KR100598695B1 - 스테롤 합성에 관여하는 유전자로 형질전환된 쑥갓 및이를 이용한 스테롤의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 스테롤 합성에 관여하는 유전자로 형질전환된 쑥갓 및 이를 이용한 스테롤의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 CaMV35S 프로모터, 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자 (smt), pCAMBIA1380유래 Nos 3' 터미네이터, CaMV35S polyA 및 pBR322유래 오리진을 함유하고 도 4의 개열지도를 가지는 재조합벡터 pCAMBIA1300/CaMV35/Nos-smt로 쑥갓(Chrysanthemum coronarium L.)을 형질전환 시키고, 형질전환된 쑥갓의 세포주 또는 조직을 배양하는 것을 특징으로 하는 스테롤의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른, 형질전환된 쑥갓을 이용한 스테롤의 생산시스템은 정상 쑥갓을 이용한 시스템에 비해 스테롤의 생산효율을 획기적으로 증가시키는 것이 가능하다.
스테롤, 베타-씨토스테롤, smt, 형질전환, 쑥갓

Description

스테롤 합성에 관여하는 유전자로 형질전환된 쑥갓 및 이를 이용한 스테롤의 제조방법 {Chrysanthemum coronarium L. Transformed with the Gene Related to Sterol Biosynthesis and a Method for Preparing Sterol Using the Same}
도 1은 베타-씨토스테롤의 생합성경로를 나타낸 것이다.
도 2는 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자(smt)를 PCR 분석을 통해서 확인한 사진이다. 레인 1: λHindⅢ 마커; 레인 2, 3, 4 및 5: smt의 PCR산물; 및 레인 6: 100bp ladder.
도 3은 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자(smt)의 염기서열을 나타낸 결과이다.
도 4는 본 발명의 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자(smt) 발현벡터인 pCAMBIA1300/CaMV35/ Nos-smt의 개략도이다.
도 5는 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자(smt)의 cDNA를 서브클로닝 한 결과를 나타낸 사진이다. 레인 1은 DNA size marker이고, 레인 2는 pGEM/smt를 제한효소 SmaI 및 SpeI로 처리한 것이며 레인 3은 DNA ladder이다.
도 6은 재조합 아그로박테리움을 PCR 분석을 통해 확인한 사진이다. 레인 1은 DNA ladder이고, 레인 2, 3, 및 4는 선별된 재조합 아그로박테리움 DNA를 서열번호 1, 2의 프라이머를 이용하여 PCR한 것이다.
도 7은 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자(smt)로 형질전환된 캘러스들을 서던 블럿한 결과이다. (A): 레인 1과 2는 정상캘러스(제한효소 처리를 하지 않았음) ; 및 레인 3과 4는 형질전환된 캘러스 (레인 3은 제한효소 SmaI-SpeI로 처리한 염색체 DNA, 레인4는 제한효소 SpeI로 처리한 염색체 DNA)를 나타낸다. (B): 레인 1은 정상캘러스(제한효소 처리를 하지 않았음), 레인 2는 형질전환된 캘러스(EcoRI로 처리)이고, 레인 3은 형질전환된 캘러스(EcoRV로 처리)이며, 레인 4는 형질전환된 캘러스(XhoI로 처리)를 나타낸다.
도 8은 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자(smt)로 형질전환된 캘러스의 total RNA를 RT-PCR한 결과이다. 레인 1: DNA ladder; 레인 2: 정상 캘러스의 total RNA; 레인 3과 4: 형질전환된 캘러스의 total RNA; 및 화살표: 크기가 약 1086bp인 smt 유전자의 RT-PCR 산물. 그리고 control인 actin 유전자의 RT-PCR 산물은 아래쪽에 나타나 있다.
도 9는 정상 캘러스와 형질전환된 캘러스의 베타-씨토스테롤의 함량을 가스 크로마토그래피를 통해서 확인한 결과이다. (A)는 정상 캘러스; (B)는 형질전환된 캘러스 1; 및 (C)는 형질전환된 캘러스 2를 나타낸다. 화살표는 베타-시토스테롤의 피크이다.
발명의 분야
본 발명은 스테롤 합성에 관여하는 유전자로 형질전환된 쑥갓 및 이를 이용한 스테롤의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 CaMV35S 프로모터, 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자 (smt), pCAMBIA1380유래 Nos 3' 터미네이터, CaMV35S polyA 및 pBR322유래 오리진을 함유하고 도 4의 개열지도를 가지는 재조합벡터 pCAMBIA1300/CaMV35/Nos-smt로 쑥갓(Chrysanthemum coronarium L.)을 형질전환 시키고, 형질전환된 쑥갓의 세포주 또는 조직을 배양하는 것을 특징으로 하는 스테롤의 제조방법에 관한 것이다.
발명의 배경
식물계는 매우 다양하다. 많은 물질들이 화학적으로 합성되고 있지만 아직까지 오직 식물에서만 얻을 수 있거나, 화학합성하기에는 고비용이 드는 물질들이 많이 있다. 또 식물로부터 얻어지는 유용물질의 수요가 계속 증가하는 반면 식물 자원은 감소하고 있는 추세이며, 이들 대부분의 유용물질 산물들이 아직까지 화학적으로 합성할 수 없는 물질들이어서 식물세포 조직배양 기술을 이용한 유용물질의 생산은 최근 많은 관심을 끌고 있다.
일반적으로 식물세포 배양방법이 직접 식물체로부터 추출해 내는 것에 비해 경제성이 있기 때문에 빠르게 발전하고 있기는 하나, 현탁배양이나 스케일-업에 있어서는 매우 다른 특성을 보이고 있고, 식물세포 배양시 낮은 세포 생육도나 세포 응집, 유용 대사산물의 생산성이 모 식물체의 생산성보다 현저히 낮은 문제점을 가지고 있다. 따라서 식물세포 조직배양 기술을 이용한 유용 대사산물 생산의 산업화를 위해서는 낮은 생산성의 향상과 식물세포의 배양특성을 고려한 생물공학적 요인에 대한 연구가 필수적이라 할 수 있다.
최근 식물분자생물학의 발달로 외래 유전자를 식물체에 도입시켜 형질전환 식물체를 유도하여 산업적으로 응용하려는 연구가 많이 진행되고 있다. 또한 유전공학적 변형작물을 이용하여 고부가가치의 치료용 물질의 생산에 대하여 많은 연구가 진행되고, 치료용 단백질 등 유용물질의 생산성 향상에 관하여 여러 가지 방법들이 연구되고 있다. 그 중에서도 유용물질의 대사과정을 규명하여 그 대사과정을 조절하는 연구를 연구자들이 많이 수행하고 있다.
우리나라뿐만 아니라 세계의 성인병 발병률은 계속 증가하고 있다. 특히 비만으로 인한 관절염과 암, 동맥경화, 심장병 등의 발병률은 식생활 변화에 따라 급격히 증가하고 있다. 스테롤 계 물질들은 우리 생활에 꼭 필요한 물질로서, 특히 조절호르몬이나 영양제, 의료용 치료제로 많이 쓰이며 체내의 대사작용에 큰 역할을 하고 있다. 그 중에서 쑥갓 등의 식물에 함유된 베타-씨토스테롤은 면역조절, 류머티스관절염치료, 항암치료, 콜레스테롤 흡수저해 등에 효과가 있는 고부가가치를 가진 유용물질이다.
식물에서 스테롤 합성에 관여하는 유전자로는, cyclopropyl sterol isomerase 유전자, C4-demethylase 유전자, C14-demethylase 유전자, C22- desaturase 유전자, sterol methyl transferase 유전자(smt) 등이 있다. 이 중에서 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자 (Genebank NM101884)는 애기장대 식물체에서 베타-씨토스테롤의 생산을 증가시키는 역할을 한다.
이에 본 발명자들은 쑥갓세포가 생산하는 유용 대사산물인 스테롤의 생산 효율을 높이기 위해, 스테롤 합성 대사경로에서 주요 역할을 하는 효소 유전자를 클로닝하여 효소를 과발현하는 형질전환된 세포주를 확립하고, 상기 형질전환된 세포주의 배양에 의해 스테롤을 효율적으로 생산할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 CaMV35S 프로모터, 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자 (smt), pCAMBIA1380유래 Nos 3' 터미네이터, CaMV35S polyA 및 pBR322유래 오리진을 함유하고 도 4의 개열지도를 가지는 재조합벡터 pCAMBIA1300/CaMV35/Nos-smt로 형질전환된 쑥갓 및 상기 형질전환된 쑥갓을 배양하여 스테롤을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CaMV35S 프로모터, 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자 (smt), pCAMBIA1380유래 Nos 3' 터미네이터, CaMV35S polyA 및 pBR322유래 오리진을 함유하고 도 4의 개열지도를 가지는 재조합벡터 pCAMBIA1300/CaMV35/Nos-smt를 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 유전자는 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자 (smt)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 재조합 벡터로 형질전환된 식물세포 또는 조직 및 상기 형질전환된 식물세포 또는 조직을 배양하는 것을 특징으로 하는 스테롤계 물질의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 스테롤계 물질은 베타-씨토스테롤, 캠페스테롤 및 스티그마스테롤로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 식물 스테롤을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히 하기 실시예에서는 스테롤 합성에 관여하는 유전자로 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자 (smt)만을 예시하였으나, cyclopropyl sterol isomerase 유전자, C4-demethylase 유전자, C14-demethylase 유전자, C22-desaturase 유전자 등을 사용하여 쑥갓을 형질전환시킨 다음 스테롤계 물질을 생산하는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
또한, 하기 실시예에서는 형질전환 식물로 쑥갓을 사용하였으나, 본 발명에 따른 재조합 벡터를 제조할 수 있는 식물이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 한편, 유성번식 식물이라 할지라도, 조직배양 등에 의해 무성적으로 반복생식 시킬 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
실시예 1: 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자( smt ) 클로닝
애기장대 식물체로부터 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자 (smt)를 RT-PCR로 클로닝하였다. 우선 애기장대로부터 cDNA를 합성한 후, 합성한 cDNA로부터 GeneBank에서 확인한 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자(At1 g20330)의 자료를 가지고 프라이머를 제작하여 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자를 클로닝하였다 (도 2). 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자의 클로닝에 사용된 PCR 프라이머는 SmaI, SpeI 제한효소 부위를 가지며 염기서열은 다음과 같다.
서열번호 1: 5′-ATGGACTCTTTAACACTCTTCTTC-3′
서열번호 2: 5′-TCAAGAACTCTCCTCCGGTGACTC-3′
합성된 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자 (smt)를 pGEM-T vector에 클로닝하여 pGEM/smt를 제작하고, 염기서열을 확인하였다. 그 결과, 1086bp의 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자 (smt)의 염기서열과 일치하는 것을 확인하였다 (도 3).
실시예 2: 발현벡터의 제작
스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자를 식물체에 형질전환시키기 위하여 pCAMBIA 1302(Cambia, USA) 벡터가 지니는 CaMV 35S 프로모터를 EcoRI 및 SacI 제한효소 부위를 가지는 프라이머(서열번호 3 및 서열번호 4)를 이용해서 PCR로 증폭한 다음, pGEM-T벡터에 클로닝하여, pGEM-T/CaMV 35S를 제작하였다. 상기 제작된 벡터를 EcoRI 및 SacI 제한효소(Takara, Jenpen)로 처리한 후 CaMV35 단편을 pCAMBIA1300(Cambia, USA) 벡터에 라이게이션하고 클로닝하여, pCAMBIA 1300/CaMV35를 제작하였다. 또한 pCAMBIA 1380 벡터(Cambia, USA)의 Nos 3' terminator를 PstI 및 HindIII 제한효소부위를 가지는 프라이머(서열번호 5 및 서열번호 6)를 이용해서 상기와 같은 방법으로 pGEM-T벡터에 클로닝한 후, 제한효소(PstI 및 HindIII)로 처리하고 상기 제조한 pCAMBIA1300/CaMV35에 라이게이션하여 발현벡터, pCAMBIA1300/CaMV35/ Nos를 제작하였다.
서열번호 3 : 5'-GAATTCCATGGAGTCAAAGATTCAAATA-3'
서열번호 4 : 5'-GAGCTCCCATGGTCAAGAGTCC-3'
서열번호 5 : 5'-CTGCAGCATGGAGTCAAAGATTC-3'
서열번호 6 : 5'-AAGCTTCCATGGTCAAGAG-3'
smt유전자를 상기 발현벡터 pCAMBIA1300/CaMV35/Nos에 삽입하기 위하여, 실시예 1에서 제작한 pGEM/smt를 제한효소 SmaI 및 SpeI으로 절단하여 얻어진 smt 유전자 단편과, 동일한 효소로 절단된 pCAMBIA1300/CaMV35/Nos을 라이게이션시켜 최종적으로 smt 발현플라스미드인 pCAMBIA1300/CaMV35/ Nos-smt를 제작하였다 (도 4).
상기 pCAMBIA1300/CaMV35/Nos-smt는 SmaI 및 SpeI를 사용하여 절단한 후 전기영동하여 smt유전자 단편이 클로닝된 것을 확인하였다 (도 5).
실시예 3: 재조합 아그로박테리움 제조
쑥갓의 형질전환을 위해 Agrobacterium tumefaciens EHA105를 사용하였다. 아그로박테리움에 전자천공법으로 pCAMBIA1300/CaMV35/Nos-smt 벡터를 도입하여 재조합 아그로박테리움을 제조하였다. 형질전환된 아그로박테리움은 기본 LB배지에 선택마커로서 리팜피신 50mg/L가 첨가된 배지에서 배양온도 30℃로 배양하였다.
선별된 단일 콜로니를 증식하여 재조합 아그로박테리움의 DNA를 추출한 후, 서열번호 1 및 서열번호 2의 smt 프라이머를 사용하여 PCR 방법으로 확인하였다 (도 6). 도 6에 나타난 바와 같이, 선별된 아그로박테리움 클론에 1086bp 크기의 smt 유전자가 삽입된 것을 확인하고 쑥갓 식물체의 형질전환에 사용하였다.
실시예 4: 쑥갓의 형질전환
파종한 후 4주 이상 분화시킨 쑥갓의 잎만을 취해서 0.5×0.5 크기로 잘라 0.8%의 한천이 첨가된 MS 기본배지[30g/L의 슈크로오스(Sigma, USA)와 0.8%의 마이크로 아가가 첨가된 Murashige & Skoog(Duchefa, Netherlands)]에 올려놓은 다음, 3일 동안 25℃ 배양실에서 전배양하였다. 실시예 3에서 제조한 재조합 아그로박테리움을 리팜피신 50mg/L가 첨가된 기본 LB배지 50ml에 접종하여 2일 동안 키운 후, 50ml 튜브에 옮겨 3000rpm으로 원심분리한 후 20ml 배지에 현탁하였다. 전배양한 쑥갓 leaf disk를 20ml에 현탁한 아그로박테리움에 10분정도 담가둔 후, 멸균필터에 올려 아그로박테리움을 닦아 낸 후 캘러스 유도배지인 MSC배지(슈크로오즈 30g/L, NAA 1mg/L, BAP 1mg/L)에 옮겨 3일 동안 co-culture 하였다. 그 후에 티멘틴(timentin) 150mg/L, 하이그로마이신 50mg/L가 첨가된 배지 위에 co-culture한 쑥갓의 leaf disk를 옮겨 25℃ 배양실에서 광조건 16/8(명/암)로 3주마다 계대배양하며 캘러스 생성을 확인하면서 배양하였다.
실시예 5: 형질전환 캘러스 선별 및 확인
형질전환된 캘러스를 선별하기 위해 플라스미드의 선택마커로 하이그로마이신을 사용하였다. 1차선별은 co-culture 후에 선별하였고 2차, 3차는 3주마다 계대하면서 선별하였다. 또한 선별된 캘러스에서 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자 (smt)의 삽입을 확인하기 위해 서던 블럿을 수행하였다. 서던 블럿을 하기 위해 선별된 형질전환된 쑥갓 캘러스와 정상 쑥갓 캘러스를 액체질소를 이용하여 냉각시킨 후, 막자사발로 분쇄한 다음 염색체 DNA를 추출하였다. 추출한 염색체 DNA를 smt 유전자 염기서열 안에 포함되어 있지 않은 EcoRI, EcoRV, XhoI 제한효소를 사용하여 1일 동안 반응시키고, 절단된 염색체 DNA를 아가로즈 0.9%의 서던 겔(0.5 TBE buffer사용)에 loading 한 후 60mV로 6시간 전개시켰다. 서던 트랜스퍼 방법은 capillary blot을 하였고 사용된 membrane은 Hybon-N+(Amersham, UK)를 사용하였다. 혼성화과정에 쓰인 probing kit는 DECApri meTM II (Ambion, USA)를 사용하였고, P32-dCTP를 사용하여 표지하였다.
서던 블럿 결과, 2개 주의 형질전환된 캘러스(D8, D29)를 최종 선별하였다 (도 7(A) 및 (B)).
실시예 6: 유전자의 발현 확인
쑥갓을 형질전환하여 얻은 형질전환된 캘러스에서 재조합 유전자의 발현여부를 확인하기 위해 정상 쑥갓 캘러스와 형질전환된 캘러스에서 total RNA를 추출하여 RT-PCR로 확인하였다. Total RNA의 추출은 정상 쑥갓 캘러스와 형질전환된 캘러스를 각각 액체질소를 이용하여 분쇄한 다음, total RNA 추출 솔루션(Trizol, Invitrogen)에 섞어주었다. 상기 용액을 원심분리하여 상등액만 취하고, 동일 부피의 아이소프로필알코올을 첨가하여 상온에서 10분간 반응시킨 다음, 원심분리하여 침전된 total RNA를 얻은 후, 75% 에탄올로 세척한 다음에 DEPC 물로 녹여 total RNA를 추출하였다. 260nm의 분광광도계로 total RNA를 정량한 후 ImProm-ⅡTM Reverse Transcription System(Promega)을 이용하여 5ug의 total RNA를 cDNA로 합성한 후 PCR을 하였다. PCR은 94℃에서 변성 반응 1분, 55℃에서 어닐링 반응 1분, 72℃에서 중합 반응 1분으로 30회 수행하였다. PCR 반응으로 얻은 산물은 0.8% 아가로즈 젤로 확인하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자 (smt)로 형질전환된 캘러스의 total RNA를 RT-PCR한 결과, 형질전환된 캘러스에서 SMT 유전자가 발현된 것을 확인할 수 있었다. 레인 2는 정상 캘러스의 total RNA이고 레인 3과 4는 형질전환된 캘러스의 total RNA이다. 크기가 약 1086bp인 smt 유전자의 RT-PCR 산물은 화살표로 나타냈다.
실시예 7: 베타-씨토스테롤 추출 및 분석
실시예 5 및 6에서 선별된 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자 (smt)가 과발현되는 형질전환 캘러스에서의 베타-씨토스테롤의 함량을 정상 캘러스의 경우와 비교하기 위해 가스 크로마토그래피 (Shimadzu GC-14B, Japen)를 이용하여 비교 분석하였다. 사용한 칼럼은 silica capillary 칼럼 (J&W Scientific DB-5:0.32mm i.d. 30 m, U.S.A)이며, 가스 크로마토그래피 조건은 초기온도 250℃부터 320℃에서 15분간이었으며 retention time은 1분에 10℃이다. 검출기는 FID를 사용하였다. 가스 크로마토그래피 측정을 위한 시료의 전처리 과정으로, 시료는 동량의 정상 쑥갓 캘러스와 형질전환 쑥갓 캘러스를 80% 메탄올에 8시간 이상 담가 베타-씨토스테롤을 추출한 후, 여과지를 이용하여 세포와 부유물을 제거한 다음, 메탄올층만 농축 플라스크에 담아 농축하였다. 농축된 각 시료를 10ml의 에틸아세테이트에 녹여낸 후 동량의 HPLC용 H2O를 섞어 분별깔때기로 물층과 에틸아세테이트층을 분획하였다. 이 과정을 2번 반복한 후 분리된 에틸아세테이트층을 다시 농축하고, 200㎕의 비스 트리메틸실릴 아세타마이드 (Lancaster, England)를 이용하여 45℃에서 1시간 정도 TMS로 처리하였다. 처리한 용액을 여과하여 5㎕씩 기기에 주입한 후, 가스 크로마토그래피로 각 시료의 베타-씨토스테롤을 측정하여 비교 분석하였다.
그 결과, 형질전환 캘러스가 정상 캘러스보다 약 140%(D8), 210%(D29)정도 높은 함량을 가지고 있는 것을 확인하였다 (도 9). 도 9에서는 다른 피크들의 변화도 보이는데 이 피크들은, 스테롤 계열의 물질로서, 스티그마스테롤(stigmasterol)과 캠페스테롤(campesterol)인 것을 GC-MS로 확인하였다. 또한 형질전환 캘러스 2종에서는 정상 캘러스보다 스티그마스테롤은 500% 이상, 캠페스테롤은 200% 이상의 함량증가를 나타내었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 CaMV35S 프로모터, 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자 (smt), pCAMBIA1380유래 Nos 3' 터미네이터, CaMV35S polyA 및 pBR322유래 오리진을 함유하고 도 4의 개열지도를 가지는 재조합벡터 pCAMBIA1300/CaMV35/Nos-smt로 형질전환된 쑥갓 및 상기 형질전환된 쑥갓을 배양하여 스테롤을 제조하는 방법을 제공하는 효과가 있다.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 형질전환된 쑥갓을 이용하여 스테롤을 생산하는 시스템은 정상 쑥갓을 이용한 시스템에 비해 스테롤의 생산 효율을 획기적으로 증가시키는 효과가 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

  1. CaMV35S 프로모터, 스테롤-메틸-트랜스퍼레이즈 유전자 (smt), pCAMBIA1380유래 Nos 3' 터미네이터, CaMV35S polyA 및 pBR322유래 오리진을 함유하고 도 4의 개열지도를 가지는 재조합벡터 pCAMBIA1300/CaMV35/Nos-smt.
  2. 삭제
  3. 제1항의 재조합벡터로 형질전환된 식물세포 또는 조직.
  4. 제3항의 형질전환된 식물세포 또는 조직을 배양하는 것을 특징으로 하는 스테롤계 물질의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 스테롤계 물질은 베타-씨토스테롤, 캠페스테롤 및 스티그마스테롤로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 식물 스테롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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