CN103834631A - 一种青霉素g酰化酶突变体及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种青霉素G酰化酶突变体及其编码基因和应用，所述青霉素G酰化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了所述的青霉素G酰化酶突变体在合成头孢类抗生素中的应用。本发明提供了一种新的青霉素G酰化酶突变体，与野生型相比，青霉素G酰化酶突变体在合成头孢类抗生素如头孢丙烯、头孢克洛或头孢羟氨苄时具有更高的活性，尤其是在催化7-APRA与侧链2-羟基乙基对羟基苯甘氨酸酯合成头孢丙烯时，酶活力极大提高，比活力由原先1.5U/mg提升到35U/mg，且合成水解活力比没有下降，合成水解比可达1.8。

Description

一种青霉素G酰化酶突变体及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物催化领域，尤其涉及一种青霉素G酰化酶突变体及其编码基因和应用。

背景技术

目前越来越多的药物或其中间体是通过一种生物酶催化合成的方式，而非化学合成。很明显，酶催化相比于传统的化学合成有极大的优势：（1）生物反应中可更好地避免有毒的反应试剂或溶剂；（2）酶具有高效率、底物特异性等特点；（3）更好的避免副反应的发生。

酰化酶是一类催化酰胺水解成相应羧酸的水解酶，其来源十分广泛且作用底物谱广，可以广泛作用于水解脂肪、芳香、杂环氨基酰胺类酰胺，但是酶活差别巨大。当底物为芳香、杂环类酰胺，尤其是存在邻位取代基时，酰化酶的活力受到显著干扰，这种干扰与空间位阻和电子效应有关。

立体选择性酰化酶是一种重要的手性合成工具酶，在制备手性羧酸及其衍生物方面具有广阔的应用前景，日益受到重视。近几年来腈化合物的生物催化技术迅速发展，酰化酶结合腈水合酶能有效地水解腈化合物生产多种酰胺和羧酸，应用于医药农药食品及饲料行业。研究发现，在腈水合酶/酰化酶的双酶体系中，立体选择性主要产生于酰胺水解这一步，尤其是对位为手性中心的底物，酰化酶具有很好的立体选择性，这使得它在制备手性中间体及光学纯的氨基酸方面具有巨大的潜力而日益受到工业界的重视。

青霉索G酰化酶属于水解酶家族，作用于肽键以外的碳-氮键，特别是直链酰胺键，其系统的名字是青霉素水解酶，别名包括青霉素酰化酶，脂肪酶，β-内酰胺水解酶，氨苄青霉素酰化酶。青霉索G酰化酶不仅可以水解青霉素或头孢菌素，分别生成β-内酰胺类抗生素工业中的母核6-APA（6-氨基青霉烷酸）和7-ACA（7-氨基头孢烷酸），而且能够催化酰基侧链与β-内酰胺之间的缩合反应，合成诸如阿莫西林、头孢羟氨苄、头孢克洛、头孢丙烯等β-内酰胺类抗生素。

国内外对于生物催化合成β-内酰胺类抗生素的研究越来越多，其中一个关键问题是所用的酶往往不能完全满足实际工业化生产的要求，酶的稳定性、活性、手性选择性等欠佳，如本申请中涉及的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示的青霉素G酰化酶，虽然其能够催化缩合7-APRA与侧链2-羟基乙基对羟基苯甘氨酸酯合成头孢丙烯，但是酶活力较低，仅为1.5U/mg左右，因此，有必要对其进行改造，提高酶活力。在野生型酶的基础上设计点突变的构建新的突变体酶是一种常用的改善酶特性的方法。构建突变体酶的方法主要可分为三种类：非理性突变，半理性突变，理性突变。

非理性突变：首先对基因随机突变，获得基因文库后进行筛选出有利的突变体，其中，体外随机突变的技术多种多样，主要有易错PCR技术（error-prone PCR），DNA重排技术（DNA rearrangement method），基因家族重排技术（gene family rearrangement method）等。这种方法工作程序简单明了，可能会出现突变极好的突变体，但也可能不会。突变库容量较大，筛选出有利突变体的概率较低。

半理性突变：组合活性位点测试（CASTing）就是其中的一种。基本要点是：通过同源建模或晶体结构确定酶底物口袋中侧链朝向位点的氨基酸残基，同时选择可以与其相互作用的另一个残基，构建饱和突变体库，以达到减少突变库容量的同时增加筛选出有益突变的概率。其构库依据一般为选定底物口袋

范围内的所有氨基酸残基，将侧链朝向底物口袋的选出，根据其所在的位点的二级结构（ɑ螺旋为n+4，β折叠为n+2，loop为n+1）选定另一个氨基酸，针对这两个氨基酸构建饱和突变进行筛选。这种策略构建的突变库库容量小，有效性高。

理性突变：在酶-底物三维建模和底物对接的基础上，加以软件分析，通过化学量子计算、热能计算、分子动力学分析等，在酶活性中心区域选择有效的点进行定向突变，直接获得有益的突变体。这种方法突变库的量极小，筛选出优突变的概率基本上达到100%。然而，前期的计算工作量极大，时间长需要知识的较多前期积累，现阶段还无法达到通过先计算再进行定点定向突变的程序。

无论采用何种方法，只有使酶在适宜的突变位置发生特定方向的突变才有可能改善酶的催化特性。

发明内容

本发明提供了一种青霉素G酰化酶突变体，用于合成头孢类抗生素，且酶催化活力提高。

一种青霉素G酰化酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明通过定点突变，在野生型青霉素G酰化酶的基础上引入突变位点，将其621位丝氨酸（Ser）突变为甘氨酸（Gly），获得了本发明的青霉素G酰化酶突变体，其中，野生型青霉素G酰化酶的氨基酸序列如SEQID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了编码如所述的青霉素G酰化酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明又提供了包含所述基因的表达盒、重组载体和重组转化子。

所述重组载体的原始载体具体可以为Pet-28a。

所述重组转化子的宿主细胞为大肠杆菌，具体可以为大肠杆菌JM109。

本发明还提供了所述的青霉素G酰化酶突变体在合成头孢类抗生素中的应用。

本领域普通技术人员根据本发明提供的青霉素G酰化酶突变体的氨基酸序列，可以方便的进行重组获得基因工程菌，以基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞破碎后的上清液或者纯化后的酶液作为酶源，可用于催化合成头孢类抗生素，其中，所述头孢类抗生素为头孢丙烯、头孢克洛或头孢羟氨苄，优选为头孢丙烯。

在合成上述头孢类抗生素的过程中，合成头孢丙烯的原料优选为7-氨基-3-[(Z)-烯丙基-1-基]-3-头孢环-4-羧酸（7-APRA）和对羟基苯甘氨酸酯（或其盐酸盐），其中对羟基苯甘氨酸酯可以为2-羟基乙基对羟基苯甘氨酸酯、对羟基苯甘氨酸乙酯、对羟基苯甘氨酸甲酯等；合成头孢克洛的原料优选为7-氨基-3-氯-头孢烯酸(7-ACCA)和苯甘氨酸甲酯（或其盐酸盐）；合成头孢羟氨苄的原料优选为7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)和对羟基苯甘氨酸甲酯（或其盐酸盐）。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供了一种新的青霉素G酰化酶突变体，与野生型相比，青霉素G酰化酶突变体在合成头孢类抗生素如头孢丙烯、头孢克洛或头孢羟氨苄时具有更高的活性，尤其是在催化7-APRA与侧链2-羟基对羟基苯甘氨酸乙酯合成头孢丙烯时，突变特定位置的氨基酸生成的突变体同野生型酶相比，酶活力极大提高，比活力由原先1.5U/mg提升到35U/mg，且合成水解活力比没有下降，合成水解比可达1.8。

附图说明

图1为采用本发明青霉素G酰化酶突变体催化反应的反应液的高效液相色谱图。

图2为实施例3的反应原理图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。

实施例1定点突变

将青霉素G酰化酶的Ser621突变为Gly，因此利用oligo7软件设计平末端引物，然后进行PCR定点突变。本次PCR突变采用KOD-Plus-NeoDNA聚合酶试剂盒（购买来自东洋纺科技有限公司，上海），引物的碱基序列为：

Ser-gly-F：5’-GGGGCTCTGCCGCGTCTGGCTGGTGACG

Ser-gly-anti：5’-CGCGGCAGAGCAGAGTCGATAGCA

PCR反应体系如表1所示。

表1定点突变反应体系

10×reaction buffering	5μl
		dNTPs（各2mM）	5μl
Mg2+（25mM）	3μl
		模板	1μl
Ser-gly-F（10mM）	1.5μl
		Ser-gly-anti（10mM）	1.5μl
KOD enzyme（1U/μl）	1μl
		ddH2O	32μl
Total	50μl

模板为含有野生型青霉素G酰化酶基因的质粒，委托公司合成，其中，质粒载体为PET-28a，野生型青霉素G酰化酶基因如SEQ ID NO.4所示，该基因来源物种为绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）。

PCR循环过程：

将PCR产物回收，50μl的体系里加入DpnⅠ（1μl），37℃下保持1.5h，用以消化模板，然后以琼脂糖（1%）凝胶电泳检测其是否定点突变完成。在保证琼脂糖凝胶上跑出明显条带后，PCR cleaning试剂盒（购买于捷瑞生物工程有限公司，上海）清洗后进行PNK连接。

PNK激酶（捷瑞生物工程有限公司，上海）连接体系为：

Ligation Buffer    5μl

PNK激酶            1μl

PCR cleaning       10μl。

混合均匀后，放置于PCR仪里16℃、1.5h后，可完成连接，即获得含突变型青霉素G酰化酶基因的重组质粒，突变型青霉素G酰化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2青霉素G酰化酶突变体的表达与纯化

1、青霉素G酰化酶突变体的表达

将实施例1得到的重组质粒转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，10h后观察菌生长状况，挑取重组转化子活化，并扩大培养翻译表达。

（1）将重组转化子接种于装有5ml含卡那霉素（50μg/ml）的LB培养基中，置于37℃、200rpm摇床中震荡培养，至OD600达到0.4～0.5左右，获得种子液。

（2）将种子液以1%的接种量接种于自诱导培养基中，25℃培养48小时。

自诱导培养基配方为：阿拉伯糖3g/L，葡萄糖0.5g/L，甘油5g/L，蛋白胨10g/L，磷酸盐6.8g/L，硫酸盐1.2g/L，NH₄Cl2.65g/L，MgSO₄0.98g/L，CaCl₂0.1g/L。

（3）将菌液以超声波破碎，离心后获得上清，即为粗酶液，SDS-PAGE检测粗酶液中的蛋白含量。

2、青霉素G酰化酶突变体的纯化

蛋白纯化可采用常规的方法。

蛋白质Ni⁺柱纯化：取1ml的带Ni⁺琼脂糖以缓冲液A先进行平衡10min后，加入5ml粗酶液，充分摇荡30min（使蛋白与带Ni⁺琼脂糖充分结合），放掉废液，以缓冲液A冲洗三次后，适量缓冲液B充分摇荡均匀20min，洗脱蛋白。SDS-PAGE检测蛋白的纯化效果。

缓冲液A：NaCl140mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄1.8mmol/L，以5M NaOH调节pH值至8.0；

缓冲液B：NaH₂PO₄·2H₂O50mM，NaCl300mM，imidazole（咪唑）500mM，以5M盐酸溶液调节pH值至8.0；

盐析：向经Ni+柱纯化的蛋白质溶液中加入过量的硫酸铵，盐析出蛋白质（硫酸铵应逐步加入，缓慢溶解，避免局部盐浓度过大，导致蛋白质变性。），硫酸铵充分溶解后将其放置于4℃冰箱，充分盐析3h，3000rpm，10min离心，获得沉淀，向内加入1ml15%甘油进行溶解，得蛋白样品。

脱盐：采用G25为填料的脱盐柱（海门市三和豪发实验器材厂）脱去蛋白样品中的咪唑、硫酸铵，即得纯化的青霉素G酰化酶突变体。

实施例3  青霉素G酰化酶突变体在合成头孢丙烯中的应用

本实施例采用的技术方案如图2所示。

由图2反应式可知，青霉素G酰化酶既能够缩合母核与侧链生成产物，又可分解产物生成母核与侧链，该反应的可逆性大小决定于该反应的平衡常数。然而2-羟基乙基对羟基苯甘氨酸酯本身可分解为对羟基苯甘氨酸，因此提高青霉素G酰化酶的合成活力具有重要的意义。

反应体系：底物溶液(40mM7-氨基-3-[(Z)-烯丙基-1-基]-3-头孢环-4-羧酸（7-APRA，CAS号：120709-09-3），40mM2-羟基乙基对羟基苯甘氨酸酯（CAS号：203007-73-2）)0.525ml，0.1ml酶液，28℃水浴反应，20min后，取10μl反应液稀释至840μl水中，充分混合，高效液相色谱仪检测产物峰滞留时间与出峰面积，记录数据并计算酶的比活力以及合成水解比。以未经突变的青霉素G酰化酶（野生型青霉素G酰化酶参照实施例2的方法进行表达和纯化）为对照。

计算方式：

1、比活力

$U=\frac{w^{*}{c}^{*}V}{t^{*}v},$

比活力=U/M；

U：28℃，每催化反应1μmol的底物所需要的酶量；

w：反应的产率，即底物的减少量与初底物的比值；

c：反应液中初底物的浓度（mol/l）；

V：反应液体积（ml）；

t：反应时间（min）；

v：加入反应酶液的量（ml）；

M：酶液的蛋白含量。

2、合成水解比（S/H）

S/H=N_{-头孢丙烯}/N_{-对羟基苯甘氨酸}；

N_{-头孢丙烯}：体系中头孢丙烯的摩尔浓度；

N_{-对羟基苯甘氨酸}：体系中对羟基苯甘氨酸的摩尔浓度。

检测目标产物头孢丙烯的核磁氢谱（DMSO）为：δ9.52(1H,COOH)，δ8.75(1H,s,OH)，δ8.32(1H,s，NH)，δ7.11(2H,s)、δ6.74(2H,s)（C₆H₄-），δ6.74(1H,CH=CH)，δ6.39(1H,CH=CH)，δ5.72(1H,s,14-H)，δ5.32（1H，s，7-H），δ4.89（1H，s，6-H），δ4.52(1H,s)、δ4.44(1H,s)（NH₂），δ3.64(1H,d，J=16.8Hz)、δ3.48(1H,d，J=16.8Hz)（4-H），δ1.64（3H，d，J=6.6Hz,CH₃）。

与目标产物头孢丙烯的分子结构（如式（Ⅰ））一致。

表2  野生青霉素G酰化酶和突变体的比活力和S/H

表3  图1中出峰时间与物质名称对应关系

采用本发明青霉素G酰化酶突变体催化合成头孢丙烯的反应液高效液相色谱（HPLC）图见图1，各出峰时间与物质名称对应关系见表6，顺式头孢丙烯占的比例是86%。

比活力U和合成水解比S/H的计算结果如表2所示，经突变后，本发明青霉素G酰化酶的突变体的比活力（比活）可达35U/mg，较野生型青霉素G酰化酶（比活仅为1.5U/mg）提高了23倍以上，合成水解比为1.8，顺式头孢丙烯的产率可达84%。

实施例4  青霉素G酰化酶突变体在合成头孢克洛中的应用

底物溶液改为：40mM7-氨基-3-氯-头孢烯酸（7-ACCA，CAS号：53994-69-7），40mM苯甘氨酸甲酯（CAS号：24461-61-8）)，具体实验方法如实施例3所述，记录并计算数据。

检测目标产物头孢克洛的核磁氢谱（D₂O）为：δ7.48(5H,s,C₆H₅-)，δ5.67(1H,d，J=4.9Hz，7-H)，δ5.16(1H,s，11-H)，5.09(1H,d，J=4.9Hz，6-H)，δ3.74(1H,d，J=18Hz，4-H)，δ3.29(1H,d，J=18Hz，4-H)

与目标产物头孢克洛的分子结构（如式（Ⅱ））一致。

表4野生青霉素G酰化酶和突变体催化头孢克洛的合成

如表4所示，经突变后，本发明青霉素G酰化酶的突变体催化合成头孢克洛的比活可达24.3U/mg，较野生型青霉素G酰化酶（比活仅为1.8U/mg）提高了13倍以上，合成水解比为1.7，头孢克洛的产率可达58.3%。

实施例5 青霉素G酰化酶突变体在合成头孢羟氨苄中的应用

底物溶液改为7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸（7-ADCA，CAS号：22252-43-3）,40mM对羟基苯甘氨酸甲酯（CAS号：37763-23-8），，具体实验方法如实施例3所述，记录并计算数据。

检测目标产物头孢羟氨苄的核磁氢谱（D₂O）为：δ6.9-7.35（4H,m，C₆H₄-）;δ5.59（1H,d,7-H）;δ5.15（1H,s,12-H）;δ4.98（1H,d,6-H）;δ3.02-3.42（2H,m,4-H）;δ1.8（3H,s,CH₃）

与目标产物头孢羟氨苄的分子结构（如式（Ⅲ））一致。

表5野生青霉素G酰化酶和突变体催化头孢羟氨苄的合成

编号

反应时间

蛋白用量

产率（%）

比活

S/H

	（min）	（mg）		（U/mg）
						野生型	20	0.03	5.5	2.3	1.5
突变体	20	0.03	27.6	11.5	1.4

如表5所示，经突变后，本发明青霉素G酰化酶的突变体催化合成头孢羟氨苄的比活可达11.5U/mg，较野生型青霉素G酰化酶（比活仅为2.3U/mg）提高了5倍以上，合成水解比为1.4，头孢羟氨苄的产率可达27.6%。

实施例6青霉素G酰化酶突变体在合成头孢丙烯中的扩大试验

反应开始为50ml体系，反应条件如下：

3g7-APRA加入35ml酶液中，用氨水调节pH至8.0，使其完全溶解。4g加入15ml酶液中，得2-羟基乙基对羟基苯甘氨酸酯溶液，然后15ml的2-羟基乙基对羟基苯甘氨酸酯溶液流加入7-APRA体系（流加15分钟），此时反应体系pH为6.4。流加的同时水浴锅的温度降至20度（从原来的26度到15度，降温时间为8分钟）。450转/分钟磁力搅拌进行反应。反应进行5小时左右有头孢丙烯析出，50ml水流加进入体系，流加30分钟完成。反应用控制pH在6.0到6.5之间。反应18小时后结束。此时反应pH为6.15。总的反应体系为100ml。取样液相检测。

表6  青霉素G酰化酶突变体应用于头孢丙烯的扩大生产

如表6所示，青霉素G酰化酶突变体应用于头孢丙烯的扩大试验，7-APRA的转化率可达99%，头孢丙烯的得率可达93.8%。

Claims (10)

1.一种青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种编码如权利要求1所述的青霉素G酰化酶突变体的基因。

3.一种包含如权利要求2所述基因的表达盒。

4.一种包含如权利要求2所述基因的重组载体。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，原始载体为Pet-28a。

6.一种包含如权利要求2所述基因的重组转化子。

7.如权利要求7所述的重组转化子，其特征在于，宿主细胞为大肠杆菌。

8.如权利要求1所述的青霉素G酰化酶突变体在合成头孢类抗生素中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述头孢类抗生素为头孢丙烯、头孢克洛或头孢羟氨苄。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，合成头孢丙烯的原料为对羟基苯甘氨酸酯或其盐酸盐、7-氨基-3-[(Z)-烯丙基-1-基]-3-头孢环-4-羧酸和对羟基苯甘氨酸酯；合成头孢克洛的原料为苯甘氨酸甲酯或其盐酸盐、7-氨基-3-氯-头孢烯酸和；合成头孢羟氨苄的原料为对羟基苯甘酸甲酯或其盐酸盐、7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸。

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