完毕后取出保温50-60℃，静置冷却固化既得。麦芽汁琼脂培养基的配制方法为：按质量分别称取以下组分：蛋白胨5g、葡萄糖10g、酵母粉3g、麦芽提取物3g、琼脂20g，称量完成后加入1L蒸馏水混匀，使用pHS-3C型号的pH测定仪(上海精密科学仪器有限公司，上海)测定原始pH值，并使用1mol/LNaOH调节pH至6.2，加热溶解，溶解后于121℃灭菌30min，灭菌完毕后取出保温50-60℃，静置冷却固化既得。
步骤2，将黑曲霉菌、绿色木霉菌和粗糙链孢霉菌分别接种至综合PDA培养基进行活化，以及将热带假丝酵母菌接种于麦芽汁琼脂培养基进行活化；活化后分别使用无菌水冲洗平板上的菌丝或孢子，即得单菌株菌悬液一。
步骤3，将黑曲霉菌、绿色木霉菌和粗糙链孢霉菌的单菌株菌悬液分别接种于液体培养基一中于28℃恒温160～170r/min振荡培养，待其孢子数量达到1×106CFU/mL后停止震荡，分别得到黑曲霉菌、绿色木霉菌、粗糙链孢霉菌单菌株悬液二，再将以上三种单菌悬液混匀，得到黑曲霉菌-绿色木霉菌-粗糙链孢霉菌的复合菌悬液；并将热带假丝酵母菌菌悬液接种于液体培养基二中于28℃恒温160～170r/min振荡培养，待其孢子数量达到1×106CFU/mL后停止震荡，得到热带假丝酵母菌悬液；其中，所述液体培养基一的组成为：每1L蒸馏水中含有葡萄糖10g、可溶性淀粉15g、蛋白胨0.75g、KH2PO4 1.5g、(NH4)2SO4 2.5g、MgSO4 0.75g。所述液体培养基二的组成为：每1L蒸馏水中含有蛋白胨5g、葡萄糖10g、酵母粉3g、麦芽提取物3g。
步骤4，将苜蓿草粉于121℃灭菌30min，先将黑曲霉菌-绿色木霉菌-粗糙链孢霉菌的复合菌悬液和营养液混匀，再加入到灭菌苜蓿草粉中混合均匀，得到混合发酵料。
步骤5，将混合发酵料进行一次发酵，一次发酵的条件为：先于28℃发酵2d，并且在0h时搅拌1次，之后每隔12h搅拌1次。发酵结束后加入步骤3得到的热带假丝酵母菌的培养液进行二次发酵，二次发酵的条件为：于28℃发酵1d。发酵结束后于60～70℃烘干。
苜蓿草粉发酵前后的营养成分变化情况
测定本实施例获得的发酵苜蓿草粉中粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、干物质、总能的含量，结果如表6所示。
粗蛋白的测定：采用GB/T 6432-2018测定粗蛋白质的含量。
粗纤维的测定：采用GB/T 6434-2006测定粗纤维的含量。
粗脂肪的测定：采用GB/T6433-2006测定粗脂肪的含量。
中性洗涤纤维的测定：采用GB/T 20806-2006测定中性洗涤纤维的含量。
酸性洗涤纤维的测定：采用NY/T 1459-2007测定酸性洗涤纤维的含量。
表6本实施例获得的发酵苜蓿草粉饲料以及苜蓿草粉营养成分表
Figure BDA0002353268570000121
注：数值均为三个重复的平均值计算；
本实施例获得的发酵苜蓿饲料发酵前后主要营养成分含量变化如表6所示，发酵后发酵苜蓿干物质、粗蛋白质、粗脂肪及总能含量均增加，粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量均下降。综上所述，利用复配菌剂发酵苜蓿有助于提高营养品质。
实施例4
本实施例提供一种固态发酵苜蓿草粉饲料，包括以下重量份的原料：苜蓿草粉1份、营养液1份、黑曲霉菌-绿色木霉菌-粗糙链孢霉菌的复合菌悬液0.18份、热带假丝酵母菌悬液0.06份，螺旋藻粉0.5～2份、酵母硒0.05～0.2份和益生菌1～2份。其中，所述营养液的组成为：每1L蒸馏水中含有(NH4)2SO4 5g、KH2PO4 1g、CaCl2 0.6g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.5g、ZnSO4 0.5g、MnSO4 0.5g、CoCl2·6H2O 0.5g。所述黑曲霉-绿色木霉-粗糙链孢霉的复合菌培养液的组成为：每1L蒸馏水中含有黑曲霉(H)菌悬液1mL、绿色木霉(L)菌悬液1mL、粗糙链孢霉菌(C)菌悬液1mL、葡萄糖10g、可溶性淀粉15g、蛋白胨0.75g、KH2PO41.5g、(NH4)2SO4 2.5g、MgSO4 0.75g。所述复合菌培养液种孢子数为1×106CFU/mL。所述热带假丝酵母菌(J)培养液的组成为：每1L蒸馏水中含有热带假丝酵母菌悬液1mL、蛋白胨5g、葡萄糖10g、酵母粉3g、麦芽提取物3g。所述热带假丝酵母菌培养液中孢子数为1×106CFU/mL。
该固态发酵苜蓿草粉饲料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，配制综合PDA培养基和麦芽汁琼脂培养基；其中综合PDA培养基的配制方法为：取200g土豆，洗净去皮切成小块，加水1000mL煮沸25min；纱布过滤，得到土豆渗滤液，滤液加水补至1000mL，得到质量体积比为20％的马铃薯汁1L，和葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g、维生素B1 8mg、琼脂20g混匀后加热溶解，溶解后于121℃灭菌30min，灭菌完毕后取出保温50-60℃，静置冷却固化既得。麦芽汁琼脂培养基的配制方法为：按质量分别称取以下组分：蛋白胨5g、葡萄糖10g、酵母粉3g、麦芽提取物3g、琼脂20g，称量完成后加入1L蒸馏水混匀，使用pHS-3C型号的pH测定仪(上海精密科学仪器有限公司，上海)测定原始pH值，并使用1mol/LNaOH调节pH至6.2，加热溶解，溶解后于121℃灭菌30min，灭菌完毕后取出保温50-60℃，静置冷却固化既得。
步骤2，将黑曲霉菌、绿色木霉菌和粗糙链孢霉菌分别接种至综合PDA培养基进行活化，以及将热带假丝酵母菌接种于麦芽汁琼脂培养基进行活化；活化后分别使用无菌水冲洗平板上的菌丝或孢子，即得单菌株菌悬液一。
步骤3，将黑曲霉菌、绿色木霉菌和粗糙链孢霉菌的单菌株菌悬液分别接种于液体培养基一中于28℃恒温160～170r/min振荡培养，待其孢子数量达到1×106CFU/mL后停止震荡，分别得到黑曲霉菌、绿色木霉菌、粗糙链孢霉菌单菌株悬液二，再将以上三种单菌悬液混匀，得到黑曲霉菌-绿色木霉菌-粗糙链孢霉菌的复合菌悬液；并将热带假丝酵母菌菌悬液接种于液体培养基二中于28℃恒温160～170r/min振荡培养，待其孢子数量达到1×106CFU/mL后停止震荡，得到热带假丝酵母菌悬液；其中，所述液体培养基一的组成为：每1L蒸馏水中含有葡萄糖10g、可溶性淀粉15g、蛋白胨0.75g、KH2PO4 1.5g、(NH4)2SO4 2.5g、MgSO4 0.75g。所述液体培养基二的组成为：每1L蒸馏水中含有蛋白胨5g、葡萄糖10g、酵母粉3g、麦芽提取物3g。
步骤4，将苜蓿草粉于121℃灭菌30min，然后和螺旋藻粉、酵母硒、益生菌混合均匀，先将黑曲霉菌-绿色木霉菌-粗糙链孢霉菌的复合菌悬液和营养液混匀，再加入到灭菌苜蓿草粉等的混合物中混合均匀，得到混合发酵料。
步骤5，将混合发酵料进行一次发酵，一次发酵的条件为：先于28℃发酵2d，并且在0h时搅拌1次，之后每隔12h搅拌1次。发酵结束后加入步骤3得到的热带假丝酵母菌的培养液进行二次发酵，二次发酵的条件为：于28℃发酵1d。发酵结束后于40℃烘干。
苜蓿草粉发酵前后的营养成分变化情况
测定本实施例获得的发酵苜蓿草粉中粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、干物质、总能的含量，结果如表7所示。
粗蛋白的测定：采用GB/T 6432-2018测定粗蛋白质的含量。
粗纤维的测定：采用GB/T 6434-2006测定粗纤维的含量。
粗脂肪的测定：采用GB/T6433-2006测定粗脂肪的含量。
中性洗涤纤维的测定：采用GB/T 20806-2006测定中性洗涤纤维的含量。
酸性洗涤纤维的测定：采用NY/T 1459-2007测定酸性洗涤纤维的含量。
表7本实施例获得的发酵苜蓿草粉饲料以及苜蓿草粉营养成分表
Figure BDA0002353268570000151
注：数值均为三个重复的平均值计算；
本实施例获得的发酵苜蓿饲料发酵前后主要营养成分含量变化如表7所示，发酵后发酵苜蓿干物质、粗蛋白、粗脂肪及总能含量均增加，粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量均下降。综上所述，利用复配菌剂发酵苜蓿有助于提高营养品质。
实施例5
发酵苜蓿饲料中真菌毒素含量检测。
真菌毒素含量标准参照GB13078-2017，检测方法参照酶联免疫法，检测结果如表8所述。
表8苜蓿发酵前后真菌毒素含量变化
Figure BDA0002353268570000161
注：数值为三个重复的平均值计算；实测浓度小于限量为合格。
实施例6
本发明的无抗发酵苜蓿饲料对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响1.试验管理
动物试验在四川农业大学动物试验基地进行。饲养试验开始前，首先对仔猪舍(包括工具)进行彻底冲洗、熏蒸、消毒和通风。仔猪试验期间自由采食和饮水，每天在08:00、14:00和20:00进行饲喂。少喂勤添，保证自由采食。饲养温度控制在24℃左右，湿度保持在65％左右。试验初、末期对猪只进行空腹称重并记录，每天记录采食量，每天早晚两次观察仔猪粪便情况，记录每个处理腹泻仔猪头次。最后以每个处理仔猪发生腹泻的头次数除以该处理总的饲养数(该处理仔猪头数×饲养天数)，计算腹泻率(当腹泻评分为2或以上，认为仔猪发生腹泻)，试验过程未使用任何药物和抗生素。预试验5-7天，正式试验期为40天。
腹泻率＝试验期腹泻仔猪头次/(试验仔猪头数×试验天数)×100％。
2.试验设计
选取21头初始体重为(7.2±0.5)kg的28日龄健康雄性断奶杜洛克×长白×约克仔猪，采用单因子试验设计，按照体重无差异原则随机分为3个处理，每个处理7个重复，每个重复1头猪，单笼饲养。对照组饲喂基础日粮，不额外添加日粮纤维。处理Ⅰ在基础日粮中添加8％普通苜蓿草粉饲料；处理Ⅱ在基础日粮中添加8％实施例3制备的发酵苜蓿草粉；处理III在基础日粮中添加8％实施例4制备的发酵苜蓿草粉。参照NRC(2012)和中国猪饲养标准配制玉米-豆粕型饲粮。试验设计与处理见表9。
表9断奶仔猪试验分组及日粮类型
Figure BDA0002353268570000171
3.试验日粮
基础日粮的组成及营养水平如表10所示。
表10日粮组成及营养水平(风干基础)
Figure BDA0002353268570000172
Figure BDA0002353268570000181
Figure BDA0002353268570000191
1)维生素预混料为每千克日粮提供：Vitamin A 30000000IU，VitaminD310000000IU，Vitamin E 80000IU，Vitamin K3 10000mg，Vitamin B1 10000mg，VitaminB2 25000mg，Vitamin B6 12000mg，Vitamin B12 120mg，D-泛酸50000mg，叶酸5000mg，D-生物素biotin 500mg。
2)7-25kg阶段矿物质预混料可为每千克日粮提供:350mg Fe(FeSO4·1H2O)，41.67mg Cu(CuSO4·5H2O)，292.78mg Zn(ZnSO4·7H2O)，66.20mg Mn(MnSO4·H2O)，8.31mgI(KI)，30.61mg Se(Na2SeO3)，1209.55mg CaCO3
3)营养水平中消化能、粗蛋白、粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、钙、有效磷、赖氨酸、蛋氨酸均为计算值。
4.试验结果
(1)本发明的饲料有效降低断奶仔猪腹泻率，结果如表11所示。
表11苜蓿对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响
Figure BDA0002353268570000192
由表11可知，与对照相比，苜蓿草粉组与发酵苜蓿草粉组ADG和F/G无显著变化，但与对照组和苜蓿草粉组相比，发酵苜蓿草粉组仔猪腹泻率分别降低了3.75％-3.79％和2.72％-2.76％。上述结果说明，添加8％发酵苜蓿草粉在不影响仔猪生长性能的基础上降低其腹泻率，促进其肠道健康。
(2)本发明的饲料增加断奶仔猪小肠杯状细胞数量，结果如表12所示。
表12发酵苜蓿对断奶仔猪小肠杯状细胞数量的影响
Figure BDA0002353268570000201
由表12可知，与苜蓿草粉组相比，饲喂实施例3和4的发酵苜蓿草粉后，仔猪十二指肠杯状细胞数量分别增加6.6和8.18个/mm，空肠杯状细胞数量分别增加8.15和9.16个/mm，回肠杯状细胞数量分别增加9.03和10.89个/mm；与对照组相比，饲喂实施例3和4的发酵苜蓿草粉后，仔猪空肠杯状细胞数量分别增加4.29和5.3个/mm，回肠杯状细胞数量分别增加0.85和2.71个/mm。杯状细胞的主要功能是分泌粘液素，维持肠道粘膜屏障的完整性。上述结果表明本发明的发酵苜蓿饲料对保护仔猪小肠上皮物理屏障更为有利，一定程度降低其肠上皮受病原微生物侵袭的几率。
(3)本发明的饲料显著降低断奶仔猪结肠食糜中的肠毒性微生物及其毒力因子的含量，结果如表14所示。
表14本发明的饲料对断奶仔猪结肠食糜特定菌群数量的影响[log(拷贝数/g)]
Figure BDA0002353268570000202
Figure BDA0002353268570000211
表14展示了特定菌群及相关毒力因子的real-time PCR结果。与对照组相比，实施例3的发酵苜蓿草粉显著降低了断奶仔猪结肠大肠杆菌肠毒素STb表达量(P<0.05)；实施例4的发酵苜蓿草粉显著降低了仔猪结肠大肠杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌肠毒素STa以及大肠杆菌肠毒素STb的数量(P<0.05)。上述结果表明本发明的发酵苜蓿饲料直接降低猪肠道中的有害菌数量及其毒力因子含量，有利于仔猪肠道微生物态平衡，降低肠道疾病风险。以一个万头猪场(年出栏肥猪10000头)为例，现有商品配合料一般为玉米-豆粕型，按发酵小麦麸替代8％玉米(成本为2000元/吨)计算，本发明的发酵苜蓿成本为1300元/吨，每头猪从断奶到出栏平均约耗料370kg，按玉米添加量平均为60％，则每头猪节约饲料成本12.5元，一个万头猪场每年至少节约饲料成本12.5万元；此外，使用本发明的发酵苜蓿饲料后明显降低仔猪腹泻率，可以预测其能提高仔猪抗病力，节约用药成本或降低仔猪死淘率，潜在经济和社会效益巨大。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种固态发酵苜蓿草粉饲料，其特征在于：包含以下重量份的原料：苜蓿草粉1～3份、营养液1～3份、黑曲霉菌-绿色木霉菌-粗糙链孢霉菌的复合菌培养液0.18～0.54份、热带假丝酵母菌悬液0.06～0.18份。
2.根据权利要求1所述的一种固态发酵苜蓿草粉饲料，其特征在于：所述固态发酵苜蓿草粉饲料，包括以下重量份的原料：苜蓿草粉1份、营养液1份、黑曲霉菌-绿色木霉菌-粗糙链孢霉菌的复合菌悬液0.18份、热带假丝酵母菌悬液0.06份。
3.根据权利要求1或2任意一项所述的一种固态发酵苜蓿草粉饲料，其特征在于：所述苜蓿草粉饲料还包括螺旋藻粉0.5～2份、酵母硒0.05～0.2份和益生菌1～2份。
4.根据权利要求3所述的一种固态发酵苜蓿草粉饲料，其特征在于：所述营养液的组成为：每1L蒸馏水中含有(NH4)2SO4 5g、KH2PO4 1g、CaCl2 0.6g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.5g、ZnSO4 0.5g、MnSO4 0.5g、CoCl2·6H2O 0.5g。
5.根据权利要求3所述的一种固态发酵苜蓿草粉饲料，其特征在于：所述黑曲霉-绿色木霉-粗糙链孢霉的复合菌培养液的组成为：每1L蒸馏水中含有黑曲霉菌悬液1mL、绿色木霉菌悬液1mL、粗糙链孢霉菌菌悬液1mL、葡萄糖10g、可溶性淀粉15g、蛋白胨0.75g、KH2PO41.5g、(NH4)2SO4 2.5g、MgSO4 0.75g。
6.根据权利要求5所述的一种固态发酵苜蓿草粉饲料，其特征在于：所述复合菌培养液中孢子数为1×106CFU/mL。
7.根据权利要求3所述的一种固态发酵苜蓿草粉饲料，其特征在于：所述热带假丝酵母菌培养液的组成为：每1L蒸馏水中含有热带假丝酵母菌悬液1mL、蛋白胨5g、葡萄糖10g、酵母粉3g、麦芽提取物3g。
8.根据权利要求7所述的一种固态发酵苜蓿草粉饲料，其特征在于：所述热带假丝酵母菌培养液中孢子数为1×106CFU/mL。
9.权利要求1～8任意一项所述的一种固态发酵苜蓿草粉饲料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，配制综合PDA培养基和麦芽汁琼脂培养基；
步骤2，将黑曲霉菌(H)、绿色木霉菌(L)和粗糙链孢霉菌(C)分别接种至综合PDA培养基进行活化，以及将热带假丝酵母菌接种于麦芽汁琼脂培养基进行活化；活化后分别使用无菌水冲洗平板上的菌丝或孢子，即得单菌株菌悬液；
步骤3，将黑曲霉菌(H)、绿色木霉菌(L)和粗糙链孢霉菌的单菌株菌悬液分别接种于液体培养基一中培养，将热带假丝酵母菌菌悬液接种于液体培养基二中培养，分别得到黑曲霉菌(H)、绿色木霉菌(L)、粗糙链孢霉菌(C)以及热带假丝酵母菌(J)的菌悬液，最后将黑曲霉菌、绿色木霉菌、粗糙链孢霉菌三种菌株的菌悬液混合成黑曲霉菌-绿色木霉菌-粗糙链孢霉菌的复合菌悬液；
步骤4，将灭菌苜蓿草粉、营养液、黑曲霉菌-绿色木霉菌-粗糙链孢霉菌的复合菌悬液和热带假丝酵母菌悬液配料，先将黑曲霉菌-绿色木霉菌-粗糙链孢霉菌的复合菌悬液和营养液混匀，再加入到灭菌苜蓿草粉中混合均匀，得到混合发酵料；
步骤5，将混合发酵料进行一次发酵，发酵结束后加入热带假丝酵母菌的培养液进行二次发酵，然后烘干既得。
10.权利要求1～8任意一项所述的固态发酵苜蓿草粉饲料或者权利要求9所述的制备方法在饲喂28日龄断奶仔猪中的应用。
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