KR20190024442A - 아밀로수크라제의 발현 시스템 및 이를 이용한 투라노스의 생산 - Google Patents

Abstract

본 발명은 설탕을 포함하는 기질로부터 투라노스를 생산할 수 있는 아밀로수크라제 효소 단백질에 관한 것이다.

Description

아밀로수크라제의 발현 시스템 및 이를 이용한 투라노스의 생산 {Expression system for producing amylosucrase and method of producing turanose using the same}

본 발명은 투라노스 생산 효소 및 이를 이용하여 투라노스를 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

투라노스는 자연적으로 벌에서 생기는 환원성 이당류로서 설탕 단맛의 약 50%에 해당하는 단맛을 나타내는 설탕의 유사체이며 3-O-α-D-글루코피라노실-D-프락토즈의 화학적 구조를 지닌다. 투라노스는 치아 우식 유발 미생물에 의해 발효되지 않기 때문에 충치 예방에 도움이 되며, 칼로리 없는 감미료로서 사용될 수 있으며, 따라서 음식, 화장품 및 약학 산업계에서 중요한 역할을 수행할 수 있다.

한국특허 제10-11772184호는 아밀로수크라제를 이용하여 설탕과 프럭토스를 기질로 투라노스를 제조하는 방법을 포함한다. 그러나, 기존 효소들은 고열에서 활성을 나타내지 못하거나 유지하지 못하여, 공정에 적합한 최적 온도인 50℃에서 투라노스 전환반응 시 수크로스가 모두 소모되기 전에 활성을 잃는다. 결과적으로 아밀로수크라제에 의한 투라노스 전환 반응 시 최종 전환액에 설탕이 남게 되어 추후 투라노스 고순도 분리를 하는 데 결정적 방해 요인이 된다. 또한 기존의 효소에 의한 투라노스 제조는 반응 속도가 매우 느려서 상업화에 적합하지 않다. 따라서 50℃이상의 온도에서 투라노스 전환반응 시에 수크로스를 모두 소모하며, 반응 속도가 개선된 아밀로수크라제를 개발하는 것이 매우 중요하다.

투라노스 생산 활성을 갖는 아밀로수크라제는 미생물 Neisseria polysaccharea, Deinococcus geothermalis 및 Alteromonas macleodii 등에서 유래된 것이 알려져 있다.

본 발명은 비피도박테리움 터모필럼 유래의 아밀로수크라제 효소 단백질 또는 이의 변이체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 아밀로수크라제 효소 단백질을 이용하여 투라노스를 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 종래 알려진 투라노스 생성 특성을 갖는 균주가 아닌, 비피도박테리움 터모필럼에서 유래되며, 투라노스 생성 특성을 갖는 아밀로수크라제 효소 및 이의 변이 효소를 이용하여 높은 수율로 투라노스를 제조할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 투라노스 생성 특성을 갖는 아밀로수크라제 효소 및 이의 변이 효소 단백질에 관한 것이다.

본 발명의 효소는 비피도박테리움 터모필럼(Bifidobacterium thermophilum) 유래의 효소 단백질일 수 있다.

본 발명의 효소 단백질은 투라노스를 생산하는 아밀로수크라제(amylosucrase)로서, 수크로스 단독 또는 수크로스 및 프럭토스를 포함하는 기질 용액으로부터 투라노스를 생성할 수 있다.

본 발명의 효소 단백질은 수크로스 0.1 내지 2.5M, 바람직하게는 0.5 내지 1.5M, 더욱 바람직하게는 0.75 내지 1.25M을 기질로 사용하거나, 상기 수크로스와 프럭토스 0.25 내지 1.5M, 바람직하게는 0.5 내지 1.25M, 더욱 바람직하게는 0.75 내지 1.25M을 더욱 포함하는 기질을 사용하여 투라노스를 전환할 수 있다.

상기 효소 단백질을 수크로스 단독 또는 수크로스 및 프럭토스를 포함하는 기질과 반응하여 생성된 투라노스를 함유하는 당 조성물, 예를 들어, 투라노스, 수크로스, 프럭토스, 트레할룰로스, 포도당 및 올리고당, 희소당(알룰로스, 알로스 등)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 당류를 포함하는 당 조성물을 제조할 수 있다. 상기 비피도박테리움 터모필럼 유래된 효소 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있으나, 투라노스를 생성할 수 있는 활성이 있는 한 이에 한정되지 않고 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 1 이상의 아미노산이 치환, 삽입 또는 결실된 변이 단백질을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 93% 이상 또는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상 상동성 있는 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질일 수 있다.

본 발명의 효소 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 1를 갖는 아미노산 서열의 200번째, 202번째, 265번째, 305번째, 393번째, 414번째 및 420번째 위치로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 위치의 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 서열번호 1를 갖는 아미노산 서열의 200번째, 202번째, 265번째, 305번째, 393번째, 414번째 및 420번째 위치로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 위치의 아미노산이 아르기닌, 이소루신, 페닐알라닌 및 트레오닌으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 서열번호 1를 갖는 아미노산 서열의 아미노산이 아래의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함할 수 있다:

200번째 아미노산이 아르기닌으로 치환,

202번째 아미노산이 이소루신으로 치환,

265번째 아미노산이 페닐알라닌으로 치환,

305번째 아미노산이 이소루신으로 치환,

393번째 아미노산이 아르기닌으로 치환,

414번째 아미노산이 페닐알라닌으로 치환, 및

420번째 아미노산이 트레오닌으로 치환.

예를 들어 상기 효소 단백질은 서열번호 1 내지 11의 아미노산 서열 중 어느 하나의 서열을 갖는 것일 수 있다.

또한 본 발명의 효소 단백질은 아래 특성으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 특성을 갖는 것일 수 있다.

(1) 단량체의 분자량이 65 내지 75 kDa

(2) 최적 온도가 30 내지 65℃, 및

(3) 최적 pH가 5.0 내지 7.0.

(4) 설탕 함유 기질로부터 투라노스 생성,

(5) pH6 및 50℃의 온도에서 기질 2M 수크로스를 반응 시, 기질 농도 100%에 대한 생성된 투라노스 농도로 산출되는 투라노스 전환율이 10 내지 60%, 및

(6) pH6 및 50℃의 온도에서 기질 2M 수크로스를 반응 시, 시간 당 생성되는 투라노스가 3 내지 80g/L/h

상기 단량체 분자량은 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 법(SDS-PAGE)으로 측정된 효소 단량체의 분자량으로, 65 내지 75kDa 바람직하게는 66 내지 80kDa, 더욱 바람직하게는 68kDa인 것일 수 있다.

상기 최적 온도는 효소의 투라노스 생산 활성이 최대가 되는 온도로서, 30 내지 65℃, 바람직하게는 40 내지 65℃, 41 내지 65℃, 42 내지 65℃, 또는 41 내지 60℃, 더욱 바람직하게는 45 내지 55℃, 더욱 바람직하게는 50℃일 수 있다. 종래 알려진 아밀로수크라제는 최적 활성 온도가 35℃내외이고, 40℃ 이상, 예를 들면 45 ℃ 또는 50℃ 의 온도에서 전환반응을 실행 할 경우 낮은 활성과 내열성의 부재로 인하여 전환액에 수크로스가 남지 않고 투라노스를 포함한 생성물만 남을 때 까지 효소의 활성이 유지가 되지 않았기 때문에 산업화에 어려움이 있었다. 그러나 본 발명의 효소 단백질은 40℃ 이상 또는 40℃ 초과하는 온도, 예를 들면 41℃, 42℃, 43℃, 45 ℃ 또는 50℃ 의 온도에서 수크로스가 모두 분해가 될 때까지 반응이 유지가 되기 때문에 내열성이 우수하여 산업화에 바람직하다.

상기 최적 pH는 효소의 투라노스 생산 활성이 최대가 되는 pH로서, pH 5.0 내지 7.0, 바람직하게는 pH 5.5 내지 6.5, 더욱 바람직하게는 pH 6.0일 수 있다.

본 발명의 효소 단백질의 투라노스 전환율은 pH6 및 50℃의 온도에서 기질 2M 수크로스를 반응 시, 기질 농도 100%에 대한 생성된 투라노스 농도로 산출되는 투라노스 전환율이 10 내지 70%, 바람직하게는 20 내지 40% 또는 35 내지 60%, 더욱 바람직하게는 45% 내지 55%일 수 있다.

본 발명의 효소 단백질은, pH6 및 50℃의 온도에서 기질 2M 수크로스를 반응 시, 시간 당 생성되는 투라노스가 3 내지 80g/L/h, 바람직하게는 10 내지 30 g/L/h 또는 20 내지 60 g/L/h, 더욱 바람직하게는 50 g/L/h 내지 60 g/L/h 일 수 있다.

기존에 많은 연구가 선행된 아밀로수크라제 효소 중 투라노스 생산율이 높은 효소로 NpAS(Neisseria polysaccharea) 가 알려져 있다. NpAS는 최적 pH는 pH 7.0, 최적 온도는 35, 기질 2 M 수크로스 기준으로 투라노스 전환율은 50.9%으로 알려져 있다. 본 발명의 신규 아밀로수크라제 야생형 효소는 내열성이 높아 보다 더 안정적이고 투라노스의 전환 수율이 높아 산업적으로 유용하다.

본 발명의 또 다른 예는, 상기 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 단백질을 발현하는 재조합 미생물을 제공한다.

상기 효소 단백질에 관한 사항은 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 재조합 벡터 또는 이를 발현하는 재조합 미생물에 동일하게 적용될 수 있다.

예를 들어 본 발명의 효소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 1 내지 서열번호 11의 아미노산 서열 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12 내지 22의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있다.

바람직하게는, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 11 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 각각 순서대로 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12 내지 22의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 상기한 염기 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 서열도 포함하는 것이다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 염기 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 그 서열을 분석한 경우, 서열번호 12 내지 서열번호 21 중 어느 하나의 염기 서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상 상동성이 있는 염기 서열을 포함한다.

당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자는 당해 분야에 공지된 유전자 재조합 기술 등에 의해 본 발명에 따른 유전자의 하나 또는 그 이상의 염기 서열을 용이하게 치환, 부가 또는 결실시킴으로써 상기 상동성을 갖는 범위 내에서 동일한 활성을 갖는 효소 단백질을 코딩하는 유전자를 용이하게 제조할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 이러한 상동성의 비교는 시판되는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

상기 유전자는 그 자체로, 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 사용될 수 있다. 상기 재조합 벡터란 목적한 유전자의 염기 서열과, 상기 유전자 염기 서열을 발현하는데 필수적인 적정 염기 서열이 작동 가능하게 연결된 재조합 핵산 분자를 의미하며, 상기 적정 염기 서열은 프로모터 및 전사 종결인자로 이루어지는 하나 이상의 요소와 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 예를 들면, 화학물질 유도성 요소 (inducible element) 및 온도 민감성 요소(temperature sensitive element)등과 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 화학물질 유도성 요소(inducible element)는 lac 오페론 및 T7 프로모터, trc 프로모터 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 T7 프로모터는 바이러스인 T7 파지에서 유래된 것으로 프로모터와 함께 T7 터미네이터를 포함한다.

상기 재조합 벡터는 당업계에 널리 알려진 다양한 방법을 통해 클로닝을 위 한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다(Francois Baneyx, current Opinion Biotechnology 1999, 10:411-421). 본 발명에서 사용되는 벡터에는 예를 들면, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터 (예, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스) 및 이들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 벡터가 포함되나 이들에 한정되는 것은 아니며, 발현 벡터는 유전자 재조합에 이용되어온 벡터라면 어느 벡터를 사용해도 무방하다. 바람직하게는 대장균 내 발현에 적합한 pRSet, pET, pBR, pTrc, pLex, pUC 벡터 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서 '형질전환'은 원래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 유전자가 있는 DNA사슬 조각 또는 플라스미드가 세포들 사이에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합, 세포의 유전형질이 변화되는 분자생물학적 현상을 말한다. 상기 벡터를 안정적이며 연속적으로 클로닝 및/또는 발현시킬 수 있는 형질전환 대상 미생물로는 활성형의 상기 효소 단백질을 과발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않고 당업계에 공지되어 있는 어떠한 미생물도 이 용할 수 있으며, 예컨대 E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X1776, E. coli W3110 등의 다양한 대장균, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균,코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 코리네 박테리아 속 그리고 살모넬라 티피무리움 등의 살모넬사 속 균, 기타 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 대장균(E. coli) 일 수 있다.

상기 벡터를 사용하여 형질전환시키기 위한 방법은 예컨대, 세균 원형질체의 융합, 전기천공법, 추진체 포격 (projectile bombardment), 및 바이러스 벡터를 사용한 감염 등 특별히 제한되지 않고 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이, 상기 효소 단백질은 수크로스를 투라노스로 전환시키는 투라노스 전환능이 있는 효소 단백질이다. 따라서, 상기 효소 단백질 또는 이를 발현하는 재조합 균주는 투라노스 제조에 적용될 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 예를 들어 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 재조합 미생물은 예를 들어 서열번호 1 내지 11의 아미노산 서열 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 아밀로수크라제 효소 단백질을 발현하는 재조합 균주일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예로서, 투라노스를 생성하는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 터모필럼 유래의 효소 단백질, 이를 발현하는 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물의 배양물 또는 상기 재조합 미생물의 파쇄물(또는 파쇄물의 상등액)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 투라노스 생산용 조성물을 제공한다.

상기 효소 단백질에 관한 사항은 상기 투라노스 생산용 조성물에 동일하게 적용될 수 있다.

예를 들어 상기 조성물은, 비피도박테리움 터모필럼 유래의 효소 단백질을 발현하는 재조합 미생물의 배양물을 원심분리하는 단계; 및 상기 원심분리된 침전물을 파쇄하는 단계; 및 상기 파쇄물의 상등액을 얻는 단계를 포함하여 제조된 세포 농축물을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예로서, 투라노스를 생성하는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 터모필럼 유래의 효소 단백질, 이를 발현하는 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물의 배양물 또는 상기 재조합 미생물의 파쇄물(또는 파쇄물의 상등액)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 포함하는 투라노스 생산용 조성물을 기질과 반응시키는 단계를 포함하는 투라노스 생산 방법을 제공한다.

상기 효소 단백질에 관한 사항은 상기 제조 방법에 동일하게 적용될 수 있다.

상기 투라노스 생산 방법에 있어서, 효율적인 투라노스 생산을 위하여, 사용되는 기질은 수크로스 단독 또는 상기 수크로스에 프럭토스를 추가적으로 보강하여 사용할 수 있다.

본 발명의 효소 단백질은 수크로스 0.1 내지 2.5M, 바람직하게는 0.5 내지 1.5M, 더욱 바람직하게는 0.75 내지 1.25M을 기질로 사용하거나, 상기 수크로스와 프럭토스 0.25 내지 1.5M, 바람직하게는 0.5 내지 1.25M, 더욱 바람직하게는 0.75 내지 1.25M을 더욱 포함하는 기질을 사용하여 투라노스를 전환할 수 있다.

상기 효소 단백질을 기질과 반응시키는 단계는 상기 단백질을 기질과 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 상기 효소 단백질을 기질과 접촉시키는 단계는, 예컨대, 상기 효소 단백질 등을 기질과 혼합하는 단계 또는 상기 효소 단백질 등이 고정화된 담체에 기질을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 또 다른 예에서 상기 효소 단백질 등을 기질과 반응시키는 단계는 상기 재조합 균주의 균체를 기질이 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 이와 같이 상기 효소 단백질은 수크로스 또는 프럭토스를 투라노스로 전환하여 수크로스 또는 프럭토스로부터 투라노스를 생산할 수 있다.

상기 생산 방법은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 효소 단백질을 발현하는 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 재조합 미생물 또는 상기 재조합 미생물로부터 분리된 효소 단백질을 기질과 반응시키는 단계를 포함할 수 있다.

상기 재조합 미생물의 배양 단계는, 사용되는 미생물, 예를 들어 균주의 특성에 따라 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 선택되는 배지 및 배양 조건 하에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 배지로서는 대장균을 비롯한 임의의 숙주 세포, 및 세포 내용물을 지지하거나 또는 함유할 수 있는 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반고체 또는 강성 지지체를 포함하며, 바람직하게는 2YT 배지, LB 배지, SOB 배지 또는 TB 배지 등이 될 수 있다. 상기 배양은 연속, 반연속, 또는 회분식 배양일 수 있다.

상기 배양물은 일반적으로 대장균을 배양하는데 적합한 조건을 사용하여 얻어질 수 있다. 예를 들면, 35 내지 37에서 상기 재조합 미생물을 150 내지 250rpm에서 진탕배양하여 배양물을 얻을 수 있다. 또한 바람직하게는 이때 온도를 14 내지 30 로 하여 단백질 과발현을 유도 할 수 있다.

상기 균체는 상기 미생물의 배양물에 대해 원심분리, 여과 등을 수행하여 얻을 수 있으며, 또한 상기 얻어진 균체를 균질화시키고 원심분리하여 수득된 상층액 또는 상기 상층액을 분획화하거나, 크로마토그래피 등을 통해 분리 정제하여 효소 단백질을 얻을 수 있다.

예컨대, 회수된 균체를 50mM 인산 완충용액으로 현탁한 후 파쇄하여 원심분리 한 후, 상등액만 Ni-NTA 컬럼 (Qiagen) 에서 흡착시킨 후 20mM, 200mM 이미다졸의 농도로 목적 단백질을 회수할 수 있다.

상기 투라노스 생산 방법에 있어서, 효율적인 투라노스 생산을 위하여, 사용되는 효소 단백질의 양은 전체 반응물(기질 및 단백질 모두을 포함) 기준으로 50 U/ml 내지 1500 U/ml 일 수 있다. 효소의 사용량이 상기 농도보다 낮으면 투라노스 전환 효율이 낮아 질 수 있고, 상기 농도보다 높으면 산업에서의 경제성이 낮아지므로 상기 범위가 적당하다.

또한, 상기 기질과 반응시키는 단계는 바람직하게는 본 발명의 효소 단백질의 최적 활성화 조건 하에 이루어질 수 있다.

즉, 상기 반응은 30 내지 65℃, 바람직하게는 40 내지 60℃, 더욱 바람직하게는 45 내지 55℃, 더욱 바람직하게는 50℃의 온도에서 이루어질 수 있으며, pH 6.0 내지 9.0, 바람직하게는 pH 6.5 내지 8.0, 더욱 바람직하게는 pH 7.0에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 방법에 의하여 프럭토스로부터 수득된 투라노스는 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있으며, 이러한 결정은 당업자에게 통상적인 기술에 속한다. 예를 들어 원심분리, 여과, 결정화, 이온교환 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예로서, 상기 투라노스 생산 방법으로 생산된 투라노스 함유 당 조성물을 제공한다.

상기 효소 단백질 및 투라노스 생산 방법에 관한 사항은 상기 투라노스 함유 당 조성물에 동일하게 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 비피도박테리움 터모필럼(Bifidobacterium thermophilum) 유래 효소 단백질은 수크로스로부터 투라노스를 고수율로 생성할 수 있어 투라노스의 산업적 이용에 유용하다.

도 1은 재조합 투라노스 3-에피머화 효소 발현용 재조합 DNA를 포함하는 발현벡터를 나타내는 도면이다.
도 2는 야생형 아밀로수크라제의 온도에 따른 상대 활성을 나타낸 결과이다.
도 3은 야생형 아밀로수크라제의 pH에 따른 상대 효소 활성을 나타낸 결과이다.
도 4는 야생형 아밀로수크라제의 온도에 따른 상대 효소 활성을 나타낸 결과이다.
도 5는 기질인 수크로스 및 프럭토스 농도에 따른 투라노스 전환율을 나타낸 결과이다.
도 6은 pH 6 및 50℃의 온도에서, 기질 2 M 수크로스와 400 U/L 및 1600 U/L로 반응시킨 후 산출된 투라노스 전환율을 나타낸 결과이다.
도 7은 pH 6 및 50℃의 온도에서, 기질 2 M 수크로스와 400 U/L 및 1600 U/L로 반응시킨 후 산출된 기질 수크로스 소비량을 나타낸 결과이다.

이하 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만 본 발명은 하기 실시예에 한정된 것이 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정이 가능함은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다. 따라서, 첨부된 청구항들은 넓게 본 발명의 사상과 범위에 부합되게 해석되어야 한다.

실시예 1. 야생형 아밀로수크라제(BtAS) 효소 제조

1.1 야생형 아밀로수크라제를 생산하는 재조합 균주 제조

발현 균주로 사용될 대장균에 최적화되도록 비피도박테리움 터모필럼(Bifidobacterium thermophilum)으로부터 유래된 아밀로수크라제(아미노산 서열, 서열번호 1 및 이를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 15)를 pBT7-N-His에 삽입하여 pBT77-N-His/아밀로수크라제 효소를 제작하였으며, 이의 벡터 계열 지도를 도 1에 나타내었다.

상기에서 얻어진 재조합 발현 벡터는 형질전환 방법에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였고 형질전환 된 미생물은 20% 글리세린 용액을 첨가하여 투라노스의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에 -80℃에서 냉동 보관하였다.

아밀로수크라제를 대량생산하기 위하여 상기 실시예 1의 재조합 E.coli BL21의 스탁 배양물을 LB배지 5mL에 접종하고 온도 37℃ 12시간 동안 180rpm에서 전 배양시킨 후, 전 배양물을 120℃에서 15분 동안 멸균시킨 2 L 플라스크에 들어있는 1 L LB배지에 접종한 후 0.01%(w/v) 암피실린의 존재 하 배양온도는 37℃, 교반 속도는 180rpm에서 배양하였다. 600nm에서의 흡광도가 0.6에 도달 했을 때, 최종 농도 0.2mM의 이소프로필-β-D-치오갈락토피라노사이드를 첨가하여 효소의 대량 발현을 유도하였다. 이소프로필-β-D-치오갈락토피라노사이드를 첨가한 후에는 배양온도를 16℃로 낮춰 20시간 배양하였다. 과발현 된 아밀로수크라제 효소 배양물을 4℃에서 10분 동안 3,000 x g에서 원심분리하여 침전물을 수확하였다 상기 침전물을 50 mM Tris-HCl 완충 용액(pH 7) 45mL에서 볼텍싱하여 완전하게 재현탁 시킨 후에 세포 용액을 초음파 분쇄기(Sonic Dismembrator 550, Fisher Scientific Co.) Model D100을 이용하여 세포를 파괴하였다. 세포 파쇄물은 4℃에서 20분 동안 11,000 x g에서 원심분리하여 침전물인 세포 잔해물은 제외하고 상등액 만을 얻는다. 이 과정에서 얻은 반응물을 세포 추출물(Cell extract)라고 명명하였다.

1.2 야생형 아밀로수크라제 효소정제

실시예 1.1에서 수확한 세포 추출물은 효소 정제 수율을 알기 위하여 소량 채취해 보관한다. 이 세포 상등액을 멸균된 0.45 μm 시린지 필터를 통해 여과시킨 후, 45 mL의 여과액을 니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 친화성 칼럼을 통해 통과시켜 재조합 히스 텍(His-tag)된 아밀로수크라제를 통과시켜 정제된 아밀로수크라제 효소를 얻었다.

컬럼을 40mL 세정 완충액(Lysis buffer) (50mM Tris-HCl, 300mM 염화나트륨, 20mM 이미다졸, pH 7.0)으로 먼저 세정한 후, 40mL의 용출 완충액(Elution buffer) (50mM Tris-HCl, 300mM 염화나트륨, 250mM 이미다졸, pH 7.0)을 이용하여 원하는 단백질을 얻는다. 정제한 단백질은 4℃에서 Amicon Centrifugal Filter Devices (Millipore Corporation, Billerica, USA)를 이용하여 농축하여 투라노스 생산에 사용되는 아밀로수크라제 효소로서 분리하였다.

시험예 1. 야생형 아밀로수크라제의 효소 활성도 측정

1.1 아밀로수크라제 효소 활성도 측정

실시예 1에서 정제된 야생형 아밀로수크라제 효소의 활성도는 수크로즈 가수 분해로부터 생성된 환원당의 양으로 측정하는 DNS법 (환원당 정량법)을 활용하였다.

다양한 농도의 프락토스(0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 %, w/v) 용액을 500 ㎕씩 준비한 후 동일양의 DNS 용액을 첨가하여 100℃에서 5분간 끓인 뒤 5분간 얼음물에 방랭 시키고, Abs575에서 흡광도를 측정하여 프락토스 농도(x)에 따른 흡광도(y)의 1차 함수를 구해 Standard curve를 구했다. 효소활성 측정은 다음과 같은 과정에 의해 진행 되었다. 먼저, 수크로스가 함유된 50 mM 완충액 490 ㎕를 10분간 pre-heat을 하였고, 이하에서 정해진 최적온도에서 30 분 동안 0.1M 수크로오스를 pH 6.0의 50 mM 소듐아세테이트에서 효소 반응을 수행 한 다음, 0.5mL DNS 용액으로 반응을 정지시켰다. 반응 혼합물을 끓는 물에서 5 분 동안 가열하여 착색시켰다. 색깔을 안정시키기 위해 찬물 아래에서 식히고, 용액의 흡광도는 575 nm에서 측정되었다. Unit(U) 단위는 분당 1 μmol의 기질로부터 과당을 방출하는 효소의 양으로 정의되었다.

상기 실시예 1.1에서 재조합 균주 배양액 1L 기준으로를 기준으로 산출된 효소 활성, 단백질량, 및 비활성 값을 아래 표에 나타내었다.

정제후	효소활성 (unit/ml)	단백질량 (mg/ml)	효소 비활성 (unit/mg)
야생형 효소(BtAS)	23±4	18±2.1	1.3±0.1

상기 단백질량(total protein, mg/ml)은 상기 정제-농축물 내 포함된 단백질량을 Bradford method를 이용해서 구한 값으로 이며, 상기 비활성(total specific activity, unit/mg)은 DNS method를 이용하여 구한 값이다.

상기 결과에서 확인할 수 있듯, 신규 야생형 아밀로수크라제 효소는 약 1.3unit/mg의 비활성, 즉 아밀로수크라제 전환 활성을 갖는 것으로 확인되었다.

1.2 야생형 아밀로수크라제의 온도에 따른 활성 분석

효소 활성에 대한 온도의 영향은 25 ~ 65℃ 의 범위에서 결정되었다. 0.1M 수크로오스, 50mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.0) 및 희석 된 효소를 함유하는 총 부피가 0.5mL 인 반응 혼합물을 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 및 65℃ 의 온도에서 배양 하였다. BtAS 활성의 온도 의존성은 다양한 온도에서 환원당의 방출량을 결정하기 위한 DNS 방법으로서, 상기 시험예 1.1에 제시된 DNS 방법에 의해 결정된 효소 활성에 기초하여 산출되었다. 즉, DNS 용액을 이용한 환원당량 측정법을 통해 온도별 효소활성을 구하고 상대활성도로 표시하였으며 그 결과를 도 2에 나타내었다.

결과에서 확인할 수 있듯 기질인 수크로스를 가수분해하는 능력은 50℃에서 최대로 나타냈다. 55℃에서는 98 %의 상대활성을 보이며, 60℃에서 약 85 %의 잔여활성을 보인다. 65℃에서는 대부분 활성이 감소하는 것을 확인 하였다. 따라서 야생형 아밀로수크라제 BtAS는 50℃에서도 안정하면서도 최대활성을 보이므로 50℃를 최적온도로 판단하였다.

1.3 야생형 아밀로수크라제의 pH에 따른 활성 분석

실시예 1에서 정제된 아밀로수크라제 효소에 대한 최적 pH를 확인하기 위하여, 효소 활성에 대한 최적 pH는 4.0 내지 10.0의 범위에서 측정 하였다. 효소 활성에 대한 pH 효과를 분석하기 위해 4 개의 완충 시스템을 사용 하였다 : 50 mM 소듐 아세테이트 완충액 (pH 4.0 내지 6.0); 50 mM 인산 나트륨 완충액 (pH 6.0 - 7.5); 50 mM Tris - HCl 완충액 (pH 7.0 - 9.0); 50 mM 글리신 -수산화나트륨 (pH 8.0 - 10.0) 0.1M 의 기질인 수크로스, pH가 다른 50mM의 각 완충액 및 희석 된 효소를 함유 한 반응 혼합물을 50℃ 에서 30 분 동안 수행 하였다. 효소 활성은 상기 시험예 1.1에 제시된 DNS 법을 이용하여 측정하고 결과를 도 3에 나타내었다.

그 결과, 야생형 효소의 가장 큰 상대 활성은 pH 6.0의 50 mM 소듐아세테이트 완충용액에서 관찰되었다. pH가 최적 pH 6.0에서 산성 (pH 5.5-4.0) 및 알칼리 (pH 7.0-9.0) 범위로 이동하면, 그 상대 활성은 현저하게 감소 하였다. 완충 시스템은 효소 활성에 영향을 주어서는 안 되지만, 본 연구에서는 동일한 pH에서도 완충 성분의 유형에 따라 효소 활성이 유의하게 영향을 받았다. 따라서, 50 mM 소듐아세테이트 완충용액 중 pH 6.0 를 이후의 연구에 사용 하였다.

1.4 야생형 아밀로수크라제의 내열성 및 효소실활상수(Kd) 평가

야생형 아밀로수크라제의 내열성, 효소실활상수를 평가하기 위하여 상기 실시예 1에서 정제된 야생형 아밀로수크라제를 항온 진탕 수조에서 최대 120시간동안 열처리하였다. 45, 50, 55 및 60℃ 의 온도에서 열처리 후, 잔류 효소 활성을 측정하기 위하여 0.1 M 수크로스가 함유된 50 mM 완충액 490 ㎕에 상기 열처리한 효소를 적당히 희석한 희석액 10 ㎕를 넣고 35℃에서 30분간 반응시킨 후 반응 종결액에 500 ㎕의 DNS 용액을 첨가하고 100℃에서 5분간 끓인 뒤 5분간 얼음물에 방랭 시켰다. Abs575에서 흡광도를 측정해 Standard curve로부터 환원 당량을 측정하여 온도에 따른 효소활성의 상대 값을 도출하고 그 결과를 도 4(A, 45℃; B, 50℃; C, 55℃; D, 60℃) 에 나타내었다. 이 값을 바탕으로 온도 별 시간에 따른 상대 활성도를 함수로 표기하고, 이를 다시 자연로그 함수로 변환시켜 kd 및 온도 반감기를 구하여 아래 표에 나타내었다.

온도(℃)	Kd(h-1)	t1/2(h)
45	0.00003	23104.9
50	0.0012	577.6
55	0.0098	70.7
60	0.762	0.9

상기에서 확인할 수 있듯 야생형 아밀로수크라제 BtAS는 45℃에서 온도 반감기가 약 23104시간, 50℃에서 온도반감기가 약 577시간으로 최대 120시간동안의 효소 반응 시 매우 우수한 온도 안정성을 보였다. 이 온도 보다 5℃가 높은 55℃에서는 온도반감기가 약 70시간으로 급격히 감소하는 경향을 보였으나, 전체적으로 열에 대한 안정성이 우수하였다.

시험예 2. 야생형 아밀로수크라제 효소의 투라노스 전환반응

50 mM 소듐아세테이트 완충용액 (pH 6.0)에서 수크로스를 1.0, 1.5, 2.0 및 2.5M의 농도(각각 1.0S, 1.5S, 2.0S 및 2.5S)로, 프럭토즈를 0.25, 0.5, 0.75 및 1M의 농도(각각 0.25F, 0.5F, 0.75F 및 1F)로 포함하는 기질로부터 투라노스를 합성시켰다. 효소 반응은 400 U/L의 야생형 효소로 48 시간 동안 수행되었다. 배양 후, 반응 혼합물을 끓는 물에서 10 분 동안 열처리하여 효소를 불 활성화시켰다. 불 활성화된 반응 용액을 0.2 ㎛ 주사기 필터로 여과하고 가용성 분획을 HPAEC로 분석 하였다. 가용성 분획은 CarboPacTM PA1 분석 칼럼 (4 x 250mm, DIONEX, SUNNYVALE, CA, USA)에서 pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD)과 결합 된 고성능 음이온 교환 크로마토그램으로 분석하여 적은 양의 포도당, 과당, 자당 및 투라노스를 정량화 하였다. 반응물의 상층 액을 증류수로 적절히 희석하고 0.2 μm 주사기 필터로 여과 하였다. 주입 부피는 50 μl이고 100 mM NaOH 용액으로 1.0 mL/min의 유속으로 분석했다. 당의 양은 스탠다드 물질과의 면적 비교에 의해 결정되었다.

투라노스 전환율에 대한 기질 조성의 영향은 400 U/L의 BtAS로 50℃ 의 온도 및 50 mM 소듐아세테이트 완충액으로 pH 6.0에서 수행되었었으며, 분석된 결과를 도 5에 나타내었다. 투라노스 전환율은 기질(수크로스)로부터 전환된 투라노스의 생성량을 의미하는 것으로, 기질 농도 대비 생성된 투라노스 농도의 비(%)로 나타낸다.

결과에서 확인할 수 있듯 48 시간 동안의 효소 반응 후, 최종 투라노스 전환율은 프럭토스 농도가 1.0 M까지 증가함에 따라 유의하게 증가 하였다. 이는 co-substrate로서 외인성 프럭토스이 투라노스 생산을 촉진함을 시사했다. 반응 혼합물 중에 1.0 M의 과당을 첨가함으로써, 투라노스 전환율은 1.0 M의 수크로스로 22.7 %에서 43.3 %로 증가하였고, 1.5 M의 수크로스에서 23.7 %에서 39.4 %로 증가 하였다. 따라서, 투라노스 수확량은 BtAS 생체 전환 시스템의 초기 프럭토스 농도에 크게 의존하는 것을 확인하였다.

즉, 수크로스로부터 유래 된 과당 부분이 효소로부터 방출되지 않고서 투라노스를 생산하기 위한 수용체로 직접 이용되고 외인과적인 과당 첨가가 투라노스 생산 수율을 더욱 향상 시키는 것으로 보인다. 최적의 기질 조건은 수크로스와 과당 각각 1.0 M이었고, 이 때 투라노스 전환율은 43.3 %이었다.

실시예 2. 단일 점 변이형 아밀로수크라제 효소 제조

단일 점(single point) 돌연변이 효소를 제작하기 위하여 아래 표의 프라이머와 Quickchange site-directed mutagenesis kit를 이용하여 돌연변이를 유발하여 재조합 벡터 pBT7-N-His/아밀로수크라제를 제작하였다.

유전자	방향	서열번호	서열
BtAS P200R	Forward	23	5’-GCCGTCGTCCGCCAAGTCTTC-3’
	Reverse	24	5’-GAAGACTTGGCGGACGACGGC-3’
BtAS V202I	Forward	25	5’-GTCCCGCAAATCTTCCCGACC-3’
	Reverse	26	5’-GGTCGGGAAGATTTGCGGGAC-3’
BtAS Y265F	Forward	27	5’-GACGCGGTGCCGTTCATCTGGAAGCAA-3’
	Reverse	28	5’-TTGCTTCCAGATGAACGGCACCGCGTC-3’
BtAS V305I	Forward	29	5’-AAAGGTGAAGTCATCATGGCTCCCAAG-3’
	Reverse	30	5’-CTTGGGAGCCATGATGACTTCACCTTT-3’
BtAS K393R	Forward	31	5’-CCGCTCAAGCACAGGGAATTCCTCTAC-3’
	Reverse	32	5’-GTAGAGGAATTCCCTGTGCTTGAGCGG-3’
BtAS S420T	Forward	33	5’-TATGATCCGGCGACGGGTGACGCGCGC -3’
	Reverse	34	5’-GCGCGCGTCACCCGTCGCCGGATCATA-3’
BtAS Y414F	Forward	35	5’-ATGGGCGAGCTGTTCAACTATGATCCG-3’
	Reverse	36	5’-CGGATCATAGTTGAACAGCTCGCCCAT-3’

상기 유발된 점 돌연변이는, 야생형 아밀로수크라제 효소의 200번째 프롤린을 아르기닌으로(서열번호 2), 202번째 발린은 이소루신으로(서열번호 3), 265번째 티로신은 페닐알라닌으로(서열번호 4) 305번째 발린은 이소루신으로(서열번호 5) 393번째 리신은 아르기닌으로(서열번호 6), 414번째 티로신은 페닐알라닌으로(서열번호 7), 420번째 세린은 트레오닌으로(서열번호 8) 치환시킨 것이다.

상기 플라스미드를 형질전환 방법에 의하여 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였고, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 변이형 아밀로수크라제 효소를 분리하였다.

시험예 3. 단일 점 변이형 아밀로수크라제 효소의 효소 활성도 및 투라노스 전환반응

상기 실시예 2의 단일 점 변이형 아밀로수크라제 효소의 효소 활성도를 시험예 1.1과 동일한 방법으로 측정하고, 상기 실시예 2의 단일 점 변이형 아밀로수크라제 효소의 투라노스 전환율을 상기 시험예 2와 동일한 방법으로 pH 6 및 50℃의 온도에서, 기질 2M 수크로스와 400U/L 반응시킨 후 기질의 농도 대비 생성된 투라노스 농도의 비(%)를 산출하였다. 또한 기질로부터 생성된 투라노스의 농도를 반응 종결 시간으로 나눈, 기질로부터 투라노스 전환 시 시간 당 생성되는 투라노스(농도)를 산출하고 아래 표에 나타내었다. Y414F는 400 U/L로 반응시켰을 때, 수크로스를 완전하게 소비하지 못하고 속도가 느려졌으며, 이는 상대적으로 단백질 양이 적게 들어가서 반응을 못한 것이라 예측하여 동일 조건에서 단백질 양을 4배 늘려 1600U/L로 반응 시켰다. 상기 측정 및 산출된 결과를 아래 표에 나타내었다.

정제후	반응 효소 양 (unit/L)	단백질량 (mg/10ml)	효소 비활성 (unit/mg)	투라노스 전환율 (%)	반응 종결 시간(h)	시간 당 생성되는 투라노스 (g/L/h)
야생형 효소(BtAS)	400	3	1.3±0.1	25±2.5	12	14.25
P200R	400	8	0.5±0.0	27±1.5	12	15.39
V202I	400	7	0.9±0.0	29±2.0	12	16.53
Y265F	400	6	0.6±0.2	23±1.0	6	26.22
V305I	400	3	1.6±0.1	21±1.0	24	6
K393R	400	4	1.0±0.0	22±0.0	12	12.54
S420T	400	4	1.5±0.3	20	24	5.7
Y414F	400	1	4.1±0.8	12.5±2.5	>24	-
Y414F	1600	4	4.1±0.8	35±1.4	12	19.95

상기 결과에서 확인할 수 있듯, 야생형 효소와 비교하면 비활성은 414번째 티로신을 페닐알라닌으로 치환시킨 변이체가 특이적으로 4배가 높아졌다. 모든 변이체들의 투라노스 전환율을 확인하기 위하여 스크리닝 개념으로 400 U/L로 효소 양을 맞춰 반응을 시킨 결과, P200R, V202I가 야생형 효소보다 투라노스 전환율이 높게 나왔으며, 반응속도는 Y265F가 빨라진 것을 확인 할 수 있었다. 또한 1600 U/L로 Y414F를 반응시킨 결과, 수크로스를 완전하게 소비하고 12시간 만에 반응이 종결되었으며 투라노스 전환율이 약 35%로, 변이체 중에서 1600 U/L로 반응시킨 Y414F 돌연변이 효소가 투라노스 전환율이 가장 높다는 것을 확인 할 수 있었다.

실시예 3. 이중 점 변이형 아밀로수크라제 효소 제조

이중 점(double point) 돌연변이 효소를 제작하기 위하여 상기 시험예 3에서 투라노스 전환율이 가장 높은 Y414F 변이체와 야생형 효소보다 반응종결시간이 빨라진 변이체의 더블 포인트 뮤테이션을 수행 하였다. 즉, P200R, V202I, Y265F를 Y414F와 접목시켰다.

pBT7-N-His/아밀로수크라제 Y414F 돌연변이 효소 벡터에 상기 표 3에 제시된 P200R, V202I, Y265F 프라이머를 이용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 이중 점 변이형 아밀로수크라제 효소, Y414F*P200R(서열번호 9), Y414F*V202I(서열번호 10), 및 Y414F*Y265F(서열번호 11)를 제작하였다.

시험예 4. 이중 점 변이형 아밀로수크라제 효소의 투라노스 전환반응

상기 실시예 3의 이중 점 변이형 아밀로수크라제 효소를 상기 시험예 2와 동일한 방법으로 pH 6 및 50℃의 온도에서, 기질 2 M 수크로스와 400 U/L 및 1600 U/L로 반응시킨 후 투라노스 전환율 및 수크로스 소비량을 산출하여 도 6 및 도 7에 나타내었다.

정제후	반응 효소 양 (unit/L)	단백질량 (mg/10ml)	효소 비활성 (unit/mg)	투라노스 전환율 (%)	반응 종결 시간(h)	시간 당 생성되는 투라노스 (g/L/h)
야생형 효소(BtAS)	400	3	1.3±0.1	25±2.5	12	14.25
Y414F*P200R	400	1.5	2.6±0.5	17±0.5	>24	-
Y414F*V202I	400	1	4.0±0.2	14±2.5	>24	-
Y414F*Y265F	400	1	4.2±0.1	13±2.0	>24	-
Y414F*P200R	1600	6	2.6±0.5	50±4	6	57
Y414F*V202I	1600	4	4.0±0.2	41.5±4.9	6	47
Y414F*Y265F	1600	4	4.2±0.1	40.5±2.1	6	46

Y414F 기반의 더블포인트 돌연변이 변이체도 Y414F 싱글포인트 돌연변이 변이체와 마찬가지로 400 U/L로 반응시켰을 때 수크로스 소비를 완전하게 하지 못하여 최대 투라노스 전환율을 확인하지 못했다. 다만 1600U/L로 반응시킨 결과, 투라노스 전환율이 높게 나왔으며 그 중에서도 Y414F 변이체와 P200R을 접목시킨 Y414F*P200R 더블 포인트 돌연변이 변이체가 투라노스 전환율이 50%로 가장 높은 투라노스 전환율을 보였다.

시험예 5. 이중 점 변이형 아밀로수크라제 효소 함유 (세포 추출물) 투라노스 생성

2M 수크로스와, 2M 수크로스+ 0.75M 프럭토스가 각각 함유된 50mM 소듐 아세테이트 완충액(pH 6.0) 10 ml을 10분간 pre-heat해준 뒤 실시예 3의 Y414F*P200R 변이체 효소 Cell extract 상태에서 16 unit/10ml의 농도가 되도록 앞서 정제한 신규 아밀로수크라제 16 unit을 수크로스 완충용액에 첨가하였다. 실시예 1.1에서 수확한 침전물을 50mM Tris-HCl 완충 용액(pH 7) 45mL에서 볼텍싱하여 완전하게 재 현탁 시킨 후에 세포 용액을 초음파 분쇄기(Sonic Dismembrator 550, Fisher Scientific Co.) Model D100을 이용하여 세포를 파괴하였다. 세포 파쇄물을 4에서 20분 동안 11,000 x g에서 원심분리하여 침전물인 세포 잔해물은 제외하고 상등액, 세포 추출물을 얻었다.

50℃에서 12시간 동안 효소반응을 수행하고 10분간 끓는 물에 가열하여 효소반응을 종결시킨 후 얻어진 반응물을 10000배 희석하여 UltiMate 3000 HPLC system(Dionex, USA)을 이용하여 분석하였다. 이때, 글루코스, 프락토스, 수크로스, 투라노스, 말토오스(Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO), 트레할룰로스(Samyang, Seongnam, Korea)를 표준물질로 이용하여 효소반응물을 분석하였으며, 투라노스의 전환율은 여러 가지 농도의 투라노스 표준물질을 분석하여 얻은 Standard curve를 이용하여 계산하였다.

투라노스를 분석하기 전에 샘플은 수크로스를 제거하기 위하여 Invertase 로 전처리한 후에 분석한다. 수크로스를 제거하는 이유는 투라노스와 수크로스의 피크가 겹쳐 투라노스의 정량에 영향을 미치기 때문이다. 투라노스 분석조건으로 HPLC 칼럼은 Bio-rad Aminex HPX-87C를 사용하였고, 샘플 주입량(Injection volume)은 10ul로 Column oven 온도는 80℃에서 이동상 용매는 100% 물로 분석하였다.

2M의 수크로스를 기질로 사용한 반응 후 6시간이 경과한 샘플의 당 분석 결과 및, 2M 수크로스 및 0.75M 프럭토스를 기질로 사용한 반응 후 6시간이 경과한 샘플의 당 분석 결과를 아래 표에 정리하였다.

	올리고머 (중량%)	투라노스 (중량%)	글루코스+트레할룰로스 (중량%)
2M 수크로스	30.02	42.01	0.16
2M 수크로스 + 0.75M 프럭토스	17.05	51.12	0.95

상기 결과에서 확인할 수 있듯, 기질을 2M 수크로스만 반응시키면 투라노스는 42.01%이고 기질을 2M 수크로스 뿐만 아니라 0.75M의 프럭토스를 첨가하여 반응시킨 결과 51.1%로 더 높은 수준으로 투라노스를 생성하는 것을 확인하였다.

<110> SAMYANG CORPORATION INDUSTRY ACADEMY COOPERATION FOUNDATION OF SEJONG UNIVERSITY <120> Expression system for producing amylosucrase and method of producing turanose using the same <130> DPP20173716KR <160> 36 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 603 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS wild-type <400> 1 Met Glu Ala Thr Tyr Arg Asp Ser Val Phe Ala Glu Arg Leu Ala Pro 1 5 10 15 Arg Cys Ala Glu Leu Glu Gln Leu Phe Arg Ser Leu Tyr Gly Asp Ser 20 25 30 Pro Glu Phe Asp His Phe Glu Gln Val Met Ala Lys Ala His Ala Asp 35 40 45 Arg Pro Ala Asp Leu Lys Arg Leu Asp Ala Ala Arg Glu His Asp Pro 50 55 60 Gln Trp Tyr Arg Arg Gly Asp Met Phe Gly Met Thr Met Tyr Thr Asp 65 70 75 80 Leu Phe Ala Gly Lys Leu Thr Asp Leu Ala Lys His Ile Asp Tyr Leu 85 90 95 Lys Glu Gln His Leu Thr Tyr Leu His Leu Met Pro Leu Leu Thr Met 100 105 110 Pro His Pro Asp Asn Asp Gly Gly Tyr Ala Ile Glu Asp Phe Asp Thr 115 120 125 Val Asp Pro Thr Ile Gly Thr Asn Glu Asp Leu Ala Asp Leu Thr Ala 130 135 140 Lys Leu Arg Glu Ala Gly Ile Ser Leu Cys Leu Asp Phe Val Met Asn 145 150 155 160 His Thr Ala Ser Thr His Arg Trp Ala Lys Ala Ala Gln Ala Gly Asp 165 170 175 Pro Glu Tyr Gln Asp Tyr Tyr Phe Cys Tyr Asp Asp Arg Thr Ile Pro 180 185 190 Asp Gln Tyr Asp Ala Val Val Pro Gln Val Phe Pro Thr Ala Ala Pro 195 200 205 Gly Asn Phe Thr Trp Asn Glu Gln Met Gly Lys Trp Val Met Thr Gln 210 215 220 Phe Tyr Pro Phe Gln Trp Asp Leu Asn Tyr Arg Asn Pro Lys Val Phe 225 230 235 240 Val Val Met Met Ser Ser Leu Leu His Leu Ala Asn Leu Gly Val Glu 245 250 255 Val Phe Arg Ile Asp Ala Val Pro Tyr Ile Trp Lys Gln Leu Gly Thr 260 265 270 Asn Cys Arg Asn Leu Pro Gln Val His Thr Ile Val Arg Met Met Arg 275 280 285 Ile Met Ser Glu Ile Val Cys Pro Ala Val Val Phe Lys Gly Glu Val 290 295 300 Val Met Ala Pro Lys Glu Leu Ala Ala Tyr Phe Gly Thr Pro Glu Lys 305 310 315 320 Pro Glu Cys His Met Leu Tyr Asn Val Ser Val Met Val Asn Leu Trp 325 330 335 Ser Ala Leu Ala Asn Gly Asp Thr Arg Leu Leu Lys Thr Gln Ile Asp 340 345 350 Lys Leu Asp Ala Leu Pro Asp Asn Cys Trp Phe Val Asn Tyr Leu Arg 355 360 365 Cys His Asp Asp Ile Gly Trp Gly Leu Asp Glu Asp Val Glu Arg Gln 370 375 380 Leu Gly Ile Asp Pro Leu Lys His Lys Glu Phe Leu Tyr His Phe Tyr 385 390 395 400 Glu Gly Met Val Pro Gly Ser Trp Ala Met Gly Glu Leu Tyr Asn Tyr 405 410 415 Asp Pro Ala Ser Gly Asp Ala Arg Ser Cys Gly Thr Thr Ala Ser Leu 420 425 430 Cys Gly Ile Glu Arg Ala Leu Ile Thr His Asp Arg Pro Leu Tyr Glu 435 440 445 Arg Ser Ile Gln Arg Asp Leu Leu Met His His Ala Met Gly Phe Leu 450 455 460 Arg Gly Phe Pro Met Leu Asn Cys Gly Asp Glu Ile Gly Gln Leu Asn 465 470 475 480 Gly Trp Asp Tyr Lys Glu Asp Pro Asp Arg Val Ala Asp Ser Arg Asn 485 490 495 Leu His Arg Ser Lys Phe Asn Trp Lys Asn Ala Ala Lys Arg Asp Val 500 505 510 Pro Gly Thr Leu Pro Asn Arg Leu Trp Glu Gly Met Ala Asp Val Arg 515 520 525 Gln Met Arg Ser Asp Pro Cys Phe Ala Pro Asp Ala Trp Val Thr Thr 530 535 540 Trp Asp Ala His Asp Asp Gly Ile Leu Ala Met Val Arg Gln Ser Gly 545 550 555 560 Gly Arg Thr Leu Leu Gly Val Phe Asn Phe Ala Asn Arg Asp Ala Thr 565 570 575 Ala Thr Leu Asp Ser Ile Glu Gly Val Ser Leu Pro Arg Thr Val Ala 580 585 590 Leu Lys Pro Tyr Glu Trp Lys Ile Glu Ala Cys 595 600 <210> 2 <211> 603 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS P200R <400> 2 Met Glu Ala Thr Tyr Arg Asp Ser Val Phe Ala Glu Arg Leu Ala Pro 1 5 10 15 Arg Cys Ala Glu Leu Glu Gln Leu Phe Arg Ser Leu Tyr Gly Asp Ser 20 25 30 Pro Glu Phe Asp His Phe Glu Gln Val Met Ala Lys Ala His Ala Asp 35 40 45 Arg Pro Ala Asp Leu Lys Arg Leu Asp Ala Ala Arg Glu His Asp Pro 50 55 60 Gln Trp Tyr Arg Arg Gly Asp Met Phe Gly Met Thr Met Tyr Thr Asp 65 70 75 80 Leu Phe Ala Gly Lys Leu Thr Asp Leu Ala Lys His Ile Asp Tyr Leu 85 90 95 Lys Glu Gln His Leu Thr Tyr Leu His Leu Met Pro Leu Leu Thr Met 100 105 110 Pro His Pro Asp Asn Asp Gly Gly Tyr Ala Ile Glu Asp Phe Asp Thr 115 120 125 Val Asp Pro Thr Ile Gly Thr Asn Glu Asp Leu Ala Asp Leu Thr Ala 130 135 140 Lys Leu Arg Glu Ala Gly Ile Ser Leu Cys Leu 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Val Asn Tyr Leu Arg 355 360 365 Cys His Asp Asp Ile Gly Trp Gly Leu Asp Glu Asp Val Glu Arg Gln 370 375 380 Leu Gly Ile Asp Pro Leu Lys His Lys Glu Phe Leu Tyr His Phe Tyr 385 390 395 400 Glu Gly Met Val Pro Gly Ser Trp Ala Met Gly Glu Leu Tyr Asn Tyr 405 410 415 Asp Pro Ala Ser Gly Asp Ala Arg Ser Cys Gly Thr Thr Ala Ser Leu 420 425 430 Cys Gly Ile Glu Arg Ala Leu Ile Thr His Asp Arg Pro Leu Tyr Glu 435 440 445 Arg Ser Ile Gln Arg Asp Leu Leu Met His His Ala Met Gly Phe Leu 450 455 460 Arg Gly Phe Pro Met Leu Asn Cys Gly Asp Glu Ile Gly Gln Leu Asn 465 470 475 480 Gly Trp Asp Tyr Lys Glu Asp Pro Asp Arg Val Ala Asp Ser Arg Asn 485 490 495 Leu His Arg Ser Lys Phe Asn Trp Lys Asn Ala Ala Lys Arg Asp Val 500 505 510 Pro Gly Thr Leu Pro Asn Arg Leu Trp Glu Gly Met Ala Asp Val Arg 515 520 525 Gln Met Arg Ser Asp Pro Cys Phe Ala Pro Asp Ala Trp Val Thr Thr 530 535 540 Trp Asp Ala His Asp Asp Gly Ile Leu Ala Met Val Arg Gln Ser Gly 545 550 555 560 Gly Arg Thr Leu Leu Gly Val Phe Asn Phe Ala Asn Arg Asp Ala Thr 565 570 575 Ala Thr Leu Asp Ser Ile Glu Gly Val Ser Leu Pro Arg Thr Val Ala 580 585 590 Leu Lys Pro Tyr Glu Trp Lys Ile Glu Ala Cys 595 600 <210> 3 <211> 603 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS V202I <400> 3 Met Glu Ala Thr Tyr Arg Asp Ser Val Phe Ala Glu Arg Leu Ala Pro 1 5 10 15 Arg Cys Ala Glu Leu Glu Gln Leu Phe Arg Ser Leu Tyr Gly Asp Ser 20 25 30 Pro Glu Phe Asp His Phe Glu Gln Val Met Ala Lys Ala His Ala Asp 35 40 45 Arg Pro Ala Asp Leu Lys Arg Leu Asp Ala Ala Arg Glu His Asp Pro 50 55 60 Gln Trp Tyr Arg Arg Gly Asp Met Phe Gly Met Thr Met Tyr Thr Asp 65 70 75 80 Leu Phe Ala Gly Lys Leu Thr Asp Leu Ala Lys His Ile Asp Tyr Leu 85 90 95 Lys Glu Gln His Leu Thr Tyr Leu His Leu Met Pro Leu Leu Thr Met 100 105 110 Pro His Pro Asp Asn Asp Gly Gly Tyr Ala Ile Glu Asp Phe Asp Thr 115 120 125 Val Asp Pro Thr Ile Gly Thr Asn Glu Asp Leu Ala Asp Leu Thr Ala 130 135 140 Lys Leu Arg Glu Ala Gly Ile Ser Leu Cys Leu Asp Phe Val Met Asn 145 150 155 160 His 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Asp Asp Ile Gly Trp Gly Leu Asp Glu Asp Val Glu Arg Gln 370 375 380 Leu Gly Ile Asp Pro Leu Lys His Lys Glu Phe Leu Tyr His Phe Tyr 385 390 395 400 Glu Gly Met Val Pro Gly Ser Trp Ala Met Gly Glu Leu Tyr Asn Tyr 405 410 415 Asp Pro Ala Ser Gly Asp Ala Arg Ser Cys Gly Thr Thr Ala Ser Leu 420 425 430 Cys Gly Ile Glu Arg Ala Leu Ile Thr His Asp Arg Pro Leu Tyr Glu 435 440 445 Arg Ser Ile Gln Arg Asp Leu Leu Met His His Ala Met Gly Phe Leu 450 455 460 Arg Gly Phe Pro Met Leu Asn Cys Gly Asp Glu Ile Gly Gln Leu Asn 465 470 475 480 Gly Trp Asp Tyr Lys Glu Asp Pro Asp Arg Val Ala Asp Ser Arg Asn 485 490 495 Leu His Arg Ser Lys Phe Asn Trp Lys Asn Ala Ala Lys Arg Asp Val 500 505 510 Pro Gly Thr Leu Pro Asn Arg Leu Trp Glu Gly Met Ala Asp Val Arg 515 520 525 Gln Met Arg Ser Asp Pro Cys Phe Ala Pro Asp Ala Trp Val Thr Thr 530 535 540 Trp Asp Ala His Asp Asp Gly Ile Leu Ala Met Val Arg Gln Ser Gly 545 550 555 560 Gly Arg Thr Leu Leu Gly Val Phe Asn Phe Ala Asn Arg Asp Ala Thr 565 570 575 Ala Thr Leu Asp Ser Ile Glu Gly Val Ser Leu Pro Arg Thr Val Ala 580 585 590 Leu Lys Pro Tyr Glu Trp Lys Ile Glu Ala Cys 595 600 <210> 4 <211> 603 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS Y265F <400> 4 Met Glu Ala Thr Tyr Arg Asp Ser Val Phe Ala Glu Arg Leu Ala Pro 1 5 10 15 Arg Cys Ala Glu Leu Glu Gln Leu Phe Arg Ser Leu Tyr Gly Asp Ser 20 25 30 Pro Glu Phe Asp His Phe Glu Gln Val Met Ala Lys Ala His Ala Asp 35 40 45 Arg Pro Ala Asp Leu Lys Arg Leu Asp Ala Ala Arg Glu His Asp Pro 50 55 60 Gln Trp Tyr Arg Arg Gly Asp Met Phe Gly Met Thr Met Tyr Thr Asp 65 70 75 80 Leu Phe Ala Gly Lys Leu Thr Asp Leu Ala Lys His Ile Asp Tyr Leu 85 90 95 Lys Glu Gln His Leu Thr Tyr Leu His Leu Met Pro Leu Leu Thr Met 100 105 110 Pro His Pro Asp Asn Asp Gly Gly Tyr Ala Ile Glu Asp Phe Asp Thr 115 120 125 Val Asp Pro Thr Ile Gly Thr Asn Glu Asp Leu Ala Asp Leu Thr Ala 130 135 140 Lys Leu Arg Glu Ala Gly Ile Ser Leu Cys Leu Asp Phe Val Met Asn 145 150 155 160 His Thr Ala Ser Thr His Arg Trp Ala Lys Ala 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Arg Thr Val Ala 580 585 590 Leu Lys Pro Tyr Glu Trp Lys Ile Glu Ala Cys 595 600 <210> 5 <211> 603 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS V305I <400> 5 Met Glu Ala Thr Tyr Arg Asp Ser Val Phe Ala Glu Arg Leu Ala Pro 1 5 10 15 Arg Cys Ala Glu Leu Glu Gln Leu Phe Arg Ser Leu Tyr Gly Asp Ser 20 25 30 Pro Glu Phe Asp His Phe Glu Gln Val Met Ala Lys Ala His Ala Asp 35 40 45 Arg Pro Ala Asp Leu Lys Arg Leu Asp Ala Ala Arg Glu His Asp Pro 50 55 60 Gln Trp Tyr Arg Arg Gly Asp Met Phe Gly Met Thr Met Tyr Thr Asp 65 70 75 80 Leu Phe Ala Gly Lys Leu Thr Asp Leu Ala Lys His Ile Asp Tyr Leu 85 90 95 Lys Glu Gln His Leu Thr Tyr Leu His Leu Met Pro Leu Leu Thr Met 100 105 110 Pro His Pro Asp Asn Asp Gly Gly Tyr Ala Ile Glu Asp Phe Asp Thr 115 120 125 Val Asp Pro Thr Ile Gly Thr Asn Glu Asp Leu Ala Asp Leu Thr Ala 130 135 140 Lys Leu Arg Glu Ala Gly Ile Ser Leu Cys Leu Asp Phe Val Met Asn 145 150 155 160 His Thr Ala Ser Thr His Arg Trp Ala Lys Ala Ala Gln Ala Gly Asp 165 170 175 Pro Glu 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Asp Pro Leu Lys His Lys Glu Phe Leu Tyr His Phe Tyr 385 390 395 400 Glu Gly Met Val Pro Gly Ser Trp Ala Met Gly Glu Leu Tyr Asn Tyr 405 410 415 Asp Pro Ala Ser Gly Asp Ala Arg Ser Cys Gly Thr Thr Ala Ser Leu 420 425 430 Cys Gly Ile Glu Arg Ala Leu Ile Thr His Asp Arg Pro Leu Tyr Glu 435 440 445 Arg Ser Ile Gln Arg Asp Leu Leu Met His His Ala Met Gly Phe Leu 450 455 460 Arg Gly Phe Pro Met Leu Asn Cys Gly Asp Glu Ile Gly Gln Leu Asn 465 470 475 480 Gly Trp Asp Tyr Lys Glu Asp Pro Asp Arg Val Ala Asp Ser Arg Asn 485 490 495 Leu His Arg Ser Lys Phe Asn Trp Lys Asn Ala Ala Lys Arg Asp Val 500 505 510 Pro Gly Thr Leu Pro Asn Arg Leu Trp Glu Gly Met Ala Asp Val Arg 515 520 525 Gln Met Arg Ser Asp Pro Cys Phe Ala Pro Asp Ala Trp Val Thr Thr 530 535 540 Trp Asp Ala His Asp Asp Gly Ile Leu Ala Met Val Arg Gln Ser Gly 545 550 555 560 Gly Arg Thr Leu Leu Gly Val Phe Asn Phe Ala Asn Arg Asp Ala Thr 565 570 575 Ala Thr Leu Asp Ser Ile Glu Gly Val Ser Leu Pro Arg Thr Val Ala 580 585 590 Leu Lys Pro Tyr Glu Trp Lys Ile Glu Ala Cys 595 600 <210> 6 <211> 603 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS K393R <400> 6 Met Glu Ala Thr Tyr Arg Asp Ser Val Phe Ala Glu Arg Leu Ala Pro 1 5 10 15 Arg Cys Ala Glu Leu Glu Gln Leu Phe Arg Ser Leu Tyr Gly Asp Ser 20 25 30 Pro Glu Phe Asp His Phe Glu Gln Val Met Ala Lys Ala His Ala Asp 35 40 45 Arg Pro Ala Asp Leu Lys Arg Leu Asp Ala Ala Arg Glu His Asp Pro 50 55 60 Gln Trp Tyr Arg Arg Gly Asp Met Phe Gly Met Thr Met Tyr Thr Asp 65 70 75 80 Leu Phe Ala Gly Lys Leu Thr Asp Leu Ala Lys His Ile Asp Tyr Leu 85 90 95 Lys Glu Gln His Leu Thr Tyr Leu His Leu Met Pro Leu Leu Thr Met 100 105 110 Pro His Pro Asp Asn Asp Gly Gly Tyr Ala Ile Glu Asp Phe Asp Thr 115 120 125 Val Asp Pro Thr Ile Gly Thr Asn Glu Asp Leu Ala Asp Leu Thr Ala 130 135 140 Lys Leu Arg Glu Ala Gly Ile Ser Leu Cys Leu Asp Phe Val Met Asn 145 150 155 160 His Thr Ala Ser Thr His Arg Trp Ala Lys Ala Ala Gln Ala Gly Asp 165 170 175 Pro Glu Tyr Gln Asp Tyr Tyr Phe Cys Tyr Asp Asp 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<210> 7 <211> 603 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS Y414F <400> 7 Met Glu Ala Thr Tyr Arg Asp Ser Val Phe Ala Glu Arg Leu Ala Pro 1 5 10 15 Arg Cys Ala Glu Leu Glu Gln Leu Phe Arg Ser Leu Tyr Gly Asp Ser 20 25 30 Pro Glu Phe Asp His Phe Glu Gln Val Met Ala Lys Ala His Ala Asp 35 40 45 Arg Pro Ala Asp Leu Lys Arg Leu Asp Ala Ala Arg Glu His Asp Pro 50 55 60 Gln Trp Tyr Arg Arg Gly Asp Met Phe Gly Met Thr Met Tyr Thr Asp 65 70 75 80 Leu Phe Ala Gly Lys Leu Thr Asp Leu Ala Lys His Ile Asp Tyr Leu 85 90 95 Lys Glu Gln His Leu Thr Tyr Leu His Leu Met Pro Leu Leu Thr Met 100 105 110 Pro His Pro Asp Asn Asp Gly Gly Tyr Ala Ile Glu Asp Phe Asp Thr 115 120 125 Val Asp Pro Thr Ile Gly Thr Asn Glu Asp Leu Ala Asp Leu Thr Ala 130 135 140 Lys Leu Arg Glu Ala Gly Ile Ser Leu Cys Leu Asp Phe Val Met Asn 145 150 155 160 His Thr Ala Ser Thr His Arg Trp Ala Lys Ala Ala Gln Ala Gly Asp 165 170 175 Pro Glu Tyr Gln Asp Tyr Tyr Phe Cys Tyr Asp Asp Arg Thr Ile Pro 180 185 190 Asp Gln Tyr 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tccgaaatcg tctgcccggc cgtcgtgttc 900 aaaggtgaag tcgtcatggc tcccaaggag ctcgccgcct acttcggcac ccccgagaag 960 cccgaatgcc acatgctgta caacgtgtcc gtcatggtca acttgtggag cgcgctcgcc 1020 aacggcgaca cccgcctgct taaaacccag atcgacaagc tcgacgccct gcccgacaac 1080 tgctggttcg tcaactatct gcgctgccat gacgatatcg gctggggtct ggacgaggat 1140 gtcgaacgcc agttgggcat cgacccgctc aagcacaagg aattcctcta ccacttctac 1200 gagggcatgg tgcccggcag ctgggcgatg ggcgagctgt tcaactatga tccggcgtcc 1260 ggtgacgcgc gcagctgcgg caccacggcg agcttgtgcg gtattgagcg tgcgctgatc 1320 acgcatgacc ggccgctgta tgagcgttcc atccagcgtg atctgctcat gcaccacgct 1380 atgggcttcc tgcgtgggtt cccgatgctc aactgcggcg acgagatcgg ccagctcaac 1440 ggctgggatt ataaggaaga cccggaccgt gtcgctgaca gccgcaatct gcaccgcagc 1500 aagttcaact ggaagaacgc cgcgaagcgc gatgtccccg gaaccttgcc aaaccggctg 1560 tgggaaggca tggcggatgt gcggcagatg cgctcggacc catgcttcgc ccctgacgct 1620 tgggtgacga cgtgggacgc gcatgatgac ggtattctcg cgatggtccg gcagtcaggt 1680 gggcgcacac tgctcggcgt gttcaatttc gcgaaccgtg acgccacggc gacgcttgac 1740 agcatcgagg gcgtgagcct gccgcgtacg gtggcgctca agccatacga gtggaagatc 1800 gaggcctgct ga 1812 <210> 22 <211> 1812 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS Y414F*Y265F <400> 22 atggaagcca catatcgcga ttccgtattc gccgaacggc tcgccccgcg ctgcgcagaa 60 cttgaacaac ttttccgctc gttgtacggg gattcccctg aattcgacca cttcgaacag 120 gtcatggcca aggcccacgc cgaccggcca gccgacctca aacgcctcga cgccgcccgt 180 gaacacgatc cgcaatggta ccgtcgcggc gacatgttcg gcatgaccat gtacaccgac 240 ctgttcgccg gcaaactcac cgatctcgcc aagcatatcg actatctcaa agagcagcat 300 ctgacctacc tgcacctcat gccgctgctg accatgcccc accccgacaa cgacggcggc 360 tacgccatcg aggatttcga caccgtcgac ccgactatcg gcaccaatga ggacctcgcc 420 gacctcaccg cgaaactgcg cgaagccggc atcagcctgt gccttgattt cgtcatgaac 480 cacaccgcat ccacccaccg gtgggcgaaa gccgcacaag ccggcgaccc cgaataccag 540 gactactact tctgctatga cgaccgcacc atccccgacc aatatgacgc cgtcgtcccg 600 caagtcttcc cgaccgccgc ccccggcaac ttcacatgga atgagcagat gggcaaatgg 660 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gaagcaa 27 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS Y265F reverse primer <400> 28 ttgcttccag atgaacggca ccgcgtc 27 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS Y305I forward primer <400> 29 aaaggtgaag tcatcatggc tcccaag 27 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS Y305I reverse primer <400> 30 cttgggagcc atgatgactt caccttt 27 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS K393R forward primer <400> 31 ccgctcaagc acagggaatt cctctac 27 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS K393R reverse primer <400> 32 gtagaggaat tccctgtgct tgagcgg 27 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS S420T forward primer <400> 33 tatgatccgg cgacgggtga cgcgcgc 27 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS S420T reverse primer <400> 34 gcgcgcgtca cccgtcgccg gatcata 27 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS Y414F forward primer <400> 35 atgggcgagc tgttcaacta tgatccg 27 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BtAS Y414F reverse primer <400> 36 cggatcatag ttgaacagct cgcccat 27

Claims (20)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성이 있는 아미노산 서열을 가지며, 수크로스를 포함하는 기질로부터 투라노스를 전환하는 활성을 갖는, 효소 단백질.
2. 제1항에 있어서,
   상기 효소 단백질은 비피도박테리움 터모필럼(Bifidobacterium thermophilum) 유래인 것인, 효소 단백질.
3. 제1항에 있어서, 상기 기질은 프럭토스를 추가로 포함하는 것인, 효소 단백질.
4. 제3항에 있어서, 상기 기질은 수크로스 0.1 내지 2.5M 및 프럭토스 0.25 내지 1.5M을 포함하는 것인, 효소 단백질.
5. 제1항에 있어서, 상기 효소 단백질은 아래 특성으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 특성을 갖는 것인, 효소 단백질:
   (1) 단량체의 분자량이 65 내지 75 kDa
   (2) 최적 온도가 30 내지 65℃, 및
   (3) 최적 pH가 5.0 내지 7.0.
6. 제1항에 있어서, 상기 효소 단백질은, 서열번호 1를 갖는 아미노산 서열의 200번째, 202번째, 265번째, 305번째, 393번째, 414번째 및 420번째 위치로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 위치의 아미노산이 치환된 것인, 효소 단백질.
7. 제6항에 있어서, 상기 효소 단백질은, 서열번호 1를 갖는 아미노산 서열의 200번째, 202번째, 265번째, 305번째, 393번째, 414번째 및 420번째 위치로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 위치의 아미노산이 아르기닌, 이소루신, 페닐알라닌 및 트레오닌으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 아미노산으로 치환된 것인, 효소 단백질.
8. 제7항에 있어서, 상기 효소 단백질은, 서열번호 1를 갖는 아미노산 서열의 아미노산이 아래의 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 것인, 효소 단백질:
   200번째 아미노산이 아르기닌으로 치환,
   202번째 아미노산이 이소루신으로 치환,
   265번째 아미노산이 페닐알라닌으로 치환,
   305번째 아미노산이 이소루신으로 치환,
   393번째 아미노산이 아르기닌으로 치환,
   414번째 아미노산이 페닐알라닌으로 치환, 및
   420번째 아미노산이 트레오닌으로 치환.
9. 제7항에 있어서, 상기 효소 단백질은 서열번호 1 내지 11의 아미노산 서열을 갖는 것인, 효소 단백질.
10. 제1항에 있어서, 상기 효소 단백질은 pH6 및 50℃의 온도에서 기질 2M 수크로스를 반응 시, 기질 농도 100%에 대한 생성된 투라노스 농도로 산출되는 투라노스 전환율 10 내지 60%인, 효소 단백질.
11. 제1항에 있어서, 상기 효소 단백질은, pH6 및 50℃의 온도에서 기질 2M 수크로스를 반응 시, 시간 당 생성되는 투라노스가 3 내지 80g/L/h인, 효소 단백질.
12. 서열번호 1 내지 11의 아미노산 서열 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드.
13. 제12항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12 내지 22의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 것인, 폴리뉴클레오티드.
14. 서열번호 1 내지 11의 아미노산 서열 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터.
15. 제14항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 것인, 재조합 발현 벡터.
16. 서열번호 1 내지 11의 아미노산 서열 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된, 아밀로수크라제 효소 단백질을 발현하는 재조합 미생물.
17. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 효소 단백질, 제16항의 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물의 배양물, 또는 상기 재조합 미생물의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 투라노스 생산용 조성물.
18. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 효소 단백질, 제16항의 재조합 미생물 균체, 상기 재조합 미생물의 배양물, 또는 상기 재조합 미생물의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 수크로스를 포함하는 기질과 반응시키는 단계를 포함하는, 투라노스 생산 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 기질은 수크로스 0.1 내지 2.0M 및 프럭토스 0.5 내지 1.5M을 포함하는 것인, 투라노스 생산 방법.
20. 제18항의 생산 방법으로 생산된, 투라노스 함유 당 조성물.

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