CN105647980B - 一种木质纤维素酶解发酵产丁醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种木质纤维素酶解发酵产丁醇的方法,包括如下步骤:(1)将预处理后的木质纤维素、纤维素酶和乙酸丁酯按一定比例加入到反应器中进行酶解;(2)采用氢氧化钙调节酶解液的pH值为6~8,于50℃反应1h;(3)在上述酶解液中加入除氧剂,并通入惰性气体,使体系处于无氧状态;(4)在上述脱毒后的酶解液中接入丁醇发酵菌种,发酵制备丁醇。本发明通过选择合适的萃取剂和脱毒剂,对预处理和酶解过程中产生的乙酸、糠醛、羟甲基糠醛等发酵抑制物进行原位萃取分离,降低了抑制物对酶解和发酵的毒性,提高了丁醇产量。
Description
技术领域
本发明属于生物质能源领域,具体涉及一种木质纤维素酶解发酵产丁醇的方法。
背景技术
丁醇作为一种重要的四碳平台化合物,具有非常广泛的用途,主要用于醋酸丁酯、邻苯二甲酸正丁酯(DBP)、丙烯酸丁酯、脂肪二元酸和磷酸类增塑剂等的制造。丁醇还是一种极具潜力的新型生物燃料,被称为第二代生物燃料,在替代汽油作为燃料方面性能优于乙醇,表现在:丁醇含有的热值比乙醇高25%,与汽油相当;丁醇的燃点高于乙醇,使用更安全;与乙醇相比,丁醇更易溶于汽油和柴油,而不易溶于水;丁醇腐蚀性小,易于运输,可直接应用于汽车而不必改造现有发动机。另外,丁醇也可以作为各种燃料的添加剂。
丁醇的生产工艺主要有化学合成法和微生物发酵法两种。随着石油资源的日益枯竭,采用以石油为原料丙烯羰基合成法生产丁醇已举步维艰,而且由于技术落后,装置偏小导致产能不够,致使中国丁醇市场长期供应不足,不能满足国内市场的需求。生物发酵法制备丁醇有其独到的优势,发展生物丁醇将极大地缓解丁醇供应不足的现状。传统的丙酮丁醇发酵以淀粉、糖蜜为主要原料,原料成本占丙酮丁醇发酵总成本的60%以上,成为影响生物丁醇价格的主要因素之一。在粮食短缺与能源危机的双重威胁下,探索纤维质原料生产燃料丁醇成为生物质能源发展战略的重要组成部分。
木质纤维素制备丁醇过程通常包括预处理、水解、发酵、蒸馏等单元操作。其中纤维素水解为可发酵糖是纤维素丁醇炼制过程中至关重要的环节。目前,木质纤维素的降解主要有化学法水解和酶法水解。但是,在木质纤维素预处理过程中,由于酸或热的作用,部分纤维素、半纤维素和木质素发生降解和分解作用产生甲酸、乙酸、乙酰丙酸、糠醛、羟甲基糠醛和酚类化合物等对酶解和后续发酵有抑制作用的物质,这些物质必须脱毒去除。木质纤维素原料水解糖液脱毒的方法很多,主要包括石灰过量中和、活性炭吸附、离子交换、蒸汽汽提和生物脱毒等,但这些方法存在脱毒效果差、成本高,或在发酵抑制物质脱除的同时糖分损失大等缺点。
CN200910088002.X公开了一种汽爆秸秆木糖发酵丙酮丁醇及提取剩余物的方法,报道了利用树脂(包括大孔吸附树脂和碱性离子交换树脂)去除抑制剂的方法,使得脱毒后的汽爆秸秆酶解液可以进行丙酮丁醇发酵,最终总溶剂产量达到12-22g/L,但是用吸附方法脱毒价格昂贵,而且使酶解液中还原糖损失很大,不得不再对酶解液进行浓缩,整个过程耗时长,成本高。
CN101748158公开了一种以木质纤维素类生物质为原料发酵制备生物丁醇的方法,玉米秸秆经过2%的硫酸(v/v)预处理,氢氧化钙(石灰乳)中和处理液后,用有机超滤膜浓缩处理液获得高浓度糖,进而用大孔吸附树脂脱毒后,用丙酮丁醇梭菌发酵处理液,最终得到15.6 g/L的总溶剂,此过程虽然省去了纤维素酶处理步骤,但繁琐且昂贵的处理和脱毒步骤不利于实际工业生产。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供了一种木质纤维素酶解发酵产丁醇的方法。本发明通过选择合适的萃取剂和脱毒剂,对预处理和酶解过程中产生的乙酸、糠醛、羟甲基糠醛等发酵抑制物进行原位萃取分离,降低了抑制物对酶解和发酵的毒性,提高了丁醇产量。
本发明木质纤维素酶解发酵产丁醇的方法,包括如下步骤:
(1)将预处理后的木质纤维素、纤维素酶和乙酸丁酯按一定比例加入到反应器中进行酶解;
(2)采用氢氧化钙调节酶解液的pH值为6~8,于50℃反应1h;
(3)在上述酶解液中加入除氧剂,并通入惰性气体,使体系处于无氧状态;
(4)在上述脱毒后的酶解液中接入丁醇发酵菌种,发酵制备丁醇。
本发明中,步骤(1)所述的木质纤维素原料包括一切含纤维素的物料,如秸秆、木屑和能源作物等,优选玉米秸秆。木质纤维素原料需要机械粉碎到粒径为0.1~30mm,优选粒径为0.2~1.0mm。所述预处理方式可以采用一切可提高木质纤维素酶解性能的物理、化学和热化学技术,包括机械粉碎、辐射、微波、酸处理、碱处理、蒸汽爆破预处理和溶剂预处理,或上述方法的组合预处理等,优选采用稀酸蒸汽爆破组合预处理。
本发明中,步骤(1)所述酶解过程中酶加量为5~20IU/g纤维素干基。所述的纤维素酶采用可水解木质纤维素组分的酶蛋白或酶蛋白混合物,可在工厂在线生成纤维素酶,也可采用市售商品纤维素酶,如诺维信酶或者泽生酶。酶解的条件为:干物浓度(可溶性固体和不可溶性固体质量之和与体系总质量的百分比,下同)为5wt%~30wt%,酶解温度为45℃~55℃,优选为48℃~52℃,酶解时间为12~40h,优选为20~30h,pH值为4.5~5.5。
本发明中,步骤(1)所述的乙酸丁酯的加入量为0.01~0.1mol/L,优选为0.05~0.08mol/L。进一步地,本发明酶解体系中优选加入一定量的Gemini表面活性剂,加入量为0.025~0.5mol/L,优选为0.1~0.25mol/L。
本发明中,步骤(2)利用氢氧化钙调节酶解液pH,采取直接加入氢氧化钙固体颗粒调节酶解液的pH至6~8,离心后去除沉淀,液体即为脱毒后的酶解液。
本发明中,步骤(3)所述除氧剂为常规使用的除氧剂,优选为保险粉,采用刃天青作为指示剂,保险粉溶液的配置方法:称取1g连二亚硫酸钠与0.6g碳酸钠溶于10mL去离子水,以0.22μm的微孔滤膜滤入经灭菌的已经除氧的厌氧小瓶内,使用时逐滴加入,至刃天青变为无色为止。所述惰性气体为氮气、氢气或二氧化碳气体等。具体根据反应体系的情况,使其可以保持无氧状态即可。
本发明中,步骤(4)所述丁醇发酵菌株为拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)或者丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum),如可以采用丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824,购于美国模式菌种收集中心;或者采用拜氏梭菌CM20,其分类命名为拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii),已于2014年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.9354。本发明优选采用拜氏梭菌CM20,该菌株是由出发菌株拜氏梭菌Clostridium beijerinckii NCIMB8052(购于英国国家工业、海洋和食品菌种保藏中心)经紫外诱变后,利用淀粉平板和葡萄糖平板筛选得到高活力产丁醇菌株,再经厌氧发酵筛选得到高产丁醇、丙酮、乙醇的目标菌株。
本发明中,步骤(4)以脱毒后的酶解液为发酵培养基进行厌氧发酵产丁醇。采用本领域常规的培养方式制备发酵菌种子液,优选采用RCM培养基制备种子液,具体配方以g/L计为:蛋白胨10,牛肉粉10,酵母粉 3.0,葡萄糖 5,可溶性淀粉 1.0,氯化钠5.0,醋酸钠3.0,L-半胱氨酸盐酸盐 0.5,琼脂 0.5,以纯水配置,115℃,灭菌20min。发酵菌种子液是在种子培养基中接入丁醇发酵菌,厌氧环境下于36-38℃下培养16-20h获得的。种子液的接种量为5%-10%(v/v),发酵温度为33-38℃,发酵时间72-84小时,即得到生物溶剂(丙酮,丁醇和乙醇)。
与现有技术相比,本发明具有如下优点:
1、在酶解阶段加入乙酸丁酯,可以高效萃取糠醛、羟甲基糠醛等毒性物质,同时降低其对酶解和发酵的抑制作用;
2、采用氢氧化钙调节酶解液的pH值,使得发酵过程可以在适宜条件下进行,而且可以去除其中的酚类化合物,进一步对酶解液进行脱毒。此外,酶解阶段加入的乙酸丁酯可以在氢氧化钙作用下水解成乙酸盐和丁醇,降低其对后续发酵过程的干扰;
3、加入Gemini表面活性剂,表面活性剂有助于纤维素酶的脱附,有助于提高酶解效果,而且有助于乙酸丁酯在碱性条件下更好地水解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行更详细的说明。本发明中,wt%为质量分数。
本发明实施例采用的木质纤维素原料为玉米秸秆,玉米秸秆中纤维素含量为38wt%,半纤维素含量为21wt%,木质素含量为17wt%。取干燥的玉米秸秆原料机械粉碎到粒径为0.2~1.0mm之间。采用稀酸蒸爆对玉米秸秆进行预处理,条件为:2wt%硫酸,干物浓度30wt%,蒸煮温度190℃,停留时间5.5min。预处理后原料的干物浓度为46.7wt%,纤维素含量为37.3wt%。
本发明实施例采用的纤维素酶为诺维信公司生产的用于转化木质纤维素原料的Biomass Kit,其中包括纤维素酶复合物(NS 50013) 和β-葡萄糖苷酶(NS 50010),酶解pH值为4.5,滤纸酶活(FPA)137 IU/g(国际单位)。
实施例1
控制酶解体系总质量为2kg,按照干物浓度为15wt%加入预处理好的玉米秸秆(PCS),控制酶加量为7IU/g纤维素干基,同时加入0.05mol/L的乙酸丁酯作为萃取剂,进行酶解反应。酶解pH值为4.5,温度为50℃,酶解30h后,加入氢氧化钙固体颗粒调节酶解液的pH至6.0,然后离心得到脱毒后的酶解液,将脱毒后的酶解液加入到反应器,加入除氧剂并通入高纯氮气保持无氧环境后加入P2培养基(以g/L计为:酵母 1.0,CH3COONH4 2.2,KH2PO40.5,K2HPO4 0.5,MnSO4 0.01,NaCl 0.01,MgSO4·7H2O 0.2,FeSO4 0.01,对氨基苯甲酸0.001,维生素B1 0.001,生物素0.01×10-3),然后接入丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824,购于美国模式菌种收集中心,接种量为10%,发酵温度为37℃,发酵72h后测得发酵液中丁醇含量为11.73g/L,发酵前测得酶解液中葡萄糖含量为58.69g/L,发酵后得水解液中葡萄糖浓度为1.4 g/L。
实施例2
控制酶解体系总质量为2kg,按照干物浓度为20wt%加入预处理好的玉米秸秆(PCS),控制酶加量为10IU/g纤维素干基,同时加入0.08mol/L的乙酸丁酯作为萃取剂,进行酶解反应。酶解pH值为5.0,温度为52℃,酶解20h后,加入氢氧化钙固体颗粒调节酶解液的pH至7.0,然后离心得到脱毒后的酶解液,将脱毒后的酶解液加入到反应器,加入除氧剂并通入高纯氮气保持无氧环境后加入P2培养基(以g/L计为:酵母 1.0,CH3COONH4 2.2,KH2PO40.5,K2HPO4 0.5,MnSO4 0.01,NaCl 0.01,MgSO4·7H2O 0.2,FeSO4 0.01,对氨基苯甲酸0.001,维生素B1 0.001,生物素0.01×10-3),然后接入丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824,购于美国模式菌种收集中心,接种量为10%,发酵温度为37℃,发酵72h后测得发酵液中丁醇含量为12.10g/L,发酵前测得酶解液中葡萄糖含量为67.69g/L,发酵后得水解液中葡萄糖浓度为9.3 g/L。
实施例3
控制酶解体系总质量为2kg,按照干物浓度为30wt%加入预处理好的玉米秸秆(PCS),控制酶加量为20IU/g纤维素干基,同时加入0.1mol/L的乙酸丁酯作为萃取剂,进行酶解反应。酶解pH值为5.5,温度为48℃,酶解25h后,加入氢氧化钙固体颗粒调节酶解液的pH至8.0,然后离心得到脱毒后的酶解液,将脱毒后的酶解液加入到反应器,加入除氧剂并通入高纯氮气保持无氧环境后加入P2培养基(以g/L计为:酵母 1.0,CH3COONH4 2.2,KH2PO40.5,K2HPO4 0.5,MnSO4 0.01,NaCl 0.01,MgSO4·7H2O 0.2,FeSO4 0.01,对氨基苯甲酸0.001,维生素B1 0.001,生物素0.01×10-3),然后接入丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824,购于美国模式菌种收集中心,接种量为10%,发酵温度为37℃,发酵72h后测得发酵液中丁醇含量为12.38g/L,发酵前测得酶解液中葡萄糖含量为65.37g/L,发酵后测得水解液中葡萄糖浓度为4.53g/L。
实施例4
处理工艺及操作条件同实施例1,不同之处在于接入拜氏梭菌CM20进行发酵。接种量为8%,发酵温度为37℃,发酵72h后测得发酵液中丁醇含量为12.15g/L,发酵前测得酶解液中葡萄糖含量为58.69g/L,发酵后测得水解液中无残糖。
实施例5
处理工艺及操作条件同实施例2,不同之处在于接入拜氏梭菌CM20进行发酵。接种量为8%,发酵温度为37℃,发酵72h后测得发酵液中丁醇含量为12.51g/L,发酵前测得酶解液中葡萄糖含量为67.69g/L,发酵后测得水解液中葡萄糖浓度为7.27g/L。
实施例6
处理工艺及操作条件同实施例1,不同之处在于在酶解过程中,同时加入0.1 mol/L的Gemini表面活性剂。发酵72h后测得发酵液中丁醇含量为12.11g/L,发酵前测得酶解液中葡萄糖含量为62.69g/L,发酵后测得水解液中葡萄糖浓度为3.6g/L。
实施例7
处理工艺及操作条件同实施例4,不同之处在于在酶解过程中,同时加入0.25mol/L的Gemini表面活性剂,接入拜氏梭菌CM20进行发酵。接种量为8%,发酵温度为37℃,发酵72h后测得发酵液中丁醇含量为12.78g/L,发酵前测得酶解液中葡萄糖含量为62.69g/L,发酵后测得水解液中葡萄糖浓度为2.58g/L。
比较例1
处理工艺及操作条件同实施例1,不同之处在于在酶解过程中,不加入乙酸丁酯作为萃取剂。发酵72h后测得发酵液中丁醇含量为8.98g/L,发酵前测得酶解液中葡萄糖含量为45.69g/L,发酵后测得水解液中葡萄糖浓度为1.76g/L。
比较例2
处理工艺及操作条件同实施例1,不同之处在于采用氢氧化钠代替氢氧化钙调节pH。发酵72h后测得发酵液中丁醇含量为10.08g/L,发酵前测得酶解液中葡萄糖含量为58.69g/L,发酵后测得水解液中葡萄糖浓度为8.76g/L。
通过上述实验结果表明,本发明在酶解过程中加入乙酸丁酯作为萃取剂,并加入Gemini表面活性剂,同时采用氢氧化钙等脱毒方法的酶解发酵工艺,大大提高了水解液中葡萄糖含量以及发酵丁醇的产量。
Claims (10)
1.一种木质纤维素酶解发酵产丁醇的方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)将预处理后的木质纤维素、纤维素酶和乙酸丁酯按一定比例加入到反应器中进行酶解,酶解时间为12~40h;乙酸丁酯的加入量为0.01~0.1mol/L;所述酶解体系中加入Gemini表面活性剂,加入量为0.025~0.5mol/L;
(2)采用氢氧化钙调节酶解液的pH值为6~8,于50℃反应1h;离心后去除沉淀,液体即为脱毒后的酶解液;
(3)在上述酶解液中加入除氧剂,并通入氮气,使体系处于无氧状态;
(4)在上述脱毒后的酶解液中接入丁醇发酵菌种,发酵制备丁醇。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(1)所述的木质纤维素原料为玉米秸秆,机械粉碎到粒径为0.1~30mm。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(1)所述的预处理采用稀酸蒸汽爆破组合预处理。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(1)所述酶解过程中酶加量为5~20IU/g纤维素干基,纤维素酶采用可水解木质纤维素组分的酶蛋白或酶蛋白混合物。
5.根据权利要求1或4所述的方法,其特征在于:步骤(1)所述酶解的条件为:干物浓度为5wt%~30wt%,酶解温度为45℃~55℃,pH值为4.5~5.5。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:乙酸丁酯的加入量为0.05~0.08mol/L。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:Gemini表面活性剂的加入量为0.1~0.25mol/L。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(3)所述除氧剂为保险粉,采用刃天青作为指示剂。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(4)所述丁醇发酵菌株为拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)或者丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(4)采用RCM培养基制备种子液,种子液的接种量为5%-10%v/v;发酵温度为33-38℃,发酵时间72-84小时。
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