CN117586933A - 一种利用甲醇培养重组盐单胞菌的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物基因工程技术领域，具体涉及一种利用甲醇培养重组盐单胞菌的方法及其应用。本发明提供了一种重组盐单胞菌，表达甲醇脱氢酶、己酮糖‑6‑磷酸合成酶和/或己酮糖‑6‑磷酸异构酶。所述的重组盐单胞菌可以利用包含甲醇的碳源进行培养。
Description
技术领域
本发明涉及微生物基因工程技术领域，具体涉及一种利用甲醇培养重组盐单胞菌的方法及其应用。
背景技术
甲醇等有机一碳(C1)化合物由于其丰富的来源、潜在的可持续性和“碳中和”生产理念以及与粮食安全不冲突而成为微生物发酵的有前途的替代碳源。甲醇在室温下保持液态，与目前的运输和发酵基础设施兼容。在来源上，甲醇可以来自于城市和农业废料堆肥产生的沼气或通过二氧化碳的电催化来获得。并且，甲醇的平均碳原子的还原程度比葡萄糖高50％，可以为生物合成提供较多的还原力。此外甲醇的价格相较于葡萄糖具有一定的优势。利用甲醇作为碳源是目前代谢工程和发酵的发展方向之一。聚羟基脂肪酸酯是一种由微生物合成的生物塑料，其可以在野外环境中自然降解，是目前解决“白色污染”、“微塑料”等问题的一个重要发展方向。
甲醇通常对于细胞有一定的毒性，其不完全的氧化物甲醛作为一种强反应性的物质可以和蛋白质中的氨基酸反应形成亚甲基桥导致蛋白交联。所以细菌对甲醇的耐受有一定的限度。在甲醇的利用中，一般只有一些甲基营养菌天然的具有耐受甲醇的能力，并能够利用甲醇作为唯一碳源生长。有一些研究酵母可以利用甲醇生产多种产品(https://zhuanlan.zhihu.com/p/630330073)。
盐单胞菌是一种来源于高盐环境的细菌，其独特的生长条件导致其能够进行开放式的大规模发酵，对于降低生产成本有独特的优势，盐单胞菌生产PHA使用的主要碳源是葡萄糖，其一般不具有利用甲醇的能力。
发明内容
本申请为提高盐单胞菌对甲醇的耐受能力，并利用甲醇提高盐单胞菌的产量，提供了一种重组盐单胞菌，通过导入Mdh、Hps和Phi，提高盐单胞菌的产量，在进一步的分析中发现，导入Mdh首先将甲醇转化为甲醛，甲醛浓度高可以诱导响应甲醛诱导的启动子提高Hps、Phi或其他酶的表达，可以进一步提高盐单胞菌对甲醇的利用。同时，本申请培养盐单胞菌采用的碳源还包括木糖，进一步导入XylA和XylB可以将木糖转化为Ru5P，增强盐单胞菌对甲醇的利用。本发明改造获得的重组盐单胞菌可以将原本0.1g/L的细胞干重，提高百倍。
具体的：
本发明的第一方面，提供了一种以甲醇为碳源的重组盐单胞菌，所述的重组盐单胞菌表达甲醇脱氢酶Mdh、己酮糖-6-磷酸合成酶Hps和己酮糖-6-磷酸异构酶Phi。
其中，所述甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶分别独立来源于芽孢杆菌属(Bacillus)、贪铜菌属(Cupriavidus)或分枝杆菌属(Mycobacterium)。
优选的，所述的甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶分别独立来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、甲醇芽孢杆菌(Bacillusmethanolicus)、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri)。
更优选的，所述的甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶和/或己酮糖-6-磷酸异构酶分别独立来源于Bacillus stearothermophilus DSM 2334、Bacillus methanolicusMGA3、Cupriavidus necator N-1、Bacillus subtilis 168和/或Mycobacterium gastri MB19。
优选的，所述的甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶和/或己酮糖-6-磷酸异构酶的来源相同或不同。
优选的，所述的甲醇脱氢酶来源于Bacillus stearothermophilus、Bacillusmethanolicus或Cupriavidus necator。
进一步优选的，来源于Bacillus stearothermophilus的甲醇脱氢酶的氨基酸序列包含如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列或包含与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。
SEQ ID NO：1：
进一步优选的，来源于Bacillus methanolicus的甲醇脱氢酶的氨基酸序列包含如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2：
进一步优选的，来源于Cupriavidus necator的甲醇脱氢酶的氨基酸序列包含如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列或包含与SEQ ID NO：3所示氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3：
优选的，所述的己酮糖-6-磷酸合成酶来源于Bacillus methanolicus、Bacillussubtilis或Mycobacterium gastri。
来源于Bacillus methanolicus的己酮糖-6-磷酸合成酶的氨基酸序列包含如SEQID NO：4所示氨基酸序列或包含与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4：
来源于Bacillus subtilis的己酮糖-6-磷酸合成酶的氨基酸序列包含如SEQ IDNO：5所示氨基酸序列或包含与SEQ ID NO：5所示氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5：
来源于Mycobacterium gastri的己酮糖-6-磷酸合成酶的氨基酸序列包含如SEQID NO：6所示氨基酸序列或包含与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6：
优选的，所述的己酮糖-6-磷酸异构酶来源于Bacillus methanolicus、Bacillussubtilis或Mycobacterium gastri。
来源于Bacillus methanolicus的己酮糖-6-磷酸异构酶的氨基酸序列包含如SEQID NO：7所示氨基酸序列或包含与SEQ ID NO：7所示氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7：
来源于Bacillus subtilis的己酮糖-6-磷酸异构酶的氨基酸序列包含如SEQ IDNO：8所示氨基酸序列或包含与SEQ ID NO：8所示氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8：
来源于Mycobacterium gastri的己酮糖-6-磷酸异构酶的氨基酸序列包含如SEQID NO：9所示氨基酸序列或包含与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9：
在本发明的一个具体实施方式中，所述的甲醇脱氢酶来源于Bacillusstearothermophilus，所述的己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶来源于Bacillus methanolicus。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的甲醇脱氢酶来源于Bacillusstearothermophilus，所述的己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶来源于Bacillus subtilis。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的甲醇脱氢酶来源于Bacillusstearothermophilus，所述的己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶来源于Mycobacterium gastri。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶均来源于Bacillus methanolicus。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的甲醇脱氢酶来源于Bacillusmethanolicus，所述的己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶来源于Bacillussubtilis。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的甲醇脱氢酶来源于Bacillusmethanolicus，所述的己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶来源于Mycobacterium gastri。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的甲醇脱氢酶来源于Cupriavidusnecator，所述的己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶来源于Bacillusmethanolicus。在本发明的一个具体实施方式中，所述的甲醇脱氢酶来源于Cupriavidusnecator，所述的己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶来源于Bacillussubtilis。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的甲醇脱氢酶来源于Cupriavidusnecator，所述的己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶来源于Mycobacteriumgastri。优选的，所述的重组盐单胞菌表达或过表达核酮糖-5-磷酸Ru5P。
优选的，所述的碳源还包含木糖。
在本方面的一个具体实施方式中，所述的碳源为甲醇和木糖。
优选的，所述的碳源中，甲醇的含量为1-30g/L，进一步优选为5-20g/L，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30g/L。
优选的，所述的碳源中，木糖的含量为1-30g/L，进一步优选为5-20g/L，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30g/L。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的碳源中，甲醇的含量为10g/L；木糖的含量为20g/L。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的碳源中，甲醇的含量为10g/L；木糖的含量为5g/L。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的碳源中，甲醇的含量为20g/L；木糖的含量为20g/L。
优选的，所述的重组盐单胞菌表达木糖异构酶和木酮糖激酶。
优选的，所述的木糖异构酶或木酮糖激酶分别独立来源于埃希氏菌属(Escherichia)。
进一步优选的，所述的木糖异构酶或木酮糖激酶为来源于大肠杆菌Escherichiacoli的木糖异构酶XylA和木酮糖激酶XylB。
在本发明的一个具体实施方式中，木糖异构酶XylA的氨基酸序列包含如SEQ IDNO：10所示的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列；所述的木酮糖激酶XylB的氨基酸序列包含如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10：
SEQ ID NO：11：
在本发明的一个具体实施方式中，所述的重组盐单胞菌表达甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶、己酮糖-6-磷酸异构酶、木糖异构酶和木酮糖激酶。
优选的，所述的甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶、己酮糖-6-磷酸异构酶、木糖异构酶或木酮糖激酶的表达受启动子的调控。
调控甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶、己酮糖-6-磷酸异构酶、木糖异构酶或木酮糖激酶的启动子为相同或不同的。
所述的启动子包括组成型启动子和/或诱导型启动子。
所述的组成型启动子包括但不限于Pporin启动子或其突变体(例如文献：Shen R,Yin J,Ye JW,Xiang RJ,Ning ZY,Huang WZ,Chen GQ.Promoter Engineering forEnhanced P(3HB-co-4HB)Production by Halomonas bluephagenesis.ACS SynthBiol.2018 Aug 17；7(8):1897-1906.doi:10.1021/acssynbio.8b00102.Epub 2018 Jul31.PMID:30024739.中所记载的)、Sp6启动子或其变体。
所述的诱导型启动子选自Pfrm启动子或其突变体、Pluc启动子或其变体、Plac启动子或其变体、Ptrp启动子或其变体、Ptac启动子或其变体、噬菌体启动子或其变体、ParaBAD启动子或其变体或PphaP启动子或其变体。
优选的，所述的Pfrm启动子或其突变体启动子可以受甲醛的调控。
优选的，所述的启动子可以是天然受到甲醛的调控，也可以通过人工改造组成型启动子使其能够受到甲醛的调控，例如在组成型启动子上加入响应甲醛调控的蛋白质的结合位点。优选的，所述的响应甲醛调控的蛋白质优选为阻遏蛋白FrmR蛋白。
当启动子上具有FrmR蛋白的结合位点，FrmR蛋白会结合在启动子上的结合位点，阻止启动子表达，当体系中存在甲醛时，甲醛与FrmR蛋白结合，使FrmR蛋白从启动子上脱离，启动子可以启动其后的基因表达。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶的表达受响应甲醛诱导的启动子调控，优选的，所述的响应甲醛诱导的启动子来源于大肠杆菌，进一步优选的，所述的响应甲醛诱导的启动子为来源于大肠杆菌的Pfrm启动子或其突变体。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的甲醇脱氢酶、木糖异构酶和木酮糖激酶通过Pporin启动子或其突变体启动表达，所述的己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶通过Pfrm启动子或其突变体启动表达。
其中，所述的Pporin启动子的核苷酸序列包含如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列或者包含与SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列。
SEQ ID NO：12：
所述的Pfrm启动子的核苷酸序列包含如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列或者包含与SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列。SEQ ID NO：13：
优选的，所述的甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶、己酮糖-6-磷酸异构酶、木糖异构酶或木酮糖激酶可以在质粒中表达，也可以插入重组盐单胞菌的染色体中表达。
优选的，所述的重组盐单胞菌包括但不限于Halomonas bluephagenesis、Halomonas campaniensis或Halomonas aydingkolgenesis。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的重组盐单胞菌包括但不限于Halomonasbluephagenesis TD01、Halomonas campaniensis LS21、Halomonas aydingkolgenesisM1、Halomonas bluephagenesis WZY254或Halomonas bluephagenesis WZY278。
本发明的第二方面，提供了一种上述第一方面所述重组盐单胞菌的制备方法，所述的制备方法包括将编码甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶的核苷酸序列导入盐单胞菌。
优选的，所述的制备方法包括将编码木糖异构酶和木酮糖激酶的核苷酸序列导入盐单胞菌。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的制备方法包括将编码甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶、己酮糖-6-磷酸异构酶、木糖异构酶和木酮糖激酶的核苷酸序列导入盐单胞菌。
优选的，所述的制备方法还包括将启动子导入盐单胞菌。
优选的，所述的启动子包括组成型启动子和/或诱导型启动子。
进一步优选的，所述的组成型启动子包括但不限于Pporin启动子或其突变体(例如文献：Shen R,Yin J,Ye JW,Xiang RJ,Ning ZY,Huang WZ,Chen GQ.PromoterEngineering for Enhanced P(3HB-co-4HB)Production by Halomonasbluephagenesis.ACS Synth Biol.2018 Aug 17；7(8):1897-1906.doi:10.1021/acssynbio.8b00102.Epub 2018 Jul 31.PMID:30024739.中所记载的)、Sp6启动子或其变体。
进一步优选的，所述的诱导型启动子选自Pfrm启动子或其突变体、Pluc启动子或其变体、Plac启动子或其变体、Ptrp启动子或其变体、Ptac启动子或其变体、噬菌体启动子或其变体、ParaBAD启动子或其变体或PphaP启动子或其变体。
优选的，所述的Pfrm启动子或其突变体启动子可以受甲醛的调控。
优选的，所述的启动子可以是天然受到甲醛的调控，也可以通过人工改造组成型启动子使其能够受到甲醛的调控，例如在组成型启动子上加入响应甲醛调控的蛋白质的结合位点。优选的，所述的响应甲醛调控的蛋白质优选为阻遏蛋白FrmR蛋白。
当启动子上具有FrmR蛋白的结合位点，FrmR蛋白会结合在启动子上的结合位点，阻止启动子表达，当体系中存在甲醛时，甲醛与FrmR蛋白结合，使FrmR蛋白从启动子上脱离，启动子可以启动其后的基因表达。
优选的，所述的编码甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶、己酮糖-6-磷酸异构酶、木糖异构酶或木酮糖激酶的核苷酸序列的转录受到所述的启动子的调控。
优选的，调控编码甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶、己酮糖-6-磷酸异构酶、木糖异构酶或木酮糖激酶的核苷酸序列转录的启动子为相同或不同的。
在本发明的一个具体实施方式中，编码己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶的核苷酸序列的转录受响应甲醛诱导的启动子调控，优选的，所述的响应甲醛诱导的启动子来源于大肠杆菌，进一步优选的，所述的响应甲醛诱导的启动子为来源于大肠杆菌的Pfrm启动子或其突变体。
在本发明的一个具体实施方式中，编码甲醇脱氢酶、木糖异构酶和木酮糖激酶的核苷酸序列的转录受Pporin启动子或其突变体调控，编码己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶的核苷酸序列的转录受Pfrm启动子或其突变体调控。优选的，对启动子的相关限定同本发明的第一方面。
优选的，所述的制备方法包括使用表达载体。
优选的，所述的表达载体包括编码甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶的核苷酸序列。
进一步优选的，所述的表达载体中包含编码木糖异构酶和木酮糖激酶的核苷酸序列。
优选的，所述的表达载体中还包含启动子。
优选的，上述蛋白在表达载体中表达，或者，所述的表达载体将启动子、编码上述蛋白的核苷酸序列插入重组盐单胞菌的染色体中。
优选的，所述的出发菌株包括但不限于Halomonas bluephagenesis、Halomonascampaniensis或Halomonas aydingkolgenesis。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的出发菌株包括但不限于Halomonasbluephagenesis TD01、Halomonas campaniensis LS21、Halomonas aydingkolgenesisM1、Halomonas bluephagenesis WZY254或Halomonas bluephagenesis WZY278。
本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体包括编码甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶的核苷酸序列。
优选的，所述的表达载体中还包含启动子。
优选的，所述的启动子包括组成型启动子和/或诱导性启动子。
优选的，所述的组成型启动子包括但不限于Pporin启动子或其突变体(例如文献：Shen R,Yin J,Ye JW,Xiang RJ,Ning ZY,Huang WZ,Chen GQ.Promoter Engineering forEnhanced P(3HB-co-4HB)Production by Halomonas bluephagenesis.ACS SynthBiol.2018Aug 17；7(8):1897-1906.doi:10.1021/acssynbio.8b00102.Epub 2018Jul31.PMID:30024739.中所记载的)、Sp6启动子或其变体。
优选的，所述的诱导型启动子选自Pfrm启动子或其突变体、Pluc启动子或其变体、Plac启动子或其变体、Ptrp启动子或其变体、Ptac启动子或其变体、噬菌体启动子或其变体、ParaBAD启动子或其变体或PphaP启动子或其变体。
优选的，所述的frm启动子或其突变体启动子可以受甲醛的调控。
优选的，所述的启动子可以是天然受到甲醛的调控，也可以通过人工改造组成型启动子使其能够受到甲醛的调控，例如在组成型启动子上加入响应甲醛调控的蛋白质的结合位点。优选的，所述的响应甲醛调控的蛋白质优选为阻遏蛋白FrmR蛋白。
当启动子上具有FrmR蛋白的结合位点，FrmR蛋白会结合在启动子上的结合位点，阻止启动子表达，当体系中存在甲醛时，甲醛与FrmR蛋白结合，使FrmR蛋白从启动子上脱离，启动子可以启动其后的基因表达。
在本发明的一个具体实施方式中，编码己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶的核苷酸序列的转录受响应甲醛诱导的启动子调控，优选的，所述的响应甲醛诱导的启动子来源于大肠杆菌，进一步优选的，所述的响应甲醛诱导的启动子为来源于大肠杆菌的Pfrm启动子或其突变体，优选的，所述的表达载体上还可以包含响应甲醛调控的FrmR蛋白，或者，FrmR蛋白存在于表达载体所在的体系中。
在本发明的一个具体实施方式中，编码甲醇脱氢酶的核苷酸序列的转录受Pporin启动子或其突变体调控，编码己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶的核苷酸序列的转录受Pfrm启动子或其突变体调控。
在本发明的一个具体实施方式中，启动子、编码上述各蛋白的核苷酸序列在表达载体中的从5’-3’的顺序为Pporin启动子-编码甲醇脱氢酶的核苷酸序列-Pfrm启动子-编码己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶的核苷酸序列。
所述的表达载体能够在宿主细胞中复制、转录及翻译。因此，其还包含常规的其他表达元件，例如终止子、酶切位点等等。
优选的，所述的表达载体可以为原核表达载体或真核表达载体，优选为原核表达载体。
优选的，所述的表达载体为质粒。
优选的，对启动子、编码甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶或己酮糖-6-磷酸异构酶的核苷酸序列的相关限定同本发明的第一方面和第二方面。
本发明的第四方面，提供了一种表达载体组合物，所述的表达载体组合物包含一个或多个第一表达载体，和，一个或多个第二表达载体。
所述的第一表达载体包含编码甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶的核苷酸序列。优选为第三方面所述的的表达载体。
所述的第二表达载体中包含编码木糖异构酶和木酮糖激酶的核苷酸序列。
优选的，所述的第二表达载体中包含启动子。
优选的，所述的启动子包括组成型启动子和/或诱导型启动子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的第二表达载体中，启动子、编码木糖异构酶和木酮糖激酶的核苷酸序列在第二表达载体中从5’-3’的顺序为Pporin启动子-编码木糖异构酶和木酮糖激酶的核苷酸序列。
所述的第一表达载体和/或第二表达载体能够在宿主细胞中复制、转录及翻译。因此，其还包含常规的其他表达元件，例如终止子、酶切位点等等。
优选的，所述的表达载体可以为原核表达载体或真核表达载体，优选为原核表达载体。
优选的，所述的表达载体为质粒。
优选的，对启动子、编码甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶、己酮糖-6-磷酸异构酶、木糖异构酶、木酮糖激酶的核苷酸序列的相关限定同本发明的第一方面和第二方面。
本发明的第五方面，提供了一种提高盐单胞菌产量的方法，所述的方法包括培养上述第一方面所述的重组盐单胞菌，或，上述第二方面所述的制备方法获得的重组盐单胞菌，并在培养过程中加入包含甲醇的碳源。
优选的，所述的碳源还包含木糖。
在本方面的一个具体实施方式中，所述的碳源为甲醇和木糖。
优选的，所述的碳源中，甲醇的含量为1-30g/L，进一步优选为5-20g/L，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30g/L。
优选的，所述的碳源中，木糖的含量为1-30g/L，进一步优选为5-20g/L，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30g/L。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的碳源中，甲醇的含量为10g/L；木糖的含量为20g/L。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的碳源中，甲醇的含量为10g/L；木糖的含量为5g/L。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的碳源中，甲醇的含量为20g/L；木糖的含量为20g/L。
本发明的第六方面，提供了一种发酵方法，所述的发酵方法包括发酵培养上述第一方面所述的重组盐单胞菌，和/或，上述第二方面所述的制备方法获得的重组盐单胞菌，并在培养过程中加入包含甲醇的碳源。
优选的，所述的碳源还包含木糖。
优选的，对碳源的相关限定同本发明的第一方面。
本发明的第七方面，提供了一种利用包含甲醇的碳源培养盐单胞菌，和/或，提高盐单胞菌对甲醇的转化和利用效率的方法。
优选的，所述的碳源还包含木糖。
优选的，所述的盐单胞菌为上述第一方面所述的盐单胞菌，和/或，与上述第一方面所述的盐单胞菌具有相同改造的盐单胞菌，和/或，上述第二方面所述的制备方法获得的重组盐单胞菌。
优选的，对碳源的相关限定同本发明的第一方面。
根据具体实施方式的需要，还可以通过实验室适应性进化进一步提高盐单胞菌对甲醇的耐受能力，以提高盐单胞菌对甲醇的转化和利用效率。
优选的，所述的实验室适应性进化包括在盐单胞菌在加入甲醇和木糖的培养基中培养，每隔12小时传代一次，逐步升高甲醇的浓度。
优选的，所述的实验室适应性进化包括传代20次以上，进一步优选包括传代100次以上，更优选包括传代300次以上，例如传代20次、24次、50次、60次、67次、100次、150次、200次、201次、235次、243次、250次、300次、322次、372次或更多次。
本发明的第八方面，提供了一种上述第三方面所述的表达载体、上述第四方面所述的表达载体组合物在制备重组盐单胞菌中的应用。
本发明的第九方面，提供了一种上述第一方面所述的重组盐单胞菌或上述第二方面所述的构建方法获得的重组盐单胞菌或使用上述第三方面所述的表达载体或上述第四方面所述的表达载体组合物制备的重组盐单胞菌在生产代谢产物中的应用。
优选的，所述的代谢产物包括PHA或组成PHA的单体。
进一步优选的，所述的组成PHA的单体包括但不限于2-羟基丙酸、3-羟基丁酸、4-羟基丁酸、3-羟基戊酸、3-羟基丙酸、5-羟基戊酸、3-羟基己酸、3-羟基庚酸、6-羟基己酸、3-羟基辛酸、3-羟基壬酸、3-羟基癸酸、3-羟基十一酸或3-羟基十二酸中的一种、两种或两种以上。
更优选的，所述PHA包括但不限于P3HP、PHB、P(HB-LA)、PHV、P34HB、PHBV、PHBHHx、PHBHHp、PHO、PHN、PHD、P3HB4HB3HV或P3HB4HB5HV中的一种或两种以上。
本发明所述的“包含”或“包括”为开放式写法，当用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有与原序列相同或相似的活性。
本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合，应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如，“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
本发明中涉及的部分中英文缩写对照表见下表1。
表1
| 英文缩写 | 中文名 |
| Mdh | 甲醇脱氢酶 |
| Hps | 己酮糖-6-磷酸合成酶 |
| Phi | 己酮糖-6-磷酸异构酶 |
| Ru5P | 核酮糖-5-磷酸 |
| XylA | 木糖异构酶 |
| XylB | 木酮糖激酶 |
| xylA | 木糖异构酶的编码基因 |
| xylB | 木酮糖激酶的编码基因 |
| Xu5P | 木酮糖5-磷酸 |
| FrmR | 甲醛响应转录调控因子 |
| Pfrm | 甲醛操纵子启动子 |
附图说明
图1：甲醇代谢路径示意图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中使用的Halomonas bluephagenesis TD01记载于专利申请公开号CN102120973A以及文献“Tan D,Xue Y,Aibaidula G,et al.Unsterile and continuousproduction of polyhydroxybutyrate by Halomonas TD01[J].BioresourceTechnology,2011,102:8130-8136”；公众可以从清华大学获得该菌。
实施例中使用的Halomonas campaniensis LS21：是本实验室筛选得到的一株革兰氏阴性嗜盐细菌，具有非常好的工业化生产应用前景，公开于专利申请公开号CN102925382A，以及“Jiang X,Yao Z,Chen G Q.Controlling cell volume forefficient PHB production by Halomonas[J].Metabolic Engineering,2017,44:30-37”一文，公众可以从清华大学获得该菌。
实施例中使用的Halomonas aydingkolgenesis M1记载于专利申请公开号CN111593006A；公众可以从清华大学获得该菌。
用于培养微生物的MM50培养基成分如下：
MgSO4 0.2g/L；KH2PO41.5g/L；以及合计＜0.1g/L的Fe(III)-NH4-Citrate，CaCl2·2H2O，ZnSO4·7H2O，MnCl2·4H2O，H3BO3，CoCl2·6H2O，CuSO4·5H2O，NiCl2·6H2O，NaMoO4·2H2O，以及，NaCL 50g/L。
实施例1：向盐单胞菌中导入不同来源的甲醇代谢基因的比较
在甲醇的代谢(代谢路径示意图参见图1)中，甲醇首先通过甲醇脱氢酶(Mdh)的作用生成甲醛，甲醛通过己酮糖-6-磷酸合成酶(Hps)的作用和核酮糖-5-磷酸(Ru5P)一起生成己酮糖-6-磷酸，再通过己酮糖-6-磷酸异构酶(Phi)的作用生成果糖-6-磷酸，进而进入糖酵解途径。本实施例中选取来源于嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilusDSM 2334、甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus MGA3和钩虫贪铜菌Cupriavidusnecator N-1的MdhBs(SEQ ID NO：1)、MdhBm(SEQ ID NO：2)和MdhCn(SEQ ID NO：3)，和来源于甲醇芽孢杆菌Bacillus methanolicus MGA3、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168和胃分枝杆菌Mycobacterium gastri MB19的Hps和Phi(HpsBm(SEQ ID NO：4)、HpsBs(SEQ IDNO：5)、HpsMg(SEQ ID NO：6)、PhiBm(SEQ ID NO：7)、PhiBs(SEQ ID NO：8)和PhiMg(SEQ ID NO：9))进行正交实验。构建上述不同来源的p321-mdh-hps-phi质粒，选用Pporin启动子(SEQ IDNO：12)串联表达该基因簇。质粒构建完成后，通过接合转化的方式转化到Halomonasbluephagenesis TD01中。在MM50培养基中添加10g/L的甲醇、20g/L木糖作为碳源，通过细胞干重(CDW)来评估甲醇的利用效果。对照组为p321空质粒。对照组的干重为0.1g/L。
正交实验结果参见表2，导入上述不同来源的p321-mdh-hps-phi质粒后，细胞干重均较野生型菌株提高，其中来源于Cupriavidus necator的Mdh和来源于Bacillussubtilis的Hps和Phi效果最佳，细胞干重可达2.2g/L。
表2细胞在10g/L的甲醇中的生长情况
| CDW(g/L) | MdhBs | MdhBm | MdhCn |
| HpsBm-PhiBm | 0.8 | 1.2 | 1.8 |
| HpsBs-PhiBs | 1.4 | 1.7 | 2.2 |
| HpsMg-PhiMg | 0.9 | 1.4 | 1.9 |
实施例2：基于甲醛诱导型启动子(Pfrm)的诱导对甲醇利用的优化Pfrm启动子(SEQID NO：13)是来源于大肠杆菌的响应甲醛诱导的启动子，其受到阻遏蛋白FrmR的调控，在有甲醛存在时启动基因的表达。使用这一套表达系统时，可以在甲醛浓度过高时提升Hps和Phi的表达量。结合实施例1中的结果，构建质粒P321-Pporin启动子-mdhCn-Pfrm启动子-hpsBs-phiBs。将该质粒通过接合转化的方式转化到Halomonas bluephagenesis TD01中，使用氯霉素作为筛选基因。在MM50培养基中添加10g/L甲醇、20g/L木糖作为碳源，通过干重来评估甲醇的利用效果。
结果参见表3，可见，采用甲醛诱导型启动子frm可以提高Halomonasbluephagenesis TD01对甲醇的利用，提高细胞干重，达到2.5g/L。
表3使用甲醛诱导启动子对甲醇利用的作用
实施例3：Ru5P再生的增强和利用
Ru5P是甲醇同化过程中参与反应的化合物，其可以从木糖来源，增加细菌对木糖的利用可以增强甲醇同化的速率。XylA是木糖异构酶，XylB是木酮糖激酶，经过这两个酶的作用可以将木糖转化为木酮糖-5-磷酸(Xu5P)，Xu5P再经过一步转化，就可以变为Ru5P。构建质粒P241-Pporin启动-xylAB来提升细菌利用木糖的能力，进而增加Ru5P的供应量。所用的xylA基因和xylB基因是来源于大肠杆菌，其中，XylA的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，XylB的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。
将质粒P321-Pporin启动子-mdhCn-Pfrm启动子-hpsBs-phiBs和质粒P241-Pporin启动子-xylAB转入到Halomonas bluephagenesis TD01中，使用氯霉素和壮观霉素作为筛选基因。对照组为P321-Pporin启动子-mdhCn-Pfrm启动子-hpsBs-phiBs和P241空质粒在MM50培养基中添加10g/L甲醇、20g/L木糖作为碳源，通过干重来评估甲醇的利用效果。
结果参见表4，可见，通过导入xylA基因和xylB基因增加Ru5P的供应量，可以进一步加强Halomonas bluephagenesis TD01对甲醇的利用，提高细胞干重，细胞干重可达7.4g/L。
表4增强木糖利用对甲醇利用的影响
实施例4：其他Halomonas属菌株对甲醇的利用
将质粒P321-Pporin启动子-mdhCn-Pfrm启动子-hpsBs-phiBs和质粒P241-Pporin启动子-xylAB转入到Halomonas campaniensis LS21中，使用氯霉素和壮观霉素作为筛选基因。对照组1为PSEVA241空质粒和PSEVA321空质粒，对照组2为PSEVA321-Pporin启动子-mdhCn-Pfrm启动子-hpsBs-phiBs和PSEVA241空质粒。在MM50培养基中添加10g/L甲醇、20g/L木糖作为碳源，通过干重来评估甲醇的利用效果。
结果参见表5，表示甲醛诱导型启动子Pfrm可以提高Halomonas campaniensisLS21对甲醇的利用，当导入xylA基因和xylB基因增加了Ru5P的供应量，可以进一步加强Halomonas campaniensis LS21对甲醇的利用，提高细胞干重，细胞干重可达6.5g/L。
表5在Halomonas campaniensis LS21中构建甲醇利用途径结果
将质粒PSEVA321-Pporin启动子-mdhCn-Pfrm启动子-hpsBs-phiBs和质粒PSEVA241-Pporin启动子-xylAB转入到Halomonas aydingkolgenesis M1中，使用氯霉素和壮观霉素作为筛选基因。对照组1为PSEVA241空质粒和PSEVA321空质粒，对照组2为PSEVA321-Pporin启动子-mdhCn-Pfrm启动子-hpsBs-phiBs和PSEVA241空质粒。在MM50培养基中添加10g/L甲醇、20g/L木糖作为碳源，通过干重来评估甲醇的利用效果。
结果参见表6，表示甲醛诱导型启动子Pfrm可以提高Halomonas aydingkolgenesisM1对甲醇的利用，当导入xylA基因和xylB基因增加了Ru5P的供应量，可以进一步加强Halomonas aydingkolgenesis M1对甲醇的利用，提高细胞干重，细胞干重可达6.9g/L。
表6在Halomonas aydingkolgenesis M1中构建甲醇利用途径结果
实施例5：利用实验室适应性进化提升对甲醇的耐受性
将甲醇的利用基因和木糖的同化利用增强基因整合到Halomonasbluephagenesis TD01中，其中Pporin启动子-xylAB整合在G4位点，Pporin启动子-mdhCn-Pfrm启动子-hpsBs-phiBs整合在G7位点(Qin Q,Ling C,Zhao Y,Yang T,Yin J,Guo Y,ChenGQ.CRISPR/Cas9 editing genome of extremophile Halomonas spp.Metab Eng.2018May；47:219-229.doi:10.1016/j.ymben.2018.03.018.Epub 2018Mar 30.PMID:29609045.)。将整合后的菌株命名为TDM0，将TDM0在MM50培养基中添加10g/L甲醇，20g/L木糖为碳源的培养基中培养，12小时后，将细菌转接到12g/L的甲醇的培养基中培养，每隔12小时传代一次，每次转接，将菌株后代码加1(如转接1次后称为TDM1，TDM235为转接235次的结果)至细菌的干重CDW能够达到其在10g/L甲醇的相当的水平甚至更高的水平。按照这个思路逐步升高甲醇的浓度，最终，在经过了约6个月的适应性进化后，TDM372菌株可以在20g/L甲醇和20g/L的木糖的条件下，获得约10.5g/L的干重水平，并生产含76％左右含量的PHA。进化过程中Halomonas bluephagenesis TD01的数据如表7所示。
表7适应性进化中各个阶段的代表菌株的甲醇利用情况
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (14)
1.一种以甲醇为碳源的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的重组盐单胞菌表达甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶；其中，甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶或己酮糖-6-磷酸异构酶分别独立来源于芽孢杆菌属(Bacillus)、贪铜菌属(Cupriavidus)或分枝杆菌属(Mycobacterium)。
2.根据权利要求1所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的甲醇脱氢酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)或钩虫贪铜菌Cupriavidus necator)；
优选的，所述的甲醇脱氢酶的氨基酸序列包含如SEQ ID NO：1-3所示的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO：1-3所示氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的己酮糖-6-磷酸合成酶来源于甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri)；
优选的，所述的己酮糖-6-磷酸合成酶的氨基酸序列包含如SEQ ID NO：4-6所示的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO：4-6所示氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3任一所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的己酮糖-6-磷酸异构酶来源于甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri)；
优选的，所述的己酮糖-6-磷酸异构酶的氨基酸序列包含如SEQ ID NO：7-9所示的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO：7-9所示氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4任一所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的重组盐单胞菌表达或过表达核酮糖-5-磷酸。
6.根据权利要求1-5任一所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的碳源还包括木糖。
7.根据权利要求1-6任一所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的重组盐单胞菌表达木糖异构酶和木酮糖激酶；
优选的，所述的木糖异构酶或木酮糖激酶分别独立来源于埃希氏菌属(Escherichia)；
进一步优选的，所述的木糖异构酶或木酮糖激酶分别独立来源于大肠杆菌(Escherichia coli)。
8.根据权利要求1-7任一所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶、己酮糖-6-磷酸异构酶、木糖异构酶或木酮糖激酶的表达受启动子的调控；
优选的，所述的启动子包括组成型启动子和/或诱导型启动子；
优选的，调控甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶、己酮糖-6-磷酸异构酶、木糖异构酶和/或木酮糖激酶的启动子为相同或不同的。
9.根据权利要求8所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶的表达受响应甲醛诱导的启动子调控；优选的，所述的响应甲醛诱导的启动子为来源于大肠杆菌。
10.根据权利要求1-9任一所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述的重组盐单胞菌包括Halomonas bluephagenesis、Halomonas campaniensis或Halomonasaydingkolgenesis。
11.一种权利要求1-10任一所述的重组盐单胞菌的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括将编码甲醇脱氢酶、己酮糖-6-磷酸合成酶和己酮糖-6-磷酸异构酶的核苷酸序列导入盐单胞菌；
优选的，所述的制备方法包括将编码木糖异构酶和木酮糖激酶的核苷酸序列导入盐单胞菌。
12.一种提高盐单胞菌产量的方法，其特征在于，所述的方法包括培养权利要求1-10任一所述的重组盐单胞菌，或，权利要求11所述的制备方法获得的重组盐单胞菌，并在培养过程中加入包含甲醇的碳源。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的碳源还包括木糖。
14.权利要求1-10任一所述的重组盐单胞菌或权利要求11所述的制备方法获得的重组盐单胞菌在生产代谢产物中的应用。
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