KR20110104104A - 조류 성장을 향상시키기 위한 식물 성장 조절제의 용도 - Google Patents

조류 성장을 향상시키기 위한 식물 성장 조절제의 용도 Download PDF

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윌리엄 맥카프리
로버트 에드워드 버렐
마크 스티븐 버렐
브렛 코텔코
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알파-제이 리서치 리미티드 파트너쉽
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Abstract

본 발명은 식물 성장 조절제 (성장 호르몬, 인돌 아세트산 등과 같은) 및 호르몬 유사물 (페녹시아세트산 화합물 등)의 사용을 통해 독립영양적, 종속 영양적 또는 광종속 영양적으로 성장하는 조류로부터의 생물량의 생성을 향상시키는 방법을 제공한다. 식물 성장 조절제 또는 이의 유사물은 추가로 조류 배양물 또는 수확된 생물량에서 바이오디젤 또는 전분과 같은 바람직한 부가가치 생성물의 비율을 증가시킬 수 있다.

Description

조류 성장을 향상시키기 위한 식물 성장 조절제의 용도{Use of plant growth regulators to enhance algae growth}
관련 출원에 대한 참조
본 출원은 2009년 1월 13일자로 출원되고 전체 내용이 본원에 참고문헌으로 인용된 미국 임시 특허 출원 번호 61/204,920에 대한 35 U.S.C. §119(e) 하의 출원일의 이점을 주장한다.
조류는 지구상의 유기체 중 가장 다산성이고 널리 퍼지 무리 중 하나이다. 150,000종을 초과하는 조류가 현재 알려져 있으며, 더 많은 종이 발견될 것이다. 다수의 조류 종에 대해, 생물의 전반적인 분류에서 상이한 조류 종을 분류하는 방식에 대해 일부 불확실성이 있지만, 기본적인 확인 특징 및 특성은 공지되어 있다.
조류(많은 상이한 크기 및 색의 식물계 형태, 규조 및 시아노박테리아 포함)는 지구 대기의 대부분에 대한 원인일 뿐만 아니라 생물의 많은 다른 형태의 먹이사슬의 기본을 형성하는 지구상의 생물의 가장 중요한 유형 중 하나를 구성한다. 전체 생태계는 조류를 중심으로 또는 조류와 공생하여 진화하였고, 조류 환경은 먹이 원천, 포식자, 바이러스, 및 대표적으로 더 고등의 생물과 관련한 많은 다른 환경 요소를 포함한다.
조류의 규모 및 중요성에도 불구하고, 직접 사람 사용은 제한되어 왔다. 조류는 특히 아시아에서 종종 "해조"의 형태로 양분으로서 성장하고 수확된다. 이들은 또한 착색제 및 음식 첨가제와 같은 다양한 성분을 생성시키기 위해 널리 사용된다. 조류는 또한 중금속 오염물질을 농축시키고 제거하는 데에 사용되어 왔으며, 규조토로서 공지된 규조의 나머지가 여과 배지로서 그리고 다른 응용을 위해 사용된다.
조류는 또한 디젤 연료, 알코올 (예를 들어, 에탄올) 및 수소 또는 메탄 가스의 생성에 사용될 수 있는 오일, 전분 및 가스를 생성시킬 수 있다.
다른 생물학적 물질도 또한 이들 연료를 생성시킬 수 있지만, 높은 생산성 및 이론적 저비용의 조류가 구별된다. 조류는 다른 형태의 식물보다 10 내지 100 배 더 빠르게 성장할 수 있다. 조류는 또한 바람직한 오일 또는 전분의 생성에서 매우 다산성일 수 있으며, 일부 경우에, 이들 형태에서 고유 중량의 60% 만큼 많이 생성시킨다. 고수율의 이점 이외에, 생물자원을 위한 조류의 사용은 농지도 필요로 않고 새로운 물도 필요로 하지 않는 경작지에 대한 농업과 경쟁하지 못한다. 더욱이, 조류는 이를 모두 대부분의 경우에 독립영양 화학합성생물임에 따라 단지 일광, 물, 공기, 이산화탄소 및 단순 영양소만을 필요로 하는 가장 기본적인 투입물로 달성시킨다.
연료원으로서 조류의 분명한 가능한 이점에도 불구하고, 실제로 상기 가능성을 달성하는 것은 많은 이유로 과거에는 방해받고 어려운 것으로 입증되었다. 예를 들어, 최적 조류 세포증식을 위한 조건은 명백하게 규정되지 않고, 이들은 일반적으로 부가가치 부생성물 (오일/지질 또는 다당류와 같은)의 최적 생성에 필요한 조건과는 상이하다.
본 발명은 예를 들어 부가가치 생물자원 (오일 또는 전분과 같은)의 생성을 위해 특정 식물 성장 조절제 (예를 들어 성장 호르몬)을 사용하여 조류 성장을 조절하기 위한 시스템 및 공정을 제공한다.
따라서, 본 발명의 한 일면은 식물 성장 조절제 또는 이의 유사물의 존재 하에 조류를 배양시켜서 조류 세포수를 증가시키는 것을 포함하여, 조류의 세포증식을 증가시기기 위한 방법을 제공한다.
특정 구체예에서, 조류 세포수는 약 5% 이상, 10%, 20%, 50%, 75%, 2 배, 5 배, 10 배, 20 배, 50 배, 100 배, 500 배, 1000 배, 104 배 (4 로그), 105 배 (5 로그), 106 배 (6 로그), 107 배 (7 로그), 108 배 (8 로그), 109 배 (9 로그) 또는 이를 초과하여 증가한다.
특정 구체예에서, 조류 세포분열의 속도는 약 5%, 10%, 20%, 50%, 75%, 100%, 200%, 500%, 1,000% 이상 까지 증가한다.
특정 구체예에서, 본 배양 조건 하에 조류 배양물에 대한 집단 배가 시간은 약 0.05 - 2 일이다.
특정 구체예에서, 식물 성장 조절제는 옥신, 시토키닌, 지베렐린 및/또는 이들의 혼합물로부터 선택된 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상의 성장 호르몬을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 성장 호르몬은 옥신, 시토키닌 또는 지베렐린으로부터 선택된 각각의 범주/부류의 혼합물로부터 하나 이상 또는 2개 이상을 포함한다.
예를 들어, 옥신은 인돌 아세트산 (IAA) 및/또는 1-나프탈렌아세트산 (NAA)를 포함할 수 있다. 다른 옥신 유사물은 2,4-D; 2,4,5-T; 인돌-3-부티르산 (IBA); 2-메틸-4-클로로페녹시아세트산 (MCPA); 2-(2-메틸-4-클로로페녹시)프로피온산 (메코프로프, MCPP); 2-(2,4-디클로로페녹시) 프로피온산 (디클로로프로프, 2,4-DP); 또는 (2,4-디클로로페녹시)부티르산 (2,4-DB)일 수 있다.
특정 구체예에서, 지베렐린은 GA3를 포함한다.
특정 구체예에서, 시토키닌은 아데닌형 시토키닌 또는 페닐우레아형 시토키닌이다. 예를 들어, 아데닌형 시토키닌 또는 유사물은 키네틴, 제아틴 및/또는 6-벤질아미노푸린을 포함할 수 있고, 페닐우레아형 시토키닌은 디페닐우레아 및/또는 티디아주론 (TDZ)을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 식물 성장 조절제는 추가로 비타민 B1 또는 이들의 유사체/유사물을 포함한다.
특정 구체예에서, 실험대상 성장 조절제들 (예를 들어, 옥신류 성장 조절제 또는 시토키닌류 성장 조절제) 중 단 한 가지가 조류 성장을 위해 사용된다.
특정 구체예에서, 한 가지 이상의 실험대상 성장 조절제가 사용된다. 특정 구체예에서, 한 가지 이상의 옥신류 성장 조절제 및 한 가지 이상의 시토키닌류 성장 조절제가 사용되며, 한 가지 이상의 옥신 대 한 가지 이상의 시토키닌의 중량비는 약 1:2 내지 2:1 (w/w/), 바람직하게는 약 1:1 (w/w)이다. 특정 구체예에서, 옥신 대 지베렐린의 비 (w/w)는 약 1:2 - 2:1, 바람직하게는 약 1:1이다. 특정 구체예에서, 옥신 대 비타민 B1의 비는 약 1:4 - 1:1, 바람직하게는 약 1:2이다.
특정 구체예에서, 유사물은 페녹시아세트산 화합물이다.
특정 구체예에서, 방법은 추가로 최적 세포증식을 위해 필요한 비제한적 수준의 영양소 및 미량원소를 갖는 배지 중에서 조류를 배양시키는 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 영양소는 하나 이상의 C, N, P, S 및/또는 O 원천을 포함한다. 바람직하게는, 영양소의 농도는 세포분열 및/또는 성장에 대해 비독성이다.
특정 구체예에서, 배지는 필요할 때에 또는 필요에 따라 임의적으로 부가적 영양소로 보충된 무산소 생체 소화물의 액체 분리를 포함할 수 있다. 무산소 생체 소화물은 동물 내장, 가축 분뇨, 식품 가공 폐기물, 도시 폐수, 얇은 스틸리지, 증류기 그레인 또는 다른 유기 물질의 무산소 소화로부터 비롯될 수 있다.
특정 구체예에서, 영양소의 농도는 세포분열 및/또는 성장에 대해 비독성이다.
특정 구체예에서, 조류는 세포분열에 대한 최적 온도하에 배양되며, 최적 온도는 비-호열성 조류에 대한 약 0-40℃ 및 호열성 조류에 대한 약 40-95℃ 또는 60-80℃이다.
특정 구체예에서, 조류는 생물반응기에서 배양된다. 바람직하게는, 생물반응기는 최적 세포증식을 위해 조정된다. 바람직하게는, 생물반응기는 살균될 수 있다.
특정 구체예에서, 조류는 종속 영양성, 광종속 영양성 또는 독립 영양성 생리학적 메카니즘을 사용하여 대사된다.
특정 구체예에서, 조류는 크로모피테스 (Chromophytes), 바람직하게는 클로로피테스 (Chlorophytes) 또는 바실라리오피테스 (Bacillariophytes)이다. 특정 구체예에서, 조류는 클로렐라 에스피. (Chlorella sp .) (클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris)와 같은), 옥세노클로렐라 에스피. (Auxenochlorella sp .) (옥세노클로렐라 프로토테코이데스 (Auxenochlorella protothecoides)), 세네데무스 에스피. (Scenedesmus sp.) 및 안키스트로데스무스 에스피. (Ankistrodesmus sp,) 등이다. 특정 구체예에서, 조류는 규조 유리 형태를 갖는다. 특정 구체예에서, 조류는 갈조 (파에오피세아에) 또는 적조가 아니다. 특정 구체예에서, 조류는 트라우스토치트리알레스 (Thraustochytriales)가 아니다.
본 발명의 또 다른 일면은 조류를 식물 성장 조절제 또는 이의 유사물의 존재 하에 배양시켜서 조류 생성물을 축적시키는 것을 포함하는, 조류 생성물을 생성시키기 위한 방법을 제공한다.
특정 구체예에서, 조류 세포수는 1000% 이하, 300%, 200%, 100% 또는 50% 까지 증가한다.
특정 구체예에서, 조류 생물량는 실질적으로 증가한다. 약 5%, 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%, 150%, 200% 이상까지 증가한다. 특정 구체예에서, 조류 생물량는 상기 조류 생성물을 축적시킨 결과로서 크게 증가한다.
특정 구체예에서, 조류는 질소-제한 배지 또는 조류 생성물 합성을 위해 최적화된 질소 수준을 갖는 배지 중에서 배양된다.
특정 구체예에서, 식물 조절 조절제는 오일 자극 인자를 포함한다. 예를 들어, 오일 자극 인자는 풀브산 또는 흄산과 같은 휴민산염을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 조류는 생물반응기에서 배양된다. 바람직하게는, 생물반응기는 조류 생성물의 최적 생성을 위해 조정된다.
특정 구체예에서, 오메가-3, -6 및/또는 -9를 포함하는 조류 생성물과 같은 오일 또는 지질이다.
특정 구체예에서, 조류 생성물은 전분 (또는 다당류)이다. 전분 또는 다당류가 바람직한 조류 생성물인 경우, 조류는 바람직하게는 질소-제한 성장 조건으로 처리되지 않는다.
본 발명의 또 다른 일면은 본 발명의 조류 성장 공정을 위해 조정된 시스템을 제공한다. 바람직하게는, 생물반응기는 종속 영양성 및 광종속 영양성 조건 하에 무균 조류 성장을 용이하게 하기 위해 살균될 수 있다.
본원에 기술된 모든 요소는 적용되는 어디에서나 다른 구체예에서의 특징과 조합될 수 있음이 고려된다.
도 1은 7일 동안 0.1% 효모 추출물 및 0.5% 글루코오스로 보정된 브리스톨 배지에서 성장한 대조군 클로렐라 불가리스를 나타낸다.
도 2는 7일 동안 0.1% 효모 추출물, 0.5% 글루코오스 및 풀브산으로 보정된 브리스톨 배지에서 성장한 클로렐라 불가리스를 나타낸다.
도 3은 식물 성장 조절제의 배합물의 존재 또는 부재 하에 클로렐라 프로토테코이데스의 대표적 성장 곡선을 나타낸다.
도 4는 식물 성장 조절제의 배합물의 존재 또는 부재 하에 클로렐라 프로토테코이데스의 대표적 성장 곡선을 나타낸다.
도 5는 식물 성장 조절제의 배합물의 존재 또는 부재 하에 클로렐라 프로토테코이데스의 대표적 성장 곡선을 나타낸다.
도 6은 식물 성장 조절제의 배합물의 존재 또는 부재 하에 클로렐라 프로토테코이데스의 대표적 성장 곡선을 나타낸다.
본 발명의 한 일면은 부분적으로, 조류 성장 (예를 들어, 지수적 성장 단계 또는 지수적 성장후 단계 동안의 세포 증식)이 특정 식물 성장 조절제 또는 이들의 유사물에 의해 자극될 수 있다는 발견에 근거한 것이다.
따라서, 본 발명의 하나의 일면은 조류를 식물 성장 조절제 또는 이의 유사물의 존재 하에 배양시켜서 조류 세포수를 증가시키는 것을 포함하는, 조류의 세포증식을 증가시키기 위한 방법을 제공한다.
식물 호르몬 또는 조절제는 식물에서 유전자 발현 및 전사 수준, 세포분열, 및 성장에 영향을 준다. 매우 많은 관련된 화학적 화합물은 사람에 의해 합성되며, 배양된 식물, 잡초 및 생체외 성장 식물 및 식물 세포의 성장을 조절하기 위해 사용되어 왔다. 이들 인공 화합물은 종종 식물 성장 조절제 또는 약칭으로 PGR로 불리운다. 합성된 조절에 대해, 이는 천연 조절제와 동일할 수 있거나, 이는 자연에서는 발견되지 않는 화학적 변형물을 함유할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이 "성장 호르몬 (또는 이들의 유사물)"은 천연 식물 호르몬 및 이들의 인공/합성 조절제, 유사물 또는 유도체를 둘 모두 포함한다. 바람직하게는, 성장 호르몬/조절제 또는 이들의 유사물은 최소한 하나의 농도 하에, 바람직하게는 실시예 3-7과 같이 하기의 실시예에 사용된 것과 유사하거나 동일한 조건 하에 조류 성장을 자극한다. 용어 "성장 호르몬" 및 "성장 조절제"는 본원에서 호환적으로 사용될 수 있다.
일반적으로, 식물 호르몬 및 조절제는 5가지의 주요 류로 분류되며, 이중 일부는 하나의 식물로부터 다음 식물로 구조가 변할 수 있는 많은 상이한 화학물질로 이루어진다. 화학물질은 각각 이들의 구조적 유사성 및 식물 생리학에 대한 이들의 효과에 근거하여 이들 류 중 하나로 함께 그룹화된다. 다른 식물 호르몬 및 성장 조절제는 이들 류로 쉽게 그룹화되지 않는다. 오히려, 이들은 천연적으로 존재하거나, 식물 성장을 억제하거나 식물 내에서 생리적 공정을 차단하는 화학물질을 포함하여 사람 또는 다른 유기체에 의해 합성된다.
5개의 주요 류는 아브시스산 (또한 ABA로 불리움); 옥신; 시토키닌; 에틸렌; 및 지베렐린이다. 다른 확인된 식물 성장 조절제는 브라시놀라이드 (동물 스테로이드 호르몬과 화학적으로 유사한 식물 스테로이드. 이들은 세포 신장 및 세포분열, 목질부 조직의 분화를 조장하고, 잎 절제를 억제함); 살리실산 (병원성 침입에 대한 방어에 도움을 주는 화학물질을 생성시키는 일부 식물에서 유전자를 활성화시킴); 자스모네이트 (지방산으로부터 생성되며, 유기체를 침입하는 것을 방어하기 위해 사용되는 방어 단백질의 생성을 조장하는 것으로 여겨짐. 이들은 또한 종자 발아에서 역할을 하고 종자에서 단백질의 저장에 영향을 주는 것으로 믿어지며, 뿌리 성장에 영향을 주는 것으로 여겨진다); 식물 펩티드 호르몬 (세포 대 세포 신호화에 수반되는 모든 작은 분비된 펩티드를 포함함. 이들 작은 펩티드 호르몬은 방어 메카니즘, 세포분열 및 팽창의 조절 및 화분 자가불화합성을 포함하는 식물 성장 및 발달에서 중요한 역할을 한다); 폴리아민 (지금까지 연구된 모든 유기체에서 발견된 저분자량을 갖는 강한 염기성 분자. 이들은 식물 성장 및 발달에 필수적이며, 유사분열 및 감수분열의 공정에 영향을 준다); 질소 산화물 (NO) (호르몬성 및 방어 반응에서 신호로서 작용함); 스트리고락톤 (가지 분지의 억제에 관련됨)을 포함한다.
아브시스산 류의 PGR은 특히 식물이 스트레스를 받을 때에 엽록체로부터 기원하는 식물의 잎에서 정상적으로 생성되는 하나의 화학적 화합물로 구성된다. 일반적으로, 이는 눈 성장, 종자 및 눈 휴면에 영향을 주는 억제성 화학적 화합물로서 작용한다.
옥신은 세포 생장, 눈 생성 및 뿌리 분화에 양성적으로 영향을 주는 화합물이다. 이들은 또한 다른 호르몬의 생성을 조장하며, 시토키닌과 함께, 이들은 줄기, 뿌리 및 과실의 성장을 조절하고, 줄기를 꽃으로 전환시킨다. 옥신은 세포벽 적응성을 변경시킴으로써 세포 신장에 영향을 준다. 옥신은 광을 감소시키고, 이것이 어두어지는 경우에 증가시킨다. 옥신은 많은 농축물에서 식물에 대해 독성이며; 이들은 쌍떡잎식물에 대해 가장 독성이며, 외떡잎식물에 대해서는 덜하다. 상기 특성 때문에, 2,4-D 및 2,4,5-T를 포함하는 합성 옥신 제초제가 개발되었고, 잡초 조절을 위해 사용되었다. 옥신, 특히 1-나프탈렌아세트산 (NAA) 및 인돌-3-부티르산 (IBA)는 또한 식물을 절단 때에 뿌리 성장을 자극하는 것으로 공통적으로 적용된다. 식물에서 발견된 가장 공통적인 옥신은 인돌아세트산 또는 IAA이다.
옥신 군의 중요한 구성원은 인돌-3-아세트산 (IAA)이다. 이는 온전한 식물에서 옥신 효과의 대부분을 발생시키고, 가장 중요한 천연 옥신이다. 그러나, IAA의 분자는 수용액 중에서 화학적으로 불안정하다. 다른 천연 옥신은 4-클로로-인돌아세트산, 페닐아세트산 (PAA) 및 인돌-3-부티르산 (IBA)를 포함한다. 공통적 합성 옥신 유사체는 1-나프탈렌아세트산 (NAA), 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D) 등을 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 수가지 대표적 (비제한적) 천연 및 합성 옥신은 아래에 나타나 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
시토키닌 또는 CK는 세포분열 및 가지 생성에 영향을 주는 일군의 화학물질이다. 이들은 또한 노화를 지연시키는 데에 도움을 주거나, 조직의 노화는 식물 전체에 걸친 옥신 운반을 매개하는 것에 반응하며, 마디간 길이 및 잎 성장에 영향을 준다. 이들은 옥신과 협력하여 고상승 효과를 가지며, 식물 호르몬의 2가지 그룹의 비는 식물 수명 동안 가장 주요한 성장 기간에 영향을 준다. 시토키닌은 옥신에 의해 유도되는 정점 우성에 반대되며; 이들은 에틸렌과 함께 잎, 꽃 및 과실 부분의 절단을 조장한다.
2가지 유형의 시토키닌이 있다 : 키네틴, 제아틴 및 6-벤질아미노푸린에 의해 표현되는 아데닌형 시토키닌, 및 디페닐우레아 또는 티디아주론 (TDZ)과 같은 페닐우레아형 시토키닌.
Figure pct00003
에틸렌은 모든 세포 내에 있는 메티오닌의 파괴로부터 Yang Cycle을 통해 생성되는 가스이다. 식물 호르몬으로서의 이의 효능은 이의 생성 속도 대 대기 내로의 이의 방출 속도에 의존한다. 에틸렌은 특히 어둠 속에서 세포를 빠르게 성장시키고 분열시키는 데에 있어서 더 빠른 속도로 생성된다. 새로운 성장 및 새로 발아된 실생식물은 식물로부터 방출되는 것보다 많은 에틸렌을 생성시키며, 이는 상승된 양의 에틸렌을 유도하여 잎 팽창을 억제한다. 새로운 가지가 광에 노출됨에 따라, 식물 세포 중의 피토크롬에 의한 반응은 에틸렌 생성을 감소시키려는 신호를 생성시켜서 잎 팽창을 허용한다. 에틸렌은 세포 성장 및 세포 형태에 영향을 주며; 성장 가지가 장애물에 부딪히면서 지하로 들어가는 경우, 에틸렌 생성이 크게 증가하여 세포 신장을 방지하고 줄기를 팽윤시킨다. 생성되는 더 두꺼운 줄기는 표면으로의 이의 경로를 막는 대상물에 대해 더 높은 압력을 부과할 수 있다. 가지가 표면에 도달하지 않고, 에틸렌 자극이 연장되게 되는 경우, 이는 수직으로 성장하도록 하는 줄기 천연 굴지성 반응에 영향을 주어서, 이것이 대상물 둘레로 성장하게 된다. 연구는 에틸렌이 줄기 직경 및 높이에 영향을 줌을 나타내는 것으로 여겨진다: 나무의 줄기가 바람을 맞아서 측면 스트레스를 유발하는 경우, 더 높은 에틸렌 생성이 일어나서, 더 두껍고 더 견고한 나무 줄기 및 가지를 결과한다. 에틸렌은 과실-성숙에 영향을 준다: 정상적으로, 종자가 성숙되는 경우, 에틸렌 생성은 과실 내에서 증가하고 축적하여, 종자 처분 직전에 전환기 사선을 결과한다. 핵 단백질 ETHYLENE INSENSITIVE2 (EIN2)는 에틸렌 생성에 의해 조절되고, 또한, ABA 및 스트레스 호르몬을 포함하는 다른 호르몬을 조절한다.
Figure pct00004
지베렐린 또는 GA는 식물 내에서 천연적으로 그리고 균류에 의해 생성되는 여러가지 화학물질을 포함한다. 지베렐린은 새로운 세포의 성장을 위해 사용되는 양분 생성을 이동시키는 효소 생성에 영향을 주는 종자 발아에 중요하다. 이는 염색체 전사를 조절함으로써 수행된다. 곡물 (쌀, 밀, 옥수수 등) 종자에서, 호분 층으로서 불리우는 세포의 층은 배젖 조직을 둘러싼다. 종자에 의한 물의 흡수는 GA의 생성을 유발한다. GA는 성장 실생식물에 의해 이용되는 배젖 내의 저장된 양분 비축물을 분해시키는 효소를 생성시킴으로써 반응하여, 호분 층으로 운반된다. GA는 장미 매듭-생성 식물의 볼팅을 생성시켜서 미디간 길이를 증가시킨다. 이들은 개화, 세포분열, 및 종자에서 발아후 성장을 조장한다. 지베렐린은 또한 ABA에 의해 유도되는 가지 성장 및 휴지의 억제를 역전시킨다.
모든 공지된 지베렐린은 색소체에서 테르페노이드 경로에 의해 합성된 후, 이들이 생물학적 활성 형태에 도달할 때 까지 세포질 망상구조 및 시토졸에서 변형되는 디테르페노이드산이다. 모든 지베렐린은 개미-지베렐란 골격으로부터 유도되지만, 개미-카우렌을 통해 합성된다. 지베렐린은 발견의 순서로 GA1....GAn으로 불리운다. 구조적으로 특징이 있는 제 1 지베렐린인 지베렐린산은 GA3이다. 2003년부터, 식물, 균류 및 박테리아로부터 126가의 GA가 확인되었다. 지베렐린은 사중고리 디테르펜산이다. 19개 탄소 또는 20개 탄소의 존재에 근거한 2가지 류가 있다. 지베렐린산과 같은 19-탄소 지베렐린은 탄소 20을 상실하였고, 대신에, 탄소 4 및 10을 결합시키는 5-원 락톤 브릿지를 갖는다. 19-탄소 형태는 일반적으로, 지베렐린의 생물학적 활성 형태이다. 히드록실화는 또한 지베렐린의 생물학적 활성에 대한 큰 효과를 갖는다. 일반적으로, 가장 생물학적으로 활성인 화합물은 탄소 3 및 탄소 13 둘 모두 상에 히드록실기를 갖는 디히드록실화된 지베렐린이다. 지베렐린산은 히히드록실화된 지베렐린이다. 대표적 (비제한적) 지베렐린은 아래에 나타나 있다:
Figure pct00005
본 발명에 사용될 수 있는 대표적 성장 호르몬/조절제 또는 이들의 유사물 (예를 들어, 조류 배양물에 첨가되어, 세포분열 또는 증식을 증가시킨)은 옥신류, 시토키닌류 및/또는 지베렐린류를 포함한다.
예를 들어, 본 발명에 유용한 옥신 및 유사물은 하기 화합물을 포함한다 (비제한적): 인돌 아세트산 (IAA); 2,4-D; 2,4,5-T; 1-나프탈렌아세트산 (NAA); 인돌-3-부티르산 (IBA); 2-메틸-4-클로로페녹시아세트산 (MCPA); 2-(2-메틸-4-클로로페녹시)프로피온산 (메코프로프, MCPP); 2-(2,4-디클로로페녹시)프로피온산 (디클로로프로프, 2,4-DP); (2,4-디클로로페녹시)부티르산 (2,4-DB); 4-클로로-인돌아세트산 (4-Cl-IAA); 페닐아세트산 (PAA); 2-메톡시-3,6-디클로로벤조산 (디캄바); 4-아미노-3,5,6-트리클로로프로피온산 (토르돈 또는 피클로람); α-(p-클로로페녹시)이소부티르산 (PCIB, 안티옥신) 또는 이들의 혼합물. 혼합물로서 사용되는 경우, 혼합물은 바람직하게는 유효량의 IAA (단독으로 사용되는 경우) 또는 유효량의 IAA + NAA와 동등한 생물학적 활성을 갖는다 (예를 들어, 실질적으로 동일한 성장 조건 하에서, 조류 세포 성장을 실질적으로 동일한 정도로, 바람직하게는 실질적으로 동일한 시간 내에 자극한다). 예를 들어, 하기의 실시예에 사용된 조건을 참조한다.
본 발명을 위해 유용한 시토키닌 및 유사물은 아데닌형 또는 페닐우레아형이며, 키네틴, 제아틴, 6-벤질아미노푸린 (6-BA 또는 6-BAP), 디페닐우레아, 티디아주론 (TDZ) 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다 (비제한적). 바람직하게는, 키네틴, 제아틴, 6-벤질아미노푸린 (6-BA 또는 6-BAP) 또는 이들의 혼합물과 같은 아데닌형 시토키닌이 사용된다. 혼합물로서 사용되는 경우, 혼합물은 바람직하게는 유효량의 키네틴 + 6-BA와 동등한 생물학적 활성을 갖는다 (예를 들어, 실질적으로 동일한 성장 조건 하에서, 조류 세포 성장을 실질적으로 동일한 정도로, 바람직하게는 실질적으로 동일한 시간 내에 자극한다). 예를 들어, 하기의 실시예에 사용된 조건을 참조한다.
본 발명에 유용한 지베렐린 및 유사물은 GA3와 같은, 본원에 기술되거나 당분야에 공지된 지베렐린 중 임의의 것일 수 있다. 바람직하게는, 지베렐린, 유사물 또는 유도체 또는 이들의 혼합물은 유효량 GA3와 동등한 생물학적 활성을 갖는다 (예를 들어, 실질적으로 동일한 성장 조건 하에서, 조류 세포 성장을 실질적으로 동일한 정도로, 바람직하게는 실질적으로 동일한 시간 내에 자극한다). 예를 들어, 하기의 실시예에 사용된 조건을 참조한다.
유사물은 또한 페녹시아세트산 화합물일 수 있다.
최적 성장 자극 효과를 달성하기 위해, 특정 구체예에서, 본 성장 조절제 (예를 들어, 옥신류 성장 조절제, 시토키닌류 성장 조절제 또는 지베렐린류 성장 조절제) 중 단지 하나가 조류 성장을 위해 사용된다. 특정의 다른 구체예에서, 하나를 초과하는 본 성장 조절제가 사용된다. 예를 들어, 하나 이상의 옥신류 성장 조절제 및 하나 이상의 시토키닌류 성장 조절제가 사용될 수 있으며, 배지 중의 총 옥신 대 총 시토키닌의 (중량)비는 약 1:2 내지 2:1, 바람직하게는 약 1:1로 조절될 수 있다.
바람직하게는, 지베렐린이 존재하는 경우, 배지 중의 총 옥신 대 총 지베렐린의 (중량)비는 약 1:2 내지 2:1, 바람직하게는 약 1:1로 조절될 수 있다.
특정 구체예에서, 비타민 B1 또는 이의 유사물, 유도체, 또는 기능적 등가물이 존재할 수 있다. 바람직하게는, 배지 중의 총 옥신 대 총 비타민 B1의 (중량)비는 약 1:4 내지 1:1, 바람직하게는 약 1:2로 조절될 수 있다.
특정 구체예에서, 성장 배지 중의 옥신의 총 농도는 약 0.01 - 0.04 ㎍/L, 약 0.003 - 0.12 ㎍/L, 약 0.002 - 0.2 ㎍/L, 또는 약 0.001 - 0.4 ㎍/L이다.
특정 구체예에서, 성장 배지 중의 시토키닌의 총 농도는 약 0.01 - 0.04 ㎍/L, 약 0.003 - 0.12 ㎍/L, 약 0.002 - 0.2 ㎍/L, 또는 약 0.001 - 0.4 ㎍/L이다.
특정 구체예에서, 성장 배지 중의 지베렐린의 총 농도는 약 0.01 - 0.04 ㎍/L, 약 0.003 - 0.12 ㎍/L, 약 0.002 - 0.2 ㎍/L, 또는 약 0.001 - 0.4 ㎍/L이다.
특정 구체예에서, 성장 배지 중의 비타민 B1 화합물의 총 농도는 약 0.02 - 0.08 ㎍/L, 약 0.006 - 0.24 ㎍/L, 약 0.004 - 0.4 ㎍/L, 또는 약 0.002 - 0.8 ㎍/L이다.
특정 구체예에서, 에틸렌, 브라시놀라이드, 살리실산, 자스모네이트, 식물 펩티드 호르몬, 폴리아민, 질소 산화물, 및/또는 스트리고락톤이 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 에틸렌, 브라시놀라이드, 자스모네이트, 식물 펩티드 호르몬, 및/또는 폴리아민이 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 하나 이상의 호르몬/조절제의 존재는 조류 증식을 바람직하게는 실시예, 예를 들어, 실시예 3-7에서의 성장 조건 중 하나 하에서 약 15% (예를 들어, 1.4 내지 1.6), 20%, 25%, 30%, 35% 이상까지 증가시킨다.
본 발명의 상기 일면에 따라, 조류 세포수는 약 5% 이상, 10%, 20%, 50%, 75%, 2 배, 5 배, 10 배, 20 배, 50 배, 100 배, 500 배, 1000 배, 104 배 (4 로그), 105 배 (5 로그), 106 배 (6 로그), 107 배 (7 로그), 108 배 (8 로그), 109 배 (9 로그) 또는 이를 초과하여 증가한다.
배지 중에 사용되는 특정 식물 성장 조절제와 무관하게, 다양한 상이한 배지가 조류 성장을 지지하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 적합한 배지는 질소, 미량금속 (예를 들어, 인, 칼륨, 마그네슘, 및 철 등)의 무기염, 비타민 (예를 들어, 티아민) 등을 포함할 수 있으며, 이는 성장에 필수적일 수 있다. 예를 들어, VT 배지, C 배지, MC 배지, MBM 배지 및 MDM 배지 (Sorui Kenkyuho, ed. by Mitsuo Chihara and Kazutoshi Nishizawa, Kyoritsu Shuppan (1979)), OHM 배지 (see Fabregas et al., J. Biotech., Vol. 89, pp. 65-71 (2001)), BG-11 배지, 브리스톨 배지 및 이들의 변형물과 같은 배지가 사용될 수 있다. 적합한 배지의 다른 예는 용원성 액체 배지, 기수, 영양소가 첨가된 물, 낙농 유거수, 1% 이하의 염도를 갖는 배지, 1% 초과의 염도를 갖는 배지, 2% 초과의 염도를 갖는 배지, 3% 초과의 염도를 갖는 배지, 4% 초과의 염도를 갖는 배지 및 이들의 배합물을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 가장 바람직한 배지는 임의적으로 부가적 영양소로 보충된 무산소 생체 소화물의 액체 분리를 포함한다. 액체는 스크류 프레스 또는 원심분리에 의해서와 같이 기계적 수단에 의해 무산소 생체 소화물로부터 분리될 수 있다. 액체는 이상적으로 5-10% 이하의 고체 함량, 바람직하게는 8% 이하의 고체 함량을 포함한다.
이들 배지는 바람직한 조류 생성물의 성장, 증식 또는 도입과 같은 이들의 용도에 의존하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 최적 세포분열/증식을 위해, 질소 원천으로서 작용하는 다량의 성분을 갖는 배지 (예를 들어, 리치 배지: 질소에 대해 표현하여 약 0.15 g/L 이상을 함유함). 조류 생성물 (예를 들어, 오일) 생성을 위해, 질소 원천으로서 작용하는 소량의 성분을 갖는 배지 (예를 들어, 질소에 대해 표현하여 약 0.02 g/L 미만을 함유함)이 바람직하다. 대안적으로, 이들 배지 사이의 중간 농도로 질소 원천을 함유하는 배지 (저영양소 배지: 질소에 대해 표현하여 0.02 g/L 이상 및 0.15 g/L 미만을 함유함)이 사용될 수 있다.
다시 말하면, 지수적 성장 단계 동안, 배지는 바람직하게는 최적 세포수 증가를 위해 필요한 비제한적 수준의 영양소 (하나 이상의 C, N, P, S 및/또는 O 원천을 포함함) 및 미량원소을 갖는다. 바람직하게는, 영양소의 농도는 세포분열 및/또는 성장에 대해 비독성이다.
질소 농도, 인 농도, 및 배지의 다른 특성은 접종하려는 조류의 양 및 이들의 기대되는 성장 속도에 의존하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 105 세포/ml 정도의 조류 수가 저영양소 (예를 들어, 질소) 배지 중에서 접종되는 경우, 조류는 특정 정도로 성장할 것이지만, 성장은 질소 원천의 양이 너무 적기 때문에 중단될 것이다. 이러한 저영양소 배지는 성장 및 조류 생성물 생성을 단일 단계로 (예를 들어, 배치 방식으로) 연속적으로 수행하기 위해 적합하다. 더욱더, N/P 몰비를 약 10-30, 바람직하게는 15-25의 값으로 조절하거나, C/N 몰비를 약 12-80 (예를 들어, 더 낮은 N 함량)을 조절함으로써, 조류는 바람직한 생물자원 (예를 들어, 오일)을 생성시키기 위해 도입될 수 있다. 접종을 위한 조류 수가 더 높은 경우에, 리치 배지는 상기 언급된 배양을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방식으로, 배지의 조성물은 다양한 조건을 고려하여 결정될 수 있다.
조류 성장 배지 중의 질소 원천 또는 질소 공급물은 질산염, 암모니아, 우레아, 아질산염, 암모늄염, 수산화암모늄, 질산암모늄, 글루탐산 일나트륨, 가용성 단백질, 불용성 단백질, 가수분해된 단백질, 동물 부생성물, 낙농 폐기물, 카세인, 유정, 가수분해된 카세인, 가수분해된 유정, 콩제품, 가수분해된 콩제품, 효모, 가수분해된 효모, 옥수수 침지액, 옥수수 침지수, 옥수수 침지 고체, 증류기 그레인, 효모 추출물, 질소의 산화물, N2O 또는 다른 적합한 원천 (예를 들어, 다른 펩티드, 올리고펩티드, 및 아미노산 등)을 포함할 수 있다. 탄소 원천 또는 탄소 보충물은 당, 단당류, 이당류, 당 알코올, 지방, 지방산, 인지질, 지방 알코올, 에스테르, 올리고당류, 다당류, 혼합된 당류, 글리세롤, 이산화탄소, 일산화탄소, 전분, 가수분해된 전분, 또는 다른 적합한 원천 (예를 들어, 다른 5-탄소 당 등)을 포함할 수 있다.
부가적 배지 성분 또는 보충물은 완충제, 미네랄, 성장인자, 발포방지제, 산, 염기, 항생제, 계면활성제, 또는 바람직하지 않은 세포를 억제하기 위한 물질을 포함할 수 있다.
영양소는 단일 후속 단일 후속 첨가로서, 조류 성장 동안 연속 공급으로서, 성장 동안 동일하거나 상이한 영양소의 다중 투여로서 또는 이들 방법의 조합으로서, 초기에 모두, 또는 초기에 일부 및 성장 공정 동안에 일부가 첨가될 수 있다.
배양물의 pH는, 바람직한 경우에, 완충제의 사용을 통해, 또는 초기에 또는 성장 동안 산 또는 염기의 첨가에 의해 조절 또는 조정될 수 있다. 일부 경우에, 산 및 염기 둘 모두는 pH를 초과하여 바람직한 정도의 조절을 달성하기 위해 동일하거나 상이한 시간에 반응기의 상이한 영역에서 또는 동일한 영역에서 사용될 수 있다. 완충계의 비제한적 예는 일염기, 이염기 또는 삼염기 인산염, TRIS, TAPS, 비신, 트리신, HEPES, TES, MOPS, PIPES, 카코딜레이트, MES 및 아세테이트를 포함한다. 산의 비제한적 예는 황산, HCl, 락트산 및 아세트산을 포함한다. 염기의 비제한적 예에는 수산화칼륨, 수산화나트륨, 수산화암모늄, 암모니아, 중탄산나트륨, 수산화칼슘 및 탄산나트륨이 포함된다. pH를 변경시키는 것 이외에, 이들 산 및 염기의 일부는 세포에 대한 영양소로서 작용할 수 있다. 배양물의 pH는 성장의 전체 과정에 걸쳐 일정한 값에 근접하도록 조절될 수 있거나, 성장 동안 변동될 수 있다. 이러한 변동은 상이한 분자 경로를 개시하거나 종료하거나, 하나 이상의 특정 생성물을 생성시키거나, 지방, 염료 또는 생물활성 화합물과 같은 생성물을 축적하거나, 다른 미생물의 성장을 억제하거나, 발포 생성물을 억제하거나 조장하거나, 세포를 휴지시키거나, 이들을 휴지 상태로부터 재생시키거나, 일부 다른 용도를 위해 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 배양 기간 전체에 걸쳐 pH를 약 4-10, 또는 약 6 내지 8로 유지시키는 것이 바람직하다.
또한, 배양물의 온도는 일부 구체예에서 특정 값에 근접하도록 조절 또는 조정될 수 있거나, pH 변동에 대해 기재된 바와 동일하거나 상이한 용도를 위해 성장 동안 변동될 수 있다. 예를 들어, 제 1 성장 조건 동안, 세포분열에 대한 최적 온도는 비-호열성 조류에 대해 약 0-40℃, 20-40℃, 15-35℃ 또는 약 20-25℃; 및 호열성 조류에 대해 약 40-95℃, 바람직하게는 약 60-80℃일 수 있다.
이러한 특정 구체예에서, 배지의 온도와 같은 시스템 내의 온도를 측정하는 온도 측정 요소, 및 측정 온도에 응하여 온도를 조절할 수 있는 조절 요소를 포함하는 온도 조절 요소가 제공된다. 조절 성분은 배양 용기의 측면 또는 바닥 벽 상에 침지된 코일 또는 재킷을 포함할 수 있다.
조류는 개방 못, 수로 또는 도랑 등과 같은 천연 환경에서 또는 밀폐 생물반응기 (콘테이너 또는 용기 등)에서 배양될 수 있다. 성장 조건이 변동 또는 조절되는 것이 필요한 경우, 조류 배양물은 제 1 성장 조건 하에 제 1 생물반응기에서, 및 제 2 성장 조건 하에 제 2 생물반응기에서 성장할 수 있다. 상이한 단계는 분리 배양 탱크/용기를 사용하여 배치 방식으로 독립적으로 수행될 수 있다. 또한, 성장된 조류를 한 단계의 종료시에 세척하고 수집하고, 조류를 다시 동일한 배양 탱크 내에 넣은 후, 다음 단계를 수행하는 것이 가능하다. 특정 구체예에서, 세척은 임의적이고, 제 1 반응기 중의 배지에 반드시 의존하거나 의존하지 않을 수 있다.
개방 못 (또는 수로 등) 또는 밀폐 (바람직하게는 살균성) 생물반응기가 배치식으로, 연속식으로 또는 반-연속식으로 작동될 수 있다. 예를 들어, 배치식에서, 못/생물반응기는 새롭고/거나 재순환된 배지 및 접종물로 적절한 수준으로 충전된다. 상기 배양물은 바람직한 정도의 성장이 발생될 때까지 성장하게 된다. 이 시점에서, 생성물의 수확이 일어난다. 하나의 구체예에서, 전체 못/생물반응기 함유물이 수확된 후, 못/생물반응기는 필요에 따라 세척되고 위생처리되고 (예를 들어, 생물반응기에 대해 살균되고), 배지 및 접종물로 재충전된다. 또 다른 구체예에서, 함유물의 단지 일부는 예를 들어 약 50% 수확된 후, 배지가 첨가되어 못/생물반응기를 재충전시키고, 성장이 연속된다.
대안적으로, 연속식에서, 새롭고/거나 재순환된 배지, 및 새로운 접종물은 못/생물반응기에 연속적으로 공급되면서, 세포 물질의 수확이 연속적으로 일어난다. 연속 작업에서, 수확이 지연되어 충분한 세포 농도가 축적되게 되는 초기 개시 단계일 수 있다. 상기 개시 단계 동안, 배지 공급 및/또는 접종물 공급이 차단될 수 있다. 대안적으로, 배지 및 접종물은 못/생물반응기에 첨가될 수 있으며, 못/생물반응기가 바람직한 액체 부피가 될 때에, 수확이 개시된다. 다른 개시 기술은 바람직함에 따라 작업 요건을 충족시키기 위해 그리고 적절함에 따라 특정 생성물 유기체 및 성장 배지를 위해 사용될 수 있다. 배양물이 제 1 못/생물반응기에서 성장되는 경우, 배양물의 약 10-90%, 또는 20-80%, 또는 30-70%가 제 2 못/생물반응기에 전달될 수 있으며, 잔류 함유물이 제 1 못/생물반응기에서 후속 성장을 위한 개시 배양물로서 작용한다. 대안적으로, 배양물의 약 100%는 제 2 못/생물반응기에 전달되며, 제 1 못/생물반응기는 새로운 원천으로 접종된다.
연속 못/생물반응기 배양물은 "교반 방식" 또는 "플러그 흐름 방식" 또는 "조합 방식"으로 작동될 수 있다. 교반 방식에서, 배지 및 접종물은 일반 용량의 못/생물반응기 내로 첨가되고 혼합된다. 혼합 장치에는 패들휠, 프로펠러, 터어빈, 패들, 또는 수직, 수평 또는 혼합 방향으로 작동하는 공기 펌프가 포함되지만 이들로 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 혼합은 배지 또는 접종물을 첨가함으로써 생성되는 난류에 의해 달성되고 보조된다. 세포 및 배지 성분의 농도는 못/생물반응기의 수평 영역을 가로질러 크게 변하지 않는다. 플러그 흐름 방식으로, 배지 및 접종물은 못/생물반응기의 한 말단에서 첨가되고, 수확은 나머지 말단에서 일어난다. 플러그 흐름 방식으로, 배양물은 일반적으로 배지 입구로부터 수확 지점을 향해 이동한다. 배양물의 이동은 못/생물반응기의 경사, 혼합 장치, 펌프, 못/생물반응기의 표면을 가로질러 송풍된 가스, 및 못/생물반응기의 한 말단에서의 물질의 첨가 및 나머지 말단에서의 제거와 관련된 이동을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 수단을 통해 달성될 수 있다. 배지 성분은 못/생물반응기 중의 다양한 지점에서 첨가되어, 세포 성장의 상이한 단계에 대한 상이한 성장 조건을 제공할 수 있다. 또한, 배양물의 온도 및 pH는 못/생물반응기의 상이한 지점에서 변할 수 있다. 임의적으로, 역혼합이 다양한 지점에서 제공될 수 있다. 활성 혼합은 혼합기, 패들, 배플 또는 다른 적절한 기술의 사용을 통해 달성될 수 있다.
배합 방식으로, 못/생물반응기의 일부는 플러그 흐름 방식으로 작동할 것이며, 일부는 교반 방식으로 작동하게 된다. 예를 들어, 배지는 교반 영역 중에 첨가되어, "자체 파종" 또는 "자체 접종" 시스템을 생성시킬 수 있다. 성장 세포를 갖는 배지는 교반 영역으로부터 플러그 흐름 영역으로 이동하여, 세포가 수확 지점 까지 그 성장을 계속한다. 교반 영역은 바람직한 효과에 의존하여 초기에, 중간에 또는 못/생물반응기의 말단을 향해 위치할 수 있다. 자체 파종 배양물을 생성시키는 것 이외에, 이러한 교반 영역은 세포를 특정 시약 또는 배지 성분의 특정 조건 또는 농도에 노출시키는 특정 체류 시간을 제공하는 것을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 용도에 사용될 수 있다. 이러한 교반 영역은 배플, 장벽, 디버터 및/또는 혼합 장치를 통해 달성될 수 있다.
반연속 배양물은 못/생물반응기를 초기량의 배지 및 접종물로 충전시킴으로써 작동될 수 있다. 성장 계속됨에 따라, 부가적 배지는 연속적으로 또는 일정 간격으로 첨가된다.
특정의 바람직한 구체예에서, 조류 배양물은 하나 이상의 밀폐 (바람직하게는 살균성) 생물반응기에서 성장할 수 있다. 이러한 밀폐 배양물 및 수확 시스템은 살균되어, 오염 조류, 박테리아, 바이러스 및 조류 소비 미생물 및/또는 다른 외인성 종으로부터의 문제점을 크게 감소시킬 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "살균"은 표면, 설비, 식품 또는 의약품 또는 생물학적 배지로부터 전염제 (균류, 박테리아, 바이러스, 포자 형태 등과 같은)를 효과적으로 치사시키거나 제거하는 임의의 공정을 포함한다. 살균은 열, 화학물질, 방사선 조사, 고압, 여과 또는 이들의 병용의 적용을 통해 달성될 수 있다. 2가지 이상의 넓은 범주의 살균이 있다 : 물리적 및 화학적. 물리적 살균은 열 살균, 방사선 살균, 고압 가스 살균 (초임계 CO2)를 포함한다. 화학적 살균은 산화에틸렌, 오존, 염소 표백제, 글루타르알데히드 폴름알데히드, 과산화수소, 과아세트산, 또는 알코올 (예를 들어 70% 에탄올, 70% 프로판올) 등을 포함한다. 방사선을 통한 살균은 자외(UV)광을 사용하는 것을 포함한다. 본원에 기술되고 당분야에 공지된 모든 수단은 본 발명에 사용되는 배양 탱크, 용기 및 콘테이너를 살균시키기 위해 조정될 수 있다.
특정 구체예에서, 이러한 생물반응기는 외부 환경에서 설치되고 작동되도록 설계될 수 있으며, 이는 환경적 광 및/또는 온도에 노출된다. 장치, 시스템 및 방법은 최적 성장 및 오일 생성과 양립할 수 있는 범위 내에서 온도를 유지시키기 위해 유용한 개선된 열조절을 제공하도록 설계될 수 있다. 특정 구체예에서, 이들 시스템은 일반 농작 곡물 (옥수수, 밀, 대두, 카놀라 또는 쌀과 같은)의 경작용으로 중요하지 않거나 쓸모 없는 토지에서 구성되고 작동될 수 있다.
특정 구체예에서, 조류는 살균되거나 살균되지 않을 수 있는 개방 못에서 최소한 특정 단계 동안 성장할 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 종속 영양성 호염성 조류는 염수-기반의 배지 중의 개방 공기 중에서 성장할 수 있으며, 이 조건은 모든 다른 세포의 성장을 실질적으로 제한한다. 유사하게, 특정 구체예에서, 호열성 종속 영양성 조류는 실질적으로 모든 다른 유기체의 성장을 제한하는 온도에서 성장할 수 있다.
조류를 배양하기 위한 가장 간단한 장치에 대한 특정 제한은 없다. 그러나, 장치가 바람직하게는 독립영양 성장을 위해 영양소 (이산화탄소를 포함) 및 광을 공급하고, 임의적으로, 종속 영양 성장을 위해 영양소 (유기 탄소 포함)을 공급할 수 있고, 임의적으로, 광종속 영양 성장 조건 하에 배양 현탁액을 광으로 방사선조사할 수 있다. 예를 들어, 소규모 배양의 경우에, 평평한 배양 플라스크가 바람직하게 사용될 수 있다. 대규모 배양 (레이스 트랙 또는 수로 가공 시스템 중에서의 배양)의 경우에, 투명한 판 (예를 들어, 유리, 플라스틱 등으로 제조됨)에 의해 구성되고, 필요에 따라, 방사선 조사 장치 및 교반기가 장착된 배양 탱크 또는 용기가 사용될 수 있다. 이러한 배양 탱크의 예는 판형 배양 탱크, 튜브형 배양 탱크, 에어돔형 배양 탱크, 및 중공 원통형 배양 탱크를 포함한다. 임의의 경우에, 밀폐 용기가 바람직하게 사용된다.
독립영양성 및 광종속 영양성 성장을 위해 자연광이 사용될 수 있지만, 인공 광원이 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 유도된 광원(원래 천연 또는 인공)이 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 태양열 집열기는 천연 일광을 모으기 위해 사용될 수 있으며, 이는 또한 도파관 (예를 들어, 광학섬유 케이블)을 통해 특정 자리 (생물반응기)로 투과될 수 있다. 바람직한 인공 광원은 LED이며, 이는 LED가 최대 세포 이용을 위해 맞춰질 수 있는 매우 특정한 파장에서 광을 제공할 수 있으므로, 가장 효율적인 광에너지원 중 하나를 제공한다. 특정 구체예에서, 약 400-500 nm, 400-460 nm, 620-680 nm 또는 600-700 nm의 파장을 갖는 LED 발광이 사용될 수 있다.
다양한 탄소 원천은 상이한 단계의 조류 성장을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 단당이 탄소 원천으로서 사용될 수 있다. 대안적으로, CO2가 탄소 원천으로서 사용될 수 있다.
CO2가 탄소 원천으로서 사용되는 경우, 이는 예를 들어 수성 배지를 통해 버블링시킴으로써 밀폐 시스템 반응기 내로 도입될 수 있다. 바람직한 구체예에서, CO2는 수행된 네오프렌 막을 통해 가스를 버블링시킴으로써 도입될 수 있으며, 이는 최대 교환에 대해 높은 표면 대 부피비를 갖는 기포를 생성시킨다. 더욱 바람직한 구체예에서, 기포는 물을 기포 이동에 대해 반대 방향으로 흐르게 하는 물 칼럼의 바닥에서 도입될 수 있다. 상기 역류 배열은 또한 기포가 수성 배지에 노출되는 시간을 증가시킴으로써 가스 교환을 최소화시킨다. CO2 용해를 추가로 증가시키기 위해, 물 칼럼의 높이는 증가되어 기포가 배지에 노출되는 시간을 연장시킬 수 있다. CO2는 물 중에 용해되어 H2CO3를 생성시킨 후, 광합성 조류에 의해 "고정"되어 유기 화합물을 생성시킬 수 있다. 이산화탄소는 예를 들어 약 0.2-2 vvm의 속도에서 약 1-3% (v/v)의 농도로 공급될 수 있다. 다양한 구체예에서, 더 높은 CO2 농도 (예를 들어, 100% 이하) 및/또는 더 낮은 속도 (예를 들어, 0.2 vvm 미만)이 사용될 수 있다. 약 용해판 배양 탱크가 사용되는 경우, 배양 현탁액은 또한 이산화탄소를 공급함으로써 교반될 수 있어서, 조류(예를 들어, 녹조류)가 광으로 균일하게 방사선 조사될 수 있게 된다.
상이한 성장 조건 사이에서 조류 배양물을 전환시키기 위해, 예를 들어, 이들을 순차적 방식으로 상이한 유형의 식물 성장 조절에 노출시킴으로써, 조류는 배지로부터 물리적으로 수확되되고 분리될 수 있다. 수확은 못으로부터 직접, 또는 저장 탱크로의 배양물의 전달 후에 일어날 수 있다. 수확 단계는 세포를 배지의 대부분으로부터 분리시키는 단계 및/또는 배지를 조류 배양물의 다른 배치를 위해 재사용하는 단계를 포함할 수 있다.
대안적으로, 전환 방법은 연속적으로 제 1 성장 조건(예를 들어, 제 1 식물 성장 조절제)하에 제 1 생물반응기에서 성장하는 조류 배양물을 희석시키고, 변위된 조류 배양물을 제 2 성장 조건 (예를 들어, 제 2 식물 성장 조절제) 하에 제 2 생물반응기에서 성장시키기 위해 수집함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일면은 부분적으로, 특정 식물 성장 조절제가 특정 조류 생성물의 생성을 자극하기 위해 사용될 수 있다는 발견에 근거한 것이다. 따라서, 본 발명의 또 하나의 일면은 조류를 식물 성장 조절제 또는 이의 유사물의 존재 하에 배양시켜서 조류 생성물을 축적시키는 것을 포함하는, 조류 생성물을 생성시키기 위한 방법을 제공한다.
바람직하게는, 오일 생성을 위해, 식물 성장 조절제는 휴민산염(예를 들어, 풀브산, 흄산 또는 휴민)과 같은 오일 자극 인자이다. 휴민산염은 상용 벤더를 포함하는 다양한 원천으로부터 얻어질 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 하기의 공정이 휴민산염을 생성시키기 위해 사용될 수 있다 : 약 25 g의 분말 연갈탄 물질 (카나다, 앨버타에서 채굴하고, Black Earth Humates Ltd, Edmonton, Alta., T5L 3C1에 의해 공급됨)을 약 500 mL의 1% NaOH 용액으로 수화시킨다. 이는 흄산 및 풀브산의 배합물을 용액 내로 방출시키는 것으로 믿어진다. 유기 회분 물질이 바닥에 침강하도록 혼합물을 방치시킨 후에, 액체 상부 부분을 신중히 빼낸다. 약 2 mL의 98% 황산을 첨가하여 빼낸 부분을 산성화시킨다. 이는 흄산을 용기의 바닥에 침전하도록 하는 것으로 믿어진다. 이 부분을 2개의 150 mL 원심분리 용기 사이에서 분할시킨다. 2개의 용기를 약 10,000 rpm에서 약 10 분 동안 원심분리시킨다. 흄산을 바닥으로 보내고, 풀브산 분획을 상부로부터 신중하게 따라낸다. 풀브산의 수율은 사용되는 연갈탄의 질에 의존하여 변할 수 있다. 당업자는 발명의 사상으로부터 벗어나지 않으면서 본원에 기술된 방법의 약간의 변경을 쉽게 이룰 수 있다.
특정 구체예에서, 사용되는 풀브산은 성장 배지의 약 5-12.5% (v/v)이다.
본 발명의 상기 일면에 따라, 조류를 성장시키는 일차 용도는 바람직한 조류 생성물을 생성시키는 것이다. 따라서, 추가의 조류 세포수 증가는 유용한 자원 또는 에너지를 소모할 수 있으며, 따라서 바람직하지 않다. 바람직하게는, 조류 세포수는 상기 성장 조건 하에서 1 로그 (10 배), 300%, 200%, 100% 또는 50% 이하 까지 증가한다.
바람직하게는, 조류 생물량는 부생성물이 축적되는 경우에 성장 조건 하에 실질적으로 증가한다. 예를 들어, 조류 생물량는 조류 생성물을 축적시킨 결과로서 크게 증가할 수 있다. 특정 구체예에서, 조류 생물량는 이러한 성장 조건 하에서 약 2 배, 5 배, 10 배, 20 배 또는 50 배 이상까지 증가한다. 예를 들어, 세포의 조류 생성물 비율 (예를 들어, 오일 등)이 1%로부터 99% 까지 증가하는 경우, 조류 생물량 중의 약 19-20 배 증가가 달성된다.
특정 구체예에서, 축적된 조류 생성물은 이러한 성장 조건 하에서 약 10 배 이상, 20 배, 50 배, 100 배, 200 배, 500 배, 1000 배, 1500 배, 2000 배, 2500 배 또는 이를 초과하여 증가한다. 예를 들어, 세포의 조류 생성물 생물량 비율 (예를 들어, 오일, 지질 등)이 1%로부터 99% 까지 증가하는 경우, 조류 생성물의 약 1900 배 증가가 달성된다.
바람직하게는, 조류는 또한 질소-제한 배지 또는 조류 생성물 합성을 위해 최적화된 질소 수준을 갖는 배지 중에서 배양된다.
상기 기술된 바와 같이, 조류는 조류 생성물의 최적 생성을 위해 조정될 수 있는 개방 못 또는 생물반응기에서 배양될 수 있다.
성장 기간의 종료시에, 조류는 성장 용기 (못 및 생물반응기)로부터 회수될 수 있다. 물/배지의 대부분으로부터의 세포 덩이의 분리는 많은 방식으로 수행될 수 있다. 비제한적 예에는 선별, 원심분리, 회전 진공 여과, 압력 여과, 하이드로사이클로닝, 부유, 스키밍, 거르기 및 중력 침전이 포함된다. 침전제, 응집제 또는 응고제 등의 첨가와 같은 다른 기술이 또한 상기 기술과 함께 사용될 수 있다. 분리의 2개 이상의 단계가 또한 사용될 수 있다. 다중 단계가 사용되는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 기술에 근거할 수 있다. 비제한적 예에는 대부분의 조류 배양물 함유물의 선별 및 유출물의 후속 여과 또는 원심분리가 포함된다.
예를 들어, 조류는 하기에 기술되는 바와 같이 스탠딩 월풀 순환, 순환 와류 및/또는 빨대관을 사용하여 배지로부터 부분적으로 분리될 수 있다. 대안적으로, 대용량의 공업용 상용 원심분리기가 사용되어 다른 분리 방법을 보충하거나 이를 대체하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 원심분리기는 공지된 상용 원천으로부터 얻어질 수 있다 (예를 들어, Cimbria Sket or IBG Monforts, Germany; Alfa Laval A/S, Denmark). 원심분리, 여과 및/또는 침전은 또한 다른 조류 성분으로부터 오일을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 수성 배지로부터의 조류의 분리는 클레이 (예를 들어, 2 미크론 미만의 입자 크기), 황산알루미늄 또는 폴리아크릴아미드와 같은 응집제의 첨가에 의해 용이해질 수 있다. 응집제의 존재하에, 조류는 단순 중력침강에 의해 분리될 수 있거나, 원심분리에 의해 더 쉽게 분리될 수 있다. 조류의 응집제-기반의 분리는 예를 들어 본원에 참고문헌으로 인용된 U.S. Patent Appl. Publ. No. 20020079270에 기술되어 있다.
당업자는 액체 배지로부터 조류와 같은 세포를 분리시키기 위해 당분야에 공지된 임의의 방법이 이용될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 각각 본원에 참고문헌으로 인용된 U.S. Patent Appl. Publ. No. 20040121447 및 U.S. Pat. No. 6,524,486에는, 수성 배지로부터 조류를 부분적으로 분리시키기 위한 접선 흐름 필터 기구 및 장치가 기술되어 있다. 배지로부터의 조류 분리를 위한 다른 방법은 각각 본원에 참고문헌으로 인용된 U.S. Pat. No. 5,910,254 및 6,524,486에 기술되어 있다. 조류 분리 및/또는 추출을 위한 다른 공개된 방법이 또한 사용될 수 있다 (참조예 : Rose et al., Water Science and Technology 25: 319-327, 1992; Smith et al., Northwest Science 42: 165-171, 1968; Moulton et al., Hydrobiologia 204/205: 401-408, 1990; Borowitzka et al., Bulletin of Marine Science 47: 244-252, 1990; Honeycutt, Biotechnology and Bioengineering Symp. 13: 567-575, 1983).
세포 덩이가 수확되면, 조류 생성물 (예를 들어, 오일)은 기계적 수단, 화학적 (예를 들어, 효소적) 수단 및/또는 용매 추출을 사용하여 조류 세포를 붕괴 (예를 들어, 용해)시킴으로써 유리될 수 있다.
세포 붕괴를 위한 기계적 수단의 비제한적 예에는 익스펠러 프레스, 배치 프레스, 필터 프레스, 콜드 프레스, 프렌치 프레스와 같은 다양한 유형의 프레스; 압력 강하 장치; 압력 강하 균질기, 콜로이드 밀, 비드 또는 볼 밀, 기계적 전단 장치 (예를 들어, 고전단 혼합기), 열충격, 열처리, 삼투압 쇼크, 음파분해 또는 초음파분해, 발현, 압착, 분쇄, 증기폭발, 회전자-고정자 붕괴기, 밸브형 프로페서, 고정된 기하학적 프로페서, 질소 분해 또는 임의의 다른 방법이 포함된다. 고용량의 상용 세포 붕괴기는 공지된 공급처로부터 구입할 수 있다 (예를 들어, GEA Niro Inc., Columbia, MD; Constant System Ltd., Daventry, England; Micro유체ics, Newton, MA). 수성 현탁액 중에서 미세조류를 파열시키는 방법은 예를 들어 본원에 참고문헌으로 인용된 U.S. Pat. No. 6,000,551에 기술되어 있다.
화학적 수단의 비제한적 예에는 효소, 산화제, 용매, 계면활성제 킬레이트화제의 사용이 포함된다. 사용되는 기술의 실제 성질에 의존하여, 붕괴는 건조하게 수행될 수 있거나, 용매, 물 또는 스팀이 존재할 수 있다.
붕괴를 위해 또는 붕괴를 보조하기 위해 사용될 수 있는 용매는 헵탄, 알코올, 초임계 유체, 염소화된 용매, 알코올, 아세톤, 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 알데히드, 케톤, 염소화된 용매, 플루오르화된-염소화된 용매, 및 이들의 배합물을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 대표적 계면활성제는 청정제, 지방산, 부분 글리세라이드, 인지질, 리소인지질, 알코올, 알데히드, 폴리소르베이트 화합물, 및 이들의 배합물을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 대표적 초임계 유체는 이산화탄소, 에탄, 에틸렌, 프로판, 프로필렌, 트리플루오로메탄, 클로로트리플루오로메탄, 암모니아, 물, 시클로헥산, n-펜탄 및 톨루엔을 포함한다. 초임계 유체 용매는 또한 물 또는 다른 화합물의 포함에 의해 변형되어 유체의 용매 특성을 변형시킬 수 있다. 화학적 붕괴에 대한 적합한 효소는 프로테아제, 셀룰라아제, 리파아제, 포스포리파아제, 리소자임, 폴리사카라아제 및 이들의 배합물을 포함한다. 적합한 킬레이트화제는 EDTA, 포스핀, DTPA, NTA, HEDTA, PDTA, EDDHA, 글루코헵토네이트, 인산염 이온 (다양하게 양자화되고 비양자화됨), 및 이들의 배합물을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 용매 추출은 본원에 기술된 바와 같이 기계적 또는 화학적 세포 붕괴와 병용될 수 있다. 화학적 및 기계적 방법의 병용이 또한 사용될 수 있다.
부분 또는 단계 포함 생성물로부터의 파괴된 세포의 분리는 다양한 기술에 의해 수행될 수 있다. 비제한적 예에는 원심분리, 하이드로사이클로닝, 여과, 부유 및 중력 침전이 포함된다. 일부 경우에, 용매 및 초임계 유체를 포함하는 것, 예를 들어 바람직한 생성물을 용해시키거나, 생성물과 파괴된 세포의 상호작용을 감소시키거나, 분리 후에 파괴된 세포와 함께 잔류하는 생성물의 양을 감소시키거나, 손실을 추가로 감소시키기 위한 세척 단계를 제공하는 것이 바람직하다. 이를 위해 적합한 용매는 헥산, 헵탄, 초임계 유체, 염소화된 용매, 알코올, 아세톤, 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 알데히드, 케톤, 및 플루오르화된-염소화된 용매를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 대표적 초임계 유체는 이산화탄소, 에탄, 에틸렌, 프로판, 프로필렌, 트리플루오로메탄, 클로로트리플루오로메탄, 암모니아, 물, 시클로헥산, n-펜탄, 톨루엔, 및 이들의 배합물을 포함한다. 초임계 유체 용매는 또한 물 또는 일부 다른 화합물의 포함에 의해 변형되어 유체의 용매 특성을 변형시킬 수 있다.
이렇게 분리된 생성물은, 원하는 용도를 위해, 예를 들어, 용매 제거, 건조, 여과, 원심분리, 화학적 변형, 에스테르 교환반응, 추가의 정제, 또는 단계들의 일부 병용에 의해서 적절하게 추가로 가공될 수 있다.
예를 들어, 지질/오일은 생물량로부터 분리된 후, 바이오디젤을 생성시키기 위해 공지된 방법을 사용하여 바이오디젤을 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 생물량는 압착될 수 있으며, 생성된 지질-부화 액체는 본원에 기술된 방법 중 임의의 것을 사용하여 분리된다. 분리된 오일은 널리 공지된 콘네만(Connemann) 공정과 같은 표준 에스테르 교환반응 기술을 사용하여 바이오디젤로 가공될 수 있다 (참조예 : 본원에 참고문헌으로 인용된 U.S. Pat. No. 5,354,878).
예를 들어, 조류는 붕괴하는 액체 배지로부터 수확되고 분리되며, 오일 함유물이 분리된다 (상기 참조). 조류-생성 오일은 트리글리세라이드가 풍부할 것이다. 이러한 오일은 평지씨유와 같은 식물 원천으로부터의 바이오디젤의 생성을 위해 널리 수립된 콘네만 공정과 같은 널리 공지된 방법을 사용하여 바이오디젤로 전환될 수 있다 (참조예 : 본원에 참고문헌으로 인용된 U.S. Pat. No. 5,354,878). 표준 에스테르 교환반응 공정은 트리글리세라이드와 알코올, 대표적으로 메탄올 사이의 알칼리 촉매 에스테르 교환반응을 수반한다. 트리글리세라이드의 지방산은 메탄올로 전달되어, 알킬 에스테르 (바이오디젤) 및 방출 글리세롤을 생성시킨다. 글리세롤은 제거되고, 다른 용도를 위해 사용될 수 있다.
배치 반응 방법(예를 들어, J. Am. OIl Soc. 61: 343, 1984)과 대조적으로, 콘네만 공정은 반응기 칼럼을 통해 반응 혼합물의 연속 흐름을 이용하며, 유속은 글리세린의 침전속도보다 낮다. 이는 바이오디젤로부터의 글리세린의 연속 분리로 끝난다. 반응 혼합물은 추가의 반응기 칼럼을 통해 가공되어 에스테르 교환반응 공정을 완결시킬 수 있다. 잔류 메탄올, 글리세린, 유리 지방산 및 촉매는 수성 추출에 의해 제거될 수 있다.
그러나, 당업자는 예를 들어 각각 본원에 인용된 U.S. Pat. Nos. 4,695,411; 5,338,471; 5,730,029; 6,538,146; 6,960,672에 기술되어 있는 바와 같이 트리글리세라이드 함유 오일로부터 바이오디젤을 생성시키기 위해 당분야에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 에스테르 교환반응을 수반하지 않는 대안적 방법이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 열분해, 기화 또는 열화학적 액화가 사용될 수 있다 (참조예 : Dote, Fuel 73: 12, 1994; Ginzburg, Renewable Energy 3: 249-252, 1993; Benemann and Oswald, DOE/PC/93204-T5, 1996).
수천 종의 공지된 천연 조류가 있지만, 많은 (그렇지 않으면 대부분은) 다른 생성물의 오일/지질/바이오디젤 생성 및 형성을 위해 사용될 수 있다. 이들 조류는 종속 영양성, 광종속 영양성 또는 독립영양성 조건 하에 대사될 수 있다. 본 발명을 위해 사용될 수 있는 특히 바람직한 조류는 클로로피테스 또는 바실리아로피테스(규조)를 포함한다.
특정 구체예에서, 조류는 유전적으로 변형/가공되어 단위 에이커당 바이오디젤 원천료 생성을 추가로 증가시킬 수 있다. 특정 생성물 산출을 위한 조류의 유전적 변형은 당분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 비교적 간단하다. 그러나, 본원에 기술된 배양, 수확 및 생성물 추출을 위한 저비용 방법이 유전적으로 변형된 (예를 들어, 형질전환, 비-형질전환) 조류에 사용될 수 있다. 당업자는 상이한 조류 변형물이 상이한 성장 및 오일 생산성을 나타낼 것이며, 상이한 조건 하에, 시스템이 조류의 변형물, 또는 상이한 성질을 갖는 변형물의 혼합물, 또는 조류 및 공생 박테리아의 변형물을 함유할 수 있다. 사용되는 조류 종은 지리학적 위치, 온도 민감성, 광 세기, pH 민감성, 염도, 수질, 영양소 이용성, 온도 또는 광의 계절적 차이, 조류로부터 얻어지게 되는 바람직한 최종 생성물 및 다양한 다른 인자에 대해 최적화될 수 있다.
특정 구체예에서, 부생성물 (예를 들어, 오일/바이오디젤)을 생성시키기 위해 사용되는 조류는 유전적으로 가공되어 (예를 들어, 형질전환, 또는 자리 유도 돌연변이 생성 등에 의해 생성되어), 부생성물 생성을 향상시키거나 조류 배양, 성장, 수확 또는 사용을 위한 사용의 다른 특징을 제공하는 하나 이상의 단리된 핵산 서열을 함유할 수 있다. 조류 종을 안정하게 형질전환시키는 방법 및 사용되는 단리된 핵산을 포함하는 조성물은 당분야에 널리 공지되어 있으며, 임의의 이러한 방법 및 조성물이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 사용되는 대표적 형질전환 방법은 입자총 방법, 전기천공, 원형질제 융합, PEG-매개 형질전환, DNA-코팅 탄화규소 위스커, 또는 바이러스 매개 현질전환을 포함할 수 있다 (참조예 : 본원에 참고문헌으로 인용된 Sanford et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:483-509; Dunahay et al., 1997, Meth. Molec. Biol. 62:503-9; U.S. Pat. Nos. 5,270,175; 5,661,017).
예를 들어, U.S. Pat. No. 5,661,017에는 바실라리오피세아에 (Bacillariophyceae), 크리소피세아에 (Chrysophyceae), 파에오피세아에 (Phaeophyceae), 크산토피세아에 (Xanthophyceae), 라피도피세아에 (Raphidophyceae), 프림네시오피세아에 (Prymnesiophyceae), 시프토피세아에 (Cryptophyceae), 시클로텔라 (Cyclotella), 나비쿨라 (Navicula), 실린드로테카 (Cylindrotheca), 파에오닥틸룸 (Phaeodactylum), 암포라 (Amphora), 카에토세로스 (Chaetoceros), 니츠키아 (Nitzschia) 또는 탈라씨오시라 (Thalassiosira)와 같은 엽록소 C-함유 조류의 조류 형질전환 방법이 기술되어 있다. 아세틸-CoA 카르복실라아제와 같은 사용되는 핵산을 포함하는 조성물이 또한 기술되어 있다.
다양한 구체예에서, 선택성 표지가 분리된 핵산 또는 벡터 내로 혼입되어, 형질전환된 조류를 선택할 수 있다. 사용되는 선택성 표지는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라아제, 아미노글리코시드 아세틸트랜스퍼라아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라아제, 블레오마이신 결합 단백질, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라아제, 브로목시닐 니트릴라아제, 글리포세이트-저항성 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 합성효소, 크립톨우린-저항성 리보솜 단백질 S14, 에메틴-저항성 리보솜 단백질 S14, 술포닐우레아-저항성 아세토락테이트 합성효소, 이미다졸리논-저항성 아세토락테이트 합성효소, 스트렙토마이신-저항성 16S 리보솜 RNA, 스펙티노마이신-저항성 16S 리보솜 RNA, 에리트로마이신-저항성 23S 리보솜 RNA 또는 메틸 벤즈이미다졸-저항성 투불린을 포함할 수 있다. C. 크립티카 아세틸-CoA 카르복실라아제 5'-비번역 조절성 조절 서열, C. 크립티카 아세틸-CoA 카르복실라아제 3' 비번역 조절성 조절 서열 및 이들의 배합물과 같은, 이식 유전자의 발현을 향상시키기 위한 조절성 핵산 서열이 공지되어 있다.
실시예 1
클로렐라 불가리스를 0.1% 효모 추출물 (Difco, MI - Bacto Yeast Exract, product number 212750) 및 0.5% 글루코오스로 보정한 브리스톨 배지 (본원에 참고문헌으로 인용된 Nichols, Growth Media - freshwater. In: Phycological Methods . Ed. J.R. Stern. Cambridge University Press, Pp 7-24, 1973; 하기의 표 1 참조) 중에서 배양하였다 (대조군 세포). 제 2 군을 연갈탄 (20-25% 풀브산)으로부터 추출한 풀브산의 10% 첨가에 의해 동일한 배지에서 배양하였다.
Figure pct00006
원액은 배지에 대한 화학물질의 쉬운 첨가를 위해 제조할 수 있다.
풀브산을 제조하기 위해, 약 25 g의 분말 연갈탄 물질 (카나다, 앨버타에서 채굴하고, Black Earth Humates Ltd, Edmonton, Alta., T5L 3C1에 의해 공급됨)을 약 500 mL의 1% NaOH 용액으로 수화시켰다. 이는 흄산 및 풀브산의 배합물을 용액 내로 방출시키는 것으로 믿어진다. 유기 회분 물질이 바닥에 침강하도록 혼합물을 방치시킨 후에, 액체 상부 부분을 신중히 빼내었다. 약 2 mL의 98% 황산을 첨가하여 빼낸 부분을 산성화시켰다. 이는 흄산을 용기의 바닥에 침전하도록 하는 것으로 믿어진다. 이 부분을 2개의 150 mL 원심분리 용기 사이에서 분할시켰다. 2개의 용기를 약 10,000 rpm에서 약 10 분 동안 원심분리시켰다. 흄산을 바닥으로 보내고, 풀브산 분획을 상부로부터 신중하게 따라 내었다. 풀브산의 수율은 사용되는 연갈탄의 질에 의존하여 변할 수 있다. 대표적으로, 현재의 물질을 사용하여 약 250-280 mL의 풀브산 분획을 수득하였다. 풀브산은 성장 배지의 약 5-12.5% (v/v) 사이의 속도로 사용하였다.
대조군 세포는 최소 액포 발달로 약 3.4 m 의 평균 반경을 갖는다. 풀브산으로 보정된 배지 중에서 배양한 세포는 매우 다양한 세포 크기를 갖는다. 큰 세포는 5.6 m의 평균 반경에 달하고, 매우 많은 액포를 나타내었다. 이들 액포는 Nile Red 염색을 사용하여 확인하여 지질을 함유하였다. 풀브산은 세포를 자극하여 대조군 세포를 훨씬 초과하여 저장 생성물을 생성시켰다.
명백히, 여기에 기재된 실시예에서, 배지 중의 질소가 비제한적이라는 점에도 불구하고, 현저히 많은 조류 세포가 풀브산의 존재 하에 저장식으로 유도되었다. 큰 액포 함유 세포의 빈도수의 실질적인 증가는 조류 세포가 제한된 질소를 갖는 조건 하에서 일어날 것으로 예측된다. 그 외에, 배양물 중의 오일 함량은 80+% (아마도 90+%) 범위 내에 있을 것으로 예측된다.
실시예 2
옥세노클로렐라 프로토테코이데스 (Auxenochlorella protothecoides )를 0.1% 효모 추출물 (상기 참조) 및 0.5% 글루코오스로 보정한 브리스톨 배지 (상기 참조) 중에서 성장시켰다 (대조군 세포). 2개의 다른 군을 인돌 아세트산 (2 mg/L, Cat. No. 12886, Sigma-Aldrich Canada Ltd.) 또는 지베렐린산 (2 mg/L, Cat. No. G7645, Sigma-Aldrich Canada Ltd.)이 첨가된 동일한 배지에서 배양하였다. 건조 중량을 결정하고, 7일 후에 배양 군 사이를 비교하였다.
인돌 아세트산으로 처리한 군은 대조군과 비교하여 건조 세포 질량을 50% 까지 증가시켰다. 지베렐린으로 처리한 군은 건조 세포 질량을 20% 까지 증가시켰다. 추가로, 인돌 아세트산으로 처리한 군은 오일 생성을 15% 까지 증가시켰다.
실시예 3. 성장인자의 특정 조합의 존재 또는 부재하의 클로렐라 프로토테코이데스의 성장의 비교
사용되는 보존 방식은 0.25 g 키네틴, 0.25 g 6-BA, 0.5 g NAA, 0.5 g GA3, 1.0 g 비타민 B1, 1.0 L dH2O이었다. 19.5 nL를 250 mL의 HGM (하기의 표 참조)에 첨가하여 방식 2를 생성시켰다. 플라스크를 클로렐라 프로토테코이데스로 접종시켜서 0.04 흡수 단위의 출발 광학 밀도를 제공하였다. 플라스크를 종속 영양성 (암) 조건 하에 125 rpm에서 진탕기 상에 놓았다. 온도를 약 23℃로 유지시켰다. 광학 밀도를 매일 측정하였다. 결과를 도 3에 요약하였다.
Figure pct00007
주석 1 : NaEDTA.2H2O, 075 g/L; FeCl3.6H2O, 0.097 g/L; MgCl2.4H2O, 0.041 g/L; boric acid, 0.011 g/L; ZnCl2, 0.005 g/L; CoCl2.6H2O, 0.002 g/L; CuSO4, 0.002 g/L; Na2MoO4.H2O, 0.002 g/L.
주석 2: HGM은 증가된 NaNO3 농도 (2.94 mM 최종 농도 내지 8.82 mM 최종 농도), 및 0.4% 효모 추출물 (Bacto), 2.0% 글루코오스, 및 미량금속의 혼합물을 포함하는 부가적 성분을 갖는 변형된 브리스톨 배지이다 (주석 1 참조). 글루코오스는 광영양성 조건하에 성장하는 조류가 광합성을 사용하여 탄수화물과 같은 유기 화합물을 생성시키기 때문에 통상적인 브리스톨 배지에 포함되지 않는다.
주석 3: 배지를 Nephelo 플라스크 (250 ml) 중에 넣고, 20 분 동안 121℃에서 살균하였다.
방식 1이 대조군 종속 영양성 성장 배지보다 더 빠른 속도로 생물량를 생성시킴이 입증되었다. 특정 성장 속도, μ는 각각 대조군 및 방식 1에 대해 1.4 및 1.8이었다.
실시예 4. 성장인자의 특정 조합의 존재 또는 부재하의 클로렐라 프로토테코이데스의 성장의 비교
사용되는 보존 방식은 0.25 g 키네틴, 0.25 g 6BA, 0.5 g NAA, 0.5 g GA3, 1.0 g 비타민 B1, 1.0 L dH2O이었다. 4.7 nL를 250 mL의 HGM (하기의 표 참조)에 첨가하여 방식 2를 생성시켰다. 플라스크를 클로렐라 프로토테코이데스로 접종시켜서 0.04 흡수 단위의 출발 광학 밀도를 제공하였다. 플라스크를 종속 영양성 (암) 조건 하에 125 rpm에서 진탕기 상에 놓았다. 온도를 약 23℃로 유지시켰다. 광학 밀도를 매일 측정하였다. 결과를 도 4에 요약하였다.
방식 2가 조절 종속 영양성 성장 배지보다 더 빠른 속도로 생물량를 생성시킴이 입증되었다. 특정 성장 속도, μ는 각각 대조군 및 방식 2에 대해 1.4 및 1.6이었다.
실시예 5. 성장인자의 특정 조합의 존재 또는 부재하의 클로렐라 프로토테코이데스의 성장의 비교
사용되는 보존 방식은 0.25 g 키네틴, 0.25 g 6BA, 0.5 g NAA, 0.25 g IAA, 0.5 g GA3, 1.0 g 비타민 B1, 1.0 L dH2O이었다. 19.5 nL를 250 mL의 HGM (하기의 표 참조)에 첨가하여 방식 3을 생성시켰다. 플라스크를 클로렐라 프로토테코이데스로 접종시켜서 0.04 흡수 단위의 출발 광학 밀도를 제공하였다. 플라스크를 종속 영양성 (암) 조건 하에 125 rpm에서 진탕기 상에 놓았다. 온도를 약 23℃로 유지시켰다. 광학 밀도를 매일 측정하였다. 결과를 도 5에 요약하였다.
방식 3이 조절 종속 영양성 성장 배지보다 더 빠른 속도로 생물량를 생성시킴이 입증되었다. 특정 성장 속도, μ는 각각 대조군 및 방식 3에 대해 1.4 및 1.8이었다.
실시예 6. 성장인자의 특정 조합의 존재 또는 부재하의 클로렐라 프로토테코이데스의 성장의 비교
사용되는 보존 방식은 0.25 g 키네틴, 0.25 g 6BA, 0.25 g NAA, 0.25 g IAA, 0.5 g GA3, 1.0 g 비타민 B1, 1.0 L dH2O이었다. 4.7 nL를 250 mL의 HGM (하기의 표 참조)에 첨가하여 방식 4를 생성시켰다. 플라스크를 클로렐라 프로토테코이데스로 접종시켜서 0.04 흡수 단위의 출발 광학 밀도를 제공하였다. 플라스크를 종속 영양성 (암) 조건 하에 125 rpm에서 진탕기 상에 놓았다. 온도를 약 23℃로 유지시켰다. 광학 밀도를 매일 측정하였다. 결과를 도 6에 요약하였다.
방식 4가 조절 종속 영양성 성장 배지보다 더 빠른 속도로 생물량를 생성시킴이 입증되었다. 특정 성장 속도, μ는 각각 대조군 및 방식 4에 대해 1.4 및 1.8이었다.
상기에 사용된 조절제 농도를 하기의 표 3에 요약하였다.
Figure pct00008
실시예 7. 광종속 영양성 및 종속 영양성 성장
스케네데스무스 오블리쿠스 (Scenedesmus obliquus) 및 클로렐라 프로토테코이데스 성장 동안의 광 노출의 영향을 평가하였다. 2가지 조류 모두의 성장 속도는 광종속 영양성 성장 조건에서보다 더 높다. 스케네데스무스 오블리쿠스 성장 속도는 광종속 영양성 성장 하에서 약 86.7% 더 높다. 한편, 클로렐라 프로토테코이데스 성장 속도는 성장이 광종속 영양성 성장 하에 수행되었을 때에 39.07%를 증가시켰다. 이들 실험의 결과를 하기의 표 4-7에 요약하였다.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012

Claims (39)

  1. 조류를 하나 이상의 식물 성장 조절제, 이의 유사물 또는 이들의 혼합물의 존재하에 배양시켜서 조류 세포수를 증가시키는 것을 포함하여. 조류의 세포증식을 증가시키는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 조류 세포수가 최소한 약 5%, 10%, 20%, 50%, 75%, 2 배, 5 배, 10 배, 20 배, 50 배, 100 배, 500 배, 1000 배, 104 배, 105 배, 106 배, 107 배, 108 배, 109 배 이상까지 증가하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 조류 세포분열의 속도가 최소한 약 5%, 10%, 20%, 50%, 75%, 100%, 200%, 500%, 1,000% 이상까지 증가하는 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 조류 배양물에 대한 집단 배가 시간이 약 0.05-2 일인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 식물 성장 조절제가 옥신, 시토키닌, 지베렐린 및/또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 최소한 하나, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 성장 호르몬을 포함하는 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 옥신이 인돌 아세트산 (IAA) 및/또는 1-나프탈렌아세트산 (NAA)을 포함하는 방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 지베렐린이 GA3를 포함하는 방법.
  8. 청구항 5에 있어서, 상기 시토키닌이 아데닌형 시토키닌 또는 페닐우레아형 시토키닌인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 아데닌형 시토키닌이 키네틴, 제아틴 및/또는 6-벤질아미노푸린을 포함하며, 상기 페닐우레아형 시토키닌이 디페닐우레아 및/또는 티디아주론 (TDZ)를 포함하, 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 식물 성장 조절제가 추가로 비타민 B1 또는 이들의 유사체/유사물을 포함하는 방법.
  11. 청구항 5에 있어서, 옥신 대 시토키닌의 비 (w/w)가 약 1:2 내지 2:1 (w/w), 또는 약 1:1 (w/w)인 방법.
  12. 청구항 5에 있어서, 옥신 대 지베렐린의 비 (w/w)가 약 1:2 내지 2:1 (w/w) , 또는 약 1:1 (w/w)인 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 유사물이 페녹시아세트산 화합물인 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 조류를 최적 세포증식을 위해 필요한 비제한적 수준의 영양소 및 미량원소를 갖는 배지 중에서 배양시키는 것을 포함하는 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 영양소가 하나 이상의 C, N, P, S 및/또는 O 원천을 포함하는 방법.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 영양소의 농도가 세포분열 및/또는 성장에 대해 비독성인, 방법.
  17. 청구항 1에 있어서, 상기 조류가 세포분열에 대한 최적 온도 하에 배양되며, 상기 최적 온도는 비-호열성 조류에 대해 약 0-40℃, 및 호열성 조류에 대해 약 40-95℃ 또는 약 60-80℃인 방법.
  18. 청구항 1에 있어서, 상기 조류가 생물반응기에서 배양되는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 생물반응기가 살균을 위해 순응하는 방법.
  20. 청구항 18에 있어서, 싱기 생물반응기가 최적 세포증식을 위해 조정되는, 방법.
  21. 청구항 1에 있어서, 상기 조류가 종속 영양성, 광종속 영양성 또는 독립영양성 생리학적 메카니즘을 사용하여 대사되는 방법.
  22. 청구항 1에 있어서, 상기 조류가 크로모피테스인 방법.
  23. 청구항 1에 있어서, 상기 조류가 클로로피테스 또는 바실라리오피테스인 방법.
  24. 청구항 1에 있어서, 상기 조류가 규조 유리 형태인 방법.
  25. 청구항 1에 있어서, 상기 조류가 갈조 (파에오피세아에) 또는 적조가 아닌 방법.
  26. 청구항 1에 있어서, 상기 조류가 트라우스토키트리알레스가 아닌 방법.
  27. 조류를 식물 성장 조절제 또는 이의 유사물의 존재 하에 배양시켜서 조류 생성물을 축적시키는 것을 포함하여, 조류 생성물을 생성시키는 방법.
  28. 청구항 27에 있어서, 조류 세포수가 1 로그 (1,000%), 300%, 200%, 100% 또는 50% 이하 까지 증가하는 방법.
  29. 청구항 27에 있어서, 조류 생물량가 실질적으로 증가하는,방법.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 조류 생물량가 최소한 약 20%, 40%, 60%, 80%, 100%, 150%, 200% 까지 증가하는 방법.
  31. 청구항 29에 있어서, 상기 조류 생물량시 상기 조류 생성물을 축적시킨 결과로서 크게 증가하는 방법.
  32. 청구항 27에 있어서, 상기 조류가 질소 제한 배지 (예를 들어, 약 1.5-15 mgN/L) 또는 조류 생성물 합성을 위해 최적화된 질소 수준을 갖는 배지에서 배양되는 방법.
  33. 청구항 27에 있어서, 상기 식물 성장 조절제가 오일 자극 인자를 포함하는 방법.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 오일 자극 인자가 풀브산 또는 흄산과 같은 휴민산염을 포함하는 방법.
  35. 청구항 27에 있어서, 상기 조류가 생물반응기에서 배양되는 방법.
  36. 청구항 35에 있어서, 상기 생물반응기가 살균을 위해 순응되는 방법.
  37. 청구항 35에 있어서, 상기 생물반응기가 상기 조류 생성물의 최적 생성을 위해 조정되는 방법.
  38. 청구항 27에 있어서, 상기 조류 생성물이 오일 또는 지질인 방법.
  39. 청구항 38에 있어서, 상기 조류 생성물이 오메가-3, -6, 및/또는 -9를 포함하는 방법.
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