CN102712910B - 用于生产 l-鸟氨酸或l-精氨酸的突变株以及用于生产其的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多核苷酸，该多核苷酸对于与来自谷氨酸棒状杆菌的鸟氨酸或精氨酸生物合成相关的乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶具有活性。本发明还涉及由所述多核苷酸编码的多肽，包括所述多核苷酸的重组载体，通过将所述重组载体引入到用于生产L-鸟氨酸或L-精氨酸的宿主微生物中，并且转化该重组载体而获得的转化体，以及通过培养所述转化体来生产L-鸟氨酸或L-精氨酸的方法。与内在活性相比较，本发明的转化体对于乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶的活性增加，并且因此可以以高产率从本发明的转化体中生产L-鸟氨酸或L-精氨酸。
Description
技术领域
本发明涉及生产L-鸟氨酸或L-精氨酸的棒状杆菌(Corynebacterium)变异体以及用于生产L-鸟氨酸或L-精氨酸的方法。更具体地，本发明涉及编码参与鸟氨酸或精氨酸生物合成的乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶两者的谷氨酸棒杆菌来源的多核苷酸、由该多核苷酸编码的多肽、携带该多核苷酸的重组载体、通过将该重组载体引入到生产L-精氨酸的宿主生物中而制备的转化体，以及通过培养该转化体来生产L-鸟氨酸或L-精氨酸的方法。
背景技术
L-氨基酸被用作用于人的药物中的成分并且特别地应用于制药工业和食品工业并且也被用作用于动物的营养物。在L-氨基酸中，L-鸟氨酸，在精氨酸循环上的产物之一，已知是增强肝功能的药物组分(Salvatore等人，1964)。L-精氨酸以游离形式大量地存在于植物种子和大蒜中并且在药物或食品产品中用作营养增补剂。L-精氨酸的药物应用的实例包括抗-肝毒物质、脑代谢增强剂、用于雄性不育的治疗剂、以及一般性氨基酸剂型(配方)。应用了L-精氨酸的食物中的代表是鱼糊添加剂、健康饮料添加剂以及用于患有高血压的患者的盐替代物。
当棒状杆菌(尤其是谷氨酸棒状杆菌)用于大量生产氨基酸时，发酵得以应用。由于在工业方面其高显著性，氨基酸的细菌生产方法连续地改善。就例如在发酵过程中搅拌、氧气引入、以及糖浓度的维持而言，已经实现了方法上的改进。
为了增加氨基酸的微生物生产率，选择适当的微生物是非常重要的。可以选择产生L-氨基酸的菌株，这些菌株对于抗代谢物质具有耐受性或对于负责氨基酸调节的代谢产物是营养缺陷的。例如，使用生产谷氨酸的短杆菌或棒状杆菌的变异体来生产鸟氨酸(EP0393708A3)。而且，使用生产谷氨酸的短杆菌或棒状杆菌的变异体来从碳和氮源直接生产L-精氨酸(日本专利公开号Sho.57-163487、60-83593以及62-265988)。
重组DNA技术也是一种有用的工具，可以通过它来基因上改变生产L-氨基酸的棒状杆菌株从而增强与生产L-氨基酸相关的功能。例如，可以将argCJBD(一种鸟氨酸生物合成基因)引入到并且过表达在不能合成精氨酸和脯氨酸的菌株中(Hwang等人，2008)。而且，可以对菌株进行基因重组用于使argR(一种抑制精氨酸生物合成操纵子的表达的基因)失活(美国专利申请公开号2002/0045223A1)。
通过加强感兴趣基因的生物合成可以实现氨基酸生产率的增加。存在这样的报告，即可以通过增加生物合成基因的表达来提高氨基酸生产的产率。例如，精氨酸生物合成基因argF的过表达导致精氨酸的生产增加(韩国专利申请号10-2004-107215)。
此外，披露了一种用于生产L-精氨酸的方法，其中argD2基因(Ncgl2355)或(Ncgl0990)，一种涉及谷氨酸棒状杆菌的精氨酸生物合成的乙酰鸟氨酸氨基转移酶的推定基因，被过表达用于以高产率生产L-精氨酸(韩国专利号0830289和0830290)。
与此类似，能够以高产率生产鸟氨酸或精氨酸的微生物菌株可能是由于生物合成基因的增强，尤其是生物合成酶乙酰谷氨酸合酶以及乙酰鸟氨酸酶的基因导致的。
然而，在迄今已知的棒状杆菌中尚未发现乙酰谷氨酸合酶。在本发明中，本发明检查了对负责乙酰谷氨酸合酶功能的酶进行编码的基因。已经报道了该基因的多肽具有类似于由argJ编码的乙酰鸟氨酸酶的活性。此外，已经发现该基因活性的增强增加了鸟氨酸或精氨酸的浓度。基于这些研究结果，完成了本发明。
发明内容
技术问题
因此本发明的一个目的是提供一种对具有乙酰谷氨酸合酶或乙酰鸟氨酸酶活性的多肽进行编码的新型棒状杆菌来源的多核苷酸，或由此编码的多肽。
本发明的另一个目的是提供其中该基因被过表达并且对于鸟氨酸或精氨酸具有改善的生产率的菌株。
本发明的另一个目的是提供使用该菌株以高浓度来生产鸟氨酸或精氨酸的方法。
技术方案
根据其一个方面，本发明提供了一种显示乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶活性的谷氨酸棒状杆菌来源的多肽。
在本发明中，发现基因Ncgl1469(其序列可通过国立卫生研究院(“National Institute of Health”)的数据库公开地得到)编码乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶两者。在棒状杆菌中，对乙酰谷氨酸进行编码的基因尚未被确定，然而报道了通过argJ来编码乙酰鸟氨酸酶(Sakayan等人，1996)。在本发明之前的文件均没有披露基因Ncgl1469编码这两种酶。它的氨基酸和核苷酸序列分别给出为SEQ ID NOS.1和2。
根据其另一个方面，本发明提供了携带对乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶两者进行编码的基因的载体。该载体包含乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶基因。可用作本发明载体的质粒的实例包括pZ1(Menkel等人)、pEkEx1(Eikmarms等人)、pHS2-1(Sonnen等人)、pCG4(美国专利号4,489,190)、pNG2(Serwold-Davis等人)或pEKO(Eikmanns等人)，其中优选pEKO。更优选地，该载体包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列或SEQID NO.2的核苷酸序列并且示于图1中。
根据其另外的方面，本发明提供了富含乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶的微生物、或转化体或重组细胞。在该上下文中，该菌株可以是在增强乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶之前已经能够生产L-鸟氨酸或L-精氨酸的菌株。本领域技术人员根据任何已知的转化方法可以容易地制备该转化体。如本文中使用的，术语“转化”用于指由于外源性DNA的摄取、结合、复制和表达引起的细胞的基因改变。
典型的典型转化方法是CaCl2沉淀、基于CaCl2沉淀使用DMSO(二甲亚砜)作为还原剂的Hanahan法、电穿孔、磷酸钙沉淀、原生质融合(血浆融合)、碳化硅纤维介导的转化、农杆菌介导的转化、PEG-介导的转化、硫酸葡聚糖法、阳离子脂质体法(Lipofectamine method)、以及干燥/抑制介导的转化。
例如，在本发明中，通过电穿孔将重组载体pEK-Ptrc::1469引入到宿主微生物中以产生转化体，然后利用抗菌素耐受性来分离该转化体。
表达“相对于内在活性增强”用于指与内在活性相比引入的酶乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶的细胞内活性的优越性。通过增加感兴趣基因的拷贝可以实现酶活性的增强。可以通过使用载体(例如质粒)，或通过将另外的基因整合到染色体中来增加基因拷贝的数量。调节元件(该元件对基因表达具有正面影响)的增强可以是用于增加基因拷贝数的一种途径。该调节元件可以在转录水平上增强基因活性，并且特别地可以用于增强转录信号。可替换地，例如可以通过增加mRNA的稳定性在翻译水平上实现该增强。可以使用具有高活性的感兴趣的基因。感兴趣基因的过表达可能是由培养基构成的改变引起的。可以通过增强其启动子或使用更强的启动子来增加基因的活性。可用于本发明的强启动子的一个实例是Tac-启动子(Amann等人)。通过突变可以增强基因的内在活性。可以通过常规方法使用UV光或诱变化学剂或通过基于核苷酸残基的缺失、插入和取代的基因操作方法来引入突变。可以将上述措施结合以增强酶的活性。
可以将棒形菌、棒状杆菌或短杆菌用于本发明中。适合于制备转化的谷氨酸棒状杆菌变异体的起始菌株的实例包括下面的野生型菌株：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032、醋谷氨酸棒状杆菌ATCC 15806、嗜醋酸棒状杆菌ATCC13870、嗜热棒状杆菌FERM BP-1539、黄色短杆菌ATCC14067、乳酸发酵短杆菌ATCC13869、分支短杆菌ATCC14020、以及它们的过表达L-鸟氨酸的变异体(这些变异体缺少涉及鸟氨酸生物合成途径的酶类，例如鸟氨酸氨甲酰转移酶、精氨酸抑制剂、和/或谷氨酸激酶)、以及它们的过表达L-精氨酸酶的变异体(这些变异体缺少涉及精氨酸生物合成的精氨酸抑制剂)。
根据其另外的方面，本发明提供了通过培养本发明的转染微生物来生产L-鸟氨酸或L-精氨酸的方法。为了培养该微生物，可以使用本领域熟知的适当的培养基和其他培养条件。本领域技术人员可以根据这些微生物容易地选择或改变适当的培养条件。它们可以例如以适当的方式来培养，其实例包括但不限于批量培养、连续培养以及进料分配培养。可以例如在“Biochemical Engineering”(James M.Lee，Prentice-Hall InternationalEditions，pp138-176，1991)中找到这些不同的培养方法。可以通过添加pH调节剂(例如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸以及硫酸)对培养物的pH进行调节。在微生物生长期间，可以使用消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯来防止泡沫的形成。为了在需氧条件下保持培养物，可以通过引入氧气或含氧气体(例如空气)对培养基充气。可以将培养基保持在从20℃至45℃的温度下，并且优选在从25℃至40℃的温度下。对于培养期而言，可以将它延长到这种程度，即获得了期望水平的L-精氨酸甲硫氨酸并且可以在10至160小时的数量级上。只要它是本领域已知的，可以使用任何典型的方法以从该培养物中分离L-鸟氨酸或L-精氨酸。分离方法的实例包括离心、过滤、离子交换层析以及结晶。例如，在以低速离心以去除生物质之后，使得到的上清液经受离子交换层析从而纯化感兴趣的氨基酸。
有益效果
如上所述，本发明提供了编码涉及鸟氨酸或精氨酸生物合成的乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶两者的谷氨酸棒杆菌来源的多核苷酸，由该多核苷酸编码的多肽，携带该多核苷酸的重组载体，通过将该重组载体引入到生产L-精氨酸的宿主微生物中而制备的转化体，以及通过培养该转化体来生产L-鸟氨酸或L-精氨酸的方法。显示了比内在活性更高的乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶活性，该转化体能够生产L-鸟氨酸或L-精氨酸并且因此在生物医药工业中找到有用的应用。
附图说明
图1是一个基因图，其示出了根据本发明的载体pEK-Ptrc::Ncgl1469的结构。
具体实施方式
可以通过下面实施例获得对本发明更好的理解，列出这些实施例是用于说明而不应理解为限制本发明。
实施例
实施例1：Ncgl1469克隆
使用SEQ ID NOS.3和4的寡核苷酸作为引物，将pTrc99A(Amann等人1988)用作模板，进行PCR，从而扩增用于制备过表达载体的trc启动子。分别地，使用SEQ ID NOS.5和6的寡核苷酸，将pTrc99A用作模板，通过PCR来扩增rrnB终止子。在PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(stratagene)存在下进行PCR，其中在95℃下变性30秒、在55℃下退火30秒，并且在68℃下延伸1分钟，25个循环。从NIH GenBank的数据库中获得NCgl1469的核苷酸序列。基于该序列，设计了一对引物(SEQID NOS.7和8)。使用合成的引物，在谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA上进行PCR，其中在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，并且在68℃下延伸1.5分钟，25个循环。
用XbaI对pEKO载体(大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭载体，Eikmanns等人1991)进行处理。分别地，分别用XbaI、NdeI/NedI、Xba1消化ptrc启动子和1469ORF(两者都是上面扩增的)，并且然后连接到消化的载体上用来产生重组载体。用HincII和EcoRI对此进行双重消化同时用SmaI/EcoRI对扩增的rrnB终止子部分进行处理，紧接着进行连接从而提供其中插入了启动子-1469ORF-终止子部分的重组载体。
实施例2：Ncgl1469过表达
为了检查实施例1中克隆的基因Ncgl1469的活性，首先，对于其中argJ断裂(中断，disrupt)的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的突变体存在需要。在本发明上下文中，使用pK18mobsacB整合载体(Schafer等人1994)来产生argJ-断裂菌株。使用两对引物(SEQ ID NOS.7和8；9和10)，在ATCC13032的基因组DNA上进行PCR，其中在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，并且在68℃下延伸1.5分钟，25个循环。分别用XbaI/ApaI和ApaI/XbaI处理由此获得的两个PCR产物，同时用XbaI消化pK18mobsacB载体。使这些得到的三种消化物彼此连接从而产生重组载体。
通过电穿孔，将重组载体转化到ATCC13032菌株中，然后使该菌株生长在包含25mg/L浓度卡那霉素的琼脂上从而区别其中该基因通过同源重组插入到染色体中的菌株。在搅拌下在营养培养基中(30℃，4小时)培养插入初级染色体的菌株，紧接着将该菌株涂布在包含从10-4至10-10的10倍稀释浓度的蔗糖的琼脂板上。大多数细菌死亡同时仅小部分显示为菌落。选择形成菌落的菌株作为需要的菌株，其中通过二次交换来除去插入到染色体中的载体序列。最后在针对卡那霉素敏感性对该菌株进行检查之后对该菌株进行选择并且使用SEQ ID NOS.7和10的引物通过PCR鉴别其基因结构。
实施例3：针对乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶活性测量Ncgl1469
在肉汤中培养在实施例2中最终选择的菌株。在通过离心进行收获之后，用100mM Tris/Hcl缓冲液(pH7.5)将细胞物质洗涤两次并且用玻璃珠粒进行溶解用于去除膜。
根据已知的方法(Errey和Blanchard，2005)，通过测量412nm处5-硫代-2-硝基苯甲酸盐的吸光度水平来确定乙酰谷氨酸的活性。还根据一种已知方法(Vogel和Mcleelan，1970)来确定乙酰鸟氨酸酶的活性。
通过将pEKO载体和pEK-Ptrc::1469载体引入到菌株ATCC13032中获得这些菌株，对argJΔ进行诱导以过表达感兴趣的基因，并且将这些结果总结在下面的表1中。
表1
*当对该菌株进行诱导(该菌株被构建成缺少argJ，一种已知编码乙酰鸟氨酸酶的基因)从而过表达Ncgl1469时，乙酰谷氨酸和乙酰鸟氨酸酶两者的活性都增加，这导致了这种结论，即Ncgl1469编码这两种酶。
实施例4：SJ8074-pEK-Ptrc::1469菌株的鸟氨酸生产
为了检查该菌株的鸟氨酸生产率(其中基因Ncgl1469被过表达)，使用生产鸟氨酸的菌株SJ8074(argF-argR-proBΔ，Hwang等人2008)作为母菌株。
在搅拌下将这些菌株培养在250mL挡板烧瓶中包含0.8g/L KH2PO4、10g/L(NH4)2SO4、1g/L MgSO4·7H2O、1.2g/L Na2HPO4、2mg/LMnSO4·H2O、10mg/L ZnSO4·7H2O、10g酵母提取物、20g/L CaCO3、60g/L葡萄糖以及10mM IPTG的培养基中。培养基中鸟氨酸的水平总结在下面的表2中。
表2
a.当在生产鸟氨酸的菌株SJ8074中将Ncgl1469过表达时，鸟氨酸的生产水平增加了约20％或更多。
通过将重组载体pEK-Ptrc::Ncgl1469引入到谷氨酸棒状杆菌SJ8074中而制备的转化体命名为谷氨酸棒状杆菌CA06-0020并且于2009年12月23日保藏在韩国微生物培养中心(Korean Culture Center ofMicroorganisms)(下文称为“KCCM”)，登录号为KCCM 11057P。
实施例5：ATCC21831、argRΔ-pEK-Ptrc::1469菌株的精氨酸生产
为了检查TL2过表达菌株的鸟氨酸生产率，将生产精氨酸的菌株ATCC21831修饰成缺少精氨酸抑制物argR，并且将修饰的菌株用作母菌株。
在搅拌下将这些菌株培养在250mL挡板烧瓶中包含0.8g/L KH2PO4、10g/L(NH4)2SO4、1g/L MgSO4·7H2O、1.2g/L Na2HPO4、2mg/LMnSO4·H2O、10mg/L ZnSO4·7H2O、10g酵母提取物、20g/L CaCO3、以及60g/L葡萄糖的培养基中。培养基中精氨酸的水平总结在下面的表3中。
表3
a.当在生产精氨酸的菌株ATCC21831-argRΔ中将Ncgl1469过表达时，精氨酸的生产水平增加了约10％。
通过将重组载体pEK-Ptrc::Ncgl1469引入到ATCC21831argRΔ中而制备的转化体被命名为谷氨酸棒状杆菌CA06-0021并且于2009年12月23日保藏在韩国微生物培养中心(Korean Culture Center ofMicroorganisms)(下文称为“KCCM”)中，登录号为KCCM 11058P。
虽然为了说明的目的已经披露了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员应当理解，在不偏离如在所附权利要求中披露的本发明的范围和精神的情况下，各种改变、添加以及替代是可能的。
工业实用性
如已经描述的，本发明提供了编码涉及鸟氨酸或精氨酸生物合成的乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶两者的谷氨酸棒杆菌来源的多核苷酸，由该多核苷酸编码的多肽，携带该多核苷酸的重组载体，通过将该重组载体引入到生产L-精氨酸的宿主微生物中而制备的转化体，以及通过培养该转化体来生产L-鸟氨酸或L-精氨酸的方法。显示了比内在活性更高的乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶活性，该转化体能够生产L-鸟氨酸或L-精氨酸并且因此在生物医药工业中发现有用的应用。
国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约
国际表格
致：CJ第一制糖株式会社 在该页底部由国际保藏机构确认的依据第
5005-GA NAMDAEMUN-RO，
7.1条公布的在原始情况下的收到
CHUNG-KU，SEOUL
韩国
1其中细则6.4适用，这样的日期是获得国际保藏单位的状态的日期，其中在获得国际保藏单位的状态之后在布达佩斯条约之外作出的保藏转换成在布达佩斯条约下的保藏，这样的日期是国际保藏机构收到微生物的日期。
表格BP/4
国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约
国际表格
保藏证明
依据第7.1条的规定公布
致：CJ第一制糖株式会社
5005-GA NAMDAEMUN-RO，
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表格BP/4
此件与原件内容一致。
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Claims (5)
1.一种由SEQ ID NO.1的氨基酸序列构成并且显示出乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶二者的活性的多肽用于生产L-鸟氨酸或L-精氨酸的用途。
2.一种由SEQ ID NO.2表示的编码权利要求1中所述的多肽的多核苷酸用于生产L-鸟氨酸或L-精氨酸的用途。
3.用于生产L-鸟氨酸或L-精氨酸的棒状杆菌( Corynebacterium sp.)菌株用于生产L-鸟氨酸或L-精氨酸的用途，所述棒状杆菌菌株用用于增加多核苷酸的表达的重组载体转化从而相对于内在活性增强乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶的活性，其中，所述多核苷酸由SEQ ID NO.2表示。
4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述菌株是谷氨酸棒状杆菌。
5.一种用于生产L-鸟氨酸或L-精氨酸的方法，包括：
在培养基中培养权利要求3所述的棒状杆菌菌株；以及
从培养物中回收L-鸟氨酸或L-精氨酸。
Applications Claiming Priority (3)
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