CN104946535A - 一种可以调控微藻生长和其它功能的生长调节剂及其鉴定方法和应用 - Google Patents

一种可以调控微藻生长和其它功能的生长调节剂及其鉴定方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物代谢工程技术领域，具体的说是一种微藻生长调节剂的代谢和信号通路及其鉴定方法和应用。通过代谢物组学手段鉴定微藻激素，再通过功能基因组学手段阐释微藻激素的代谢通路、信号传递通路和调控网络；再通过转录组学手段鉴定在微藻抗逆和油脂合成过程中关键的激素代谢和信号传递相关的酶和蛋白；再通过代谢工程和化学工程手段调控激素代谢和信号通路，优化藻类和植物生理性状。本发明提供用于鉴定微藻激素及其代谢通路和信号通路的方法。利用该方法可以阐释与藻类生理密切相关的激素代谢的酶、信号蛋白和相关调控机理，并用于改良生物的农艺性状。

Description

一种可以调控微藻生长和其它功能的生长调节剂及其鉴定方法和应用
技术领域
本发明涉及生物代谢工程技术领域，具体的说是一种可以调控微藻生长和其它生理功能的生长调节剂及其鉴定方法和应用。
背景技术
微藻被认为是最有潜力的油脂生物质资源之一。尽管微藻用于生产生物燃料的优势明显，但其经济可行性仍面临着巨大挑战，主要的技术瓶颈包括微藻生长密度低、抗逆性能差和含油量低等。另一方面，随着微藻生物技术、基因工程技术以及分子生物学技术的发展，使得对油脂代谢通路关键基因的分离克隆和调控逐渐成为可能。1990年，乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）首次在Cyclotella cryptica中被克隆（Roessler,1990），随后被成功的用于对硅藻C.cryptica和Naviculasaprophila的改造中；经检测工程微藻中的ACC酶活提高了2-3倍，然而藻体内油脂的积累水平并未显著提高（Dunahay et al.,1996）。这表明，通过对油脂代谢通路上的单一酶的改造，尚无法有效提高油脂的积累。因此，需要寻找一种针对总体代谢或调控网络的调控手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以调控微藻生长和其它生理功能的生长调节剂及其鉴定方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种可以调控微藻生长和其它生理功能的生长调节剂，其特征在于：所述生长调节剂为用于调节微藻生长发育的化合物。
所述生长调节剂为生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯、油菜素甾醇、独脚金甾醇、水杨酸或茉莉酸等；以及生长调节剂的代谢和信号传递通路；激素合成酶、激素分解酶、激素衍生化酶（乙酰化或糖基化等）、激素转运蛋白、激素结合蛋白、激素信号传递蛋白、转录因子或蛋白激酶。
一种微藻生长调节剂及其代谢和信号通路的鉴定方法，通过代谢物组学手段鉴定微藻激素，通过功能基因组学手段阐释微藻激素的代谢、信号传递通路和调控网络；再通过转录组学手段鉴定在微藻生长、抗逆和油脂合成过程中关键的激素代谢酶和信号传递相关的蛋白。
进一步的说，利用超高效液相色谱-电喷雾电离方式鉴定微藻激素的存在，利用超高效液相色谱-电喷雾电离方式鉴定微藻激素的种类并测定其含量，而后利用功能基因组学手段阐释微藻激素的代谢通路、信号传递通路和调控网络，最后利用转录组手段鉴定微藻激素的代谢酶和信号传递网络调控蛋白。
所述微藻为自养、异养或兼性营养型单细胞或多细胞藻类；或，通过基因工程手段获得的工程藻、通过物理化学诱变获得的突变子。
所述微藻为绿藻、红藻、硅藻、褐藻、裸藻、甲藻、黄藻、金藻或真眼点藻；或，生产高值蛋白、药物、动物疫苗、高值化合物（中性脂、虾青素、二十二碳六烯酸）的工程藻。
将所述微藻激素代谢和信号通路相关的酶和蛋白通过改造进而作为调控微藻生理状态，提高其生长速率的手段。
方法中所述证明微藻内源性激素存在的方法为超高效液相色谱-电喷雾电离技术或其等效技术。
所述的超高效液相色谱-电喷雾电离技术的等效技术包括免疫酶联技术、质谱技术、细胞学技术等已知或尚待开发的可用于发现特定激素的技术。
方法中所述阐释微藻激素的代谢和信号传递通路及调控网络的手段包括功能基因组学手段或其等效手段。
所述的功能基因组学手段的等效手段包括分子生物学手段、蛋白质组学手段、酵母杂交技术、基因工程技术、化学工程技术、细胞学技术等已知或尚待开发的可用于鉴定激素的代谢、信号传递和调控网络的技术。
方法中所述的鉴定微藻激素的代谢通路、信号传递通路和网络调控的关键酶和蛋白的手段包括转录组技术或其等效技术。
所述的转录组技术的等效技术包括高通量测序技术、芯片技术、荧光定量技术、分子生物学技术、细胞生物学技术、植物生理学技术、蛋白质组学手段、酵母杂交技术、基因工程技术、化学工程技术等已知或尚待开发的可用于鉴定微藻激素的代谢通路、信号传递和网络调控的关键酶和蛋白的技术。
一种微藻激素及其代谢和信号通路的应用，所述通过改造上述鉴定获得的微藻激素及其代谢通路和信号通路，提高微藻的生长速率、抗逆性以及生物质、油脂和高附加值化合物的积累。
方法中所述的可以提高微藻和植物抗逆性能及其生物质、油脂和高附加值化合物积累的技术包括外源施加激素或其等效技术。
所述的外源施加激素的等效技术包括基因工程改造激素代谢和信号传递通路、化学物理方法诱变激素代谢和信号传递通路、外源施加激素代谢或信号传递化学抑制剂、外源施加可产生激素的微生物等任何物质。
方法中所述的通过扰动激素代谢或信号传递而改良的性状为微藻和植物的抗逆性能、生长速率或其它可提高微藻经济价值、降低微藻工业化成本的性状。
所述的可提高微藻经济价值、降低微藻工业化成本的性状包括生物质合成、高能量密度物质合成和高附加值化合物合成等。
与现有技术相比，本发明实现了藻类学技术的重点突破，具有如下有益效果：
1.本发明提供用于鉴定微藻激素及其代谢通路和信号通路的方法。利用该方法可以阐释与藻类生理密切相关的激素代谢的酶、信号蛋白和相关调控机理，并用于改良生物的农艺性状。
2.本发明提供了可用于调控微藻生理的植物激素的种类和含量。可用于针对性的调控相应激素的代谢和信号通路，改善微藻生理性状。
3.本发明提供了可用于鉴定调控微藻生理过程的激素代谢和信号传递的关键酶和蛋白的方法。可以筛选获得调控特定生理性状的酶或蛋白，针对性的提高微藻特定的生理性状。
4.本发明利用外源施加植物激素的方法调控微藻生理性状，并能有效提高微藻的生长速率、光合效率和抗逆性能。可以用于改良微藻、作物或其它植物的各种经济性状。
5.本发明能通过基因工程手段调控激素代谢或信号通路，实现外源基因在微藻或植物中高效表达并有效改善其各种经济性状。
6.本发明能通过调控激素代谢或信号通路，提高工程藻经济价值，用于大量生产各种目的蛋白、生物制剂（生长素、干扰素、血清蛋白、胰岛素等）、疫苗（霍乱、狂犬病、炭疽病、破伤风、阿米巴等）、高附加值化合物（虾青素、植物甾醇、虾青素、二十二碳六烯酸、色素、蛋白质）和高能量密度化合物（中性脂、类萜、长链烃、长链脂肪醇）。
7.借助本发明技术，可使微藻具备更加优越的规模培养性状，如高生长速率和高抗逆性（抗生物或非生物胁迫）等。设计与构建结合本发明的针对特定微藻的低成本高光效反应设施，降低规模培养成本。
8.本发明所采用的微藻具有光合效率高、繁殖快、环境适应性强的特点，而后通过调控激素代谢和信号通路，可以进一步提高其光合效率，固碳效率，减排产能。
9.多种微藻基因组序列已经测定，借助本发明可以进一步在微藻中发掘激素代谢和信号通路相关的酶和蛋白以及网络调控机理。
附图说明
图1为本发明实施例提供的微拟球藻甾体激素组成和含量效果图，简写：油菜素内酯（brassinolide，BL）、油菜素甾酮（castasterone，CS）、香蒲甾醇（typhasterol，TY）、扁豆甾内酯（dolicholide，DL）、高油菜素甾酮（homocastasterone，homoCS）和28-去甲基油菜素内酯（28-norbrassinolide，norBL）。
图2为本发明实施例提供的微拟球藻细胞分裂素组成和含量效果图。简写：顺式-玉米素（cis-zeatin，cZ）、顺式-玉米素核苷（cis-zeatinriboside，cZR）、顺式-玉米素-O-葡萄糖苷（cis-zeatin-O-glucoside，cZOG）、顺式-玉米素核苷-O-葡萄糖苷（cis-zeatin riboside-O-glucoside，cZROG）、顺式-玉米素核苷-5’-单磷酸（cis-zeatin riboside-5’-monophosphate，cZRMP）、反式-玉米素（trans-zeatin，tZ）、反式-玉米素核苷（trans-zeatin riboside，tZR）、反式-玉米素-核苷酸（tZR-nucleotide，tZRMP）、反式-玉米素核苷-O-葡萄糖苷（trans-zeatin-O-glucoside，tZOG）、反式-玉米素核苷-O-葡萄糖苷（trans-zeatin riboside-O-glucoside，tZROG）、反式-玉米素-9-葡萄糖苷（trans-zeatin-9-glucoside，tZ9G）、二氢玉米素（dihydrozeatin，DHZ）、二氢玉米素核苷（dihydrozeatin riboside，DHZR）、二氢玉米素核苷酸（dihydrozeatin riboside nucleotide，DHZRMP）、二氢玉米素-O-葡萄糖苷（dihydrozeatin-O-glucoside，DHZOG）、二氢玉米素核苷-O-葡萄糖苷（dihydrozeatin riboside-O-glucoside，DHZROG）、二氢玉米素核苷-9-葡萄糖苷（dihydrozeatin-9-glucoside，DHZ9G）、异戊烯基腺嘌呤（isopentenyladenine，iP）、异戊烯基腺嘌呤核苷（isopentenyladenine，iPR）、异戊烯基腺嘌呤-核苷酸（iPR-nucleotide，iPRMP）、异戊烯基腺嘌呤-葡萄糖苷（isopentenyladenine-9-glucoside，iP9G）。（b）芳香族细胞分裂素组成和含量。简写：meta-topolin（mT）、meta-topolin riboside（mTR）、meta-topolin-O-glucoside（mTOG）、meta-topolinriboside-O-glucoside（mTROG）、meta-topolin-9-glucoside（mT9G）、ortho-topolin（oT）、ortho-topolin riboside（oTR）、ortho-topolin-O-glucoside（oTOG）、ortho-topolinriboside-O-glucoside（oTROG）和ortho-topolin-9-glucoside（oT9G）。图3为本发明实施例提供的微拟球藻赤霉素组成和含量效果图。赤霉素1（GA1）、赤霉素4（GA4）、赤霉素13（GA13）、赤霉素15（GA15）、赤霉素19（GA19）、赤霉素20（GA20）、赤霉素24（GA24）、赤霉素29（GA29）、赤霉素34（GA34）和赤霉素53（GA53）。
图4为本发明实施例提供的光合真核生物中激素代谢和信号通路图。仅列出了异戊二烯来源的激素。黑色表示e-value≥1e-10；红色表示e-value≤1e-50。缩写：S，合成（synthesis）；H，水解（hydrolysis）；C，衍生化（conjugation）；T，转运（transporter）；R，受体（receptors）；SC，信号组分（signaling components）。Cm，红藻C.merolae；Pt，硅藻P.tricornutum；Tp，硅藻T.pseudonana；Fc，硅藻F.cylindrus；No，真眼点藻N.oceanica；Es，褐藻E.siliculosus；Mi，绿藻Micromonassp.RCC299；Ot，绿藻O.tauri；Cv，绿藻C.variabilis NC64A；Cp，绿藻C.pyrenoidosa；Cs，绿藻C.subellipsoidea C-169；Cr，绿藻C.reinhardtii；Vc，绿藻V.carteri；Pp，苔藓P.patens；Sm，地钱S.moellendorfii；Zm，单子叶Z.mays和At，双子叶A.thaliana。
图5为本发明实施例提供的微拟球藻激素代谢通路图。以微拟球藻（N.oceanica）和拟南芥（Arabidopsis）为例进行对比。仅列出了异戊二烯来源的激素。黑色箭头表示代谢和信号通路；虚线箭头表示省略的步骤。酶或蛋白用方框表示；红色方框表示在微拟球藻中存在的酶。绿色斜体表示微拟球藻中存在的化合物。
图6为本发明实施例提供的异戊二烯类细胞分裂素在缺氮诱导下的变化谱。顺式-玉米素（cis-zeatin，cZ）、顺式-玉米素核苷（cis-zeatin riboside，cZR）、顺式-玉米素-O-葡萄糖苷（cis-zeatin-O-glucoside，cZOG）、顺式-玉米素核苷-O-葡萄糖苷（cis-zeatin riboside-O-glucoside，cZROG）、顺式-玉米素核苷-5’-单磷酸（cis-zeatin riboside-5’-monophosphate，cZRMP）、反式-玉米素（trans-zeatin，tZ）、反式-玉米素核苷（trans-zeatinriboside，tZR）、反式-玉米素-核苷酸（tZR-nucleotide，tZRMP）、反式-玉米素核苷-O-葡萄糖苷（trans-zeatin-O-glucoside，tZOG）、反式-玉米素核苷-O-葡萄糖苷（trans-zeatin riboside-O-glucoside，tZROG）、反式-玉米素-9-葡萄糖苷（trans-zeatin-9-glucoside，tZ9G）、二氢玉米素（dihydrozeatin，DHZ）、二氢玉米素核苷（dihydrozeatin riboside，DHZR）、二氢玉米素核苷酸（dihydrozeatin riboside nucleotide，DHZRMP）、二氢玉米素-O-葡萄糖苷（dihydrozeatin-O-glucoside，DHZOG）、二氢玉米素核苷-O-葡萄糖苷（dihydrozeatin riboside-O-glucoside，DHZROG）、二氢玉米素核苷-9-葡萄糖苷（dihydrozeatin-9-glucoside，DHZ9G）、异戊烯基腺嘌呤（isopentenyladenine，iP）、异戊烯基腺嘌呤核苷（isopentenyladenine，iPR）、异戊烯基腺嘌呤-核苷酸（iPR-nucleotide，iPRMP）和异戊烯基腺嘌呤-葡萄糖苷（isopentenyladenine-9-glucoside，iP9G）。
图7为本发明实施例提供的芳香族细胞分裂素在缺氮诱导下的变化谱。mT,meta-topolin;mTR,meta-topolin riboside;mTRNT,mTR nucleotide;mT9G,meta-topolin-9-glucoside;oT,ortho-topolin;oTR,ortho-topolin riboside;oTRNT,oTR nucleotide;oT9G,ortho-topolin-9-glucoside。
图8为本发明实施例提供的赤霉素及赤霉素合成抑制剂对微拟球藻生长的影响。（a）赤霉素合成抑制剂Paclobutrazole对微拟球藻生长的影响（b）赤霉素合成抑制剂Chlormequat chloride对微拟球藻生长的影响（c）赤霉素对微拟球藻生长的影响（d）赤霉素和赤霉素合成抑制剂对微拟球藻生长的影响。
图9为本发明实施例提供的细胞分裂素6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）对缺氮胁迫下微拟球藻生长速率和细胞干重的影响。将培养至对数期（OD750=3.0）的微拟球藻离心收集后，灭菌海水清洗3遍后，接种于新鲜的无氮和有氮培养液中培养。向培养液中加入6-苄氨基腺嘌呤至终浓度为0.5μM和5μM，对照组加入等量0.1M盐酸。于6、12、24、48、96和144小时对细胞进行计数。于144小时，收集10ml藻细胞，烘干后称量，每个处理取4个生物学重复样本。星号（*）表示p值<0.05。
图10为本发明实施例提供的脱落酸对胁迫下微拟球藻抗逆性能的影响。将培养至对数期（OD750=3.0）的微拟球藻离心收集后，灭菌海水清洗3遍后，接种于新鲜的含氮培养基（150μmol photons m-2s-1light高光下培养）或无氮培养液中（50μmol photons m-2s-1的光照下或黑暗下），培养。向培养液中加入脱落酸至终浓度为0.5μM和5μM，对照组加入等量DMSO。于2、4、6、8、10和12小时测量细胞光系统II（PSII）的光合效率。每个处理取4个生物学重复。星号（*）表示p值<0.05。
图11为本发明实施例提供的拟南芥det2突变株功能互补实验。将微拟球藻DET2基因转化入拟南芥突变体det2（矮化表型），经多次传代后获得转化植株（恢复野生表型）。
具体实施方式
本发明所述的提高微藻抗逆性能及其生物质、油脂和高附加值化合物积累的技术，是指鉴定微藻激素成分，鉴定激素代谢和信号通路关键酶，鉴定其中与微藻生长、抗逆和高能量密度碳氢化合物合成相关的基因，调控微藻激素代谢或信号通路，达到提高微藻和植物抗逆性能及其生物质、油脂和高附加值化合物积累的目的。
下面结合实施案例对本发明的方法及该方法所达到的效果作进一步详细说明。
实施例1：藻类激素的鉴定
步骤1.藻种选择本发明涉及的藻种包括（1）绿藻，如Micromonas sp.RCC299，Ostreococcus tauri，Chlorella variabilis NC64A，Haematococcuspluvialis，Chlorella pyrenoidosa，Chlorella subellipsoidea C-169，Chlamydomonas reinhardtii，Volvox carteri等；（2）红藻，如Cyanidioschyzonmerolae,Porphyridium purpureum，Gelidium amansii，Gloiopeltis furcata，Caloglossa leprieurii，Digenea simples等；（3）硅藻，如Phaeodactylumtricornutum，Thalassiosira pseudonana，Fragilariopsis cylindrus等；（4）褐藻，如Pelvetia canaliculata，Ecklonia hornem，Undaria pinnatifida，Ectocarpus siliculosus等；（5）真眼点藻，如Nannochloropsis oceanica等，但不限于上述藻种。所述微藻可市购获得或从自然界中筛选获得。
步骤2.藻种培养
将上述微藻在其适合的培养基中培养至对数生长期，待用。以真眼点藻属微拟球藻（Nannochloropsis oceanica）为例。采用优化的F/2海水培养基，配方如下：35g L-1海盐，1g L-1硝酸钠（NaNO3），67mg L-1磷酸二氢钠一水（NaH2PO4*H2O），3.65mg L-1氯化铁六水（FeCl3*6H2O），4.37mgL-1柠檬酸钠二水（Na2EDTA*2H2O），微量元素[0.0196mg L-1硫酸铜五水（CuSO4*5H2O），0.0126mg L-1钼酸钠二水（NaMoO4*2H2O），0.044mg L-1硫酸锌七水（ZnSO4*7H2O），0.01mg L-1氯化钴（CoCl2）和0.36mg L-1氯化锰四水（MnCl2*4H2O）]和维生素混合液（2.5μg L-1维生素B12,2.5μg L-1生物素和0.5μg L-1盐酸硫胺素）。细胞在50μmol photons m-2s-1的连续光照下，25℃培养。收集对数期藻体，用于后续实验。
步骤3.测定微藻激素种类和含量
利用超高效液相色谱-电喷雾电离技术，鉴定微藻激素的种类并测定其含量，具体包括免疫酶联技术、质谱技术、细胞学技术等。
1）甾体激素（brassinosteroids，BRs）测定：超声破碎藻细胞5分钟，采用80%的甲醇过夜冰浴萃取，加入内标：50pmol的[2H6]芸苔素内酯（[2H6]brassinolide）、[2H6]油菜素甾酮（[2H6]castasterone）、[2H3]2,4-表油菜素内酯([2H3]24-epibrassinolide)和[2H3]24-表油菜素甾酮（[2H3]24-epicastasterone）。离心收集样品，并采用聚酰胺SPE柱（polyamideSPE columns）（Supelco,Bellefonte,PA,USA）和Strata-X柱（Phenomenex,Torrance,CA,USA）进行纯化。上机，进行UPLC-MS/MS（Micromass,Manchester,UK）分析。
2）细胞分裂素（cytokinins，CKs）测定：超声破碎藻细胞5分钟，加入Bieleski’s溶液过夜萃取。加入下述同位素标记的内标：[13C5]反式-玉米素（[13C5]tZ）、[2H5]反式-玉米素核苷（[2H5]tZR）、反式-玉米素-葡萄糖苷（[2H5]tZ9G）、[2H5]tZOG和[2H5]tZROG），[2H5]反式-玉米素-核苷酸（[2H5]–tZRMP）、[13C5]顺式-玉米素（[13C5]cZ）、[2H3]二氢玉米素（[2H3]DHZ）、[2H3]二氢玉米素核苷（[2H3]DHZR）、二氢玉米素-葡萄糖苷（[2H3]DHZ9G和[2H7]DHZOG）、[2H3]二氢玉米素-核苷酸（[2H3]DHZRMP）、[2H6]异戊烯基腺嘌呤（[2H6]iP）、[2H6]异戊烯基腺嘌呤核苷（[2H6]iPR）、[2H6]异戊烯基腺嘌呤-葡萄糖苷（[2H6]iP9G）、[2H6]异戊烯基腺嘌呤-核苷酸（[2H6]iPRMP）、[2H7]苄基腺嘌呤（[2H7]BA）、[2H7]苄基腺嘌呤核苷（[2H7]BAR）、[2H7]苄基腺嘌呤-葡萄糖苷（[2H7]BA9G）、[2H7]苄基腺嘌呤-核苷酸（[2H7]BARMP）、[15N4]mT和[15N4]oT。（其中细胞分裂素核苷酸为5pmol，其余均为3pmol）。离心收集上清，采用弱阴离子交换柱（weakanion-exchange column，DEAE A-25,GE Healthcare,Sweden）纯化。其中核苷酸部分通过酶学处理（每5ml样品加入10单位的大肠杆菌碱性磷酸酶），经Plexa C18（200mg每6ml）纯化。最后，采用免疫亲和层析获得纯化的萃取物。上机，进行UPLC-MS/MS（Micromass,Manchester,UK）分析。
3）赤霉素（gibberellins，GAs）测定超声破碎藻细胞5分钟，加入1mL80%甲基氰（含有5%甲酸），过夜冰浴萃取，加入内标：[2H2]赤霉素1（[2H2]GA1）、[2H2]赤霉素3（[2H2]GA3）、[2H2]赤霉素4（[2H2]GA4）、[2H2]赤霉素5（[2H2]GA5）[2H2]赤霉素6（[2H2]GA6）、[2H2]赤霉素7（[2H2]GA7）[2H2]赤霉素8（[2H2]GA8）、[2H2]赤霉素9（[2H2]GA9）、[2H2]赤霉素12（[2H2]GA12）、[2H2]乙醛赤霉素12（[2H2]GA12ald）、[2H2]赤霉素15（[2H2]GA15）、[2H2]赤霉素19（[2H2]GA19）、[2H2]赤霉素20（[2H2]GA20）、[2H2]赤霉素24（[2H2]GA24）[2H2]赤霉素29（[2H2]GA29）、[2H2]赤霉素34（[2H2]GA34）、[2H2]赤霉素44（[2H2]GA44）、[2H2]赤霉素51（[2H2]GA51）和[2H2]赤霉素53（[2H2]GA53）。离心收集上清，并采用离子交换柱（ion exchangecartridges，Waters,Milford,MA,USA）纯化。上机，进行UPLC-MS/MS（Micromass,Manchester,UK）分析。
4）脱落酸（abscisic acid，ABA）测定：超声破碎藻细胞5分钟，加入1mL预冷的甲醇/水/醋酸（10/89/1，体积比）和20pmol[2H6](+)ABA作为内标。1h后离心，并再次萃取沉淀。收集两次的上清，通过HLB交换柱（Milford,MA,USA)纯化。甲基化处理，采用ABA-特异的免疫亲和柱纯化。上机，进行UPLC-MS/MS（Micromass,Manchester,UK）分析。
5）甾体激素含量分析：以真眼点藻属微拟球藻（N.oceanica）为例。N.oceanica含有多样的甾体激素（图1）。其中含量最高的是27碳的28-去甲基油菜素内酯（28-norbrassinolide，norBL，305.08±22.20ng g-1干重）。此外还有长春花甾酮（cathasterone，CT）、香蒲甾醇（typhasterol，TY）和6-脱氧-24-表-油菜素甾酮（6-deoxo-24-epicastasterone，6-deoxo-epiCS）。本发明涉及的甾体激素还包括油菜素内酯（brassinolide，BL）、24-表油菜素内酯（24-epibrassinolide，epiBL）、28-高油菜素内酯（homobrassinolide，homoBL）、28-去甲基油菜素内酯（28-norbrassinolide，norBL）、油菜素甾酮（castasterone，CS）、24-表油菜素甾酮（24-epicastasterone，epiCS）、高油菜素甾酮（homocastasterone，homoCS）、28-去甲基油菜素甾酮（28-norcastasterone，norCS）、扁豆甾酮（dolichosterone，DS）、高扁豆甾酮（homodolichosterone，homoDS）、扁豆甾内酯（dolicholide，DL）、高扁豆甾内酯（homodolicholide，homoDL）、茶甾酮（teasterone，TE）、28-去甲基茶甾酮（28-norteasterone，norTE）、香蒲甾醇（typhasterol，TY）和6-脱氧-24-表-油菜素甾酮（6-deoxo-24-epicastasterone，6-deoxo-epiCS），但不限于上述甾体激素。
6）细胞分裂素含量分析：以真眼点藻属微拟球藻（N.oceanica）为例。N.oceanica含有异戊二烯类和芳香族细胞分裂素（图2）。包括顺式-玉米素（cis-zeatin，cZ）、顺式-玉米素核苷（cis-zeatin riboside，cZR）、顺式-玉米素-O-葡萄糖苷（cis-zeatin-O-glucoside，cZOG）、顺式-玉米素核苷-O-葡萄糖苷（cis-zeatin riboside-O-glucoside，cZROG）、顺式-玉米素核苷-5’-单磷酸（cis-zeatin riboside-5’-monophosphate，cZRMP）、反式-玉米素（trans-zeatin，tZ）、反式-玉米素核苷（trans-zeatin riboside，tZR）、反式-玉米素-核苷酸（tZR-nucleotide，tZRMP）、反式-玉米素核苷-O-葡萄糖苷（trans-zeatin-O-glucoside，tZOG）、反式-玉米素核苷-O-葡萄糖苷（trans-zeatin riboside-O-glucoside，tZROG）、反式-玉米素-9-葡萄糖苷（trans-zeatin-9-glucoside，tZ9G）、二氢玉米素（dihydrozeatin，DHZ）、二氢玉米素核苷（dihydrozeatin riboside，DHZR）、二氢玉米素核苷酸（dihydrozeatin riboside nucleotide，DHZRMP）、二氢玉米素-O-葡萄糖苷（dihydrozeatin-O-glucoside，DHZOG）、二氢玉米素核苷-O-葡萄糖苷（dihydrozeatin riboside-O-glucoside，DHZROG）、二氢玉米素核苷-9-葡萄糖苷（dihydrozeatin-9-glucoside，DHZ9G）、异戊烯基腺嘌呤（isopentenyladenine，iP）、异戊烯基腺嘌呤核苷（isopentenyladenine，iPR）、异戊烯基腺嘌呤-核苷酸（iPR-nucleotide，iPRMP）、异戊烯基腺嘌呤-葡萄糖苷（isopentenyladenine-9-glucoside，iP9G）、meta-topolin（mT）、meta-topolinriboside（mTR）、meta-topolin-O-glucoside（mTOG）、meta-topolinriboside-O-glucoside（mTROG）、meta-topolin-9-glucoside（mT9G）、ortho-topolin（oT）、ortho-topolin riboside（oTR）、ortho-topolin-O-glucoside（oTOG）、ortho-topolin riboside-O-glucoside（oTROG）和ortho-topolin-9-glucoside（oT9G）。
7）赤霉素含量分析以真眼点藻属微拟球藻（N.oceanica）为例。N.oceanica含有多样的赤霉素（图3），包括赤霉素1（GA1）、赤霉素4（GA4）、赤霉素13（GA13）、赤霉素15（GA15）、赤霉素19（GA19）、赤霉素20（GA20）、赤霉素24（GA24）、赤霉素29（GA29）、赤霉素34（GA34）和赤霉素53（GA53）。本发明涉及的GAs还包括赤霉素3（GA3）、赤霉素5（GA5）、赤霉素6（GA6）、赤霉素7（GA7）、赤霉素8（GA8）、赤霉素9（GA9）、赤霉素12（GA12）、乙醛赤霉素12（GA12ald）、赤霉素44（GA44）和赤霉素15（GA51），但不限于上述赤霉素。
8）脱落酸含量分析：以真眼点藻属微拟球藻（N.oceanica）为例。N.oceanica中脱落酸含量为2.65±0.27ng g-1细胞干重。
实施例2：藻类激素代谢和调控关键酶或蛋白的鉴定
步骤1.藻种选择本发明涉及的藻种包括（1）绿藻，如Micromonas sp.RCC299，Ostreococcus tauri，Chlorella variabilis NC64A，Haematococcuspluvialis，Chlorella pyrenoidosa，Chlorella subellipsoidea C-169，Chlamydomonas reinhardtii，Volvox carteri等；（2）红藻，如Cyanidioschyzonmerolae,Porphyridium purpureum，Gelidium amansii，Gloiopeltis furcata，Caloglossa leprieurii，Digenea simples等；（3）硅藻，如Phaeodactylumtricornutum，Thalassiosira pseudonana，Fragilariopsis cylindrus等；（4）褐藻，如Pelvetia canaliculata，Ecklonia hornem，Undaria pinnatifida，Ectocarpus siliculosus等；（5）真眼点藻，如Nannochloropsis oceanica等，但不限于上述藻种。所述微藻可市购获得或从自然界中筛选获得。
步骤2.数据收集本发明涉及的数据来源包括The Conserved DomainDatabase(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)，SMART(http://smart.emblheidelberg.de/)，Cyanidioschyzon merolae Genome Project（http://merolae.biol.s.u-tokyo.ac.jp），DOE Joint Genome Institute（http://genome.jgi-psf.org/Phatr2/Phatr2.home.html），A functional genomicsdatabase for energy microalgae（http://www.bioenergychina.org:8989/），OnlineResource for
Community Annotation of Eukaryotes（http://bioinformatics.psb.ugent.be/orcae/），The Arabidopsis InformationResource（http://www.arabidopsis.org/），Maize Genome Sequencing Project（http://www.maizesequence.org/index.html），Phytozome（http://genome.jgi-psf.org/Volca1/Volca1.home.html）和Physcomitrella patensresource（http://genome.jgi-psf.org/Phypa1_1/Phypa1_1.home.html）等。
步骤3.藻类激素代谢和调控关键酶或蛋白发掘通过比较功能基因组学手段，在藻类基因组中发掘激素代谢和调控关键酶或蛋白。具体讲，首先，构建已知的拟南芥激素代谢和调控关键酶或蛋白数据库；其次，格式化步骤2中涉及物种的基因组和转录组序列；再次，采用已知的拟南芥激素代谢和调控关键酶或蛋白，通过同源序列比对和结构域比对等手段，挖掘藻类基因组中潜在的激素代谢和调控关键酶或蛋白；最后，对获得的蛋白序列进行进化关系分析，深度解析激素代谢和调控的起源和进化过程。其中用到的软件包括本地化的BLAST软件包、Pfam、CLUSTALW、gBlock、ProtTest和PhyML3.0等。
1）甾体激素代谢酶和信号传递与调控蛋白的发掘：通过比较功能基因组学手段，在藻类基因组中发掘甾体激素代谢和调控关键酶或蛋白。具体讲，首先，构建已知的拟南芥中甾体激素代谢和调控关键酶或蛋白数据库；其次，格式化步骤2中涉及物种的基因组和转录组序列；再次，采用已知的拟南芥甾体激素代谢和调控关键酶或蛋白，通过同源序列比对和结构域比对等手段，挖掘藻类基因组中潜在的甾体激素代谢和调控关键酶或蛋白。本发明涉及的代谢关键酶包括甾体激素合成酶、甾体激素降解酶和甾体激素衍生化酶（糖基化、酰基化等）（图4）。其中甾体激素合成酶包括油菜素内酯-6-氧化酶（Brassinosteroid-6-oxidases）、细胞色素P45085A1（BR6ox1）、油菜素内酯-6-氧化酶2（Brassinosteroid-6-oxidases，BR6ox2）、细胞色素P450单加氧酶（C-3oxidation，CPD）、细胞色素P450单加氧化酶（C-22hydroxylation，CYP90B1）、细胞色素P45090C1（cytochrome P-45090C1）、细胞色素P45090D1（cytochrome P450CYP90D1）、甾醇-5α-还原酶（steroid-5-alpha-reductase，DET2）、Δ7-甾醇-C5-去饱和酶（delta7sterol C-5desaturase，DWF7）、Δ7-甾醇-C7-还原酶（delta7-sterol-C7reductase，DWF5）、24-脱氢胆固醇还原酶（24-dehydrocholesterol reductase，DWF1）；甾体激素降解酶包括C-26-羟化酶（Phyb Aativation Tagged Suppessor1，BAS1）和细胞色素P45072C1（Cytochrome P45072C1，SOB7）；甾体激素衍生化酶包括DON-糖基转移酶（DON-Glucosyltransferase，UGT73C5）。甾体激素信号传递与调控蛋白包括甾体激素受体，如油菜素内酯失敏蛋白1（BRINSENSITIVE1，BRI1）、油菜素内酯失敏蛋白1相似蛋白1（BRI1LIKE1，BRL1）、油菜素内酯失敏蛋白1相似蛋白2（BRI1LIKE2，BRL2）、油菜素内酯失敏蛋白1相似蛋白3（BRI1LIKE3，BRL3）；以及其它信号传递和调控相关的蛋白，如油菜素内酯失敏蛋白1激酶抑制蛋白（BRI1KinaseInhibitor1，BKI）、油菜素内酯失敏蛋白1-相关受体激酶（BRI1-associatedReceptor Kinase，BAK1）、油菜素内酯信号激酶1（Brassinosteriod-signalingKinase1，BSK1）、油菜素内酯信号激酶2（Brassinosteriod-signaling Kinase2，BSK2）、油菜素内酯信号激酶3（Brassinosteriod-signaling Kinase3，BSK3）、油菜素内酯失敏蛋白2（Brassinosteroid-insensitive2，BIN2）、Brassinazole不敏蛋白2（Brassinazole-resistant2，BES-1）、Brassinazole不敏蛋白1（Brassinazole-resistant1，BZR1）、螺旋-环-螺旋蛋白家族（basichelix-loop-helix family protein）BIM1、BRI1抑制激活标签作用因子（activation-tagged BRI1suppressor1-interacting factor1，AIF1）、细胞色素P45072B1（CYP72B1，BAS1）、BRI1抑制蛋白（BRI1SUPPRESSOR1，BRS1；BRI1SUPPRESSOR2，BSU1；SUPPRESSOR OF BRI1，SBI1）和蛋白磷酸化酶2A（Protein Phosphatase2A，PP2A B）。但不限于上述酶或蛋白。
2）细胞分裂素代谢酶和信号传递与调控蛋白的发掘：通过比较功能基因组学手段，在藻类基因组中发掘细胞分裂素代谢和调控关键酶或蛋白。具体讲，首先，构建已知的拟南芥中细胞分裂素代谢和调控关键酶或蛋白的数据库；其次，格式化步骤2中涉及物种的基因组和转录组序列；再次，采用已知的拟南芥细胞分裂素代谢和调控关键酶或蛋白，通过同源序列比对和结构域比对等手段，挖掘藻类基因组中潜在的细胞分裂素代谢和调控关键酶或蛋白。本发明涉及的代谢关键酶包括细胞分裂素合成酶、细胞分裂素降解酶和细胞分裂素衍生化酶（糖基化、酰基化等）（图4）。其中细胞分裂素合成酶包括腺苷磷酸-异戊烯基转移酶（adenosinephosphate-isopentenyltransferases，IPTs）、腺嘌呤转磷酸核糖基酶（adeninephosphoribosyl transferases，APTs）、腺苷激酶（adenosine kinase，AKs）和细胞分裂素核苷-5’-单磷酸phophoribohydrolases（cytokinin nucleoside5’-monophosphate phophoribohydrolases，LOGs）等；细胞分裂素降解酶包括细胞分裂素氧化/脱氢酶（cytokinin oxidase/dehydrogenase，CKXs）等。细胞分裂素衍生化酶，如细胞分裂素羟化酶（cytokinin trans-hydroxylase，CYP735A1和CYP735A2）、细胞分裂素糖基转移酶（cytokinin-N-glucosyltransferase，UGT76C1和UGT76C2）。细胞分裂素转运蛋白，如PUP1和PUP2。细胞分裂素信号传递与调控蛋白包括细胞分裂素受体，如细胞分裂素受体（cytokinin receptor，AHKs）；以及其它信号传递和调控相关的蛋白，如组氨酸磷酸转移酶（Histidine-containing PhosphotransferFactor，AHPs）、拟南芥响应因子（Arabidopsis response regulator，ARRs）、细胞分裂素响应因子（Cytokinin response factor，CRFs）、G蛋白偶联受体（G-coupled receptor1，GCR1）和WUSCHEL蛋白（WUS）等。但不限于上述酶或蛋白。
3）赤霉素代谢酶和信号传递与调控蛋白的发掘：通过比较功能基因组学手段，在藻类基因组中发掘赤霉素代谢和调控关键酶或蛋白。具体讲，首先，构建已知的拟南芥中赤霉素代谢和调控关键酶或蛋白数据库；其次，格式化步骤2中涉及物种的基因组和转录组序列；再次，采用已知的拟南芥赤霉素代谢和调控关键酶或蛋白，通过同源序列比对，结构域比对等手段，挖掘藻类基因组中潜在的赤霉素代谢和调控关键酶或蛋白。本发明涉及的代谢关键酶包括赤霉素合成酶、赤霉素降解酶和赤霉素衍生化酶（糖基化、酰基化等）（图4）。其中赤霉素合成酶包括古巴焦磷酸合成酶（ent-copalyl diphosphate synthase，CPS）、内根-贝壳杉烯合成酶（ent-kaurenesynthase，KS）、内根-贝壳杉烯19-氧化酶（ent-kaurenoic oxidase，KO）、GAI-RGA样赤霉素响应调控子（GAI-RGA like gibberellin responsemodulator，GA4）、贝壳杉烯酸氧化酶1（ent-kaurenoic acid oxidase，KAO1）、贝壳杉烯酸氧化酶2（ent-kaurenoic acid oxidase，KAO2）、GA20-氧化酶（GA20-oxidase，GA20ox）、GA3-氧化酶（GA3-oxidase，GA3ox）等；赤霉素降解酶包括GA2-氧化酶（GA2-oxidase，GA2ox）、赤霉素-16α,17-环氧酶（gibberellin16α,17-epoxidase，CYP714D1）等。赤霉素衍生化酶，如赤霉素甲基化酶（GA methyltransferase，GAMT）。赤霉素信号传递与调控蛋白包括赤霉素受体，如赤霉素失敏矮化蛋白（GA Insensitive Dwarf1，GID1）；以及其它信号传递和调控相关的蛋白，如N-乙酰基葡萄糖胺转移酶（N-acetyl glucosamine transferase，SPY）、F-box蛋白1（F-box protein，SLY1）、F-box蛋白2（F-box protein，SLY2）、赤霉素失敏蛋白（GAInsensitive，GAI）、赤霉素抑制蛋白（Repressor of GA，RGA）、赤霉素抑制蛋白样蛋白（RGA-LIKE1，RGL1、RGA-LIKE2，RGL2、RGA-LIKE3，RGL3）。但不限于上述酶或蛋白。
4）脱落酸代谢相关酶和信号传递与调控蛋白的发掘：通过比较功能基因组学手段，在藻类基因组中发掘脱落酸代谢和调控关键酶或蛋白。具体讲，首先，构建已知的拟南芥中脱落酸代谢和调控关键酶或蛋白数据库；其次，格式化步骤2中涉及物种的基因组和转录组序列；再次，采用已知的拟南芥脱落酸代谢关键酶和调控蛋白，通过同源序列比对和结构域比对等手段，挖掘藻类基因组中潜在的脱落酸代谢和调控关键酶或蛋白。本发明涉及的代谢关键酶包括脱落酸合成酶、转运蛋白、脱落酸降解酶和脱落酸衍生化酶，如糖基化和酰基化等酶（图4）。其中脱落酸合成酶包括玉米黄质环氧化酶（zeaxanthin epoxidase，ZEP）、新叶黄素合成酶（neoxanthinsynthase，ABA4）、9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxycarotenoiddioxygenases，NCEDs）、黄氧素脱氢酶（xanthoxin dehydrogenase，ABA2）、脱落酸醛氧化酶（abscisic aldehyde oxidase，AAO1s）、硫磺钼辅因子（molybdenum cofactor sulfurate，ABA3）等；脱落酸降解酶包括脱落酸-8’-羟化酶（ABA8’-hydorxylases,CYP707As）；脱落酸转运蛋白包括ABCG25和ABCG40等。衍生化酶，如脱落酸糖苷酶（ABA glucosidase，BG1）。脱落酸信号传递与调控蛋白包括脱落酸受体，如脱落酸结合蛋白（ABA-binding protein，ABAR）等；以及其它信号传递和调控相关的蛋白，如G蛋白耦联受体（G-protein-coupled receptor，GCR1和GCR2）、G蛋白耦联受体2样蛋白（GCR2-like1，GCL1和GCR2-like2，GCL2）、GPCR类G蛋白受体（GPCR-type G protein receptor，GTG1和GTG2）、pyrabactin抗性蛋白（Pyrabactin resistance1，PYR1）、pyrabactin抗性蛋白样蛋白（PYR1-LIKEs，PYLs）、ABA超敏蛋白1（Hypersensitive to ABA1，HAB1）、脱落酸脱敏蛋白（ABA INSENSITIVE，ABI）、ABI2同源蛋白（Homology toABI2，HAB2）、磷酸酯酶2C家族（ABA-Hypersensitive Germination，AHG）、SNF1-相关蛋白激酶（SNF1-Related Protein Kinase2s，SNRK2s）、脱落酸响应元件结合因子（ABA responsive element-binding factor，ABF）、G蛋白α亚基（G proteinαdomain，GPA1）、磷酸酶Dα亚基（Phosphatase D ALPHA1，PLDα）、钙离子依赖型蛋白激酶1（Calcium-dependent protein kinase1，CDPK1）、RAC样蛋白3（RAC-LIKE3，Rac3）、2A型调控元件（type2Aregulatory subunit，RCN1）、Ras样小G蛋白（Ras-like small GTPase，ROP6和ROP10）和磷脂酶C1（Phospholipase C1，PLC1）等。但不限于上述酶或蛋白。
步骤4.微拟球藻植物激素代谢和信号传递网络：利用转录组手段鉴定微藻激素代谢酶、信号传递和网络调控蛋白，而后在微拟球藻中构建了激素合成、降解、激素转运、信号传递和调控的网络图（图5）。其中微藻中激素合成和降解通路与已经证明的拟南芥中的通路存在着一定的相似；而信号传递和调控网络和已经证明的拟南芥中的通路存在着明显的不同（图5）。
实施例3：缺氮胁迫下微藻激素的代谢响应
步骤1.藻种选择本发明涉及的藻种包括（1）绿藻，如Micromonas sp.RCC299，Ostreococcus tauri，Chlorella variabilis NC64A，Haematococcuspluvialis，Chlorella pyrenoidosa，Chlorella subellipsoidea C-169，Chlamydomonas reinhardtii，Volvox carteri等；（2）红藻，如Cyanidioschyzonmerolae,Porphyridium purpureum，Gelidium amansii，Gloiopeltis furcata，Caloglossa leprieurii，Digenea simples等；（3）硅藻，如Phaeodactylumtricornutum，Thalassiosira pseudonana，Fragilariopsis cylindrus等；（4）褐藻，如Pelvetia canaliculata，Ecklonia hornem，Undaria pinnatifida，Ectocarpus siliculosus等；（5）真眼点藻，如Nannochloropsis oceanica等，但不限于上述藻种。所述微藻可市购获得或从自然界中筛选获得。
步骤2.藻种培养和样品采集以真眼点藻属微拟球藻（Nannochloropsisoceanica）为例。采用优化的F/2海水培养基，配方如下：35g L-1海盐，1g L-1硝酸钠（NaNO3），67mg L-1磷酸二氢钠一水（NaH2PO4*H2O），3.65mg L-1氯化铁六水（FeCl3*6H2O），4.37mg L-1柠檬酸钠二水（Na2EDTA*2H2O），微量元素[0.0196mg L-1硫酸铜五水（CuSO4*5H2O），0.0126mg L-1钼酸钠二水（NaMoO4*2H2O），0.044mg L-1硫酸锌七水（ZnSO4*7H2O），0.01mg L-1氯化钴（CoCl2）和0.36mg L-1氯化锰四水（MnCl2*4H2O）]和维生素混合液（2.5μg L-1维生素B12,2.5μg L-1生物素和0.5μg L-1盐酸硫胺素）。细胞在50μmol photons m-2s-1的连续光照下，25℃培养。将培养至对数期（OD750=3.0）的微拟球藻离心收集后，采用灭菌后的海水清洗3遍后，接种于新鲜的无氮和有氮培养液中，并开始计时。于6、12、24、48和72小时收集200ml藻细胞，液氮速冻后保存于-80℃，每个时间点取3个生物学重复样本。
步骤3.分析微藻中的激素种类和含量
利用超高效液相色谱-电喷雾电离技术测定微藻激素细胞分裂素（cytokinins，CKs）的种类并测定其含量，具体包括免疫酶联技术、质谱技术、细胞学技术等。超声藻细胞5分钟，加入Bieleski’s溶液过夜萃取。加入下述同位素标记的细胞分裂素内标：[13C5]反式-玉米素（[13C5]tZ）、[2H5]反式-玉米素核苷（[2H5]tZR）、反式-玉米素-葡萄糖苷（[2H5]tZ9G）、[2H5]tZOG和[2H5]tZROG），[2H5]反式-玉米素-核苷酸（[2H5]–tZRMP）、[13C5]顺式-玉米素（[13C5]cZ）、[2H3]二氢玉米素（[2H3]DHZ）、[2H3]二氢玉米素核苷（[2H3]DHZR）、二氢玉米素-葡萄糖苷（[2H3]DHZ9G和[2H7]DHZOG）、[2H3]二氢玉米素-核苷酸（[2H3]DHZRMP）、[2H6]异戊烯基腺嘌呤（[2H6]iP）、[2H6]异戊烯基腺嘌呤核苷（[2H6]iPR）、[2H6]异戊烯基腺嘌呤-葡萄糖苷（[2H6]iP9G）、[2H6]异戊烯基腺嘌呤-核苷酸（[2H6]iPRMP）、[2H7]苄基腺嘌呤（[2H7]BA）、[2H7]苄基腺嘌呤核苷（[2H7]BAR）、[2H7]苄基腺嘌呤-葡萄糖苷（[2H7]BA9G）、[2H7]苄基腺嘌呤-核苷酸（[2H7]BARMP）、[15N4]mT和[15N4]oT。（其中细胞分裂素核苷酸为5pmol，其余均为3pmol）。离心收集上清，采用弱阴离子交换柱（weak anion-exchange column，DEAE A-25,GEHealthcare,Sweden）纯化。酶学处理核苷酸化细胞分裂素（每5ml样品加入10单位的大肠杆菌碱性磷酸酶），经Plexa C18（200mg每6ml）纯化。最后，采用免疫亲和层析进一步纯化，上机，进行UPLC-MS/MS（Micromass,Manchester,UK）分析。
步骤4.分析缺氮诱导过程中细胞分裂素变化以真眼点藻属微拟球藻（N.oceanica）为例。N.oceanica中的异戊二烯类和芳香族细胞分裂素在缺氮下产生了显著的变化（图6和7）。细胞分裂素可以分为：生物活性型（包括反式-玉米素、异戊烯基腺嘌呤和二氢玉米素）、转运型（玉米素核苷、异戊烯基腺嘌呤核苷和二氢玉米素核苷）和储存型（糖基化细胞分裂素）。整体上讲，在缺氮诱导下异戊二烯类细胞分裂素（糖基化衍生物除外）的含量显著下降（p≤0.05；图6）。缺氮诱导12小时后，反式-玉米素、异戊烯基腺嘌呤含量持续下降；同时，二氢玉米素的含量虽然在24小时诱导后有所上升，但是其始终保持在较低水平。另一方面，顺式-玉米素（植物顺式-玉米素活性很低或者不具有活性）在缺氮诱导下含量下降。反式-玉米素核苷、异戊烯基腺嘌呤核苷的含量很低，在缺氮诱导下并没有显著变化；顺式-玉米素核苷的含量在缺氮诱导24小时后提高了4倍，与对照相比，始终保持在较高的水平上。糖基化细胞分裂素含量较低。在缺氮诱导72小时后，其变化规律和细胞分裂素自由基基本相反（反式-玉米素除外）。同时，tZRNT和iPRNT的含量从缺氮诱导开始持续下降（iPRNT在12小时时有小幅上升）。cZRNT的含量在缺氮诱导最初的24小时有所上升，之后又下降，最终保持在低于对照组的水平。DHZRNT从缺氮诱导6小时后开始上升，并始终保持在高于对照组的水平上。与异戊二烯类细胞分裂素相比，缺氮诱导下芳香族细胞分裂素的变化规律要复杂的多，如mT的含量在6小时后提高了2倍，之后又恢复了正常水平。与此相反，oT的含量在12小时后下降了4倍，但72小时后，与对照组相比，其含量却有所上升（图8）。
实施例4：激素在促进藻类生长中的应用
步骤1.藻种培养和样品采集以真眼点藻属微拟球藻（N.oceanica）为例。采用优化的F/2海水培养基，配方如下：35g L-1海盐，1g L-1硝酸钠（NaNO3），67mg L-1磷酸二氢钠一水（NaH2PO4*H2O），3.65mg L-1氯化铁六水（FeCl3*6H2O），4.37mg L-1柠檬酸钠二水（Na2EDTA*2H2O），微量元素[0.0196mg L-1硫酸铜五水（CuSO4*5H2O），0.0126mg L-1钼酸钠二水（NaMoO4*2H2O），0.044mg L-1硫酸锌七水（ZnSO4*7H2O），0.01mg L-1氯化钴（CoCl2）和0.36mg L-1氯化锰四水（MnCl2*4H2O）]和维生素混合液（2.5μg L-1维生素B12,2.5μg L-1生物素和0.5μg L-1盐酸硫胺素）。细胞在50μmol photons m-2s-1的连续光照下，25℃培养至对数期（OD750=3.0）。
步骤2.激素施加将对数期微拟球藻稀释至OD750=0.2，向培养液中加入赤霉素（0.02、0.2、2、20和40mg L-1）或赤霉素合成抑制剂Paclobutrazole（0.5、5、20和40mg L-1）或赤霉素合成抑制Chlormequat chloride（0.5、5、20和40mg L-1）。
步骤3.生物量测定每24小时测定OD750。结果显示，20mg L-1GA可以促进微拟球藻生长。抑制GA合成（0.5mg L-1和5mg L-1Chlormequatchloride；0.5mg L-1、5mg L-1和20mg L-1Paclobutrazole）显著降低了微拟球藻的生长速率（图8）。
实施例5：激素在促进胁迫下藻类生长中的应用
步骤1.藻种培养和样品采集以真眼点藻属微拟球藻（N.oceanica）为例。采用优化的F/2海水培养基，配方如下：35g L-1海盐，1g L-1硝酸钠（NaNO3），67mg L-1磷酸二氢钠一水（NaH2PO4*H2O），3.65mg L-1氯化铁六水（FeCl3*6H2O），4.37mg L-1柠檬酸钠二水（Na2EDTA*2H2O），微量元素[0.0196mg L-1硫酸铜五水（CuSO4*5H2O），0.0126mg L-1钼酸钠二水（NaMoO4*2H2O），0.044mg L-1硫酸锌七水（ZnSO4*7H2O），0.01mgL-1氯化钴（CoCl2）和0.36mg L-1氯化锰四水（MnCl2*4H2O）]和维生素混合液（2.5μg L-1维生素B12,2.5μg L-1生物素和0.5μg L-1盐酸硫胺素）。细胞在50μmol photons m-2s-1的连续光照下，25℃培养。将对数期（OD750=3.0）的微拟球藻离心收集后，采用灭菌海水清洗3遍后，接种于新鲜的无氮和有氮培养液中。
步骤2.激素配置准确称取22mg细胞分裂素6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），先用2mL的1mol L-1的盐酸溶解，然后加水，定容至20mL，浓度为1.1g L-1(5mM)，，再用10%的1M盐酸稀释为0.5mM，放置于冰箱内备用。
步骤3.激素施加向培养液中加入6-苄氨基腺嘌呤至终浓度为0.5μM和5μM，对照组加入等量0.1M盐酸，并开始计时。
步骤4.生物量测定于6、12、24、48、96和144小时对细胞进行计数。于144小时，收集10ml藻细胞，烘干后称量。每个处理取4个生物学重复样本。结果显示，6-苄氨基腺嘌呤可以显著促进微拟球藻生长（图9）。
实施例6：激素在提高藻类生物抗逆性能中的应用
步骤1.藻种培养和样品采集以真眼点藻属微拟球藻（N.oceanica）为例。采用优化的F/2海水培养基，配方如下：35g L-1海盐，1g L-1硝酸钠（NaNO3），67mg L-1磷酸二氢钠一水（NaH2PO4*H2O），3.65mg L-1氯化铁六水（FeCl3*6H2O），4.37mg L-1柠檬酸钠二水（Na2EDTA*2H2O），微量元素[0.0196mg L-1硫酸铜五水（CuSO4*5H2O），0.0126mg L-1钼酸钠二水（NaMoO4*2H2O），0.044mg L-1硫酸锌七水（ZnSO4*7H2O），0.01mg L-1氯化钴（CoCl2）和0.36mg L-1氯化锰四水（MnCl2*4H2O）]和维生素混合液（2.5μg L-1维生素B12,2.5μg L-1生物素和0.5μg L-1盐酸硫胺素）。细胞在50μmol photons m-2s-1的连续光照下，25℃培养。将对数期（OD750=3.0）的微拟球藻离心收集后，灭菌海水清洗3遍后，接种于新鲜的含氮培养基（150μmol photons m-2s-1light高光下培养）或无氮培养液中（50μmol photons m-2s-1的光照下或黑暗条件下）培养。
步骤2.激素配置准确称取26mg，先用0.02mL的DMSO溶解，然后加水，定容至20mL，浓度为1.3g L-1(5mM)，再用0.1%的DMSO稀释为0.5mM，置于冰箱内备用。
步骤3.激素施加向培养液中加入脱落酸至终浓度为0.5μM和5μM，对照组加入等量0.1%的DMSO，并开始计时。
步骤4.抗逆性能测定于2、4、6、8、10和12小时测定细胞光系统II光合效率（Fv/Fm）。每个处理取4个生物学重复。结果显示，脱落酸可以显著提高胁迫条件下微拟球藻的光合效率和抗逆性能（图10）。
实施例7：藻类激素合成酶在转基因生物中的应用
步骤1.藻种培养和样品采集以真眼点藻属微拟球藻（N.oceanica）为例。采用优化的F/2海水培养基，配方如下：35g L-1海盐，1g L-1硝酸钠（NaNO3），67mg L-1磷酸二氢钠一水（NaH2PO4*H2O），3.65mgL-1氯化铁六水（FeCl3*6H2O），4.37mg L-1柠檬酸钠二水（Na2EDTA*2H2O），微量元素[0.0196mg L-1硫酸铜五水（CuSO4*5H2O），0.0126mg L-1钼酸钠二水（NaMoO4*2H2O），0.044mg L-1硫酸锌七水（ZnSO4*7H2O），0.01mgL-1氯化钴（CoCl2）和0.36mg L-1氯化锰四水（MnCl2*4H2O）]和维生素混合液（2.5μg L-1维生素B12,2.5μg L-1生物素和0.5μg L-1盐酸硫胺素）。细胞在50μmol photons m-2s-1的连续光照下，25℃培养至对数期（OD750=3.0）待用。
步骤2.总RNA提取将冷冻保存的藻液在液氮中充分研磨，采用Trizol（Invitrogen）试剂盒进行中RNA的提取。质检后，用于构建cDNA文库。
步骤3.DET2基因克隆设计并合成如下两对引物，其中引物P1SEQID NO:1和SEQ ID NO:2的扩增产物是SEQ ID NO:3。以微拟球藻cDNA为模板，经引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2进行PCR扩增，反应程序为：94℃5min预变性；94℃30sec，58℃30sec，72℃40sec，共30个循环；72℃7min延伸。PCR扩增产物即为片段SEQ ID NO:3，约700bp，纯化PCR产物，连接于pMD-18T载体，转化大肠杆菌，提取重组质粒，用BamHI和XbaI酶切，与经过同样酶切的pGreen180载体连接，获得含有片段SEQ ID NO:3的重组质粒pGreen180-DET2。
步骤4.转基因拟南芥构建采用农杆菌介导的方法将
pGreen180-DET2转化DET2缺陷的拟南芥突变体（det2）。经多次传代纯化获得过表达微拟球藻DET2的拟南芥det2突变体。拟南芥det2突变株个体较小，呈现显著的BR缺失矮化表型。而表达微拟球藻DET2的拟南芥，恢复了野生表型，表现出野生型拟南芥的株高（图11）。
微藻是进行生物柴油炼制的理想之选，借助本发明涵盖的激素代谢和信号通路及其调控方法，可进一步提高其抗逆性能、油脂积累、生长效率，推动微藻柴油的产业化进程；另外，微藻积累高附加值底物（虾青素、植物甾醇、二十二碳六烯酸），借助本发明可以优化各种转基因工程微藻工业化培养参数，进一步提高其高附加值底物的产量，改善其工业化生产性能；更加上多种微藻核基因组和叶绿体基因组序列已经测定，借助本发明可以在更大规模上发掘微藻激素代谢和信号传递与调控元件，进行功能基因组学研究，揭示机理并用于改善微藻或作物农艺性状。
本发明涉及的其它序列及记号分列如下：
SEQ ID NO:1的信息
长度：bp
分子类型：寡核苷酸
链性：单链
拓扑结构：线性
序列描述：SEQ ID NO:1
cgggatccatggatatagacaaagaactactgcac
SEQ ID NO:2的信息
长度：bp
分子类型：寡核苷酸
链性：单链
拓扑结构：线性
序列描述：SEQ ID NO:2
gctctagactactctaccatctcaccaaagaagtt
SEQ ID NO:3的信息
长度：bp
分子类型：寡核苷酸
链性：单链
拓扑结构：线性
序列描述：SEQ ID NO:3
atggatatagacaaagaactactgcaccgctccttggcatacgctttactagctttgggcattgctgccgctattgtcctgtttgtacgtcctgcaccgtatggacgctattccgaagccatgggctgggggcccttgatcgacgccaagctggcatggctaattatggagtcacccaatgtttttgtcagtgccgtgctatggaacgacgccggcttcgccacgaaaagcgaagccaaccaagtattgctcggactgtttgtcctgcactacgtgaaccgctccttcatctaccctgctcggatggccgcgggcaagcctatgccgctgtgcattatgcttatggcttgtagctttagttgttgtaatgactaccttcagacgagatatctgaccaaattttacatttaccctgaaacttgggtctcaagtccagaatatatccttggtcttctgatatttttcgcagggttttacatgaatctcgattctgattacatcctgcgagagctaaggaaaaagaaatgtgcaaagacaaaggcagaccgcgagtctcccgattccatgcgcactcgtcgacaagccaacgaggaacctgaagcagagaggaattcggtctcacagatatcctcatattgcatcccccgcggcgggctcgttgagtacatttccggcgccaacttctttggtgagatggtagagtag
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种可以调控微藻生长和其它功能的生长调节剂，其特征在于：所述生长调节剂为用于调节微藻生长发育的化合物。
2.按权利要求1所述的可以调控微藻生长和其它功能的生长调节剂，其特征在于：
所述生长调节剂为生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯、油菜素甾醇、独脚金甾醇、水杨酸或茉莉酸；以及生长调节剂的代谢和信号传递通路；激素合成酶、激素分解酶、激素衍生化酶、激素转运蛋白、激素结合蛋白、激素信号传递蛋白、转录因子或蛋白激酶。
3.一种权利要求1所述的可以调控微藻生长和其它功能的生长调节剂的鉴定方法，其特征在于：通过代谢物组学手段鉴定微藻激素，再通过功能基因组学手段阐释微藻激素的代谢通路、信号传递通路和调控网络；再通过转录组学手段鉴定在参与微藻抗逆和油脂合成过程中的激素代谢和信号传递相关的酶和蛋白。
4.按权利要求3所述的可以调控微藻生长和其它功能的生长调节剂，其特征在于：利用超高效液相色谱-电喷雾电离方式鉴定微藻激素的存在，利用超高效液相色谱-电喷雾电离方式鉴定微藻激素的种类并测定其含量，而后利用功能基因组学手段阐释微藻激素的代谢通路、信号传递通路和调控网络，最后利用转录组手段鉴定微藻激素的代谢、信号传递和网络调控的关键酶和蛋白。
5.按权利要求3或4所述的可以调控微藻生长和其它功能的生长调节剂，其特征在于：微藻为自养、异养或兼性营养型单细胞或多细胞藻类；或，通过基因工程手段获得的工程藻、通过物理化学诱变获得的突变子。
6.按权利要求5所述的可以调控微藻生长和其它功能的生长调节剂，其特征在于：所述微藻为绿藻、红藻、硅藻、褐藻、裸藻、甲藻、黄藻、金藻或真眼点藻；
或，生产高值蛋白、药物、动物疫苗、高值化合物（中性脂、虾青素、二十二碳六烯酸）的工程藻。
7.一种按权利要求1所述的可以调控微藻生长和其它功能的生长调节剂的应用，其特征在于：所述通过改造上述鉴定获得的微藻激素及其代谢通路和信号通路进而用于调控微藻生理状态，提高其生长速率。
8.一种按权利要求1所述的可以调控微藻生长和其它功能的生长调节剂的应用，其特征在于：所述通过改造上述鉴定获得的微藻激素及其代谢通路和信号通路进而用于提高微藻的抗逆性。
9.一种按权利要求1所述的可以调控微藻生长和其它功能的生长调节剂的应用，其特征在于：所述通过改造上述鉴定获得的微藻激素及其代谢通路和信号通路进而用于提高微藻的生物质、油脂和高附加值化合物的积累。
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