KR101230610B1 - 미세조류의 ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ 신호전달을 조작함으로써 지질 및 카로티노이드 대사 기작을 조절하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미세조류(microalgae)의 MAP kinase 신호전달을 조작함으로써 지질 및 카로티노이드 대사 기작을 조절하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 조작은 inhibitor를 이용하는 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일면은 Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella vulgaris 중 선택된 어느 하나의 미세조류를 inhibitor를 이용하여 MAP kinase 신호전달을 저해하면, 지질 및 카로티노이드(carotenoid)의 생합성이 동시에 증가함을 특징으로 하는 미세조류의 MAP kinase 신호전달을 조작함으로써 지질 및 카로티노이드 대사 기작을 조절하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 일면은 Haematococcus pluvialis 를 inhibitor를 이용하여 미세조류의 MAP kinase 신호전달을 저해하면, 아스타크산틴의 생합성이 감소함을 특징으로 하는 미세조류의 MAP kinase 신호전달을 조작함으로써 지질 및 카로티노이드 대사 기작을 조절하는 방법에 관한 것이다.
차세대 바이오 에너지원인 지질과 인류에 유익한 이차대사물질인 카로티노이드 계통을 전반적으로 제어할 수 있는 MAP kinase 신호전달 체계에 대한 규명에 대한 의미는 향후 산업적인 응용 가능성에 비추어 지대하다고 하겠다.

Description

미세조류의 ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ 신호전달을 조작함으로써 지질 및 카로티노이드 대사 기작을 조절하는 방법{Manipulation of microalgal lipid and carotenoid biosynthetic pathway by altering MAP kinase signaling pathway}

본 발명은 미세조류의 지질 및 카로티노이드 대사 기작의 전반적인 조절을 가능하게 하는 MAP kinase 신호전달에 관한 것이다. MAP kinase 신호전달은 한 가지 미세조류 균주에만 국한되지 않고, 여러 가지 미세조류에서 동일한 역할을 하는 것으로 본 연구에서 규명되었다. 이 신호전달 체계를 교란시키거나 조절함으로써, 미세조류의 중대한 대사물질인 지질과 카로티노이드를 산업적으로 응용할 수 있는 방향으로 획기적으로 조절 할 수 있다는 점에 관한 것이다.

산업화 혁명 이후 인류 문명의 급격한 발전은 화석 연료를 활용할 수 있는 기술의 개발에 기인한 것이라고 하여도 과언이 아니다. 따라서 산업화 혁명과 인류 문명의 발전은 화석 연료 사용의 비정상적인 증가를 필연적으로 초래하여 왔다. 지구상에 가용한 화석연료 자원은 한정되어 있는 점을 고려할 때, 이러한 화석연료에 대한 폭발적인 수요 증가는 궁극적으로 화석연료의 고갈 시기를 크게 앞당기게 될 것이다. 무엇보다도 화석연료 자원의 기하급수적인 사용 증가는 온실가스의 배출과 지구 온난화와 같은 심각한 환경 파괴 문제를 필연적으로 수반하여 왔으며, 이에 대한 세계적인 경각심이 크게 증대되고 있는 실정이다. 이에 따라, 세계의 과학자들은 화석 연료를 대체할 수 있는 지속가능하고 환경 친화적인 청정 그린에너지원을 발굴하고 개발 상용화하는데 박차를 가하고 있다.

화석연료를 대체할 신재생에너지원으로써 바이오매스를 에너지로 활용하는 기술은 청정에너지 기술로 각광을 받고 있다. 광합성을 통하여 이산화탄소를 흡수하면서도 대체 에너지원으로 가용한 바이오매스를 생성할 수 있다는 점에서 탄소 순환형 경제 체계를 확립할 수 있다는 큰 장점을 가지고 있다. 더욱이, 최근의 고유가에 기인하는 에너지 위기는 바이오매스 기반 바이오 에너지 생산 및 개발에 대한 전 세계 학계와 산업계의 비상한 관심을 이끌어 내고 있으며, 이에 대한 연구의 필요성을 절실하게 만들고 있다. 이 때문에, 바이오 에너지원으로 가용한 가장 유력 성분인 미세조류 지방질의 생합성 기작이나 이를 제어하는 메커니즘에 관한 연구의 필요성은 무엇보다도 절실해지고 있다고 하겠다.

무엇보다도 미세조류의 경우 바이오연료 외에도 유용 생산물을 부수적으로 생산할 수 있어서 일찍부터 주목을 받아 왔다. 이러한 유용 생산물은 카로티노이드 등의 이차대사 물질에 기인하는 것이 대부분이다. 카로티노이드는 생물학적 채색에 중요한 역할을 하는 것으로 비타민 A의 전구체가 된다. 카로티노이드 계통의 대표적인 유용 생산물의 예로는 Haematococcus pluvialis를 이용한 astaxanthin 생산이 부각되고 있다. Astaxanthin은 염료, 항산화제등으로 쓰이는 것으로 시장은 계속 커지고 있으며, 년 간 시장은 $200백만 달러 정도 된다고 한다. 이미 미국의 Aquasearch 나 Cyanotech등의 회사가 시장에 진출하여 있는 상태이다. 이와 같은 산업적인 중요성에도 불구하고, 미세조류의 카로티노이드 계통의 이차대사물질 생산 기작이나 영향을 미치는 신호전달 체계에 대한 기본적인 이해는 크게 미흡한 실정이다.

이하 본 발명과 관련된 특허문헌에 대해서 기재한다. 첫째, 출원번호 10-2010-0014481 이 존재한다. 이 발명은 미세조류 고밀도 배양용 광생물 반응기와, 이를 이용한 미세조류 배양 및 수확 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 세네데스무스(Scenedesmus sp.), 클로렐라(Chlorella sp.), 스피룰리나(Spirulina sp.)등과 같은 이산화탄소의 처리와 동시에 바이오디젤, 사료첨가제, 건강보조식품 등의 생산에 유용한 미세조류의 저비용, 고품질, 대량생산을 실현시킬 수 있는 미세조류 고밀도 배양용 광생물 반응기와, 이를 이용한 미세조류 배양 및 수확 방법에 관한 것으로 본 발명이 목적한 기술적 해격책에 대한 어떠한 개시도 없다는 점에서 차별성이 인정된다고 할 것이다. 둘째, 출원번호 10-2010-0015455 이 존재한다. 이 발명은 미세조류의 저비용 고효율의 배양방법을 제시하며, 바이오디젤의 원료에 적합한 지질함량이 높은 바이오메스(미세조류)를 수득하여 자연순환되는 재생에너지를 얻기 위한 것으로, 대표도면에 표시된 바와 같은 과정으로 최종 산물인 바이오디젤까지의 전체적인 생산과정 중에서 가장 핵심적인 역량이 필요한 배양장 설비 및 형질전환을 유도하여 미세조류내의 고지방산을 얻기 위한 장치의 생산과정을 통해 지질함량이 높은 미세조류의 생산방법을 제공하는 것을 특징으로 하는 바, 본 발명과 비교하여 기술적 본질을 달리한다.

현재까지 미세조류를 이용한 바이오에너지 생산기술 개발 분야는 국내에서도 최근 몇 종의 미세조류를 이용하여 지질함량을 높이기 위한 최적 배양조건 규명에만 초점이 맞추어져 왔다. 그러나 이러한 접근방법은 미세조류 바이오매스의 중요한 바이오 에너지원인 지질의 생성 기작에 대한 근원적인 지식에 대한 탐구가 뒷받침되지 않는다면 한계가 자명할 것으로 사료된다. 이러한 한계는 미세조류를 활용하여 카로티노이드등 고부가가치의 유용 생산물을 생산하고자 하는 연구 분야에서도 별반 다르지 않다.

여타의 생명체들과 마찬가지로 미세조류는 다양한 환경에 적응하기 위하여, 신호전달 메커니즘을 활용하여 지질과 카로티노이드 대사를 적절히 조절 및 제어해 나갈 것으로 사료된다. 따라서 미세조류의 신호전달 체계는 세포의 지질이나 카로티노이드의 축적의 시기와 함량을 총체적으로 제어할 수 있는 가장 유력한 생물학적 과정이라고 할 수 있다. 이러한 중요성에도 불구하고, 현재까지 미세조류의 신호전달 기작에 대한 이해는 거의 전무한 현실이다. 그러므로 미세조류 지질 대사와 카로티노이드 생합성을 제어하는 신호전달에 대한 이해는 반드시 선행되어져야 할 연구이며, 궁극적으로는 이러한 이해 없이는 목표지향적인 미세조류의 개량은 불가능하다고 하겠다. 본 발명에서는 미세조류 MAP kinase 신호전달 기작에 대하여 초점을 맞추고 연구를 수행하였으며, 이를 통하여 MAP kinase 신호전달이 미세조류의 지질과 카로티노이드 생산에 결정적인 역할을 하는 것을 확인 하였다. 인류가 미세조류를 효과적으로 활용하기 위하여 지질과 카로티노이드 등의 유용 생산물 생산에 영향을 미치는 신호전달 제어기작에 대한 이해가 중차대한 당면과제인데, 본 발명을 통하여 이에 대한 발견이 가능하였다. 본 발명을 통하여 미세조류 활용 유용생산물을 제어하는 MAP kinase 신호전달의 조작을 통하여, 향후 산업적 활용에 새로운 장을 열었다고 하겠다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 본 발명의 기재로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명에서는 미세조류(microalgae)의 MAP kinase 신호전달을 조작함으로써 지질 및 카로티노이드 대사 기작을 조절하는 방법을 제공한다.

바람직하게는 상기 조작은 inhibitor를 이용하는 것임을 특징으로 할 수 있고, 보다 바람직하게는 MEK inhibitor U0126 (promega)을 사용할 수 있다.

상세하게는 본 발명에서는 Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella vulgaris 중 선택된 어느 하나의 미세조류를 inhibitor를 이용하여 MAP kinase 신호전달을 저해하면, 지질 및 카로티노이드(carotenoid)의 생합성이 동시에 증가함을 특징으로 하는 미세조류의 MAP kinase 신호전달을 조작함으로써 지질 및 카로티노이드 대사 기작을 조절하는 방법을 제공한다.

상세하게는 본 발명에서는 Haematococcus pluvialis 를 inhibitor를 이용하여 미세조류의 MAP kinase 신호전달을 저해하면, 아스타크산틴의 생합성이 감소함을 특징으로 하는 미세조류의 MAP kinase 신호전달을 조작함으로써 지질 및 카로티노이드 대사 기작을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명인 미세조류의 MAP kinase 신호전달을 조작함으로써 지질 및 카로티노이드 대사 기작을 조절하는 방법을 통해, 우리 연구 그룹은 미세조류 지질과 astaxanthin을 포함하는 카로티노이드 계통의 색소체를 동시에 제어하는 MAP kinase 신호전달 기작을 규명할 수 있었다. 이 MAP kinase 신호전달 pathway는 단일 미세조류에만 국한되지 않고, 여러 가지 미세조류에서 동일한 역할을 할 수 있도록 진화학적으로 잘 보존되어 있었다. 차세대 바이오 에너지원인 지질과 인류에 유익한 이차대사물질인 카로티노이드 계통을 전반적으로 제어할 수 있는 MAP kinase 신호전달 체계에 대한 규명에 대한 의미는 향후 산업적인 응용 가능성에 비추어 지대하다고 하겠다. 본 연구 그룹은 MAP kinase 신호전달 이 다양한 미세조류 종들의 지질과 카로티노이드 계통의 생합성을 제어하는 'silver bullet'이라고 생각하며, 이의 조작을 통하여 미세조류를 활용한 상용화에 초석이 될 수 있을 것으로 생각한다. 본 발명을 통하여 미세조류를 바이오에너지원으로 상용화하거나 이차대사 유용 물질을 고부가가치 부산물로 활용할 수 있는 중대한 돌파구가 될 수 있을 것이다.

도 1은 미세조류 Chlamydomonas reinhardtii에서의 MAP kinase inhibitor 처리를 통한 지질 합성의 증대를 개시하는 실험결과이다(Growth curve에서 induction으로 표기된 시점에서 MAP kinase inhibitor를 처리. 처리 농도는 1→4로 갈수록 증가됨).
도 2는 미세조류 Chlorella vulgaris에서의 MAP kinase inhibitor 처리를 통한 지질 합성의 증대를 개시하는 실험결과이다(Growth curve에서 induction으로 표기된 시점에서 MAP kinase inhibitor를 처리. 처리 농도는 1→4로 갈수록 증가됨).
도 3은 미세조류 Haematococcus pluvialis에서의 MAP kinase inhibitor 처리를 통한 지질 합성의 증대를 개시하는 실험결과이다(Growth curve에서 induction으로 표기된 시점에서 MAP kinase inhibitor를 처리. 처리 농도는 1→4로 갈수록 증가됨).
도 4는 미세조류 C. reinhardtii에서의 MAP kinase inhibitor 처리를 통한 카로티노이드 합성의 증대를 개시하는 실험결과이다(MAP kinase inhibitor를 처리 농도는 1→4로 갈수록 증가됨).
도 5는 미세조류 C. vulgaris에서의 MAP kinase inhibitor 처리를 통한 카로티노이드 합성의 증대를 개시하는 실험결과이다(MAP kinase inhibitor를 처리 농도는 1→4로 갈수록 증가됨).
도 6은 미세조류 H. pluvialis에서의 MAP kinase inhibitor 처리를 통한 카로티노이드 합성의 증대를 개시하는 실험결과이다(MAP kinase inhibitor를 처리 농도는 1→4로 갈수록 증가됨).
도 7은 미세조류 H. pluvialis에서의 MAP kinase inhibitor 처리를 통한 astaxanthin 합성의 증대를 개시하는 실험결과이다(MAP kinase inhibitor를 처리 농도는 1→4로 갈수록 증가됨).

본 발명은 미세조류(microalgae)의 MAP kinase 신호전달을 조작함으로써 지질 및 카로티노이드 대사 기작을 조절하는 방법에 관한 것이다.

바람직하게는 상기 조작은 inhibitor를 이용하는 것임을 특징으로 할 수 있고, 보다 바람직하게는 MEK inhibitor U0126 (promega)을 사용할 수 있다.

상세하게는 본 발명은 Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella vulgaris 중 선택된 어느 하나의 미세조류를 inhibitor를 이용하여 MAP kinase 신호전달을 저해하여 지질 및 카로티노이드(carotenoid)의 생합성이 동시에 증가함을 특징으로 하는 미세조류의 MAP kinase 신호전달을 조작함으로써 지질 및 카로티노이드 대사 기작을 조절하는 방법에 관한 것이다.

상세하게는 본 발명은 Haematococcus pluvialis 를 inhibitor를 이용하여 미세조류의 MAP kinase 신호전달을 저해하여 아스타크산틴의 생합성이 감소함을 특징으로 하는 미세조류의 MAP kinase 신호전달을 조작함으로써 지질 및 카로티노이드 대사 기작을 조절하는 방법에 관한 것이다.

이하에서 검증될 실험에 기반한 메커니즘을 토대로 본 발명에 대해 구체적으로 설명한다.

본 발명은 미세조류의 지질과 카로티노이드 생합성에 관여하는 MAP kinase 신호전달의 규명과 향후 산업적인 응용에 관한 것이다. 일반적으로 특정 신호전달을 이해하기 위하여서는 그 신호전달에 관여하는 단백질을 합성하는 정보를 가진 특정 유전자를 삭제한 mutant를 생성하여 냄으로써만 가능하다고 받아들여지고 있다. 하지만, 미세조류에서는 이와 같은 mutant 생성 연구방법이 Chlamydomonas reinhardtii를 제외하고는 잘 확립되어 있지 않을 뿐만 아니라, 유사한 유전자가 상호보완적으로 여러 개수로 존재함으로 인하여 연구에 제약을 받아왔다. 이에 대한 해결책으로 본 발명에서는 특정 신호전달 체계를 교란할 수 있는 inhibitor를 대안으로 활용하였으며, 이를 통하여 신호전달의 기능적 역할을 성공적으로 규명할 수 있었다.

본 연구그룹은 MAP kinase 신호전달을 저해하거나 교란하는 특정 inhibitor를 처리함으로써 미세조류 MAP kinase 신호전달의 세포내의 특정 metabolites의 조절 역할을 규명하였다. 하단의 도면에서 보여지 듯이, 미세조류의 MAP kinase 신호전달을 저해하게 되면 미세조류의 지질과 카로티노이드의 동시적인 지대한 증대가 발생함을 본 연구그룹은 발견 할 수가 있었다. 이러한 지질과 카로티노이드의 함량은 MAP kinase 신호전달을 저해하는 inhibitor 농도와 정확히 비례하는 것으로 판명되었다. 이는 MAP kinase 신호전달이 본 발명에서 판명된 지질과 카로티노이드 생합성에 크게 영향을 미치고 있다는 반증이다. 또한 본 연구그룹은 미세조류 MAP kinase 신호전달이 진화학적으로 잘 보존 되어 있음을 세 가지 종류의 미세조류 종인 Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella vulgaris, 그리고 Haematococcus pluvialis를 가지고 테스트함으로써 검증하였다. MAP kinase 신호전달은 본 발명에서 시도된 세 가지 미세조류 균주의 차이를 뛰어 넘어 동일한 역할을 하는 것으로 나타났다. 그러므로, MAP kinase 신호전달이 진화학적으로 다양한 미세조류 종간에 차이가 없이 유사한 역할을 하는 것으로 판명될 수 있었다. 이를 바탕으로 미세조류 MAP kinase 신호전달이 지질과 카로티노이드의 생합성을 음의 방향으로 제어한다는 결론을 도출할 수 있었고, 이는 다양한 미세조류 종간의 차이가 없이 공통적인 것이었다.

그러나, H. pluvialis를 활용한 astaxanthin의 경우 여타의 카로티노이드와는 달리 MAP kinase 신호전달에 의하여 양의 방향으로 제어되었다. MAP kinase 신호전달의 inhibitor의 처리는 astaxanthin 생합성을 오히려 저해하였다. 이는 H. pluvialis의 카로티노이드와 astaxanthin 생합성이 경쟁관계에 있으면서, 동일한 MAP kinase 신호전달 체계에 상반되게 제어 되고 있음을 보여주는 것이다. Metabolic flux가 카로티노이드 생합성으로 편향되게 되면, H. pluvialis의 astaxanthin 생합성의 경우 저해되기 때문으로 사료된다.

본 발명을 통하여, 미세조류 지질과 카로티노이드 또는 astaxanthin과 같은 인류에 유용한 색소체 생합성 제어에 관한 신호전달 메커니즘의 이해를 한층 높일 수 있었다. 향후 미세조류의 MAP kinase 신호전달을 유전자 조작이나 화학적인 저해제 또는 조절제를 특정 시점에 inducer로 투여함으로써 조절하면, 우리가 원하는 방향 (지질이나 카로티노이드 합성의 증대)으로 미세조류의 표현형을 충분히 획기적으로 변환시킬 수 있을 것으로 판단된다.

이상 본 발명에 대해서 설명하였으나 이는 본 발명의 일면에 불과하며 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 설명된 실시형태를 변경 또는 변형할 수 있으며, 이러한 변경 또는 변형도 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 본 명세서에서 설명한 각 구성요소의 물질은 당업자가 공지된 다양한 물질로부터 용이하게 선택하여 대체할 수 있다. 또한 당업자는 본 명세서에서 설명된 구성요소 중 일부를 성능의 열화 없이 생략하거나 성능을 개선하기 위해 구성요소를 추가할 수 있다. 뿐만 아니라, 당업자는 공정 환경이나 장비에 따라 본 명세서에서 설명한 방법 단계의 순서를 변경할 수도 있다. 따라서 본 발명의 범위는 설명된 실시형태가 아니라 특허청구범위 및 그 균등물에 의해 결정되어야 한다.

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3. Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella vulgaris 중 선택된 어느 하나의 미세조류를 MEK inhibitor U0126를 이용하여 MAP kinase 신호전달을 저해하여 지질 및 카로티노이드(carotenoid)의 생합성이 동시에 증가함을 특징으로 하는 미세조류의 MAP kinase 신호전달을 조작함으로써 지질 및 카로티노이드 생합성이 증가되도록 조절하는 방법.
4. Haematococcus pluvialis를 MEK inhibitor U0126를 이용하여 미세조류의 MAP kinase 신호전달을 저해하여 아스타크산틴(astaxanthin)의 생합성이 감소되도록 하는 방법.
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