CN116479028A - 能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸工程菌的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸工程菌的构建方法。所述构建方法包括：敲除高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株的LPL1基因和IZH3基因。所述构建方法通过敲除LPL1基因和IZH3基因，可以使得高产脂肪酸工程菌能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸。

Description

能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸工程菌的构建方法及其应用
技术领域
本申请涉及一种能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸工程菌的构建方法，属于微生物基因工程和代谢工程应用领域。
背景技术
甲醇含有碳、氢两种元素，既能看作氢载体，碳元素还能用来合成多种化学品。其液态特性利于储存与运输，能够与现有石油化工基础设施对接，被看作一种具有潜力的化工原料。甲醇可以由煤炭、天然气以及可再生生物质进行制备(Energy,2014,77,125)，特别是，近年来提出了“液态阳光”路线，CO2直接加氢获得甲醇(Science,2017,355,1296)，将能保证甲醇原料稳定供给。因此，建立甲醇高效转化路线是保证未来能源及化学品需求的可行路径。生物合成系统(酶及微生物细胞)选择性好，过程绿色，条件温和，能合成结构更加复杂的含氧化学品以及能量密度更高的液体燃料。因此，生物系统与化工路线互为补充，有望成为甲醇高效转化的另一可行路径，推动我国煤炭及一碳资源洁净利用(NatureEnergy,2018,3,925.)。
利用微生物细胞工厂生产大宗化学品、生物燃料以及天然产物等目标产物是一种可持续的生产模式。因此，以能够利用甲醇为底物的微生物为宿主构建细胞工厂是实现高效甲醇生物转化的重要研究方向。自然界中，存在一类“甲基营养型”微生物能够利用C1化合物(甲烷、甲醇等)为碳源进行生长代谢，其主要包括一些原核细菌以及甲醇酵母(巴斯德毕赤酵母和多形汉逊酵母等)。其中，多形汉逊酵母具有底物谱广泛(葡萄糖、木糖和甲醇等)、耐高温(50℃以上)以及副产物少和易于高密度发酵等诸多优良特性，是一种优良的细胞工厂底盘细胞(FEMS Yeast Research,2012,12,271)。但是，缺乏高效遗传操作工具严重阻碍了汉逊酵母的应用与发展。发明人前期工作构建了相对完善的汉逊酵母遗传操作平台，实现了方便、快速的精准基因组编辑和代谢调控，为构建高效汉逊酵母细胞工厂奠定了良好基础(iScience,2021,24,102168)。
目前针对于甲基营养型微生物的研究主要着眼于构建并强化上游甲醇利用途径，普遍认为如果细胞能够高效同化甲醇，就能实现目标产物的高效合成。但是，我们发现高产脂肪酸的汉逊酵母工程菌株无法在以甲醇为唯一碳源的基础培养基中进行生长。这一现象说明在甲基营养型微生物中，甲醇利用过程中细胞生长与产物合成可能存在相互竞争的关系，也就是说，甲醇代谢通量可能无法同时满足细胞生长与产物合成，但相关分子机制并不清楚。因此，了解这一竞争关系并解析相关分子机制，将有望推动天然甲基营养型微生物细胞工厂研究进展，提高天然/合成甲基营养型微生物甲醇利用效率，真正实现高效甲醇生物转化合成多种高附加值的目标产物。
因此，本发明旨在获得一株能够高效利用甲醇并高产脂肪酸的汉逊酵母菌株。在faa1Δ的汉逊酵母底盘细胞中，借助实验室适应性进化，对驯化菌株进行多组学测序，揭示甲醇同化时脂质代谢和细胞生长竞争的分子机制。在驯化菌株中鉴定了两个关键突变基因LPL1和IZH3，其双突变能够有效缓解细胞由脂肪酸积累和甲醇代谢导致的细胞毒性，并能够提高野生型细胞高浓度甲醇耐受能力。最终，在驯化菌株中进行的全局代谢途径重构增加了乙酰辅酶A和NADPH供给，使得脂肪酸产量达到15.9g/L，证明了汉逊酵母作为细胞工厂的应用潜力。
发明内容
根据本申请的一个方面，提供一种能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸工程菌的构建方法，所述构建方法通过敲除LPL1基因和IZH3基因，使得高产脂肪酸工程菌能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸。
能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸工程菌指的是所述工程菌能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸，即能够在仅含有甲醇碳源的培养基中生产脂肪酸，但并不排除其也能够利用别的碳源产脂肪酸。
一种能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸工程菌的构建方法，所述构建方法包括：
敲除高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株的LPL1基因和IZH3基因。
可选地，所述高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株为通过将野生型汉逊酵母的FAA1基因敲除得到。
可选地，所述野生型汉逊酵母为野生型汉逊酵母NCYC 495leu1.1。
可选地，所述LPL1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述IZH3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
根据本申请的一个方面，提供根据上述所述的构建方法得到的能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸工程菌。
根据本申请的一个方面，提供根据上述所述的构建方法得到的能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸工程菌、上述所述的能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸工程菌在以甲醇为碳源制备脂肪酸中的应用。
根据本申请的一个方面，提供一种提高野生型汉逊酵母甲醇耐受能力的方法，所述方法包括：
敲除野生型汉逊酵母的LPL1基因和IZH3基因。
可选地，所述LPL1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述IZH3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
可选地，所述野生型汉逊酵母为野生型汉逊酵母NCYC 495leu1.1。
根据本申请的一个方面，提供一种获得能够以甲醇为唯一碳源高产脂肪酸的汉逊酵母菌株的方法，所述方法包括以下步骤：
将高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株进行以下驯化：
在同时含有葡萄糖和甲醇的初始培养基中进行适应性培养，之后在葡萄糖和甲醇比例逐渐减少的培养基中进行适应性培养，直至葡萄糖减少至0，得到所述能够以甲醇为唯一碳源高产脂肪酸的汉逊酵母菌株；
所述高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株为通过敲除野生型汉逊酵母的FAA1基因得到；
葡萄糖和甲醇在培养基中的总碳浓度为0.2～0.5mol/L。
可选地，葡萄糖和甲醇在培养基中的总碳浓度为0.2、0.3、0.4、0.5mol/L中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。
可选地，所述初始培养基中葡萄糖和甲醇的碳摩尔比为x：10-x，x取值为3～7。
可选地，x取值为3、4、5、6、7中的任意一个值或任意两个值之间的范围值。
可选地，所述葡萄糖和甲醇比例逐渐减少为葡萄糖和甲醇的碳摩尔比为x：10-x中的x以y为梯度进行递减，其中，y的取值为0.5～1。
可选地，所述进行适应性培养为将高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株在培养基中进行驯化至初始以OD600＝0.2接种，在48h时生长OD600达到5～6。
可选地，所述方法还包括对驯化后的高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株进行基因组测序分析和/或转录组测序分析，获得关键基因靶点和/或代谢途径，对关键基因靶点和/或代谢途径进行优化。
可选地，所述方法还包括在驯化后的高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株中提高MmACL基因的表达。
可选地，所述方法还包括在驯化后的高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株中提高ZWF1基因和FBP1基因的表达。
可选地，所述方法还包括在驯化后的高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株中提高ZWF1基因、FBP1基因和MmACL基因的表达。
可选地，所述方法还包括在驯化后的高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株中提高ZWF1基因、FBP1基因、MmACL基因和RPE基因的表达。
可选地，所述方法还包括在驯化后的高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株中提高ZWF1基因、FBP1基因、MmACL基因和ScIDP2基因的表达。
可选地，所述方法还包括在驯化后的高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株中提高ZWF1基因、FBP1基因、MmACL基因、RPE基因和ScIDP2基因的表达。
作为一种实施方案，本发明提供了一种提高脂肪酸和甲醇代谢毒性耐受能力的方法及其应用。首先，前期构建的高产脂肪酸的汉逊酵母细胞无法利用甲醇进行生长与代谢，说明细胞生长与产物合成会严重竞争甲醇代谢流导致细胞死亡。通过实验室适应性进化获得了能够利用甲醇并高产脂肪酸的汉逊酵母驯化菌株；其次，通过基因组测序分析，鉴定了两个关键突变基因LPL1(推测脂酶基因)和IZH3(Zn代谢相关膜蛋白基因)，其双敲除能够使faa1Δ菌株在甲醇中生长并积累脂肪酸。同时，全局转录组分析发现与甲醇代谢前体5-磷酸木酮糖(Xu5P)供给相关基因FBP1、RPE和TAL1等显著上调；再次，通过分析碘化丙锭(PI)染色细胞百分比，证明了高产脂肪酸汉逊酵母在甲醇中主要经历了由Rim101途径介导的细胞坏死过程；最后，通过全局代谢调控与优化，批式补料发酵下，以甲醇为唯一碳源脂肪酸产量达到15.9g/L。
作为一种实施方案，本发明提供一株以甲醇为唯一碳源高产脂肪酸的多形汉逊酵母菌株，以敲除脂酰辅酶A合成酶(由基因FAA1编码)的汉逊酵母为出发菌株，经过实验室适应性进化获得。
所述菌株在含有10g/L甲醇的基础成分培养基中发酵96h，脂肪酸产量达到480mg/L，脂肪酸种类包括C16-1、C16、C18-3、C18-2、C18-1和C18。
所述菌株经过基因组测序分析，含有包括推测脂酶基因(由LPL1编码)和与Zn代谢相关膜蛋白基因(由IZH3编码)等在内的15个基因突变，以及染色体大片段加倍和缺失。
所述的LPL1和IZH3基因，核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
所述菌株经过转录组测序分析，1,6-二果糖磷酸酶(由基因FBP1编码)、核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶(由基因RPE编码)、转醛酶(由基因TAL1编码)等基因表达上调。
作为一种实施方案，本发明提供一种营救高产脂肪酸汉逊酵母甲醇利用缺陷的方法，所述方法在高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株(faa1Δ)中，敲除了基因LPL1和IZH3。
敲除了基因LPL1和IZH3缓解了Rim101途径介导的细胞死亡过程，涉及的基因涉及但不限于RIM101和RIM13。
作为一种实施方案，本发明提供一种提高野生型汉逊酵母甲醇耐受能力的方法，所述方法在野生型汉逊酵母NCYC 495leu1.1中，敲除了基因LPL1和IZH3。
所述方法能够提高汉逊酵母菌株在50g/L甲醇中生长速率。
作为一种实施方案，本发明提供一种提高汉逊酵母甲醇产脂肪酸的代谢工程改造策略，所述策略在驯化菌株的基础上，过表达了6-磷酸葡萄糖脱氢酶(由基因ZWF1编码)、FBP1、来源于Mus musculus的ATP:柠檬酸裂解酶(由基因MmACL编码)、来源于酿酒酵母的细胞质异柠檬酸脱氢酶(由基因ScIDP2编码)和RPE。
所述的一种提高汉逊酵母甲醇产脂肪酸的代谢工程改造策略，在以甲醇为唯一碳源的基础培养基中进行批式补料发酵时，脂肪酸产量达到15.9g/L。
本申请可取得的有益效果包括：
(1)本申请所提供的工程菌的构建方法，通过敲除LPL1基因和IZH3基因，使得高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸、可以提高野生型汉逊酵母甲醇耐受能力。
(2)本申请所提供的一种获得能够以甲醇为唯一碳源高产脂肪酸的汉逊酵母菌株的方法，通过所提供的驯化方法，获得能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸的菌株。
附图说明
图1A示出了高产脂肪酸菌株合成脂肪酸示意图；图1B为各菌株在葡萄糖发酵培养基中的生长情况，图1C为各菌株在葡萄糖发酵培养基中的脂肪酸生产情况，图1D示出了高产脂肪酸汉逊酵母(faa1Δ)甲醇利用缺陷。
图2示出了实验室适应性进化获得甲醇利用且高产脂肪酸驯化菌株；其中图2A为驯化过程示意图；图2B～D分别为第一～三组驯化后的生长特性；图2E～G分别为第一～三组驯化后的脂肪酸产量。
图3示出了基因组测序分析鉴定关键突变基因LPL1和IZH3；其中图3A为检测出20个突变；B为染色体大片段加倍与缺失；图3C为HpFA01敲除LPL1和/或IZH3后的生长情况；图3D为HpFA01敲除LPL1和/或IZH3后的脂肪酸产量情况；图3E为野生型菌株敲除LPL1和IZH3后的生长情况。
图4全局转录组测序分析驯化菌株差异表达基因；其中图4A、图4B表明驯化菌株整体基因表达水平显著下调；图4C表明除甲醇代谢相关途径外，其余途径显著下调。
图5Rim101途径介导的细胞坏死过程调控高产脂肪酸汉逊酵母甲醇利用；其中图5A～H为各菌株的细胞坏死率；图5I为Rim101途径介导的细胞坏死过程。
图6A、图6B示出了各菌株的脂肪酸产量。
图7A为各菌株摇瓶批式补料发酵的生物量；图7B为各菌株的脂肪酸产量。
图8示出了HpFAM16u在发酵罐批式补料发酵中高效转化甲醇合成脂肪酸。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。
本申请中，对基因的改造为将含有“整合位点上游同源臂-整合片段-整合位点下游同源臂”或“敲除位点上游同源臂-敲除位点下游同源臂”的供体DNA导入宿主中，借助CRISPR/Cas9系统实现基因的整合或敲除(iScience,2021,24,102168)。本申请涉及到的供体DNA和位点靶向序列如表1和表2所示。
表1.本申请实施例涉及到的供体DNA和gRNA表达载体
供体DNA gRNA表达载体 整合位点
NS11up-PPMA1-MmACL-TADH2-NS11dw gRNA-NS11 NS11
NS2up-TCAT1-ZWF1-PADH1+PPMA1-FBP1-TGAP-NS2dw gRNA-NS2 NS2
NS3up-PGAP-ScIDP2-TAMO-NS3dw gRNA-NS3 NS3
PRPEup-PTAL1-PRPEdw pHpgRNA79 PRPE
表1中的整合位点、表达载体中的20bp靶向序列和上下游同源臂参考Synth.Syst.Biotechnol.,2021,6,63-68，整合片段的序列可根据所提供的基因/启动子/终止子名称在NCBI中查询。
表2.本申请实施例涉及到的供体DNA和位点靶向序列
供体DNA 20bp靶向序列 敲除位点
LPL1up-LPL1dw(SEQ ID No.5) SEQ ID No.3 LPL1
IZH3up-IZH3dw(SEQ ID No.6) SEQ ID No.4 IZH3
作为一种实施方式，本发明的目的是获得一株能够高效利用甲醇且高产脂肪酸的汉逊酵母菌株，并深入探究甲醇同化时脂质代谢和细胞生长竞争的分子机制。进一步地，将这一分子机制应用于提高细胞甲醇耐受能力和脂肪酸产量。本发明是采用如下技术方案来实现的：
本发明的第一方面，提供一株高效利用甲醇且高产脂肪酸的汉逊酵母菌株，其能够在以甲醇为唯一碳源的基础培养基中正常生长，并且积累高浓度脂肪酸。
进一步地，上述技术方案的具体实施步骤是：借助实验室适应性进化技术，以高产脂肪酸汉逊酵母HpFA01(基因型为MATa,leu1.1,faa1Δ,(PGAP-hCAS9-TAOX1))出发，从YPD活化平板中，挑取3个单菌落，进行独立地连续传代培养。初始培养基为含有葡萄糖：甲醇摩尔比为5：5的Delft基础培养基(2.5g/L(NH4)2SO4,14.4g/L KH2PO4,0.5g/L MgSO4·7H2O,微量元素和维他命)，以OD600＝0.2接种，37℃，220rpm进行培养。如果菌株能够在培养48h时，OD600达到5～6左右，则转接到新培养基中，含有葡萄糖：甲醇摩尔比为4.5：5.5的Delft基础培养基。否则，继续转接到原培养基中。以此类推，葡萄糖占比逐渐减少，甲醇占比增加，直至驯化菌株能够在以甲醇为唯一碳源的Delft基础培养基进行正常生长，且培养48h，OD600达到5～6左右，驯化结束。将3组驯化菌株分别稀释涂布YPD平板，各挑取6个单菌落，在以甲醇为唯一碳源的Delft基础培养基中，37℃，220rpm培养96h，分析细胞生长与脂肪酸积累情况。
进一步地，为了解析驯化菌株能够以甲醇进行生长并合成脂肪酸的分子机制，将获得的3组驯化菌株，每组各挑选3个单菌落，连同出发菌株HpFA01进行基因组测序分析。10株菌在YPD培养基中，37℃，220rpm培养16～18h，收集细胞。基因组测序结果发现并鉴定了2个关键突变基因LPL1(推测的酯酶基因)和IZH3(Zn代谢相关膜蛋白基因)。
进一步地，为了探究驯化菌株转录水平上基因差异表达情况，将上述9株驯化菌株和对照菌株HpFA01进行全局转录组学分析。10株菌在YPM(20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉，10g/L甲醇)培养基中，37℃，220rpm培养24h，收集细胞，提取总RNA测定转录组。转录组分析结果发现并鉴定了FBP1、RPE和TAL1等基因表达显著上调。
本发明的第二方面，提供了一种营救高产脂肪酸汉逊酵母甲醇利用缺陷的方法。无缝敲除了LPL1和与IZH3。
进一步地，上述技术方案的具体实施步骤：以HpFA01菌株出发，无缝敲除了基因LPL1和IZH3。以无缝敲除基因LPL1为例，本发明对汉逊酵母的基因组编辑主要依托自主构建的CRISPR/Cas9系统完成(iScience,2021,24,102168)。首先，构建靶向基因LPL1的sgRNA表达载体pHpgRNA98，其中20bp靶向序列如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；接着，构建供体DNA分子，分别扩增基因LPL1编码区上下游各1000bp左右的序列，通过融合PCR方法获得完整供体DNA片段；将gRNA表达载体pHpgRNA98和供体DNA以各500ng的量，电击转化进入菌株HpFA01，于SD平板37℃静置培养2～3天；转化子经液体SD培养基培养后，通过PCR验证正确，YPD培养基连续传代进行质粒丢失，质粒丢失后的菌株保存备用。敲除基因IZH3(20bp靶向序列如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列)以及下文中的其它基因组编辑工作均遵循相似流程。
进一步地，为了验证lpl1Δ和izh3Δ菌株在甲醇培养基中生长与脂肪酸产量，将活化后的重组菌株以初始OD600＝0.4转接至含有10g/L甲醇的Delft基础培养基中，37℃，220rpm进行发酵。
进一步地，鉴定了LPL1和IZH3在汉逊酵母中的序列(分别如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列)以及功能。
本发明的第三方面，提供了一种提高野生型汉逊酵母甲醇耐受能力的方法，敲除了基因LPL1和IZH3，使菌株能够耐受50g/L以上甲醇。进一步地，以野生型汉逊酵母495-3(基因型为MATa,leu1.1,(PGAP-hCAS9-TAOX1))为对照菌株，双敲除基因LPL1和IZH3，比较二者在含有50g/L甲醇的Delft基础培养基中的生长情况。菌株37℃，220rpm进行发酵120h，每24h取样测定OD600。
本发明的第四方面，提供了一种提高驯化菌株脂肪酸产量的代谢工程改造策略。对中心碳代谢途径进行重排以增加前体乙酰辅酶A和辅因子NADPH供给，并提高甲醇利用效率。
进一步地，上述技术方案的实施步骤是：
(1)增加前体乙酰辅酶A供给
以驯化菌株HpFAM01(驯化第三组10号菌株)出发，敲除基因URA3作为基因编辑筛选标记，敲除基因KU80以增加同源重组效率，获得菌株HpFAM03。过表达来源于Musmusculus的ATP:柠檬酸裂解酶(由基因MmACL编码)，增加细胞内乙酰辅酶A供给，具体流程与上述本发明第二方面内容一致，其中构建的供体DNA由融合PCR方法获得，包括两侧同源臂各1000bp左右以及表达盒PPMA1-MmACL-TADH2。整合位点为基因组中性位点NS11(Synth.Syst.Biotechnol.,2021,6,63-68.)，故构建的sgRNA表达载体为gRNA-NS11，实现基因MmACL整合。
(2)增加辅因子NADPH供给
在上述菌株的基础上，进一步过表达6-磷酸葡萄糖脱氢酶(由基因ZWF1编码)，1,6-二果糖磷酸酶(由基因FBP1编码)，以及来源于酿酒酵母的细胞质异柠檬酸脱氢酶(由基因ScIDP2编码)。具体流程与上述本发明第二方面内容一致，其中构建的供体DNA，所需sgRNA表达载体以及整合位点如表1所示。
(3)提高甲醇利用效率
为了提高菌株甲醇利用效率，考虑增加甲醇利用前体5-磷酸木酮糖供给，过表达核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶(由基因RPE编码)。以强甲醇诱导型启动子PTAL1替换其原有启动子PRPE，从而实现基因RPE过表达。具体流程与上述本发明第二方面内容一致，其中构建的供体DNA，所需sgRNA表达载体以及整合位点如表1所示。
进一步地，为了提高菌株发酵稳定性，将最终改造菌株回补基因URA3和KU80，获得原养型菌株HpFAM16u。进行批式补料发酵，在1.0L发酵罐中初始装液量为300mL，以初始OD600＝1进行接种，当发酵罐中甲醇耗尽，开始补加600g/L甲醇和5×Delft培养基，并以2:1速率进行流加补料。发酵过程中实时监测甲醇剩余情况，调整补料速率。通气量为18～48sL/h，搅拌速率为400～800rpm，溶氧控制为30％，用2M KOH和1M HCl调节pH为5.6。
本申请实施例中，野生型汉逊酵母NCYC 495leu1.1可从中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)购买，菌株编号2.2412；
菌株495-3已在iScience,2021,24,102168中有记载，公众可从申请人处获得，该生物材料仅可用于专利内容的验证，不可作为它用。
实施例1高产脂肪酸汉逊酵母甲醇利用缺陷
(1)高产脂肪酸菌株构建
图1A示出了高产脂肪酸菌株合成脂肪酸示意图。
在野生型汉逊酵母NCYC 495leu1.1基础上构建汉逊酵母CRISPR/Cas9基因组编辑系统获得菌株495-3(基因型为MATa,leu1.1,(PGAP-hCAS9-TAOX1))(iScience,2021,24,102168)，单独敲除出发菌株495-3脂酰辅酶A合成酶(由FAA1编码)得到菌株HpFA01，单独敲除脂酰辅酶A氧化酶(由POX1编码)得到菌株HpFA02，同时敲除FAA1基因和POX1基因得到菌株HpFA03。
(2)菌株培养及脂肪酸发酵
YPD培养基：20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉；
葡萄糖发酵培养基(含葡萄糖的基础成分培养基)：(NH4)2SO4 2.5g/L，KH2PO414.4g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，加入约900mL ddH2O，调节pH为5.6，定容至950mL，115℃灭菌30min。灭菌后，补加1mL Vitamin solution和2mL Trace metal solution，以及50mL400g/L葡萄糖溶液，使用时添加亮氨酸(60mg/L)和尿嘧啶(20mg/L)。
甲醇发酵培养基(含10g甲醇/L的基础成分培养基)：(NH4)2SO4 2.5g/L，KH2PO414.4g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，加入约900mL ddH2O，调节pH为5.6，定容至1L，115℃灭菌30min。灭菌后，补加1mL Vitamin solution和2mL Trace metal solution，以及12.6mL纯甲醇，使用时添加亮氨酸(60mg/L)和尿嘧啶(20mg/L)。
其中，Trace-metal solution配方见表3；Vitamin solution的配方见表4。
表3.Trace-metal solution的配方
表4.Vitamin solution的配方
菌株活化，495-3,HpFA01(faa1Δ),HpFA02(pox1Δ),HpFA03(faa1Δpox1Δ)菌株划线于YPD固体培养基，37℃静置培养2天；分别挑取单菌落于3/15mL YPD培养基中(即，15ml培养管中加入3ml培养基)，37℃，220rpm震荡培养24h；接种，按初始OD600＝0.2接种于发酵培养基，装液量为20mL/100mL锥形瓶，37℃，220rpm条件下进行发酵。定点取样(每隔12h取样)或者终点(第60h)取样，用于生物量(以600nm处的吸光值表示)和产量分析。
实验结果表明，将野生型汉逊酵母与单独或组合敲除FAA1和POX1的菌株在含有葡萄糖或甲醇的基础成分培养基中进行培养。在葡萄糖发酵培养基中，菌株生长正常，且faa1Δ菌株能够大量积累脂肪酸(如图1B-C所示)。而在甲醇发酵培养基中，野生型和单独敲除POX1的菌株生长正常，但不积累脂肪酸，但是，敲除了FAA1的菌株出现甲醇利用缺陷的现象(如图1D所示)。因此，认为汉逊酵母中，脂肪酸合成与细胞生长相互竞争甲醇代谢流，并最终导致细胞死亡。
实施例2实验室适应性进化
以菌株HpFA01的3个单克隆独立地进行连续传代培养，初始培养基为含有葡萄糖和甲醇碳摩尔比为5:5的基础成分培养基，葡萄糖和甲醇总碳摩尔浓度为0.3mol/L，在初始培养基中培养，初始以OD600＝0.2接种，当菌株能够在48h时OD600达到5～6，将葡萄糖和甲醇的碳摩尔比调整为4.5:5.5，转接至初始以OD600＝0.2接种，当菌株能够在48h时OD600达到5～6，以0.5的梯度调整葡萄糖和甲醇的碳摩尔比，以此类推至葡萄糖和甲醇碳摩尔比为1:9，然后在葡萄糖和甲醇碳摩尔比为0:10的培养基中进行培养，直至菌株能够在以甲醇为唯一碳源的基础成分培养基中进行生长，且发酵48h时OD600达到5～6，驯化结束(示意图如图2A)。
实验结果显示3组驯化尽管经历的过程不尽相同，耗时35～65天不等，但最终均获得了能够在甲醇中正常生长且合成脂肪酸的突变菌株(图2)。每组驯化挑取5～6个单克隆，以与实施例1同样的条件，在含有10g/L甲醇的基础培养基中进行脂肪酸发酵，观察驯化菌株生长及脂肪酸合成情况。所有驯化菌株均具有相似的生长特性和脂肪酸合成情况，培养96h最终OD600达到8左右(图2B-D)，脂肪酸产量在280～450mg/L之间(图2E-G)。其中，3-10号菌株具有最好的生长状态，并且最终脂肪酸产量也能维持在400mg/L左右，可以作为后续高产脂肪酸的出发菌株(也称为菌株HpFAM01)。
实施例3基于基因组和转录组的反向代谢工程改造
(1)基因组测序分析
为了探究驯化菌株能够利用甲醇合成脂肪酸的分子机制，我们进行了基因组测序分析。首先，每组驯化各挑选3株驯化菌株(1-1，1-2，1-14，2-2，2-6，2-16，3-10，3-12，3-18)以及faa1Δ出发菌株(菌株HpFA01)，共计10株菌。在YPD培养基中培养16～18h收集细胞，提取基因组进行测序分析。其中，对faa1Δ出发菌株进行了三代基因组测序组装，能够有效避免后续分析假阳性结果，并能够进行染色体大片段加倍与缺失分析。以faa1Δ出发菌株作为参考基因组，其余9株驯化菌株进行了重测序分析。
结果如图3A所示，检测出20个突变(SNP和InDel)，涉及15个基因，其中，一种推测的脂酶(由基因LPL1编码)在3组驯化中均检测出突变，第一组中为S205P和F185L，第二、三组中均为1bp插入导致的移码突变。除此之外，第二、三组中还存在一个共同突变位点，基因IZH3，其38位氨基酸由E突变为终止密码子，导致基因提前终止。IZH3编码一种与Zn代谢相关的膜蛋白。这些基因均是进一步反向代谢工程靶点验证的关键位点。染色体大片段加倍与缺失(图3B)也涉及大量基因，这些突变也可能是驯化菌株能够利用甲醇并高产脂肪酸的重要原因。
(2)基因组关键靶点验证
根据基因组测序结果，对关键位点进行了验证分析，发酵条件与实施例1相同。对菌株HpFA01单独LPL1基因敲除无法使菌株在甲醇中生长(图3C)。因此，推测可能存在其它协同基因发挥关键作用。鉴于Group II和III除LPL1外，还有一个共同突变基因IZH3(E38*)。因此，我们在出发菌株中对IZH3分别进行了单敲除和组合敲除，发现组合敲除LPL1和IZH3使得高产脂肪酸的汉逊酵母在以甲醇为唯一碳源的基础培养基中生长，最高生长OD600达到3左右。而单独敲除IZH3菌株依然无法生长，说明LPL1和IZH3发挥协同作用。最终，双敲除菌株发酵120h后能够积累40.9mg/L的脂肪酸(图3D)。
为了验证基因LPL1和IZH3在提高细胞甲醇耐受能力的潜在作用，在野生型汉逊酵母495-3菌株中将LPL1和IZH3进行了双敲除。结果显示双敲除菌株在含有50g/L甲醇的基础成分培养基中生长速率明显高于对照菌株(图3E)，说明双敲除菌株具有更高的甲醇耐受能力，也证明了基因LPL1和IZH3在提高细胞甲醇耐受能力的应用优势。
(3)转录组测序分析
为了分析驯化菌株与出发菌株在转录水平上的基因表达差异，将上述9株驯化菌株和出发菌株，在YPM(10g/L甲醇，20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉)中培养24h后，收集细胞并提取RNA进行转录组测序分析。基因表达差异整体情况如图4所示，发现驯化菌株整体基因表达水平显著下调(图4A,B)，包括氨基酸代谢相关基因在内的大量基因表达下调，这可以帮助细胞减少无意义的蛋白质合成，有利于菌株抵抗由脂肪酸积累和甲醇代谢导致的细胞毒性。特别地，对中心碳代谢途径基因差异表达情况分析发现，除与甲醇代谢相关途径外，其余途径也显著下调(图4C)。糖异生与磷酸戊糖途径非氧化阶段部分基因(FBP1,RPE,TAL1)表达上调，可能与甲醇代谢前体Xu5P供给强化有关。这些基因靶点可以为后续提高菌株甲醇利用效率和脂肪酸产量奠定基础。
实施例4细胞坏死调控高产脂肪酸菌株甲醇利用
为了探究驯化菌株细胞内到底发生了哪些变化，使得其能够在以甲醇为唯一碳源时正常生长且高产脂肪酸。在YPM培养基中培养细胞，初始接种OD600为0.2，在37℃，220rpm条件下培养24h，收集细胞。1000g离心5min并用PBS缓冲液洗涤2次。用含有5μg/mL碘化丙锭(PI)的PBS溶液重悬，室温下放置10min。流式细胞仪488/620nm处检测荧光，计算细胞坏死率。
能够被PI染色的细胞通常被称为坏死细胞，通过上述实验检测，由图5可以看出，faa1Δ(菌株HpFA01)细胞坏死率超过了90％，相比之下野生型(495-3菌株，对应图5F中的野生型)和驯化菌株(HpFAM01，对应图5B中的驯化菌株)死亡率均低于6％，说明高产脂肪酸汉逊酵母细胞在甲醇培养基中经历了细胞坏死介导的死亡过程。同时，单独或组合敲除基因LPL1和IZH3均显著降低了细胞坏死率，并且二者可能发挥协同作用。为了进一步证明这一结论，将HpFA01菌株的细胞坏死调控途径Rim101途径关键基因RIM101和RIM13分别进行了单独敲除，结果显示二者敲除均能显著降低细胞坏死率。因此，在高产脂肪酸汉逊酵母利用甲醇时，脂肪酸会提高细胞内二酰甘油DAG含量，而DAG被报道能够诱导细胞坏死过程。另一方面，甲醇，以及其氧化产物甲醛能够诱导DNA-蛋白质交联，导致细胞死亡。二者存在剂量依赖的协同效应，共同诱导由Rim101途径介导的细胞坏死过程，并最终导致细胞死亡。而lpl1Δ能够缓解由DAG诱导的细胞坏死，而izh3Δ也能够减弱DNA-蛋白质交联作用，二者共同降低细胞坏死率，使细胞能够生长并积累脂肪酸。
实施例5提高汉逊酵母以甲醇为底物的脂肪酸合成
(1)策略筛选与组合
尽管FBP1、RPE和TAL1等基因不能促进高产脂肪酸细胞甲醇利用，但是强化Xu5P供给可能提高驯化菌株的脂肪酸产量。除此之外，强化脂肪酸合成过程所需前体乙酰辅酶A和辅因子NADPH供给也有望进一步提高驯化菌株脂肪酸合成。为了提高细胞内NADPH供给，在HpFAM03菌株(HpFAM03为以驯化菌株HpFAM01出发，敲除基因URA3作为基因编辑筛选标记，敲除基因KU80以增加同源重组效率)中表达了FBP1增加糖异生到PPP的代谢流量，并偶联ZWF1基因(即，在NS2位点整合了DNA片段TCAT1-ZWF1-PADH1-PPMA1-FBP1-TGAP)，使得脂肪酸产量提高了30％；同时，为了增加细胞内乙酰辅酶A供给，在HpFAM03菌株中表达来源于Musmusculus的ATP:柠檬酸裂解酶(由基因MmACL编码)(即，在NS11位点整合了DNA片段PPMA1-MmACL-TADH2)；在HpFAM03菌株中表达了来源于大肠杆菌的丙酮酸脱氢酶复合体(PDH)突变体(即，在4NS5位点整合了DNA片段PGAP-EcLpdA*-TFBA-TPDB-EcAceE-PTEF1-PADH1-EcAceF-TAMO)其中EcAceE和EcAceF均可在NCBI数据库中获得序列，EcLpdA*序列可参考Biochemistry32,2737-2740(1993).；在HpFAM03菌株中修饰β-氧化过程(即，敲除PEX10基因，pex10Δ)。结果显示，以与实施例1同样的条件，在含有10g/L甲醇的基础培养基中进行脂肪酸发酵96h，只有过表达MmACL将脂肪酸产量提高了10％，FBP1-ZWF1将脂肪酸产量提高了31.1％，其余策略并无明显作用，甚至pex10Δ导致细胞无法生长。这一结果说明单一途径改造对甲醇生产脂肪酸过程无明显作用，需要全局的代谢重排以增加脂肪酸合成前体与辅因子。(图6A，图中Control为HpFAM03菌株)
进一步地，在HpFAM03菌株中同时表达FBP1-ZWF1与MmACL(整合位点和整合片段同上述)得到HpFAM09，脂肪酸产量显著提高了近60％。在此基础上，为了促进甲醇利用，增加Xu5P供给，进一步表达了核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶(由基因RPE编码)(即，在PRPE位点整合了DNA片段PTAL1)得到HpFAM13，结果使脂肪酸产量进一步提高了30％，使得脂肪酸产量在10g/L补加10g/L甲醇的条件下达到680mg/L。(图6B)。图6B中的发酵条件与实施例1中相同，只是在48h补加10g/L甲醇，发酵120h结束。
(2)摇瓶批式补料发酵
为了避免营养缺陷型对细胞生长的影响，在HpFAM03、HpFAM09、HpFAM13中回补了营养缺陷型基因URA3和KU80，获得的原养型菌株(分别为HpFAM02u、HpFAM09u、HpFAM15u)进行了摇瓶水平的批式补料脂肪酸发酵。初始装液量50/250mL，含10g/L甲醇的基础成分培养基中，初始接种量为OD600＝0.4。初始42h未进行补料，从42h开始，每24h补0.6mL甲醇(10g/L)和0.4mL 5×Deflt营养盐，根据pH试纸，前86h未调pH，86h开始每24h用2M KOH调节pH～5左右(pH试纸)。其中，5×Deflt营养盐的组成为(NH4)2SO4 12.5g/L，KH2PO472g/L，MgSO4·7H2O 2.5g/L，5mL/L Vitamin solution和10mL/L Trace metal solution。
但是，发现在摇瓶批式补料发酵过程中，HpFAM15u脂肪酸产量提升没有上述批式发酵显著，推测可能是在长时间发酵过程中NADPH供给不足，因此，在HpFAM09u、HpFAM15u又进一步表达了来源于酿酒酵母的细胞质异柠檬酸脱氢酶(由基因ScIDP2编码)(即，在NS3位点整合了DNA片段PGAP-ScIDP2-TAMO)，获得了菌株HpFAM14u和HpFAM16u。菌株摇瓶批式补料发酵结果如图7所示。图7A示出了生长情况，对照菌株生长最慢，前期M14u和M16u生长比M15u略快，发酵后期，M15u生长更好，最高OD600超过50，而对照菌株、M14u和M16u最终OD基本一致；脂肪酸积累方面从图7B可以看出，发酵168h后，3株工程菌株脂肪酸产量均明显高于对照菌株，而M14u和M16u产量也要明显高于M15u，其中M16u最高达到8.3g/L，是对照菌株的2.8倍。
(3)发酵罐批式补料发酵
基于摇瓶批式补料发酵结果，选取最好的菌株HpFAM16u进行发酵罐批式补料发酵实验。发酵过程在DasGip平行生物反应系统(Eppendorf)中完成。初始发酵培养基为含有10g/L甲醇的基础成分培养基，1.0L发酵罐装液量为0.3L，初始接种量为OD600＝1。当发酵罐中甲醇耗尽，开始补加600g/L甲醇和5×Delft培养基，并以2:1速率进行流加补料。发酵过程中实时监测甲醇剩余情况，调整补料速率。通气量为18～48sL/h，搅拌速率为400～800rpm，溶氧控制为30％，用2M KOH和1M HCl调节pH为5.6。
发酵结果如图8所示，25h甲醇耗尽开始补料，前期甲醇消耗速率波动，72h开始稳定维持在0.6g/h直至终点。细胞快速生长，发酵183h结束最终OD600达到137.6，脂肪酸产量达到15.9g/L，证明了汉逊酵母作为细胞工厂高效转化甲醇合成脂肪酸及其它产物的应用潜力。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
序列表
<110> 中国科学院大连化学物理研究所
<120> 可以甲醇为唯一碳源产脂肪酸工程菌的构建方法及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1521
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggaatcta agaactgtca tcttgttgtt ctttgtcacg gtctttgggg agtgtctgag 60
cacttcgcct atattgaggc ccagctgaaa aatcatgctt ctctaagctc tagcaaagac 120
cagctaatag tctatactac aaagaccaac gagaggttca aaacctacga cggtatcgac 180
ctctgcggta ctcgcgtcgc agaggagatt cttgctgaag ccctaagatt gcaggaacag 240
ggattgactg ttagtaaatt ttctgttgtt ggctattctt taggaggttt aattgcacgg 300
tatgccatcg gtgttctgca ctatcgcggt tttttctgca atatcgagcc tgttaatttc 360
actagcttct gttcgccgca tgttggagtc ctcactcccg gccagagcgt cagtatcaag 420
attttcaact ggttggtgcc tgtgctactg ggcaaaagcg gccaccagct ttttctcaaa 480
gactcgtcta cagtgcctct tttgaaactg atgtcgcttc cccataccgt attctaccgc 540
ggcctcgcaa agttcaaaaa catctcgctg tattcgaaca tccgctccga catccggaca 600
tcctggtggt gttctggaat cagttacatc aatccttttg acatcttgga caagaatcct 660
aacgtcaaaa ttgaccagga cggatatatt cactttgaga acggctccaa gtttagcctg 720
aagttcattg aagactacaa accggtcgtt ctggatgcgg ataagccaat cacgttcaca 780
ggcctagtcg acgtctcgtc caaagcaaaa ctcaaccaaa tggttcagga ggacctccca 840
gccgacaacg acgtcccggc acagtcgaaa actgccaatt tcttccagag aaaattcaag 900
tgggtcatca tgctgtttcg gttcggtgta tacctgccaa tgtgggtcac gtggtttgtg 960
ctgcacaact ggttgcaagt ctttaattcc actctgcgag tgatcaagga gtcgtcgaaa 1020
ctggccgaat ttctggagct ttgcgaggag cctgagcctg cacggccgcc gctcaccaaa 1080
cggctcagcg aagccagcat tgacctgcac cgcctggagc atgggctgca tgaccaagga 1140
gatgagttca tcgactctgt ctttgatgcc atcacctcga cgaacgacat caaccgcagc 1200
atttttgagg cacgtgaaaa cggcccgctc tcgctcacca ccacaatcaa caagatcggc 1260
gagttcgacc tttctgcaga gccagataca ccggatgcac tccggtaccg gcagattctg 1320
agtcctttta aattggacct ttccgaccat caaaaggaca ttatcagtca tctcaataag 1380
ctaccatggc gcaaatttcc gatctacatc accaagacaa acgccacgca cgcggccgcc 1440
attgtccgac acgacgatcc tgcttttgag gagggtaagg tcgtggtgaa gcatttcgtt 1500
gaggaagtgt tccagcaata g 1521
<210> 2
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtcttcca ctggcattga ggtgcacggg tcggacctgt ttgatgagca cgaccagaag 60
ctcatgcagc ggatcaagtc gcagtccgag ctgaacagcg acgcgtcgct ggaagagcgt 120
gtgctggagc ggtttgaccg gtttctggcc aagctggagt cgcggatcga ggatttcgaa 180
aagtacttta ccaactccgc ccacaaatcg aatcggaccc actacacatt ctttgaggcg 240
ttgaagtcca tcaaggccgc cgtgattcag aaccagcagc acaatctgca ggcgttcgga 300
cagatcttgg acaggtatta tggcagtctg ctggacgaga aaaaagagta cgactcgacg 360
gacatgtacg caaaaatatc gaccgggctg cagtttctgg acgagaaaat tgacctgttt 420
gagaagacct tcaacatccc gctaagcccg caagaacacc ttggaaaatt gaaggagaaa 480
ctgtacaatt tcgataaggc cgtggctgcc ggctcgaagc gacttcttca tttctacgag 540
ctgcctttcc aatggcgaga aaacaagtac attatctacg gctaccggtt caactcgggc 600
catctctcgg ctctgaagag cgttttccag ctccacaacg aaactgccaa tatttggaca 660
cacatattgg gatctctgct actcctgtac attatgctca aacactatcc ggcaaccgag 720
atttatgccc gttccagctt tggcgacaag ctggtgacca actgcttctt ccttgcctcc 780
atcaagtgtc tcatgtcgtc tgtcgtctgg cacacctacg actgcatctc gcaactcaag 840
ctgcgcaaaa gattcgcgtg tatcgactac acaggtatca cagtgttgat cacggcgtcc 900
atcatcacca ccgaacacat cgcgctcaag gagttccctg ccgcagagct cggcttcatc 960
tcgttttcta ccatcgccgg catcgtcggg gtgctcttca cgtggtccga gttcttcgac 1020
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ccgctgttga aaagctttgt gtggtacctg accggagtcc agttttacgg cacattggtg 1200
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<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagaggttca aaacctacga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgaccagaa gctcatgcag 20
<210> 5
<211> 2027
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctttgctggg ctgtcaaatg agtccaggtg atcggtcaga atgggcaagt tctctggccc 60
gccgattgga ggattcaggg cactctcggg aactaggaga ttctctataa tttctggtgg 120
agtgtaagtc gtgtaatcat aaacaaagaa tgcagacaga agaagaacaa ttgttccgct 180
aacaacacct gatgtgagga aaaacagctt cagcactctt ccgacagcgg tattcgtcca 240
aaaacttgat ttcggccgct tgacaggcgg taacgaaccg acctcgttcg aacgaggaaa 300
acccgtttgg aattgtctag agagcaaggc agtcgccagc agcggttttt tcaaatagac 360
tggagcagag ctggccaccg gcttggggca accccagata cttggtttag gccgcaaagc 420
cagtccaaga gtcgtttttg gcaggccaac ctttattatt gatgggaaca tactaaaggt 480
gctcttctaa gaaaagtgta ggcggccaaa ttacaaccaa atttaatagc caaacacaat 540
tgaataaaaa caaactgtgt gtttgaccta tagggatttt ataatgccaa gtgtaaggaa 600
cagacctgac cgaaaagtgc caatgaaaaa aagattttag atgttttcaa ccaccaatat 660
ccgatcggag ttgttggcaa tagggggtgc acgtttgctt ttttcataga tccatagtta 720
ccgtgcaacc aacctgatcc attgcgttcc ggccggcatt aaacggtggg cgccctttct 780
aggaatccga cgtgcatatt acatatttga gggggtgcaa agttcataac tcacatctgt 840
gcaccaaagt tatggcccgt ctcggtcgac cctgtttact cacctctgca ccgcgtagaa 900
ttttatggaa atccacatct cacaatcagt tattgtcttg cgacaatctc ttatctctgc 960
gtcgtgtgga ttataaaaga ccctgtaaat tccctagccc gccacgcatt cagcatttat 1020
agagagtaaa tctatcagca actccttgaa tgaaaattct tcaatgctca attcgcctcg 1080
ctcagctcgg caatgatggc ctccagcaca ccgccaaatc tgccgaccag cccgacaaaa 1140
ctgtctacca acacgttttt gtcgcccgac tccagcacac caggcgctac ttccaacgca 1200
agaccgtcta tcctgcttgc caggctcatt ttttcatgct cctctgtatc tctggcccgc 1260
tcctcgaaag acccctgcgg ccgcgccgat tctgccgcgt ctctctccgg cgtggccccc 1320
agctccatgt tacccttctc ggtgaccgga gtcatcgcca gcggcgccgt cgaagcgaga 1380
ttgatgttca caccaaactg attgagcgtg tctggcgacg ctgctgccgt cttgtcgtcc 1440
atcaactgtg agtgcaacat cggcacaggc atctggagcc gcatctgcga gcgcgcacgc 1500
gacaacgacc ccggctcgga cttcatctcc tggtactcgt tgttgctcag cgcgggagca 1560
gtctgtgggc caggaggaac gttctgcgac ggtatcttac tgttgatcgg ctgcaacagc 1620
ggctgctgcg aggccgacga gggaagcggc ttcatgtgtg gcagccgttg cggtgatggc 1680
acgaggccgg cctcctttag ccgctgcggc gagggcgtcc tgttgcccag actcgatagt 1740
cctgtgctgg aagctcctat gcgccgaacg gcaggctcct cagcctgcac gggggttgac 1800
ggcgactcct gacgcgacac ggttgacgcc cttggccgtt tttcctgtgc agccgtctct 1860
ggaagcgtgt ccagactggg gatctctata ggcacattgg ggaccgcgga cacctctgcg 1920
acgggcgacg acggcgtctc atcggactcg tcctgctcaa acagctttag cagcgatttt 1980
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<210> 6
<211> 2023
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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ctgagtcctg gaagtcgtcg tagatcaggc cgtttaccac aaggtttccc aaaatctcca 1980
gcatgacgtc gcggttcgcg tagagatagt ccagcacgag atc 2023

Claims (10)

1.一种能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
敲除高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株的LPL1基因和IZH3基因。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株为通过将野生型汉逊酵母的FAA1基因敲除得到；
优选地，所述野生型汉逊酵母为野生型汉逊酵母NCYC 495leu1.1；
优选地，所述LPL1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述IZH3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求1～2任一项所述的构建方法得到的能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸工程菌。
4.根据权利要求1～2任一项所述的构建方法得到的能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸工程菌、权利要求3所述的能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸工程菌在以甲醇为碳源制备脂肪酸中的应用。
5.一种提高野生型汉逊酵母甲醇耐受能力的方法，其特征在于，所述方法包括：
敲除野生型汉逊酵母的LPL1基因和IZH3基因。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述LPL1基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；
所述IZH3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
优选地，所述野生型汉逊酵母为野生型汉逊酵母NCYC 495leu1.1。
7.一种获得能够以甲醇为唯一碳源高产脂肪酸的汉逊酵母菌株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株进行以下驯化：
在同时含有葡萄糖和甲醇的初始培养基中进行适应性培养，之后在葡萄糖和甲醇比例逐渐减少的培养基中进行适应性培养，直至葡萄糖减少至0，得到所述能够以甲醇为唯一碳源高产脂肪酸的汉逊酵母菌株；
所述高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株为通过敲除野生型汉逊酵母的FAA1基因得到；
葡萄糖和甲醇在培养基中的总碳浓度为0.2～0.5mol/L。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述初始培养基中葡萄糖和甲醇的碳摩尔比为x：10-x，x取值为3～7；
优选地，所述葡萄糖和甲醇比例逐渐减少为葡萄糖和甲醇的碳摩尔比为x：10-x中的x以y为梯度进行递减，其中，y的取值为0.5～1；
优选地，所述进行适应性培养为将高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株在培养基中进行驯化至初始以OD600＝0.2接种，在48h时生长OD600达到5～6。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括对驯化后的高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株进行基因组测序分析和/或转录组测序分析，获得关键基因靶点和/或代谢途径，对关键基因靶点和/或代谢途径进行优化。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在驯化后的高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株中提高MmACL基因的表达；
优选地，所述方法还包括在驯化后的高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株中提高ZWF1基因和FBP1基因的表达；
优选地，所述方法还包括在驯化后的高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株中提高ZWF1基因、FBP1基因和MmACL基因的表达；
优选地，所述方法还包括在驯化后的高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株中提高ZWF1基因、FBP1基因、MmACL基因和RPE基因的表达；
优选地，所述方法还包括在驯化后的高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株中提高ZWF1基因、FBP1基因、MmACL基因和ScIDP2基因的表达；
优选地，所述方法还包括在驯化后的高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株中提高ZWF1基因、FBP1基因、MmACL基因、RPE基因和ScIDP2基因的表达。
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