CN105177055B - 一种提高木质纤维素糖化效果的生物-化学组合处理工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明为一种提高木质纤维素糖化效果的组合处理工艺，本工艺先利用一株高效的木质纤维素降解菌Sphingobacterium sp.LD‑1(保藏号为CGMCC No.10920)对木质纤维素原料进行生物处理，通过微生物的作用去除木质纤维素原料中的部分木质素和半纤维素成分，并在一定程度上破坏木质纤维素的稳定结构；再进一步利用碱/尿素在低温下进行化学处理，使木质纤维素结构变得更松散。经本工艺预处理后，木质纤维素的组分含量发生明显变化，纤维素所占比例显著升高；此外，木质纤维素的结构也发生了显著变化，原料表面变得粗糙且疏松多孔，大大增加了酶解糖化时的可及表面。本组合预处理工艺具有设备要求不高、操作简单、处理条件温和、成本低廉等优点，可大幅提升木质纤维素的糖化效率。

Description

一种提高木质纤维素糖化效果的生物-化学组合处理工艺
技术领域
本发明涉及木质纤维素制取生物乙醇预处理技术领域，具体来讲是一种细菌Sphingobacterium sp.LD-1与碱/尿素预处理木质纤维素的组合工艺。
背景技术
随着全球能源危机的加剧，目前对可替代能源的开发研究成为热点问题。木质纤维素制取燃料乙醇由于具有较高的环境和经济价值受到各方关注。第一代生物质燃料乙醇以糖类和淀粉类等为原料，但面临着成本上升、与人争地的问题；以农林废弃物作为第二代生物质原料制取燃料乙醇成为最适合的替代能源之一。
木质纤维素是植物光合作用的主要产物，其主要成分为纤维素、半纤维素和木质素。其中纤维素是骨骼物质，木质素和半纤维素以包容物质的形式分散在纤维素之间及其周围，三种成分之间主要通过共价键紧密连结，同时存在一定程度的化学键。因此，木质纤维素结构复杂且稳定。
有别于第一代能够直接糖化发酵的生物质原料，目前以农林废弃物为主的第二代原料，由于木质纤维素结构的复杂稳定性，利用其制取燃料乙醇的主要瓶颈在于预处理技术。预处理的主要目的是在最大限度保留纤维素的基础上，对木质素的脱除以及破坏纤维素的结晶度和聚合度，从而提高纤维素酶酶解效率。
目前常规的预处理技术主要分为物理法、化学法和生物法。物理法主要有球磨法、蒸汽爆破法，其中蒸汽爆破法虽然酶解效率较高，但其对设备要求高，投入大，制约了规模化生产。化学方法，如酸法、碱法，其中酸预处理对木质素脱除效果不明显，并且容易产生微生物发酵抑止物，增加了后续处理的难度，此外酸对预处理装置的腐蚀性也是制约其工业化的重要原因之一；碱预处理相对于酸法反应器成本较低、操作安全，但仍需废水和残余物的回收处理工序。生物法则主要采用白腐霉等真菌预处理，处理条件温和但预处理效果不佳，且时间过长，不易于工业投产。因此，一种低成本的高效预处理技术对于推动木质纤维素制取燃料乙醇的工业化生产具有重要意义。
发明内容
为了解决现有木质纤维素预处理技术存在的问题，本发明提供了一种生物联合碱/尿素的预处理工艺，提高了木质纤维素的酶解糖化效率。
本发明的技术方案为：
(1)将保存在LB斜面的LD-1菌体接种于LB液体培养基中，于25℃-40℃温度下，培养16-24h，得到LD-1的种子液；
(2)其中所述LB液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L；所述LB斜面是在上述配方的基础上加入15-20g/L的琼脂；
(3)将上一步所得到的LD-1种子液在6000-10000rpm条件下离心2-5分钟，弃去上层清液，收集菌体；
(4)进一步将收集的LD-1菌体按5-15％(体积比)接种量，接种于木质纤维素液体培养基中，于25℃-40℃温度下，自然pH，培养3-7天；
(5)其中所述木质纤维素液体培养基各成分配比为：木质纤维素3.0g，K2HPO41.0g，(NH4)2SO4 2.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.1g，FeSO4 0.05g，MnSO4 0.02g，蒸馏水1L；
(6)将经过LD-1培养后的木质纤维素清洗至pH呈中性后，于50℃-60℃烘干至恒重；
(7)进一步将木质纤维素置于适当大小容器中，按固液比为1:10-1:30(g/ml)加入浓度为1％/2％-4％/6％的NaOH/尿素溶液，静置于-10℃-20℃恒温环境中2-6h后，过滤分离得到湿渣A；
(8)进一步用蒸馏水反复冲洗湿渣A，直至冲洗液pH呈中性，将冲洗后得到的湿渣B置于50℃-60℃烘干至恒重。
本发明提供的预处理方法的优势在于：
(1)利用高效木质纤维素降解菌LD-1生物处理与NaOH/尿素溶液结合的两步法，去除半纤维素和木质素组分，破坏木质纤维素结构，使得原料表面变得粗糙且疏松多孔，大大增加了酶解糖化时的可及表面；
(2)经该组合工艺预处理后的木质纤维素能够大幅提高酶解糖化效率，相比于未经预处理的木质纤维素，酶解效率提高为原来的5倍以上；
(3)预处理过程中第二步温度条件在我国北部一些地区不需消耗任何能源就可达到，本发明在这些地区经济效益显著增加；
(4)该预处理方法对设备要求低，设备投入不高、操作简单、处理条件温和、成本低廉等优点。
附图说明:
图1：经本发明组合预处理后木质纤维素各组分变化
图2：经本发明组合预处理后木质纤维素酶解效果分析
图3：经本发明组合预处理的木质纤维素预处理前后扫描电镜分析
具体实施方式：
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。
实施例1
(1)将水稻秸秆粉碎后40目过筛，超纯水清洗两遍，于55℃烘干至恒重；
(2)将保存在LB斜面的LD-1菌体接种于LB液体培养基中，于30℃温度下，培养18h，得到LD-1的种子液；
(3)其中所述LB液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L，所述LB斜面是在上述配方的基础上加入15g/L的琼脂；
(4)将上一步所得到的LD-1种子液在8000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；
(5)进一步将收集的LD-1菌体按10％(体积比)接种量，接种于木质纤维素液体培养基中，于30℃温度下，自然pH，培养4天；
(6)其中所述木质纤维素液体培养基各成分配比为：木质纤维素3.0g，K2HPO41.0g，(NH4)2SO4 2.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.1g,FeSO4 0.05g，MnSO4 0.02g，蒸馏水1L；
(7)将经过LD-1培养后的木质纤维素清洗至pH呈中性后，于55℃烘干至恒重；
(8)进一步将木质纤维素置于适当大小容器中，按固液比为1:20(g/ml)加入浓度为4％/6％的NaOH/尿素溶液，静置于-10℃恒温环境中4h后，过滤分离得到湿渣A；
(9)进一步用蒸馏水反复冲洗湿渣A，直至冲洗液pH呈中性，将冲洗后得到的湿渣B置于55℃烘干至恒重，得到预处理后的水稻秸秆；
通过本实施例的实施，如附图1所示，经本方法处理后的水稻秸秆各组分含量发生显著变化，木质素及半纤维素含量显著降低，而纤维素含量升高；预处理后的水稻秸秆酶解液中还原糖含量达到9.25g/L(如附图2)，相比于未经预处理的水稻秸秆纤维素酶酶解液中还原糖含量仅为1.73g/L，经该实施例预处理后，水稻秸秆酶解效率提高为原来的5.3倍，因此联合预处理后水稻秸秆的酶解效果得到大幅提高。结合扫描电镜图像(如附图3)所示，未经预处理的水稻秸秆(a、b、c)呈直杆状且杆径较粗，表面平整光滑；而经本实施例预处理后的水稻秸秆(d、e、f)相对较细，呈弯曲长条状；500倍放大图像中可以看到，水稻秸秆表面粗糙，出现严重孔洞现象，由此可以推断出经本实施例预处理后的水稻秸秆在纤维素表面上暴露出大量活性界面，大大增加了酶的可及表面，加速了纤维素酶对水稻秸秆的水解。
实施例2
(1)将水稻秸秆粉碎后40目过筛，超纯水清洗两遍，于55℃烘干至恒重；
(2)将保存在LB斜面的LD-1菌体接种于LB液体培养基中，于30℃温度下，培养18h，得到LD-1的种子液；
(3)其中所述LB液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L，所述LB斜面是在上述配方的基础上加入15g/L的琼脂；
(4)将上一步所得到的LD-1种子液在8000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；
(5)进一步将收集的LD-1菌体按10％(体积比)接种量，接种于木质纤维素液体培养基中，于30℃温度下，自然pH，培养4天；
(6)其中所述木质纤维素液体培养基各成分配比为：木质纤维素3.0g，K2HPO41.0g，(NH4)2SO4 2.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.1g，FeSO4 0.05g，MnSO4 0.02g，蒸馏水1L；
(7)将经过LD-1培养后的木质纤维素清洗至pH呈中性后，于55℃烘干至恒重；
(8)进一步将木质纤维素置于适当大小容器中，按固液比为1:20(g/ml)加入浓度为4％/6％的NaOH/尿素溶液，静置于4℃恒温环境中4h后，过滤分离得到湿渣A；
(9)进一步用蒸馏水反复冲洗湿渣A，直至冲洗液pH呈中性，将冲洗后得到的湿渣B置于55℃烘干至恒重，得到预处理后的水稻秸秆；
经本实施例预处理后的水稻秸秆酶解液中还原糖含量从1.73g/L提高到8.36g/L，酶解效率提高为原来的5.8倍。
实施例3
(1)将水稻秸秆粉碎后40目过筛，超纯水清洗两遍，于55℃烘干至恒重；
(2)将保存在LB斜面的LD-1菌体接种于LB液体培养基中，于30℃温度下，培养18h，得到LD-1的种子液；
(3)其中所述LB液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L；所述LB斜面是在上述配方的基础上加入15g/l的琼脂；
(4)将上一步所得到的LD-1种子液在8000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；
(5)进一步将收集的LD-1菌体按10％(体积比)接种量，接种于木质纤维素液体培养基中，于30℃温度下，自然pH，培养4天；
(6)其中所述木质纤维素液体培养基各成分配比为：木质纤维素3.0g，K2HPO41.0g，(NH4)2SO4 2.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.1g，FeSO4 0.05g，MnSO4 0.02g，蒸馏水1L；
(7)将经过LD-1培养后的木质纤维素清洗至pH呈中性后，于55℃烘干至恒重；
(8)进一步将木质纤维素置于适当大小容器中，按固液比为1:20(g/ml)加入浓度为4％/6％的NaOH/尿素溶液，静置于20℃恒温环境中4h后，过滤分离得到湿渣A；
(9)进一步用蒸馏水反复冲洗湿渣A，直至冲洗液pH呈中性，将冲洗后得到的湿渣B置于55℃烘干至恒重，得到预处理后的水稻秸秆；
经本实施例预处理后的水稻秸秆酶解液中还原糖含量从1.73g/L提高到8.14g/L，酶解效率提高为原来的5.7倍。
注：本专利涉及的细菌Sphingobacterium sp.LD-1于2015年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号：CGMCC NO.10920，分类命名为鞘氨醇杆菌Sphingobacterium sp。

Claims (1)

1.一种提高木质纤维素糖化效果的生物-化学组合处理方法，其特征在于：包括以下几个步骤：（1）鞘氨醇杆菌LD-1（Sphingobacterium sp. LD-1，2015年6月10日，中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC，CGMCC No. 10920）预处理：将鞘氨醇杆菌LD-1菌体按5-15%（体积比）接种量，接种于木质纤维素液体培养基中，于25℃-40℃温度下，自然pH，培养3-7天，所得木质纤维素用超纯水清洗3次，烘干至恒重；
（2）碱/尿素预处理：将步骤（1）所得木质纤维素按固液比为1:10-1:30（g/ml）加入浓度为1%/2%-4%/6%的NaOH/尿素溶液中，静置于-10℃-20℃恒温环境中2-6 h后，过滤分离，所得木质纤维素用超纯水清洗至pH呈中性后，烘干至恒重，完成木质纤维素的预处理。
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