BR112019026883A2 - polipeptídeo inovador e método para produzir produto à base de ornitina com uso do mesmo - Google Patents

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Abstract

A presente revelação refere-se a um polipeptídeo inovador que tem capacidade de exportar um produto à base de ornitina, e um método para produzir um produto à base de ornitina que usa o mesmo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “POLIPEPTÍDEO INOVADOR E
MÉTODO PARA PRODUZIR PRODUTO À BASE DE ORNITINA COM USO DO MESMO” CAMPO DA TÉCNICA
[001] A presente revelação refere-se a um polipeptídeo inovador que tem capacidade de exportar um produto à base de ornitina, e um método para produzir um produto à base de ornitina que usa o mesmo.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[002] Ornitina, que é um material amplamente encontrado em plantas, animais e micro-organismos, é biossintetizada a partir de glutamato e é usada como um precursor na biossíntese de putrescina, citrulina e prolina. Ademais, ornitina desempenha um papel importante nas trajetórias para excreção de ureia produzida a partir de aminoácidos ou amônia pelo ciclo de ornitina no metabolismo in vivo de animais superiores. A ornitina é eficaz na acentuação de crescimento muscular e redução de gordura corporal e, assim, é usada como suplementos nutritivos e também como fármacos farmacêuticos para melhorar a cirrose hepática e distúrbios de função hepática. Os métodos conhecidos para produzir ornitina incluem o tratamento de caseína de leite com enzimas digestivas e uso de E. coli transformada ou um micro- organismo do gênero Corynebacterium (Patente Coreana no 10-1372635; T. Gotoh et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 33: 773 a 777, 2010).
[003] Putrescina (ou 1,4-butanodiamina) é uma matéria-prima muito importante para a produção de poliamida-4, 6 incluindo náilon-4, 6 e pode ser produzida em uma escala industrial pela hidrogenação de succinonitrila, que é produzida a partir de acrilonitrila pela adição de cianeto de hidrogênio. A trajetória de síntese dessas substâncias químicas exige produtos petroquímicos não renováveis como matérias- primas. Adicionalmente, altas temperatura e pressão, que são implicadas com o uso de sistemas catalisadores dispendiosos, assim como equipamento e etapas de preparação relativamente complexos são também necessários. Consequentemente, como uma alternativa ao processo de produção química, um processos de produzir putrescina a partir de uma fonte de carbono derivada de biomassa renovável é exigido. Recentemente, estudos foram continuamente conduzidos para uso de micro- organismos ecológicos para a produção de poliaminas de alta concentração industrialmente disponível (putrescina) (Qian ZG, et al., Biotechnol Bioeng, 104: 651 a 662, 2009; Schneider J, et al., Appl Microbiol Biotechnol, 88: 859 a 868, 2010).
[004] Entretanto, NCgl2522 foi identificado como um gene que tem uma capacidade para exportar putrescina (Patente Coreana no 2014-0115244). Entretanto, a fim de produzir putrescina em um rendimento mais alto, há ainda uma necessidade de desenvolver uma proteína com uma capacidade melhorada para exportar putrescina que pode exportar mais efetivamente putrescina de uma cepa que produz putrescina.
[005] L-arginina foi amplamente usada em medicamentos como agentes promotores de função hepática, agentes promotores de função cerebral e como ingredientes de múltiplos suplementos de aminoácido. Adicionalmente, L-arginina ganhou muito interessa na indústria alimentícia como um aditivo alimentar para tortas de peixe e bebidas saudáveis e como um substituto para sal para pacientes com hipertensão. Estudos foram continuamente conduzidos para usar micro-organismos para a produção de arginina de alta concentração industrialmente disponível, e os exemplos dos mesmos incluem um método para usar uma cepa mutante induzida a partir do micro-organismo que pertence ao gênero Brevibacterium ou Corynebacterium, que é uma cepa que produz glutamato, ou um método para usar uma cepa que produz aminoácido, cujo crescimento é melhorado através da fusão celular. Entretanto, lysE do micro-organismo que pertence ao gênero Corynebacterium que tem uma capacidade para exportar L-lisina também mostrou exportar o mesmo aminoácido básico L-arginina (Bellmann A, et al, Microbiology, 147:1.765 a 1.774, 2001). Ademais, um método para acentuar a capacidade de produção de cepas que produzem L-arginina através da acentuação do gene acima foi conhecido (Patente no U.S. 2002-196232).
REVELAÇÃO PROBLEMA DA TÉCNICA
[006] Os presentes inventores fizeram esforços extensivos para desenvolver uma variante de uma proteína de exportação com a capacidade para melhorar adicionalmente a capacidade de produção acentuando-se a capacidade para exportar um produto de ornitina, e como um resultado, foi confirmado que a capacidade para exportar um produto à base de ornitina foi acentuada quando uma modificação foi introduzida em um sítio específico da sequência de aminoácidos da proteína NCgl2522. Consequentemente, constatou-se que putrescina ou arginina, que é um produto à base de ornitina, pode ser produzida em um alto rendimento introduzindo- se a variante de proteína em cepas que produzem putrescina ou arginina, concluindo, assim, a presente invenção.
SOLUÇÃO TÉCNICA
[007] Um objetivo da presente revelação é fornecer um polipeptídeo inovador que tem uma capacidade para exportar um produto à base de ornitina.
[008] Outro objetivo da presente revelação é fornecer um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo e um vector que compreende o polinucleotídeo.
[009] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um micro-organismo que produz um produto à base de ornitina que compreende o polipeptídeo ou que tem uma atividade acentuada do mesmo.
[010] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para produzir um produto à base de ornitina que compreende: (i) cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz um produto à base de ornitina em um meio; e (ii) recuperar um produto à base de ornitina do micro-organismo ou do meio obtido acima.
EFEITOS VANTAJOSOS
[011] O polipeptídeo que tem uma capacidade para exportar um produto à base de ornitina da presente revelação mostra uma excelente atividade para exportar um produto à base de ornitina, e, assim, a capacidade para produzir um produto à base de ornitina pode ser adicionalmente melhorada quando tal atividade é introduzida em um micro-organismo que produz um produto à base de ornitina.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS
[012] A presente revelação será descrita em detalhes a seguir. Entretanto, as explicações e modalidades reveladas na presente revelação podem ser aplicadas a outras explicações e modalidades, respectivamente. Isto é, todas as combinações de vários elementos revelados no presente documento pertencem ao escopo da presente revelação. Adicionalmente, o escopo da presente revelação não deve ser limitado pelas descrições específicas descritas doravante.
[013] A fim de alcançar os objetivos acima, um aspecto da presente revelação fornece um polipeptídeo inovador que tem uma capacidade para exportar um produto à base de ornitina, em que o resíduo de glicina na posição 77 da terminação N da sequência de aminoácidos de uma proteína de exportação de produto à base de ornitina é substituído por outros aminoácidos.
[014] Conforme usado no presente documento, a proteína de exportação de produto à base de ornitina refere-se a uma proteína que desempenha um papel na exportação extracelular dos produtos biossintetizados a partir de ornitina como um precursor e se refere especificamente a uma proteína que desempenha um papel na exportação extracelular de putrescina ou arginina. Mais especificamente, a mesma pode ser a proteína NCgl2522 revelada na Publicação de Pedido de Patente Coreana no 2014-0115244. A proteína NCgl2522 pode, por exemplo, consistir em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, mas qualquer sequência que tenha atividade idêntica à proteína pode ser incluída sem limitação, e as informações de sequência da mesma podem ser obtidas a partir do GenBank do NCBI, um banco de dados conhecido.
[015] O polipeptídeo inovador que tem a capacidade de exportar um produto à base de ornitina da presente revelação tem um recurso em que o resíduo de glicina na posição 77 da terminação N da sequência de aminoácidos de uma proteína de exportação de produto à base de ornitina é substituído por outros aminoácidos e,
assim, tem uma capacidade melhorada para exportar um produto à base de ornitina em comparação a um polipeptídeo não modificado, especificamente, um polipeptídeo que tem um resíduo de glicina na posição 77. O polipeptídeo que tem uma capacidade para exportar um produto à base de ornitina podem ser, por exemplo, aqueles em que a glicina na posição 77 na sequência de aminoácidos de uma proteína de exportação de produto à base de ornitina é substituída por alanina ou arginina. Especificamente, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre a SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 6, ou uma sequência de aminoácidos que tem uma homologia ou identidade com a mesma de 70% ou mais, 80% ou mais, especificamente 85% ou mais, mais especificamente 90% ou mais, ainda mais especificamente 95% ou mais, e ainda mais especificamente 99% ou mais, porém, não é limitada a isso, contanto que a mesma tenha a capacidade para exportar um produto à base de ornitina pela substituição de glicina na posição 77 por outro aminoácido. Adicionalmente, deve ser interpretado que, como uma sequência de aminoácidos que tem tal homologia ou identidade, uma sequência de aminoácidos com deleção, modificação, substituição ou adição de uma parte da sequência também falha dentro do escopo da presente revelação contanto que a sequência de aminoácidos tenha uma atividade biológica substancialmente idêntica ou correspondendo ao polipeptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 6.
[016] Conforme usado no presente documento, o termo “produto à base de ornitina” refere-se a um material que pode ser biossintetizado a partir de ornitina como um precursor. Especificamente, os exemplos dos materiais que podem ser produzidos pelo ciclo de ornitina incluem putrescina, citrulina, prolina e arginina, mas o material não se limita a isso, contanto que o mesmo possa ser biossintetizado a partir de ornitina como um precursor. Por exemplo, o produto à base de ornitina pode ser putrescina e arginina. Adicionalmente, qualquer material, que pode ser sintetizado a partir de ornitina como um precursor e exportado pelo polipeptídeo inovador que tem uma capacidade para exportar um produto à base de ornitina da presente revelação,
pode ser incluído sem limitação.
[017] Outro aspecto da presente revelação fornece um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo que tem uma capacidade para exportar um produto à base de ornitina.
[018] O polinucleotídeo pode incluir um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 6, ou um polipeptídeo que tem uma homologia ou identidade com a mesma de 70% ou mais, 80% ou mais, especificamente 85% ou mais, mais especificamente 90% ou mais, ainda mais especificamente 95% ou mais, e ainda mais especificamente 99% ou mais, mas não é limitado a isso, contanto que o mesmo tenha uma atividade similar ao polipeptídeo que tem uma capacidade para exportar um produto à base de ornitina. Adicionalmente, fica aparente que, devido à degeneração de códon, polinucleotídeos que podem ser traduzidos na proteína que consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 6 ou proteínas que têm uma homologia ou identidade com a mesma podem também ser incluídos. Alternativamente, uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência de genes conhecida, por exemplo, qualquer sequência que hibridiza com uma sequência complementar a toda ou parte da sequência de nucleotídeos sob condições estringentes para codificar uma proteína que tem a atividade da proteína que consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 6 pode ser incluída sem limitação.
[019] As “condições estringentes” referem-se a condições sob as quais hibridização específica entre polinucleotídeos é permitida. Tais condições são especificamente reveladas na literatura (por exemplo, J. Sambrook et al.). Por exemplo, as condições estringentes podem incluir condições sob as quais os genes que têm uma alta homologia ou identidade, uma homologia ou identidade de 80% ou mais, 85% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, ainda mais especificamente 97% ou mais e ainda mais especificamente 99% ou mais hibridizam entre si, ao mesmo tempo que os genes que têm uma homologia ou identidade menor do que a homologia ou identidade acima não hibridizam entre si; ou podem incluir condições de lavagens comuns de hibridização Southern, isto é, lavando uma vez, especificamente duas ou três vezes, a uma concentração de sal e uma temperatura correspondendo a 60 °C, 1×SSC e 0,1% de SDS; especificamente 60 °C, 0,1×SSC e 0,1% de SDS; e mais especificamente 68 °C, 0,1×SSC e 0,1% de SDS.
[020] A hibridação exige que dois ácidos nucleicos tenham sequências complementares, embora pareamentos incorretos entre bases sejam possíveis dependendo da estringência da hibridação. O termo “complementar” é usado para descrever a relação entre bases de nucleotídeo que podem hibridizar entre si. Por exemplo, em relação ao DNA, adenosina é complementar à timina, e citosina é complementar à guanina. Portanto, a presente revelação pode também incluir um fragmento de ácido nucleico isolado complementar à sequência inteira assim como uma sequência de ácidos nucleicos substancialmente similar à mesma.
[021] Especificamente, o polinucleotídeo que tem homologia pode ser detectado com o uso de condições de hibridização incluindo uma etapa de hibridização a um valor de Tm de 55 °C sob as condições descritas acima. Adicionalmente, o valor de Tm pode ser 60 °C, 63 °C ou 65 °C, porém sem limitação, e pode ser apropriadamente controlado por aqueles versados na técnica dependendo do propósito do mesmo.
[022] A estringência apropriada para hibridizar polinucleotídeos depende do comprimento e do grau de complementaridade dos polinucleotídeos, e essas variáveis são conhecidas na técnica (Sambrook et al., supra, 9.50 a 9.51, 11.7 a 11.8).
[023] Conforme usado no presente documento, o termo “homologia” se refere ao grau de correspondência entre duas dadas sequências de aminoácidos ou sequências de nucleotídeos e pode ser expressa como uma percentagem. Na presente revelação, uma sequência homóloga que tem uma atividade que é idêntica ou similar a esta da sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos dada pode ser indicada em termos de “% de homologia”.
[024] Conforme usado no presente documento, o termo “identidade” refere-se ao grau de relevância entre duas sequências de aminoácidos ou sequências de nucleotídeos dadas. Em alguns casos, a identidade é determinada pela correspondência entre cadeias de tais sequências. Por exemplo, a identidade pode ser confirmada com o uso de software padrão para calcular parâmetros, tais como pontuação, identidade e similaridade, especificamente, BLAST 2.0, ou comparando- se sequências por meio de experimentos de hibridização southern sob condições estringentes definidas, e as condições de hibridização apropriadas estão dentro da habilidade da técnica e podem ser determinadas por um método bem conhecido por aqueles versados na técnica (por exemplo, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque).
[025] Os termos “homologia” e “identidade” são frequentemente usados de modo intercambiável entre si.
[026] A homologia ou identidade de sequência de polinucleotídeos ou polipeptídeos conservados pode ser determinada por algoritmos de alinhamento padrão e pode ser usada juntamente com penalidade por lacuna padrão estabelecida pelo programa que é usado. Substancialmente, espera-se que polinucleotídeos ou polipeptídeos homólogos ou idênticos hibridizem a todo ou pelo menos cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80% ou cerca de 90% do comprimento inteiro dos polinucleotídeos ou polipeptídeos-alvo sob condições de estringência moderada ou alta. Os polinucleotídeos que contêm códons degenerados em vez de códons são também considerados nos polinucleotídeos de hibridização.
[027] A possibilidade de quaisquer duas sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos terem uma homologia ou identidade de pelo menos 50%, 55%, 60%, 65% 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% uma com a outra pode ser determinada por um algoritmo de computador, tal como o programa “FASTA” (por exemplo, Pearson et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444) com o uso de parâmetros padrão. Alternativamente, pode ser determinado pelo algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48. 443 a 453), que é realizado com o uso do programa Needleman do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet.
16. 276 a 277) (de preferência, versão 5.0.0 ou versões posteriores) (pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL., J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guia para Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, e [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Por exemplo, a homologia ou identidade pode ser determinada com o uso de BLAST ou ClustalW da National Center for Biotechnology Information (NCBI).
[028] A homologia ou identidade de polinucleotídeos ou polipeptídeos pode ser determinada comparando-se as informações de sequência com o uso, por exemplo, do programa de computador GAP, tal como Needleman et al., (1970), J Mol Biol. 48. 443, conforme revelado em Smith e Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Em resumo, o programa GAP define a homologia ou identidade como o valor obtido dividindo-se o número de símbolos alinhados de modo similar (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos) pelo número total dos símbolos na menor das duas sequências. Parâmetros padrão para o programa GAP podem incluir (1) uma matriz de comparação binária (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et al., (1986), Nucl. Acids Res. 14:6745, conforme revelado em Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, páginas 353 a 358, 1979; (2) uma penalidade de 3,0 para cada lacuna e uma penalidade adicional de 0,10 adicional para cada símbolo em cada lacuna (ou um penalidade de abertura de lacuna de 10 e uma penalidade de extensão de lacuna de 0,5); e (3) sem penalidade para lacunas de extremidade. Consequentemente, conforme usado no presente documento, o termo “homologia” ou “identidade” refere-se à comparação entre polipeptídeos ou polinucleotídeos.
[029] Ainda outro aspecto da presente invenção fornece um vetor que compreende o polinucleotídeo.
[030] Conforme usado no presente documento, o termo “vector” refere-se a um construto de DNA contendo a sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo-alvo, que é ligado de maneira funcional a uma sequência regulatória adequada de modo que o polipeptídeo-alvo possa ser expresso em um hospedeiro apropriado. A sequência regulatória pode incluir um promotor com capacidade para iniciar a transcrição, qualquer sequência de operador para o controle da transcrição, uma sequência que codifica um domínio de ligação de ribossomo de mRNA apropriado e uma sequência que regula o término da transcrição e da tradução. Após ser transformado em uma célula hospedeira adequada, o vetor pode ser replicado ou funcionar independentemente do genoma hospedeiro e pode ser integrado ao próprio genoma hospedeiro.
[031] O vetor usado na presente revelação não é particularmente limitado contanto que o mesmo possa ser replicado em uma célula hospedeira, e qualquer vetor conhecido na técnica pode ser usado. Os exemplos de vetores convencionalmente usados podem incluir plasmídeos naturais ou recombinantes, cosmídeos, vírus e bacteriófagos. Por exemplo, como um vetor de fago ou vetor de cosmídeo, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etc. podem ser usados, e como um vetor de plasmídeo, aqueles baseados em pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET, etc. podem ser usados. O vetor que pode ser usado na presente revelação não é particularmente limitado e um vetor de expressão conhecido pode ser usado. Especificamente, os vetores pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC etc. podem ser usados.
[032] Em uma modalidade, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo-alvo no cromossomo pode ser substituído por um polinucleotídeo modificado através de um vetor para inserção de cromossomo intracelular. A inserção do polinucleotídeo no cromossomo pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, recombinação homóloga, porém, não é limitado a isso.
[033] Conforme usado no presente documento, o termo “transformação” refere-
se a um processo de introduzir um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo-alvo em uma célula hospedeira, permitindo, assim, a expressão do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo na célula hospedeira. Contanto que o polinucleotídeo transformado possa ser expresso na célula hospedeira, não importa se o mesmo é inserido no cromossomo de uma célula hospedeira e localizado no mesmo ou localizado fora do cromossomo, e ambos os casos podem ser incluídos. Por exemplo, a transformação pode ser executada por meio de eletroporação, fosfato de cálcio (CaPO4), precipitação, precipitação de cloreto de cálcio (CaCl2), microinjeção, um técnica de polietilenoglicol (PEG), uma técnica de DEAE-dextrano, uma técnica de lipossoma catiônico, e uma técnica de acetato de lítio-DMSO etc., mas o método não é limitado aos mesmos. Adicionalmente, o polinucleotídeo inclui DNA e RNA que codificam um polipeptídeo-alvo. O polinucleotídeo pode ser introduzido em qualquer forma contanto que possa ser introduzido em uma célula hospedeira e expresso na mesma. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, que é uma construção de gene que inclui todos os elementos necessários para autoexpressão. O cassete de expressão pode incluir convencionalmente um promotor ligado de maneira funcional ao polinucleotídeo, um terminador, um domínio de ligação de ribossomo e um códon de parada. O cassete de expressão pode estar na forma de um vetor de expressão com capacidade para autorreplicação. Adicionalmente, o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira dessa forma e ligado de modo operacional a uma sequência necessária para a sua expressão na célula hospedeira, mas sem limitação a isso.
[034] Ademais, conforme usado acima, o termo “ligado de maneira funcional” refere-se a uma ligação funcional entre uma sequência de genes acima e uma sequência promotora que inicia e media a transcrição do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo-alvo da presente revelação.
[035] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um micro-organismo que produz um produto à base de ornitina que compreende o polipeptídeo que tem uma capacidade para exportar um produto à base de ornitina ou que tem atividade acentuada do mesmo.
[036] Especificamente, a presente revelação fornece um micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou arginina, incluindo o polipeptídeo que tem uma capacidade para exportar um produto à base de ornitina ou que tem uma atividade acentuada do mesmo.
[037] Conforme usado no presente documento, o termo “micro-organismo” inclui todos os micro-organismos do tipo selvagem, ou micro-organismos geneticamente modificados de modo natural ou artificial, e o mesmo pode ser um micro-organismo em que um mecanismo particular é enfraquecido ou acentuado devido à inserção de um gene estranho ou à acentuação ou enfraquecimento da atividade de um gene endógeno.
[038] Conforme usado no presente documento, o termo “micro-organismo do gênero Corynebacterium” pode ser especificamente Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, etc., porém, não é limitado a isso. Mais especificamente, os micro-organismos do gênero Corynebacterium na presente revelação pode ser Corynebacterium glutamicum, o crescimento e a sobrevivência celular dos quais são dificilmente afetados mesmo quando expostos a uma alta concentração de putrescina ou arginina.
[039] Conforme usado no presente documento, o termo “micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz um produto à base de ornitina” refere-se a um micro-organismo do gênero Corynebacterium que tem uma capacidade de produzir um produto à base de ornitina naturalmente ou por meio de modificação. O micro- organismo do gênero Corinebacterium que produz um produto à base de ornitina podem ser, porém sem limitação particular, aqueles modificados de modo que a atividade de pelo menos uma selecionada a partir do grupo que consiste em, por exemplo, acetilglutamato sintase, que converte glutamato em N-acetilglutamato, ou ornitina acetiltransferase (argJ), que converte N-acetilornitina em ornitina,
acetilglutamato quinase (ArgB), que converte N-acetilglutamato em fosfato de N- acetilglutamila, acetil-gama-glutamil-fosfato redutase (ArgC), que converte fosfato de N-acetilglutamila em N-acetilglutamato semialdeído, e acetilornitina aminotransferase (ArgD), que converte N-acetilglutamato semialdeído em N-acetilornitina, seja aumentada em comparação à atividade endógena da mesma, a fim de acentuar a trajetória biossintética de glutamato para ornitina, melhorando, assim, a produtividade de ornitina.
[040] Conforme usado no presente documento, o termo “micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou arginina” refere-se a um micro- organismo do gênero Corynebacterium que tem uma capacidade para produzir putrescina ou arginina naturalmente ou por meio de modificação. O micro-organismo do gênero Corynebacterium não produz putrescina, pode produzir arginina, mas a produtividade de arginina é notavelmente baixa. Portanto, conforme usado no presente documento, o micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina ou arginina refere-se à própria cepa nativa ou a um micro-organismo do gênero Corynebacterium no qual um gene estranho envolvido o mecanismo de produção de putrescina ou arginina é inserido, ou a atividade de um gene endógeno é acentuada ou enfraquecida, de modo a se ter uma produtividade melhorada de putrescina ou arginina.
[041] Adicionalmente, o micro-organismo que produz putrescina podem ser aqueles adicionalmente modificados de modo que a atividade de pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em ornitina carbamoiltransferase (ArgF), que está envolvida na síntese de arginina a partir de ornitina, uma proteína envolvida na exportação de glutamato, e acetiltransferase, que acetila a putrescina, seja enfraquecida em comparação à atividade endógena dos mesmos e/ou podem ser aqueles modificados de modo que uma atividade de ornitina decarboxilase (ODC) seja introduzida.
[042] Ademais, o micro-organismo que produz arginina podem ser aqueles modificados de modo que a atividade de pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em ornitina carbamoiltransfrase, (ArgF), que está envolvida na síntese de arginina a partir de ornitina, argininossuccinato sintase (argG), argininossuccinato liase (argH), aspartato amônia liase e aspartato aminotransferase seja acentuada, em comparação à atividade endógena dos mesmos.
[043] Conforme usado no presente documento, o termo “acentuação” da atividade de uma proteína significa que a atividade de uma proteína é introduzida, ou a atividade é acentuada em comparação à atividade endógena da mesma. A “introdução” da atividade significa que a atividade de um polipeptídeo específico que o micro-organismo não tinha originalmente é natural ou artificialmente expressa.
[044] Conforme usado no presente documento, o termo “aumento” na atividade de uma proteína em comparação à atividade endógena da mesma significa que a atividade de uma proteína é melhorada em comparação à atividade endógena de uma proteína possuída por um micro-organismo ou à atividade antes da transformação. A “atividade endógena” refere-se à atividade de uma proteína específica originalmente possuída pela cepa progenitora ou um micro-organismo não modificado antes da transformação do mesmo, quando os traços do micro-organismo são alterados através de modificação genética devido a fatores naturais ou artificiais, e a mesma pode ser usada de maneira intercambiável com a atividade antes da transformação.
[045] Especificamente, a acentuação da atividade na presente revelação pode ser realizada pelos seguintes métodos: 1) um método para aumentar o número de cópias do polinucleotídeo que codifica a proteína; 2) um método para modificar uma sequência regulatória de expressão de modo que a expressão do polinucleotídeo seja aumentada; 3) um método para modificar a sequência de polinucleotídeo em um cromossomo de modo que a atividade da proteína seja acentuada; 4) um método para introduzir um polinucleotídeo estranho que exibe a atividade da proteína ou um polinucleotídeo modificado em que os códons do polinucleotídeo acima foram otimizados; e
5) um método para modificação para acentuar a atividade por uma combinação dos métodos acima, mas o método não é limitado a isso.
[046] O aumento do número de cópias do polinucleotídeo no método 1) acima pode ser realizado na forma em que o polinucleotídeo é ligado de maneira funcional a um vetor ou inserindo-se em um cromossomo de uma célula hospedeira, mas não é particularmente limitado a isso. Especificamente, o mesmo pode ser realizado ligando de maneira funcional o polinucleotídeo que codifica a proteína da presente revelação a um vetor que pode replicar e funcionar independentemente da célula hospedeira e introduzindo o mesmo na célula hospedeira. Alternativamente, o mesmo pode ser realizado por um método para aumentar o número de cópias do polinucleotídeo no cromossomo da célula hospedeira ligando-se de maneira funcional o polinucleotídeo a um vetor que pode inserir o polinucleotídeo no cromossomo da célula hospedeira e introduzindo o mesmo na célula hospedeira.
[047] A seguir, a modificação de uma sequência regulatória de expressão de modo que a expressão do polinucleotídeo seja aumentada no método 2) pode ser realizada induzindo-se uma modificação na sequência através de deleção, inserção ou substituição não conservativa ou conservativa de uma sequência de ácidos nucleicos ou uma combinação das mesmas de modo a acentuar adicionalmente a atividade da sequência regulatória de expressão ou substituindo-se por uma sequência de ácidos nucleicos que tem uma atividade mais forte, porém sem limitação particular. Adicionalmente, a sequência regulatória de expressão pode incluir um promotor, uma sequência operadora, uma sequência que codifica um domínio de ligação de ribossomo, uma sequência que regula a terminação de transcrição e tradução etc., porém, sem limitação particular a isso.
[048] Um promotor heterólogo forte pode ser ligado à região a montante da unidade de expressão do polinucleotídeo em vez do promotor original. Os exemplos do promotor forte incluem o promotor CJ7 (Patente Coreana no 0620092 e Publicação Internacional no WO2006/065095), promotor lysCP1 (Publicação Internacional no WO2009/096689), promotor EF-Tu, promotor groEL, promotor aceA ou aceB etc., mas o promotor forte não se limita aos mesmos. Ademais, a modificação da sequência de polinucleotídeos em um cromossomo no método 3) pode ser realizada induzindo-se uma modificação na sequência regulatória de expressão através de deleção, inserção ou substituição não conservativa ou conservativa de uma sequência de ácidos nucleicos ou uma combinação das mesmas de modo a acentuar adicionalmente a atividade da sequência de polinucleotídeos ou substituindo-se a sequência de polinucleotídeos por uma sequência de polinucleotídeos modificada para ter uma atividade mais forte, porém sem limitação particular.
[049] Adicionalmente, a introdução de uma sequência de polinucleotídeos estranha no método 4) pode ser realizada introduzindo-se em uma célula hospedeira um polinucleotídeo estranho que codifica uma proteína que exibe uma atividade idêntica ou similar a esta da proteína acima ou um polinucleotídeo modificado em que os códons do polinucleotídeo estranho foram otimizados. O polinucleotídeo estranho pode ser usado sem limitação por sua origem ou sequência contanto que o mesmo exiba uma atividade idêntica ou similar a esta da proteína. Ademais, o polinucleotídeo estranho pode ser introduzido em uma célula hospedeira após a otimização de seus códons de modo a alcançar a transcrição e tradução otimizada na célula hospedeira. A introdução pode ser realizada por aqueles versados na técnica selecionando-se um método de transformação adequado conhecido na técnica, e uma proteína pode ser produzida na medida em que os polinucleotídeos introduzidos são expressos na célula hospedeira, aumentando, assim, sua atividade.
[050] Finalmente, o método para modificação para acentuar a atividade por uma combinação dos métodos 1) a 4) no método 5) pode ser realizado por uma aplicação combinada de pelo menos um dos seguintes métodos: aumentar o número de cópias do polinucleotídeo que codifica a proteína, modificar uma sequência regulatória de expressão de modo que a expressão do polinucleotídeo seja aumentada, modificar a sequência de polinucleotídeos em um cromossomo e modificar um polinucleotídeo estranho que exibe a atividade da proteína ou um polinucleotídeo modificado com otimização de códon da mesma.
[051] Conforme usado no presente documento, o termo “enfraquecimento” da atividade de uma proteína inclui a redução na atividade ou não ter nenhuma atividade, em comparação à atividade endógena da mesma.
[052] O enfraquecimento da atividade de uma proteína pode ser alcançado por vários métodos bem conhecidos na técnica. Os exemplos dos métodos incluem um método para deletar uma parte ou a totalidade de um gene que codifica a proteína em um cromossomo, incluindo o caso em que a atividade da proteína é eliminada; um método para substituir o gene que codifica a proteína no cromossomo com um gene com mutação de modo a reduzir a atividade enzimática; um método para produzir uma modificação em uma sequência regulatória de expressão do gene que codifica a proteína no cromossomo; um método para substituir uma sequência regulatória de expressão do gene que codifica a proteína por uma sequência que tem uma atividade fraca ou nenhuma atividade (por exemplo, m método para substituir o promotor de gene por um promotor mais fraco do que o promotor endógeno); um método para deletar uma parte ou a totalidade de um gene que codifica a proteína em um cromossomo; um método para introduzir um oligonucleotídeo antissenso que se liga complementarmente ao transcrito do gene no cromossomo para inibir a tradução do mRNA na proteína (por exemplo, RNA antissenso); um método para adicionar artificialmente uma sequência complementar a montante da sequência SD do gene que codifica a enzima para formar uma estrutura secundária, tornando, assim, a adesão do ribossomo impossível; e um método de engenharia de transcrição reversa (RTE), que adiciona um promotor à extremidade 3′ do quadro de leitura aberto (ORF) da sequência correspondente de modo a ser transcrito de modo reverso, ou uma combinação dos mesmos, porém sem limitação particular.
[053] Especificamente, o método para deletar uma parte ou a totalidade de um gene que codifica a proteína pode ser realizado substituindo-se o polinucleotídeo que codifica a proteína-alvo endógena dentro do cromossomo com um polinucleotídeo que tem uma sequência de ácidos nucleicos parcialmente deletada ou um gene marcador através de um vetor para inserção cromossômica em micro-organismos. Em uma modalidade, um método para deletar um gene por recombinação homóloga pode ser usado, porém sem limitação. Adicionalmente, conforme usado no presente documento, o termo “parte”, embora possa variar dependendo dos tipos de polinucleotídeo e possa ser apropriadamente selecionado por aqueles versados na técnica, pode se referir especificamente a 1 a 300 nucleotídeos, mais especificamente 1 a 100 nucleotídeos e ainda mais especificamente 1 a 50 nucleotídeos, mas não é particularmente limitado a isso.
[054] Adicionalmente, o método para modificar uma sequência regulatória de expressão pode ser realizado induzindo-se uma modificação na sequência regulatória de expressão através de deleção, inserção, substituição conservativa ou não conservativa ou uma combinação das mesmas de modo a enfraquecer adicionalmente a atividade da sequência regulatória de expressão; ou substituindo-se a sequência por uma sequência de ácidos nucleicos que tem uma atividade mais fraca. A sequência regulatória de expressão pode incluir um promotor, uma sequência operadora, uma sequência que codifica um domínio de ligação de ribossomo e uma sequência que regula a terminação de transcrição e tradução, porém, sem limitação a isso.
[055] Ademais, o método para modificar a sequência de genes no cromossomo pode ser realizado induzindo-se uma modificação na sequência de genes através da deleção, inserção, substituição conservativa ou não conservativa ou uma combinação das mesmas de modo a enfraquecer adicionalmente a atividade da proteína; ou substituindo-se a sequência por uma sequência de genes modificada para ter uma atividade mais fraca ou uma sequência de genes modificada para não ter nenhuma atividade, porém sem limitação.
[056] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método para produzir um produto à base de ornitina que compreende: (i) cultivar um micro-organismo que produz um produto à base de ornitina que compreende o polipeptídeo que tem uma capacidade para exportar um produto à base de ornitina ou que tem uma atividade acentuada do mesmo em um meio; e
(ii) recuperar o produto à base de ornitina do micro-organismo ou do meio obtido acima.
[057] Em uma modalidade específica, a presente revelação fornece um método para produzir putrescina que compreende: (i) cultivar um micro-organismo que produz putrescina que compreende o polipeptídeo que tem uma capacidade para exportar um produto à base de ornitina ou que tem uma atividade acentuada do mesmo em um meio; e (ii) recuperar putrescina do micro-organismo ou do meio obtido acima.
[058] Em outra modalidade específica, a presente revelação fornece um método para produzir L-arginina que compreende: (i) cultivar um micro-organismo que produz L-arginina que compreende o polipeptídeo que tem uma capacidade para exportar um produto à base de ornitina ou que tem uma atividade acentuada do mesmo em um meio; e (ii) recuperar L-arginina do micro-organismo ou do meio obtido acima.
[059] O polipeptídeo que tem uma capacidade para exportar um produto à base de ornitina e/ou o micro-organismo que produz um produto à base de ornitina são conforme descrito acima.
[060] No método acima, o cultivo do micro-organismo pode ser realizado por um método de cultura em batelada conhecido, método de cultura contínuo, método de cultura em batelada alimentada, etc., porém sem limitação particular. Em particular, em relação às condições de cultura, o pH da cultura pode ser ajustada a um pH adequado (por exemplo, pH 5 a 9, especificamente pH 6 a 8 e mais especificamente pH 6,8) com o uso de um composto básico (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia) ou um composto ácido (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico). Adicionalmente, oxigênio ou mistura de gás contendo oxigênio pode ser injetada na cultura a fim de manter um estado aeróbico. A temperatura de cultura pode ser mantida a 20 °C a 45 °C, especificamente a 25 °C a 40 °C, e o cultivo pode ser realizado por cerca de 10 horas a 160 horas, mas a cultura não se limita ao anterior. O produto à base de ornitina produzido pela cultura pode ser secretado no meio ou pode permanecer nas células.
[061] Adicionalmente, como uma fonte de carbono para o meio de cultura a ser usado, açúcares e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e celulose), óleos e gorduras (por exemplo, óleo de soja, semente de girassol óleo, óleo de amendoim e óleo de coco), ácidos graxos (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico), álcoois (por exemplo, glicerol e etanol), ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético) etc. podem ser usados sozinhos ou em combinação, porém sem limitação. Como uma fonte de nitrogênio, compostos orgânicos contendo nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, molho de carne, extrato de malte, licor de maceração de milho, farinha de soja e ureia) ou compostos inorgânicos (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio) etc. podem ser usados sozinhos ou em combinação, porém sem limitação. Como uma fonte de fósforo, di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato de dipotássio, sais contendo sódio correspondentes dos mesmos etc. podem ser usados sozinhos ou em combinação, porém sem limitação. Adicionalmente, materiais de promoção de crescimento essenciais, tais como outros sais metálicos (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos, vitaminas, etc. podem estar contidos no meio.
[062] No método para recuperar o produto à base de ornitina produzido na etapa de cultivo da presente revelação, os produtos desejados podem ser coletados a partir do meio ou micro-organismo cultivado com o uso de um método apropriado conhecido na técnica. Por exemplo, centrifugação, filtração, cromatografia de troca de ânion, cristalização, HPLC, etc. podem ser usadas, porém sem limitação. Adicionalmente, o método para recuperar o produto à base de ornitina pode incluir adicionalmente um processo de purificação com o uso de um método apropriado conhecido na técnica.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS
[063] A presente revelação será descrita em mais detalhes através das modalidades exemplificativas. Entretanto, essas modalidades exemplificativas são dadas para propósitos ilustrativos apenas e não se destinam a limitar o escopo da presente revelação. EXEMPLO 1. CONFIRMAÇÃO DA CAPACIDADE PARA EXPORTAR
ARGININA DA PROTEÍNA QUE EXPORTA PUTRESCINA
[064] Constatou-se que NCgl2522, um gene de Corynebacterium glutamicum, tem uma capacidade para exportar putrescina (Publicação de Pedido de Patente Coreana no 2014-0115244). Para esta finalidade, o experimento a seguir foi conduzido para confirmar se NCgl2522 pode também exportar citrulina, prolina e arginina, que podem ser biossintetizadas a partir de ornitina como um material de partida, adicionalmente à putrescina.
[065] Especificamente, foi confirmado se NCgl2522 tem uma capacidade para exportar arginina como um exemplo representativo, dentre os produtos que podem ser biossintetizados a partir de ornitina como um material de partida. <1-1> CONSTRUÇÃO DE VETORES BASEADOS EM CEPA QUE PRODUZ ARGININA E CEPAS QUE TÊM ATIVIDADE ACENTUADA DE NCGL2522
[066] A fim de acentuar a atividade de NCgl2522 na cepa ATCC21831 do tipo selvagem e KCCM10741P (Patente Coreana no 10-0791659) que tem uma capacidade de produção de arginina, o promotor CJ7 (WO 2006/065095 A) foi introduzido a montante do códon de iniciação de NCgl2522 dentro do cromossomo.
[067] Um fragmento recombinante homólogo, que inclui o promotor CJ7 revelado no documento no WO 2006/065095 A e em que ambas as extremidades do promotor têm a sequência original de NCgl2522 no cromossomo, foi obtido. Especificamente, a região de extremidade 5′ do promotor CJ7 foi obtida realizando-se PCR com o uso de um par de iniciadores das SEQ ID NOS: 17 e 18 mostradas na Tabela 1, com base no DNA genômico de ATCC21831 ou KCCM10741P de Corynebacterium glutamicum como um modelo. Em particular, a reação PCR foi realizada repetindo-se 30 ciclos de desnaturação a 94 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 30 segundos. Adicionalmente, a região de promotor CJ7 foi obtida realizando-se PCR sob as mesmas condições com o uso de um par de iniciadores das SEQ ID NOS: 19 e 20 mostradas na Tabela 1, e a região de extremidade 3′ do promotor CJ7 foi obtida realizando-se PCR com o uso de um par de iniciadores das SEQ ID NOS: 20 e 21 mostradas na Tabela 1, sob as mesmas condições, com base no DNA genômico de ATCC21831 ou KCCM10741P de Corynebacterium glutamicum como um modelo. Os iniciadores usados na substituição de promotores são mostrados na Tabela 1 abaixo. TABELA 1 Iniciadores Sequência (5' -> 3') NCgl2522; L5 TGCAGGTCGACTCTAGA SEQ ID NO: 17) GTTCTGCGTAGCTGTGTGCC NCgl2522; L3 GATGTTTCT GGATCGTAACTGTAACGAATGG SEQ ID NO: 18) CJ7-F (SEQ ID NO: 19) AGAAACATCCCAGCGCTACTAATA CJ7-R (SEQ ID NO: 20) AGTGTTTCCTTTCGTTGGGTACG NCgl2522-R5 (SEQ ID NO: CAACGAAAGGAAACACT 21) ATGATTTCAGAAACTTTGCAGGCG NCgl2522-R3 (SEQ ID NO: TCGGTACCCGGGGATCC 22) CACAAAAAGCGTAGCGATCAACG
[068] Cada um dos produtos de PCR obtidos acima foi submetido à clonagem de fusão no vetor pDZ tratado com BamHI e XbaI. A clonagem de fusão foi realizada a 50 °C por 10 minutos com o uso do Kit de Clonagem In-Fusion® HD (Clontech Laboratories, Inc.), e os plasmídeos assim obtidos foram nomeados pDZ-P(CJ7)- NCgl2522-21831 e pDZ-P(CJ7)-NCgl2522-10741P, respectivamente.
[069] Os plasmídeos pDZ-P(CJ7)-NCgl2522-21831 e pDZ-P(CJ7)-NCgl2522- 10741P preparados acima foram respectivamente introduzidos em ATCC21831 e KCCM10741P, que são cepas que produzem arginina, meio de eletroporação para obter transformantes, e os transformantes assim obtidos foram colocados em placas em meio de placa BHIS (37 g/l de infusão de cérebro e coração, 91 g/l de sorbitol e 2% de ágar) contendo canamicina (25 μg/ml) e X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolin-D- galactosídeo) e cultivados para formar colônias. Dentre as colônias assim formadas, as cepas introduzidas com o plasmídeo pDZ-P(CJ7)-NCgl2522-21831 ou pDZ- P(CJ7)-NCgl2522-10741P foram selecionadas.
[070] As cepas selecionadas foram cultivadas com agitação (30 °C, 8 horas) em meio CM (10 g/l de glicose, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de extrato de carne bovina, 2,5 g/l de NaCl e 2 g/l de ureia a pH 6,8) e sequencialmente diluídas de 10−4 a 10−10, colocadas em placas em meio sólido contendo X-gal e cultivadas para formar colônias. Dentre as colônias assim formadas, colônias brancas que apareceram a uma taxa relativamente baixa foram selecionadas, selecionando, assim, finalmente as cepas, em que o promotor do gene NCgl2522 foi substituído pelo promotor CJ7 por um cruzamento secundário. As cepas finalmente selecionadas foram submetidas à PCR com o uso de um par de iniciadores das SEQ ID NOS: 19 e 22 mostradas na Tabela 1, e os produtos assim obtidos foram aplicados ao sequenciamento. Como um resultado, foi confirmado que o promotor CJ7 foi introduzido a montante do códon de iniciação de NCgl2522 dentro do cromossomo. Em particular, a reação PCR foi realizada repetindo-se 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 1 minuto.
[071] As cepas modificadas assim selecionadas de Corynebacterium glutamicum foram nomeadas ATCC21831_Pcj7 Ncgl2522 e KCCM10741P_Pcj7 NCgl2522, respectivamente. <1-2> CONFIRMAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE
ARGININA DE CEPAS BASEADAS EM CEPA QUE PRODUZ ARGININA QUE TÊM ATIVIDADE ACENTUADA DE NCGL2522
[072] A fim de confirmar o efeito do gene NCgl2522 gene na capacidade para exportar arginina, um dos produtos à base de ornitina, a capacidade de produção de arginina foi comparada dentre as cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum ATCC21831_Pcj7 Ncgl2522 e KCCM10741P_Pcj7 NCgl2522 preparadas no Exemplo 1 acima.
[073] Como os grupos de controle, ATCC21831 e KCCM10741P de Corynebacterium glutamicum, que são as cepas progenitoras, foram usadas, e uma alça de platina de cada cepa foi inoculada em um frasco com chicanas no canto de 250 ml contendo 25 ml de meio de produção [6% de glicose, 3% de sulfato de amônio, 0,1% de fosfato de monopotássio, 0,2% de sulfato de magnésio heptaidratado, 1,5% de licor de maceração de milho (CSL), 1% de NaCl, 0,5% de extrato de levedura e 100 μg/l de biotina a pH 7,2] e cultivada a 30 °C a uma taxa de 200 rpm por 48 horas para produzir arginina. Após a conclusão da cultura, a produção de arginina foi medida por HPLC. Os resultados são mostrados na Tabela 2 abaixo. TABELA 2 Cepas OD Concentraçã Concentraçã Arginina o de Arginina o de Ornitina Fold (%) (g/l) (g/l) KCCM10741P 91 3,0 0,3 100 KCCM10741P_Pcj7 Ncgl2522 72 3,6 0,4 120 ATCC21831 102 4,2 0,3 100 ATCC21831_Pcj7 Ncgl2522 86 4,8 0,4 114
[074] Conforme mostrado na Tabela 2, quando o promotor do gene NCgl2522 em KCCM10741P e ATCC21831 foi acentuado pela substituição pelo promotor CJ7, as cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum mostraram um aumento na produção de arginina de 20% e 14% em comparação às cepas progenitoras, respectivamente. Adicionalmente, foi confirmado que a concentração de ornitina, um reagente antes da conversão em arginina, foi também aumentada nas cepas modificadas em comparação às cepas progenitoras.
[075] Com base nessas constatações, foi confirmado que o gene NCgl2522 não é apenas um gene para exportar putrescina, mas também tem uma capacidade para exportar produtos incluindo ornitina que são biossintetizados a partir de ornitina como material de partida. Adicionalmente, pode ser interpretado a partir dos resultados acima que o gene NCgl2522 e as variantes da presente revelação podem ser muito úteis na produção de produtos à base de ornitina com o uso de biomassa. EXEMPLO 2. CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA DE VARIANTES DE
GENE QUE CODIFICAM PROTEÍNA QUE EXPORTA PUTRESCINA E ESTABELECIMENTO DA MODIFICAÇÃO EFICAZ
[076] A fim de aumentar a atividade da proteína de exportação de produto à base de ornitina, os presentes inventores construíram variantes para NCgl2522 (Patente Coreana no 10-1607741), um gene que codifica uma proteína que exporta putrescina.
[077] Especificamente, a fim de construir uma biblioteca das variantes de gene NCgl2522, uma PCR de mutagênese aleatória (PCR propensa a erro JENA) foi realizada com o uso de um par de iniciadores específico das SEQ ID NOS: 7 e 8 excluindo o códon de iniciação de ORF do gene NCgl2522, mostrado na Tabela 3, com base no DNA genômica de ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum como um modelo. TABELA 3 Iniciador Sequência (5' -> 3') 13032-putE-EF-FX (SEQ ID NO: 7) CCGGGGATCCTCTAGA
ACTTCAGAAACCTTACAGGC 13032-putE-EF-RX (SEQ ID NO: 8) GCAGGTCGACTCTAGA
CTAGTGCGCATTATTGGCTC
[078] Os fragmentos de gene mutantes assim preparados foram submetidos à clonagem de fusão no vetor pDZ clivado com XbaI. A clonagem de fusão foi realizada a 50 °C por 10 minutos com o uso do Kit de Clonagem In-Fusion® HD Kit (Clontech
Laboratories, Inc.), concluindo, assim, a construção de bibliotecas de plasmídeo das variantes pDZ-N2522.
[079] As bibliotecas de plasmídeos recombinantes construídas desse modo foram triadas por meio de triagem de alto rendimento (HTS). Em particular, a cepa de plataforma usada para triagem foi KCCM11240P, que é um micro-organismo recombinante derivado de Corynebacterium glutamicum com a capacidade para produzir putrescina (Patente Coreana no 10-1493585).
[080] Especificamente, a fim de obter variantes com uma atividade melhorada para exportar putrescina, as bibliotecas de plasmídeos assim construídas foram introduzidas em KCCM11240P por meio de eletroporação para obter transformantes, e os transformantes assim obtidos foram colocados em placas em meio de placa BHIS (37 g/l de infusão de cérebro e coração, 91 g/l de sorbitol e 2% de ágar) contendo canamicina (25 μg/ml) e X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolin-D-galactosídeo) e cultivados para formar colônias. Dentre as colônias assim formadas, as cepas introduzidas com as bibliotecas de variante pDZ-N2522 de plasmídeo foram selecionadas.
[081] As cepas selecionadas goram cultivadas por agitação em uma placa de 96 poços profundos juntamente com meio de titulação (2 g/l de glicose, 0,4 g/l de MgSO4·7H2O, 0,8 g/l de MgCl2, 1 g/l de KH2PO4, 4 g/l de (NH4)2SO4, 0,48 g/l de hidrolisado de proteína de soja, 0,01 g/l de MnSO4·7H2O, 200 μg/l de HCl de tiamina, 200 μg/l de biotina, 0,01 g/l de FeSO4·7H2O, arginina 1 mM e 25 μg/ml de canamicina a pH 7,2), e a concentração de putrescina produzida em cada cultura foi medida, e, então, um transformante com o maior aumento na produtividade de putrescina em comparação ao grupo de controle foi selecionado. Subsequentemente, foi confirmada qual modificação foi induzida na sequência de aminoácidos da proteína NCgl2522 para o transformante selecionado. A sequência da variante de Ncgl2522 foi confirmada conforme segue: um fragmento recombinante homólogo foi obtido realizando-se PCR com o uso de um par de iniciadores das SEQ ID NOS: 7 e 8, com base no transformante incluindo as variantes correspondentes, seguido pela aplicação do produto ao sequenciamento de genoma o uso de um iniciador da SEQ ID NO: 7.
Em particular, a reação PCR foi realizada repetindo-se 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 1 minuto.
[082] Como um resultado, foi confirmado que a variante de NCgl2522 selecionada a partir da mesma foi modificada de modo que a glicina (Gly), que é o resíduo de aminoácido na posição 77 da terminação N da sequência de aminoácidos de NCgl2522 (SEQ ID NO: 1) de ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum, tenha sido substituída por alanina (Ala) e foi nomeada NCgl2522_G77A (SEQ ID NO: 3). EXEMPLO 3. ESTABELECIMENTO DE VÁRIAS VARIANTES EM QUE O RESÍDUO DE AMINOÁCIDO NA POSIÇÃO 77 DO GENE QUE CODIFICA
PROTEÍNA QUE EXPORTA PUTRESCINA É SUBSTITUÍDO
[083] Com base na variante NCgl2522_G77A preparada no Exemplo 2, os presentes inventores perceberam que o resíduo de aminoácido na posição 77 da terminação N é importante para a atividade da proteína NCgl2522. Consequentemente, várias variantes em que o resíduo de aminoácido na posição 77 da proteína NCgl2522 foi substituído por outros resíduos de aminoácido foram preparadas.
[084] Especificamente, um fragmento recombinante homólogo foi obtido com o uso de um par de iniciadores específico das SEQ ID NOS: 7 e 8 excluindo o códon de iniciação de ORF do gene NCgl2522, com base no DNA genômica de ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum como um modelo. Em particular, a reação PCR foi realizada repetindo-se 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 1 minuto.
[085] Subsequentemente, o produto de PCR obtido acima foi submetido à clonagem de fusão no vetor pDZ tratado com XbaI. A clonagem de fusão foi realizada com o uso do Kit de Clonagem In-Fusion® HD (Clontech Laboratories, Inc.), e o plasmídeo assim obtido foi nomeado pDZ-NCgl2522_G77.
[086] Então, a fim de induzir uma mutagênese aleatória no resíduo de aminoácido na posição 77 de NCgl2522, uma biblioteca de plasmídeo para a variante pDZ-NCgl2522_G77 foi concluída realizando-se PCR com o uso de um par de iniciadores das SEQ ID NOS: 9 e 10 mostradas na Tabela 4, com base no plasmídeo pDZ-NCgl2522_G77 construído acima como um modelo. Em particular, a reação PCR foi realizada repetindo-se 25 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 5 minutos. TABELA 4 Iniciador Sequência (5' -> 3') SM_putE_G77-F (SEQ ID NO: TGGGGTTCCGTGNNKATTCTTGGCGCT 9) SM_putE_G77-R (SEQ ID NO: AGCGCCAAGAATMNNCACGGAACCCCA 10)
[087] As bibliotecas de plasmídeos recombinantes construídas desse modo foram triadas por meio de triagem de alto rendimento (HTS). Em particular, a cepa de plataforma usada para triagem foi KCCM11240P, que é um micro-organismo recombinante derivado de Corynebacterium glutamicum com a capacidade para produzir putrescina.
[088] As bibliotecas de plasmídeo construídas foram introduzidas em KCCM11240P por meio da eletroporação para obter transformantes, e as cepas introduzidas com a variante pDZ-NCgl2522_G77 de plasmídeo foram selecionadas da mesma maneira que no Exemplo 2. Dois transformantes com o maior aumento na produtividade de putrescina em comparação ao grupo de controle foram selecionados, e foi confirmada qual modificação foi induzida na sequência de aminoácidos da proteína NCgl2522 para cada transformante, da mesma maneira que no Exemplo 2.
[089] Como um resultado, adicionalmente à variante NCgl2522_G77A (ATCC13032) (SEQ ID NO: 3), em que glicina, o resíduo de aminoácido na posição 77 da terminação N da sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de NCgl2522 de ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum, foi substituída por alanina, a variante em que a glicina foi substituída por arginina foi confirmada e foi nomeada NCgl2522_G77R (ATCC13032) (SEQ ID NO: 4).
[090] Adicionalmente, a fim de confirmar se o efeito de aumentar a produtividade de putrescina devido à modificação pode ser aplicado a proteínas NCgl2522 derivadas de diferentes cepas, diversas variantes, em que o resíduo de aminoácido na posição 77 da proteína NCgl2522 derivada de ATCC13869 de Corynebacterium glutamicum foi substituído por outros resíduos de aminoácido, foram construídas.
[091] Especificamente, um fragmento recombinante homólogo foi obtido com o uso de um par de iniciadores específico das SEQ ID NOS: 7 e 8 excluindo o códon de iniciação de ORF do gene NCgl2522, com base no DNA genômica de ATCC13869 de Corynebacterium glutamicum como um modelo. Em particular, a reação PCR foi realizada repetindo-se 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 30 segundos.
[092] O produto de PCR obtido acima foi submetido à clonagem de fusão no vetor pDZ tratado com XbaI. A clonagem de fusão foi realizada com o uso do Kit de Clonagem In-Fusion® HD (Clontech Laboratories, Inc.), e o plasmídeo assim obtido foi nomeado pDZ-13869-NCgl2522_G77.
[093] Então, a fim de induzir uma mutagênese aleatória no resíduo de aminoácido na posição 77 de NCgl2522, uma biblioteca de plasmídeo para a variante pDZ-13869-NCgl2522_G77 foi concluída realizando-se PCR com o uso de um par de iniciadores das SEQ ID NOS: 9 e 10 mostradas na Tabela 4, com base no plasmídeo pDZ-13869-NCgl2522_G77 acima como um modelo. Em particular, a reação PCR foi realizada repetindo-se 25 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 5 minutos.
[094] Subsequentemente, as bibliotecas de plasmídeos recombinantes assim construídas foram triadas por meio de triagem de alto rendimento (HTS). Em particular, a cepa de plataforma usada para triagem foi DAB12-b, que é um micro- organismo recombinante derivado de Corynebacterium glutamicum com a capacidade para produzir putrescina. Então, as bibliotecas de plasmídeo construídas foram introduzidas em DAB12-b por meio da eletroporação para obter transformantes, e as cepas introduzidas com a variante pDZ-13869-NCgl2522_G77 de plasmídeo foram selecionadas da mesma maneira que no Exemplo 2.
[095] Como um resultado, duas variantes, em que o resíduo de aminoácido na posição 77 da terminação N da sequência de aminoácidos de NCgl2522 (SEQ ID NO: 2) de ATCC13869 de Corynebacterium glutamicum foi substituído, foram selecionadas como as cepas com a maior produção de putrescina, como as variantes de NCgl2522 de ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum. Dentre as mesmas, a variante em que glicina, o resíduo de aminoácido na posição 77, foi substituída por alanina foi nomeada NCgl2522_G77A (ATCC13869) (SEQ ID NO: 5), e a variante em que glicina, o resíduo de aminoácido na posição 77, foi substituída por arginina foi nomeada NCgl2522_G77R (ATCC13869) (SEQ ID NO: 6). EXEMPLO 4. CONSTRUÇÃO DE CEPAS DE VARIANTE DE NCGL2522
E CONFIRMAÇÃO DE CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE PUTRESCINA DAS
MESMAS <4-1> CONSTRUÇÃO DE CEPAS DE VARIANTE NCGL2522 A PARTIR DA CEPA PARA PRODUZIR PUTRESCINA BASEADA EM ATCC13032
[096] A fim de aumentar a capacidade para exportar putrescina da cepa que produze putrescina, NCgl2522_G77A e NCgl2522_G77R, que são variantes do gene NCgl2522, foram respectivamente introduzidas no cromossomo da cepa que produz putrescina baseada em ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum.
[097] Especificamente, um fragmento recombinante homólogo que tem uma sequência modificada de NCgl2522_G77A foi obtido realizando-se PCR com o uso de pares de iniciadores das SEQ ID NOS: 11 e 14 e SEQ ID NOS: 12 e 13, com base no DNA genômico de ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum como um modelo, e um fragmento recombinante homólogo que tem uma sequência modificada de NCgl2522_G77R foi obtido com o uso de pares de iniciadores das SEQ ID NOS: 11 e 16 e SEQ ID NOS: 12 e 15, com base no DNA genômico de ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum como um modelo. Em particular, a reação PCR foi realizada repetindo-se 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 30 segundos. TABELA 5 Iniciador Sequência (5' -> 3') pDC-Pself-putE-up-FX (SEQ ID NO: CCGGGGATCCTCTAGA 11) CCTCTAAGCGCCTCAAAG pDC-putE-up-RX (SEQ ID NO: 12) GCAGGTCGACTCTAGA
GATTCGCGATATTGGCCG putE_G77A-F CCGGCACTTTGGCTGACAAAATCG SEQ ID NO: 13) putE_G77A-R (SEQ ID NO: 14) CGATTTTGTCAGCCAAAGTGCCGG putE_G77R-F (SEQ ID NO: 15) CCGGCACTTTGCGTGACAAAATCG putE_G77R-R CGATTTTGTCACGCAAAGTGCCGG SEQ ID NO: 16)
[098] Cada um dos produtos de PCR obtidos acima foi submetido à clonagem de fusão no vetor pDZ tratado com XbaI. A clonagem de fusão foi realizada com o uso do Kit de Clonagem In-Fusion® HD (Clontech Laboratories, Inc.), e os plasmídeos assim obtidos foram nomeados pDZ-NCgl2522_G77A e pDZ-NCgl2522_G77R, respectivamente.
[099] Os plasmídeos pDZ-NCgl2522_G77A e pDZ-NCgl2522_G77R preparados acima foram respectivamente introduzidos em KCCM11240P (Publicação de Pedido de Patente Coreana no 2013-0082478), que é uma cepa que produz putrescina baseada em ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum, por meio de eletroporação para obter transformantes, e os transformantes assim obtidos foram colocados em placas em meio de placa BHIS (37 g/l de infusão de cérebro e coração, 91 g/l de sorbitol e 2% de ágar) contendo canamicina (25 μg/ml) e X-gal (5-bromo-4-cloro-3-
indolin-D-galactosídeo) e cultivados para formar colônias. Dentre as colônias assim formadas, as cepas introduzidas com os plasmídeos pDZ-NCgl2522_G77A ou pDZ- NCgl2522_G77R foram selecionadas.
[0100] As cepas selecionadas foram cultivadas com agitação (30 °C, 8 horas) em meio CM (10 g/l de glicose, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de extrato de carne bovina, 2,5 g/l de NaCl e 2 g/l de ureia a pH 6,8) e sequencialmente diluídas de 10−4 a 10−10, colocadas em placas em meio sólido contendo X-gal e cultivadas para formar colônias. Dentre as colônias assim formadas, colônias brancas que apareceram a uma taxa relativamente baixa foram selecionadas, selecionando, assim, finalmente as cepas, em que o gene NCgl2522 foi substituído pela variante NCgl2522_G77A ou NCgl2522_G77R por um cruzamento secundário. As cepas finalmente selecionadas foram submetidas à PCR com o uso de um par de iniciadores das SEQ ID NOS: 11 e 12, e os produto assim obtidos foram aplicados ao sequenciamento para confirmar a substituição pelas variantes. Em particular, a reação PCR foi realizada repetindo-se 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 1 minuto.
[0101] As cepas modificadas assim selecionadas de Corynebacterium glutamicum foram nomeadas KCCM11240P NCgl2522_G77A e KCCM11240P NCgl2522_G77R, respectivamente. <4-2> CONSTRUÇÃO DE CEPAS DE VARIANTE NCGL2522 A PARTIR DA CEPA PARA PRODUZIR PUTRESCINA BASEADA EM ATCC13869
[0102] DAB12-a ΔNCgl1469 (Publicação de Pedido de Patente Coreana n o 2013- 0082478), que é uma cepa que produz putrescina baseada em ATCC13869 Corynebacterium glutamicum, foi nomeada DAB12-b. Para esta finalidade, a fim de aumentar a capacidade para exportar putrescina da cepa que produz putrescina, NCgl2522_G77A e NCgl2522_G77R, que são variantes do gene NCgl2522, foram respectivamente introduzidas no cromossoma da cepa DAB12-b.
[0103] Especificamente, um fragmento recombinante homólogo que tem uma sequência modificada de NCgl2522_G77A foi obtido realizando-se PCR com o uso de pares de iniciadores das SEQ ID NOS: 11 e 14 e SEQ ID NOS: 12 e 13 mostradas na Tabela 5, com base no DNA genômico de ATCC13869 de Corynebacterium glutamicum como um modelo, e um fragmento recombinante homólogo que tem uma sequência modificada de NCgl2522_G77R foi obtido realizando-se PCR com o uso de pares de iniciadores das SEQ ID NOS: 11 e 16 e SEQ ID NOS: 12 e 15 mostradas na Tabela 5, com base no DNA genômico de ATCC13869 de Corynebacterium glutamicum como um modelo. Em particular, a reação PCR foi realizada repetindo-se 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 30 segundos.
[0104] Cada um dos produtos de PCR obtidos acima foi submetido à clonagem de fusão no vetor pDZ tratado com XbaI. A clonagem de fusão foi realizada com o uso do Kit de Clonagem In-Fusion® HD (Clontech Laboratories, Inc.), e os plasmídeos assim obtidos foram nomeados pDZ-NCgl2522_G77A-2 e pDZ-NCgl2522_G77R-2, respectivamente.
[0105] Os plasmídeos pDZ-NCgl2522_G77A-2 e pDZ-NCgl2522_G77R-2 preparados acima foram respectivamente introduzidos em DAB12-b por meio de eletroporação para obter transformantes, e os transformantes assim obtidos foram colocados em placas em meio de placa BHIS (37 g/l de infusão de cérebro e coração, 91 g/l de sorbitol e 2% de ágar) contendo canamicina (25 μg/ml) e X-gal (5-bromo-4- cloro-3-indolin-D-galactosídeo) e cultivados para formar colônias. Dentre as colônias assim formadas, as cepas introduzidas com o plasmídeo pDZ-NCgl2522_G77A-2 ou pDZ-NCgl2522_G77R-2 foram selecionadas.
[0106] As cepas selecionadas foram cultivadas com agitação (30 °C, 8 horas) em meio CM (10 g/l de glicose, 10 g/l de polipeptona, 5 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de extrato de carne bovina, 2,5 g/l de NaCl e 2 g/l de ureia a pH 6,8) e sequencialmente diluídas de 10−4 a 10−10, colocadas em placas em meio sólido contendo X-gal e cultivadas para formar colônias. Dentre as colônias assim formadas, colônias brancas que apareceram a uma taxa relativamente baixa foram selecionadas, selecionando, assim, finalmente as cepas, em que o gene NCgl2522 foi substituído pela variante
NCgl2522_G77A ou NCgl2522_G77R por um cruzamento secundário. As cepas finalmente selecionadas foram submetidas à PCR com o uso de um par de iniciadores das SEQ ID NOS: 11 e 12, e os produto assim obtidos foram aplicados ao sequenciamento para confirmar a substituição pelas variantes. Em particular, a reação PCR foi realizada repetindo-se 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, anelamento a 55 °C por 30 segundos e extensão a 72 °C por 1 minuto.
[0107] As cepas modificadas assim selecionadas de Corynebacterium glutamicum foram nomeadas DAB12-b NCgl2522_G77A e DAB12-b NCgl2522_G77R, respectivamente. <4-3> AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE PUTRESCINA DE CEPAS INTRODUZIDAS COM VARIANTES DE NCGL2522
[0108] A fim de confirmar o efeito das variantes de NCgl2522 na produção de putrescina quando as variantes do gene NCgl2522, que aumenta a capacidade para exportar putrescina, foram introduzidas nas cepas que produzem putrescina, a capacidade de produção de putrescina foi comparada dentre as cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum preparadas no Exemplos 4 -1 e 4-2.
[0109] Especificamente, as cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum (KCCM11240P NCgl2522_G77A e DAB12-b NCgl2522_G77R) e dois tipos de cepas progenitoras (KCCM11240P e DAB12-b) foram respectivamente colocados em placas em meio de placa CM contendo arginina 1 mM (1% de glicose, 1% de polipeptona, 0,5% de extrato de levedura, 0,5% de extrato de carne bovina, 0,25% de NaCl, 0,2% de ureia, 100 μl de NaOH 50% e 2% de ágar a pH 6,8, com base em 1 l) e cultivados a 30 °C por 24 horas. Cerca de uma alça de platina de cada cepa cultivada a partir da mesma foi inoculada em 25 ml de meio de titulação (8% de glicose, 0,25% de proteína de soja, 0,50% de sólidos de maceração de milho, 4% de (NH4)2SO4, 0,1% de KH2PO4, 0,05% de MgSO4,7H2O, 0,15% de ureia, 100 μg de biotina, 3 mg de HCl de tiamina, 3 mg de ácido cálcio-pantotênico, 3 mg de nicotinamida e 5% de CaCO3, com base em 1 l) e cultivada com agitação a 30 °C a uma taxa de 200 rpm por 50 horas. Durante o cultivo de todas as cepas, arginina 1 mM foi adicionada ao meio. Após a conclusão da cultura, a concentração de putrescina produzida em cada cultura foi medida, e os resultados são mostrados na Tabela 6 abaixo. TABELA 6 □ Nome das Cepas Putrescina Produtividade Fold (g/l) (g/l/h) (%) KCCM11240P 5,8 0,116 100 KCCM11240P NCgl2522_G77A 6,8 0,136 117 KCCM11240P NCgl2522_G77R 6,3 0,126 109 DAB12-b 6,5 0,129 100 DAB12-b NCgl2522_G77A 7,3 0,146 113 DAB12-b NCgl2522_G77R 7,1 0,142 110
[0110] Conforme mostrado na Tabela 6 acima, quando as variantes NCgl2522_G77A e NCgl2522_G77R foram respectivamente introduzidas em KCCM11240P e DAB12-b, as cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum introduzidas com as variantes mostraram um aumento na produtividade e produção de putrescina de 7% a 13% em comparação às cepas progenitoras, respectivamente. Em particular, a produtividade representa a produção de putrescina por hora para cada transformante e foi expressa em g/l/h. EXEMPLO 5. INTRODUÇÃO DE VARIANTES DE NCGL2522 EM CEPAS
QUE PRODUZEM PUTRESCINA COM CAPACIDADE MELHORADA PARA EXPORTAR PUTRESCINA E CONFIRMAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUÇÃO
DE PUTRESCINA DAS MESMAS <5-1> CONSTRUÇÃO DE CEPAS INTRODUZINDO0SE VARIANTES DE NCGL2522 EM CEPAS COM CAPACIDADE MELHORADA PARA EXPORTAR
PUTRESCINA
[0111] A fim de confirmar o efeito das variantes do fene NCgl2522, NCgl2522_G77A e NCgl2522_G77R foram respectivamente introduzidas no cromossomo de KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 (Publicação de Pedido de Patente Coreana no 2014-0115244), que é uma cepa que produz putrescina baseada em ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum com uma capacidade aumentada para exportar putrescina.
[0112] Especificamente, pDZ-NCgl2522_G77A e pDZ-NCgl2522_G77R preparados no Exemplo 4-1 foram respectivamente transformados em KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 da mesma maneira que no Exemplo 4-1, e, assim, foi confirmado que o gene NCgl2522 foi substituído pelas variantes dentro do cromossomo do mesmo. As cepas modificadas selecionadas de Corynebacterium glutamicum foram nomeadas KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 NCgl2522_G77A e KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 NCgl2522_G77R, respectivamente. <5-2> AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE PUTRESCINA DE CEPAS PREPARADAS INTRODUZINDO-SE VARIANTES DE NCGL2522 EM CEPA COM CAPACIDADE MELHORADA PARA EXPORTAR
PUTRESCINA
[0113] A fim de confirmar o efeito das variantes de NCgl2522 nas cepas que produzem Corynebacterium glutamicum com uma capacidade melhorada para exportar putrescina, a capacidade de produção de putrescina foi comparada dentre as cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum preparadas no Exemplo 5-1 e a cepa progenitora.
[0114] Especificamente, as cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum (KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 NCgl2522_G77A e KCCM11240P P(CJ7)- NCgl2522 NCgl2522_G77R) e a cepa progenitora (KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522) foram respectivamente colocadas em placas em meio de placa CM contendo arginina 1 mM (1% de glicose, 1% de polipeptona, 0,5% de extrato de levedura, 0,5% de extrato de carne bovina, 0,25% de NaCl, 0,2% de ureia, 100 μl de NaOH 50% e 2% de ágar a pH 6,8, com base em 1 l) e cultivadas a 30 °C por 24 horas. Cerca de uma alça de platina de cada cepa cultivada a partir da mesma foi inoculada em 25 ml de meio de titulação (8% de glicose, 0,25% de proteína de soja, 0,50% de sólidos de maceração de milho, 4% de (NH4)2SO4, 0,1% de KH2PO4, 0,05% de MgSO4,7H2O, 0,15% de ureia, 100 μg de biotina, 3 mg de HCl de tiamina, 3 mg de ácido cálcio-pantotênico, 3 mg de nicotinamida e 5% de CaCO3, com base em 1 l) e cultivada com agitação a 30 °C a uma taxa de 200 rpm por 50 horas. Durante o cultivo de todas as cepas, arginina 1 mM foi adicionada ao meio. Após a conclusão da cultura, a concentração de putrescina produzida em cada cultura foi medida, e os resultados são mostrados na Tabela 7 abaixo. TABELA 7 □ Nome das Cepas Putrescina Produtividad Fold (g/l) e (%) (g/l/h) KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 6,9 0,138 100 KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 7,6 0,152 110 NCgl2522_G77A KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 7,5 0,150 109 NCgl2522_G77R
[0115] Conforme mostrado na Tabela 7 acima, quando as variantes NCgl2522_G77A e NCgl2522_G77R foram respectivamente introduzidas em KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522 com uma capacidade melhorada para exportar putrescina, as cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum mostraram um aumento na produção e produtividade de putrescina de 9% a 10% em comparação à cepa progenitora, que já mostrou uma capacidade melhorada para exportar putrescina. Em particular, a produtividade representa a produção de putrescina por hora para cada transformante e foi expressa em g/l/h. EXEMPLO 6. INTRODUÇÃO DE VARIANTES DE NCGL2522 EM CEPAS
QUE PRODUZEM ARGININA E CONFIRMAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE ARGININA DAS MESMAS
<6-1> CONSTRUÇÃO DE CEPAS INTRODUZINDO-SE VARIANTES DE NCGL2522 EM CEPAS QUE PRODUZEM ARGININA
[0116] A fim de aumentar a capacidade para exportar L-arginina das cepas que produzem L-arginina, NCgl2522_G77A e NCgl2522_G77R, que são variantes do gene NCgl2522, foram respectivamente introduzidas nos cromossomos de Corynebacterium glutamicum ATCC21831 e KCCM10741P (Patente Coreana no 10- 0791659).
[0117] Especificamente, as cepas, em que o gene NCgl2522 foi substituído pelas variantes NCgl2522_G77A e NCgl2522_G77R, foram finalmente selecionadas da mesma maneira que no Exemplo 4-2. As cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum selecionadas a partir do mesmo foram nomeadas KCCM10741P NCgl2522_G77A, KCCM10741P NCgl2522_G77R, ATCC21831_Pcj7 Ncgl2522_G77A e ATCC21831_Pcj7 Ncgl2522_G77R, respectivamente. <6-2> AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE L-ARGININA DE CEPAS INTRODUZIDAS COM VARIANTES DE NCGL2522
[0118] A fim de confirmar o efeito das variantes de NCgl2522 na produção de L- arginina quando as variantes do gene NCgl2522, que aumenta a capacidade para exportar L-arginina, foram introduzidas nas cepas que produzem L-arginina, a capacidade de produção de L-arginina foi comparada dentre as cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum preparadas no Exemplo 6-1.
[0119] Em particular, como os grupos de controle, KCCM10741P e ATCC21831 de Corynebacterium glutamicum, que são as cepas progenitoras, e KCCM10741P_Pcj7 Ncgl2522 e ATCC21831_Pcj7 Ncgl2522, que foram preparadas no Exemplo 1, foram usadas. Uma alça de platina de cada cepa foi inoculada em um frasco com chicanas no canto de 250 ml contendo 25 ml de meio de produção [6% de glicose, 3% de sulfato de amônio, 0,1% de fosfato de monopotássio, 0,2% de sulfato de magnésio heptaidratado, 1,5% de licor de maceração de milho (CSL), 1% de NaCl, 0,5% de extrato de levedura e 100 μg/l de biotina a pH 7,2] e cultivada com agitação a 30 °C a uma taxa de 200 rpm por 48 horas para produzir L-arginina. Após a conclusão da cultura, a produção de L-arginina foi medida por HPLC. Os resultados são mostrados na Tabela 8 abaixo. TABELA 8 Cepas OD Concentraçã Concentraçã Arginina o de o de Ornitina Fold (%) Arginina (g/l) (g/l) KCCM10741P 91 3,0 0,3 100 KCCM10741P_Pcj7 Ncgl2522 72 3,6 0,4 120 KCCM10741P_Pcj7 69 4,1 0,5 136,7 Ncgl2522_G77A KCCM10741P_Pcj7 70 4,2 0,5 140 Ncgl2522_G77R ATCC21831 102 4,2 0,3 100 ATCC21831_Pcj7 Ncgl2522 86 4,8 0,4 114 ATCC21831_Pcj7 86 5,4 0,5 128,6 Ncgl2522_G77A ATCC21831_Pcj7 88 5,3 0,6 126,2 Ncgl2522_G77R
[0120] Conforme mostrado na Tabela 8, quando as variantes pNCgl2522_G77A e NCgl2522_G77R foram respectivamente introduzidas em KCCM10741P e ATCC21831, todas as cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum introduzidas com as variantes mostraram um aumento na produção de L-arginina de 26% e 40% em comparação às cepas progenitoras.
[0121] Adicionalmente, foi confirmado que a concentração de L-ornitina, que foi exportada após a conversão em L-arginina, também aumentou quando as variantes foram introduzidas. Com base nessas constatações, pode ser interpretado que as cepas modificadas de Corynebacterium glutamicum podem também exportar produtos biossintetizados a partir de ornitina como um material de partida.
[0122] Em conclusão, os presentes inventores confirmaram que o resíduo de aminoácido na posição 77 da terminação N desempenha um papel chave na capacidade para exportar produtos à base de ornitina em NCgl2522, uma proteína de exportação de putrescina. Em particular, quando o aminoácido na posição 77 foi substituído por outros resíduos de aminoácido, constatou-se que a produção dos produtos à base de ornitina foi aumentada nas cepas introduzidas com as variantes. Consequentemente, as variantes da presente revelação podem ser aplicadas a um método para produzir produtos à base de ornitina com o uso de micro-organismos para melhorar adicionalmente a produção dos mesmos e, assim, podem ser muito úteis para a produção de produtos à base de ornitina com o uso de biomassa.
[0123] Na presente revelação, NCgl2522_G77A, uma variante do gene NCgl2522, foi introduzida no cromossomo da cepa que produz putrescina baseada em ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum, e como um resultado, foi confirmado que putrescina poderia ser produzida com alto rendimento e alta produtividade na cepa de Corynebacterium glutamicum introduzida com a variante. Consequentemente, a cepa foi nomeada KCCM11240P NCgl2522_G77A e depositada no Centro de Cultura Coreano de Micro-organismos (KCCM), uma Autoridade Depositária Internacional, sob o Tratado de Budapeste em 1 de setembro de 2016 com no de Acesso KCCM11886P.
[0124] Uma pessoa de habilidade comum na técnica reconhecerá que a presente revelação pode ser incorporada em outras formas específicas sem se afastar de seu espírito ou suas características essenciais. As modalidades descritas devem ser consideradas em todos os aspectos somente como ilustrativas e não como restritivas. Portanto, o escopo da presente revelação é, portanto, indicado pelas reivindicações anexas em vez da descrição supracitada. Todas as mudanças que são abrangidas pelo significado e alcance de equivalência das reivindicações devem ser abrangidas pelo escopo da presente revelação.

Claims (21)

REIVINDICAÇÕES
1. Polipeptídeo que tem capacidade de exportar um produto à base de ornitina, caracterizado por o resíduo de glicina na posição 77 da extremidade N da sequência de aminoácidos de uma proteína de exportação de produto à base de ornitina, que consiste em uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, ser substituído por outros aminoácidos.
2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a glicina na posição 77 ser substituída por alanina ou arginina.
3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptídeo consistir em uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma dentre a SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 6.
4. Polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo caracterizado por ter capacidade de exportar um produto à base de ornitina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. Vetor caracterizado por compreender o polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 4.
6. Micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz putrescina, caracterizado por compreender o polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou ter uma atividade acentuada do mesmo.
7. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o micro-organismo ser Corynebacterium glutamicum.
8. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por uma atividade de ornitina decarboxilase (ODC) ser adicionalmente introduzida.
9. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a atividade de pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em ornitina carbamoiltransferase (ArgF) e uma proteína envolvida em exportação de glutamato ser adicionalmente inativada em comparação à atividade endógena do mesmo.
10. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a atividade de pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato de glutamila de gama de acetila reductase (ArgC), acetilglutamato sintase ou ornitina acetiltransferase (argJ), acetilglutamato quinase (ArgB), e acetilornitina aminotransferase (ArgD) ser adicionalmente intensificada em comparação à atividade endógena do mesmo.
11. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a atividade de putrescina acetiltransferase ser adicionalmente enfraquecida em comparação à atividade endógena do mesmo.
12. Micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz arginina, caracterizado por compreender o polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou ter uma atividade acentuada do mesmo.
13. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a atividade de pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato de glutamila de gama de acetila reductase (ArgC), acetilglutamato sintase ou ornitina acetiltransferase (argJ), acetilglutamato quinase (ArgB), e acetilornitina aminotransferase (ArgD) ser adicionalmente intensificada em comparação à atividade endógena do mesmo.
14. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a atividade de pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em ornitina carbamoiltransfrase (ArgF), argininosuccinato sintase (argG), argininosuccinato liase (argH), asparato de amônia liase e/ou aspartato aminotransferase ser adicionalmente aumentada em comparação à atividade endógena do mesmo.
15. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o micro-organismo ser Corynebacterium glutamicum.
16. Método para produzir putrescina caracterizado por compreender: (i) cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11, em um meio; e (ii) recuperar putrescina do micro-organismo ou do meio obtido acima.
17. Método para produzir arginina caracterizado por compreender: (i) cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, em um meio; e (ii) recuperar arginina do micro-organismo ou do meio obtido acima.
18. Micro-organismo que produz um produto à base de ornitina, caracterizado por compreender o polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou ter uma atividade acentuada do mesmo.
19. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a atividade de pelo menos um selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato de glutamila de gama de acetila reductase (ArgC), acetilglutamato sintase ou ornitina acetiltransferase (argJ), acetilglutamato quinase (ArgB), e acetilornitina aminotransferase (ArgD) ser adicionalmente intensificada em comparação à atividade endógena do mesmo.
20. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o micro-organismo ser Corynebacterium glutamicum.
21. Método para produzir um produto à base de ornitina, caracterizado por compreender: (i) cultivar o micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, em um meio; e (ii) recuperar um produto à base de ornitina do micro-organismo ou do meio obtido acima.
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