DE10112608A1

DE10112608A1 - Mutierte Glutarylamidase und deren Verwendung zur Herstellung von 7-Amino-Cephalosporansäure (7-ACS) und deren Derivaten

Info

Publication number: DE10112608A1
Application number: DE10112608A
Authority: DE
Inventors: Klaus-Peter Koller; Gudrun Lange; Klaus Sauber; Karin Fritz-Wolf; Wolfgang Kabsch
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-03-14
Filing date: 2001-03-14
Publication date: 2002-09-19

Abstract

Die Erfindung betrifft mutierte Glutarylamidase und ein Verfahren zur Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure unter deren Verwendung.

Description

7-Amino-Cephalosporansäure ist Ausgangsprodukt für die semisynthetische Herstellung diverser Cephalosporin-Antibiotika. Zur großtechnischen Produktion aus fermentativ hergestelltem Cephalosporin C bedient man sich entweder eines peptidchemischen oder eines der enzymatischen Verfahren, wobei letzteres aus ökonomischen und vor allem aus Gründen des Umweltschutzes bevorzugt ist.

Um auf enzymatischen Wege von Cephalosporin C zu 7-ACS zu gelangen, bieten sich drei technisch gangbare Verfahren an. Im ersten Verfahren wird Cephalosporin C zunächst chemisch oxidativ decarboxyliert zu Glutaryl-7-ACS. Dieses Substrat wird dann mit Hilfe des Enzyms Glutarylamidase in 7-ACS weiter prozessiert. Dieses Verfahren ist mit hohen Umweltbelastungen und Kosten verbunden.

Im zweiten Verfahren wird die oxidative Decarboxylierung enzymatisch mit Hilfe der D-Aminosäureoxidase durchgeführt. Glutaryl-7-ACS wiederum wird dann mit dem Enzym Glutarylamidase unter Abspaltung des Glutarylrestes zu 7-ACS umgesetzt (Literatur: K. Buchholz und V. Kasche, Biokatalysatoren und Enzymtechnologie, VCH Verlag, Weinheim, 1. Auflage 1997). Diese Verfahren ist umweltschonend und wird technisch genutzt.

Um vornehmlich aus Kostengründen den zweistufigen enzymatischen Prozess zu umgehen, wird als drittes Verfahren die Verwendung des Enzyms Cephalosporin-C- Acylase beschrieben, das Cephalosporin C direkt in 7-ACS umsetzen kann (Ishii, Y. et al., Eur. J. Biochemistry, 230, 773-778 (1995)). Allerdings sind die spezifischen Aktivitäten dieses Enzyms für einen technischen Einsatz so gering, dass man versucht hat, die enzymatische Aktivität durch Mutagenese des Enzyms zu verbessern. Ein technischer Prozess auf Basis dieses Ein-Enzym-Verfahrens ist bislang dennoch nicht literaturmäßig bekannt geworden.

Aufgabe der Erfindung ist, die Wirtschaftlichkeit des zwei Enzyme benötigenden enzymatischen 7-ACS Verfahrens zu verbessern. Diese Aufgabe wird gelöst dadurch, dass das Verfahren im Unterschied zu bekannten Verfahren mutierte Glutarylamidase verwendet wird, die Cehalosporin C direkt zu 7-ACS spalten kann. Durch Verwendung des mutierten Enzyms ist es möglich, zu einem Ein-Enzym- Verfahren zu kommen, das verfahrenstechnisch einfacher und bedeutend kostengünstiger ist.

Insbesondere zeichnet sich das Verfahren dadurch aus, daß die enzymatischen Umsetzungen in einem pH-Bereich von pH 7.5-8.5, vorzugsweise bei pH 8.2, durchgeführt werden, wodurch autokatalysische Zersetzung von Cephalosporin C minimiert wird. Die Konzentration von Cephalosporin C im Reaktionsansatz kann im Bereich von 20-200 mM liegen, wobei 50-120 mM bevorzugt sind. Bei den Umsetzungen wird eine Enzymkorizentration von 0.25-10 mg/ml im Reaktionsansatz verwendet, vorzugsweise 2 mg/ml. Der Temperaturbereich ist variabel zwischen 15 und 45°C.

Zur weiteren Kostensenkung kann das mutierte Enzyme bei den Umsetzungen auch trägerfixiert verwendet werden, wobei die in der industriellen Enzymologie verwendeten Tägermaterialien genutzt werden können (K. Buchholz und V. Kasche, Biokatalysatoren und Enzymtechnologie, VCH Verlag, Weinheim, 1. Auflage 1997)

Das Enzym Glutarylamidase hat zwar eine hohe spezifische Aktivität gegenüber Glutaryl-7-ACS, kann aber Cephalosporin C nicht direkt zu 7-ACA umsetzen. Es hat deshalb nur als Glutaryl-7-ACS-spaltendes Enzym Eingang in industrielle Prozesse gefunden.

Die Genstruktur für dieses Enzyms wurde in den Patentanmeldungen EP-A0504798 und EP-A0708180 beschrieben. Letztere Anmeldung beschreibt auch ein neues Verfahren zur gentechnischen Herstellung des Enzyms. Die gute operationale Stabilität und die hohen Umsatzzahlen machen dieses Enzym daher besonders geeignet für technische Umsetzungen.

Um das Enzym Glutarylamidase für den Einsatz in einem Ein-Enzym-Verfahren verfügbar zu machen, werden in der vorliegenden Anmeldung mutierte Enzyme der Glutarylamidase beschrieben, die Cephalosporin C als Substrat erkennen und direkt in 7-ACS spalten. Ausgehend von der Kristallstruktur des Enzyms wird dieses Ziel durch Protein Engineering erreicht, ohne evolutionäre Strategien zu nutzen (Arnold, F. H., Nature 409, 253-257, 2001)

Das in den o. a. Patenten beschriebene Enzym Glutarylamidase besteht aus zwei verschieden großen Untereinheiten, die aus einem 720 Aminosäuren umfassenden Vorläuferprotein durch im Periplasma des Expressionsorganismus ablaufende Prozessierungsschritte gebildet werden und dort zu einem funktionsfähigen Enzym assoziieren. Die kleine Untereinheit (A-Kette) umfasst im funktionsfähigen Enzym 160 bzw. 161 Aminosäuren, die große Untereinheit (B-Kette) 522 Aminosäuren. Die Proteinsequenzen sind in Tabelle 1 niedergelegt.

Die für die Änderung der Substratspezifität des Enzyms notwendigen Mutationen in der Aminosäresequenz basieren auf der genauen Analyse der Aminosäuren, die an der Bindung von Glutary-7-ACS beteiligt sind. Diese Aminosäuren konnten aufgrund einer selbst ermittelten 3D-Struktur des Enzyms verbunden mit dem Einmodellieren des Subtrats Glutary-7-ACS im Vergleich zum Substrat Cephalolsporin C identifiziert werden.

In einer Veröffentlichung von Kim, Y. et al., Structure, 8, 1059-1086 (2000) wird - unabhängig von unserer kristallographischen Analyse - eine 3D-Struktur des Enzyms Glutarylamidase beschrieben. Die Autoren benennen sieben Aminosäurereste, Leu B 24, Phe B24, Phe B31, Gln 850, Leu B53, Arg B57, Phe B58, Phe B177, die sich in der Bindungstasche des Enzyms befinden, als Kandidaten für Substitutionen, die darauf abzielen, die Aktivität verschiedener in der Literatur beschriebener Glutarylamidasen gegenüber Cephalosporin C zu verbessern.

Kim, Y. et al. leiten die Bindungstasche (Siehe Fig. 2 und 3, S. 1063/1064) durch einen Sequenzhomologievergleich und Überlagerung der Struktur mit einem verwandten Enzym, der Penicillin-G-Acylase (Duggleby, H. J. et al., Nature, 373, 264-268 (1995) ab. Da kein Cephalosporin C-Enzymkomplex beschrieben wird, werden auch keine weiteren Details über die Funktionen der oben beschriebenen Aminosäurereste und ihre Rolle in der Bindung bzw. enzymatischen Spaltung angegeben.

Ein Vergleich der Proteinsequenzen des in den oben angegebenen Patentanmeldungen genannten Enzyms mit der in der Publikation von Kim, Y. et al. genannten Proteinsequenz der dort verwendeten Glutarylamidase ergab eine weitgehende Sequenzhomologie zu dem in den beiden Patenten beschriebenen Enzym. Homologien in der 3D Struktur der Glutarylamidase zeigen sich auch mit dem Enzym Penicillin-G-Acylase, die von Duggleby, H. J. et al. beschrieben wurde.

Erfindungsgemäß wurde nun Glutaryl-7-ACS in die putative Bindungstasche der Glutarylamidase einmodelliert und mit der Orientierung des Phenylessigsäurerestes in der Bindetasche der Penicillin-G-Acylase verglichen. Nimmt man nun den von Duggleby, H. J. et al. vorgeschlagenen Spaltmechanismus für Serinproteasen als Basis, dann wurde das Substrat Glutaryl-7-ACS so einmodelliert, das Serin B1 das Carbonylatom am Glutarylrest angreifen kann und das Val B70 und Asn B244 das Oxyanion-Loch bilden können. Die Carboxylat-Seitenkette des Glutarylrestes wurde so modelliert, dass sie mit Arg B57 interagieren kann. Dabei wurde die gleiche Orientierung für die Seitenkette genutzt, wie sie für die Phenylessigsäure in Penicillin im Enzym Penicillin-G-Acylase orientiert ist. In der Penicillin-G-Acylase ist die Seitenkettenbindungstasche hydrophob, wohingegen die Glutarylamidase an dieser Stelle mit Arg B57 hydrophil ist, und somit mit dem Glutarylseitenkettencarboxylat interagieren kann. Diese Gegebenheiten sind in Abb. 2 veranschaulicht.

Ersetzt man nun Glutaryl-7-ACS durch die räumliche Struktur von Cepahlosporin C in der Bindetasche, erhält man ungünstige Interaktionen, die erklären, warum Glutarylamidase die Spaltung von CPC nicht katalysieren kann. Die Überlagerung der Sequenz der Cephalosporin-C-Acylase mit der der Glutarylamidase lässt vermuten, dass Mutationen von Phe B177 in Histidin Interaktionen mit der Aminogruppe von Cephalosporin C ermöglichen. Hier sollte sich die zusätzliche Mutation Thr176 Asp günstig auf den basischen Zustand des Histidins und die Stabilisierung der Substratbindung auswirken.

Zur Bindung der Carboxylatgruppe von Cephalosporin C bietet sich Arg B57 in der nativen Ga-Sequenz an. Als Alternativen bieten sich an:

a) die Doppel-Mutation Arg B57 His und Leu B24 Arg, wie der Vergleich mit Cephalosporin C Acylase vermuten lässt.
b) Die Doppel-Mutation Arg B57 His, Gln B50 Arg, wie sich aus dem modellierten Enzym-Substrat Komplex ergibt.

Mutationen Tyr A150 Ala und/oder Tyr B153 Ala führen zu einer Vergrößerung der Bindungstasche, um das größere Substrat Cephalosporin C besser einpassen zu können.

Mutationsstudien mittels Chemikalien wurden bislang für die Cephalosporin-C- Acylase durchgeführt (Ishii, Y. et al., Eur. J. Biochemistry, 230, 773-778 (1995)).

Dabei wurde gefunden, dass in diesem Enzym wahrscheinlich Tyr B32 (dort als Tyr 270 beschrieben) mit Serin 1 der B-Kette (dort als Serin 239 beschrieben) interagiert und dass die Mutation Tyr B32 in Glutamat die enzymatische Aktivität unterbindet.

Im Gegensatz zu dem bei Kim, Y. et al andiskutierten Sequenzvergleich wurde nun überraschenderweise gefunden, dass TyrB33 in der 3D Struktur der Glutarylamidase mit Tyr B32 in der Cephalosporin-C-Acylase korrespondiert, da dies das einzige Tyrosin in der Nähe von Serin B1 und der Glutarylseitenkette ist. Dieses von oben genannten Autoren abweichende Sequenzarrangement erklärt den Verlust der katalytischen Aktivität, wenn dieser Rest zu einem negativ geladenen Glutamatrest mutiert wird.

Erfindungsgemäß führen folgende Mutationen in der Glutarylamidase zu Enzymen mit geänderter Substratbindung, die in Folge direkte Katalyse der Cephalosporinspaltung in 7-ACS bewirken.

1. Phe B177 His, Leu B24 Arg
2. Phe B177 His, Leu B24 Arg, Arg B57 His, Gln B50 (Val oder Ala)
3. Phe B177 His, Leu B24 Arg, Arg B57 His, Gln B50 (Val oder Ala), Val B70 His
4. Phe B177 His, Leu B24 Arg, Arg B57 His, Gln B50 (Val oder Ala), Val B70 His, TyrB 153 Leu
5. Phe B177 His, Thr B176 Asp
6. Phe B177 His, Thr B176 Asp, Tyr A150 Ala (Tyr A150 Ala for sterical reasons)
7. Phe B177 His, Thr B176 Asp, Leu B24 Arg, Arg B57 His
8. Phe B177 His, Thr B176 Asp, Leu B24 Arg, Arg B57 His, Tyr A150 Ala
9. Phe B177 His, Thr B176 Asp, Gln B50 Arg, Arg B57 His
10. Phe B177 His, Thr B176 Asp, Gln B50 Arg, Arg B57 His, Tyr A150 Ala

Aus der Menge der von Kim, Y. et al. vorgeschlagenen Schlüsselresten (Leu B24, Phe B24, Phe B31, Gln B50, Leu B53, Arg B57, Phe B58, Phe 8177) sind danach nur vier von Bedeutung, während Thr B176, Tyr A150 und Val B70 in diesem Zusammenhang von den Autoren nicht erwähnt werden. Kim et al. machen keine Angaben in welche Aminosäuren ihre Schlüsselreste mutiert werden sollen. Erfindungsgemäß sind daher solche Mutationen, die die Ladungsverteilung im aktiven Zentrum und den Elektronenfluß beim Ablauf der Zielreaktion berücksichtigen und nur als Kombination von zwei oder mehr Mutationen zur Veränderung der Substratspezifität der Glutarylamidase führen können.

Mutationen in der Glutarylamidase wurden eingeführt unter Verwendung von klonierten Teilfragmenten aus dem Glutarylamidasegen, die beidseitig von singulär im Expressionsplasmid T 415 flankiert sind, sodass ein Rücktransfer des mutierten Fragments in den Vektors rasch und unkompliziert möglich ist. Die ortsspezifischen Mutationen zum Austausch eines kodiernden Kodons in den Genfragmenten wurden jeweils mit Hilfe von zwei mutagenen DNA Primern durchführt durchgeführt und vor Rückklonierung in den Expressionsvektor durch DNA-Sequenzierung verifiziert.

Nicht im einzelnen beschriebene gentechnische Arbeiten, insbesondere der Mutation, Klonierung und der Transformation, wurden nach den detaillierten Anleitungen bei Ausubel, F. et al. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, 1994-1998 und Supplements durchgeführt. Das Wachstum der rekombinanten E. coli Klone erfolgte bei 28°C.

Für die Expression der mutierten Enzyme wurde der Vektor T 415 gewählt, der eine hohe konstitutive Expression funktionaler Enzyme erlaubt. Entsprechend kann die Expression auch über induktive Systeme erfolgen, wie sie beispielsweise in der Anmeldung EP-A0504798 beschrieben sind. Darüber hinaus ist eine intrazelluäre Expression möglich, wie sie beispielsweise von Lee, Y. S und Park, S. S. J. Bacteriol. 180, 4576-4582 (1998) durchgeführt wurde.

Es wird ein Verfahren beschrieben, das die einfache, rasche und kostenmäßig günstig Herstellung großer Mengen an Enzym durch Kristallisation beschrieben, ohne daß aufwendige chromatographische Reinigungsverfahren verwendet werden. Erfindungsgemäß gelingt die Kristallisation des Enzyms nach Aufschluß der Zellen und Entfernung der Zellreste direkt aus der Mutterlauge in Gegenwart von hochmolaren Salzpuffern, vorzugsweise 0.8-1.5 M Kalium Phosphatpuffer. Der pH Bereich kann dabei von pH 7.5-pH 8.2 variiert werden.

Beispiel 1 Einführen der Leu B24Arg, Phe B177His Mutation

Plasmid DNA des in der Patentanmeldung Hoe 93/F419 beschriebenen Plasmids T415 wird mit den Restriktionsenzymen BamH1 und Hind III komplett verdaut und die ca 1900 bp und 4800 bp großen Fragmente nach Agarose-Gelelektrophorese und Elektroelution isoliert. Zunächst wurde das ca. 1900 große Fragment in den mit BamH1 und HindIII geschnittenen Vektor puC19 (New England Biolabs GmbH, Brüningstr. 50, 65926 Frankfurt) einligiert. Nach Transformation in den E. coli Stamm MC 1061 wird die Plasmid DNA isoliert und einer über mutagene Primer vermittelten site-directed Mutagenese unterworfen. Die Leu B24 Arg Mutation wurde dabei unter Verwendung des Primerpaars Nr. 1 durchgeführt und nach Analyse der isolierten Plasmid DNA durch DNA Sequenzierung bestätigt. Dem schloß sich an der so mutagenisierten DNA das Einführen der Mutation Phe B177 His unter Verwendung des mutagenen Primerpaars Nr. 2 an. Das Vorhandensein beider Mutationen in dem BamH1-HindIII Fragment wurde nach Isolierung der Plasmid DNA durch DNA Sequenzierung des kompletten Fragment bestätigt.

Aus der DNA des Vektors, der das an den beschriebenen zwei Stellen mutierte Fragment enthält, wurde mit Hilfe der Restriktionsenzyme BamH1 und Hind III das ca. 1900 bp Fragment freigesetzt, gelelektophoretisch aufgetrennt und nach Elektroelution isoliert. Das isolierte Fragment wurde in das oben beschriebene 4800 bp große Bam H1-HindIII geschnittene Fragment einligiert und das Ligationsgemisch in E. coli W3110 eintransformiert. Rekombinante Klone wurden aufgrund ihrer Fähigkeit selektioniert, in Gegenwart von 12 ug/ml Chloramphenicol zu wachsen und Cephalosporin C umzusetzen zu 7-Aminocephalosporansäure.

Primerpaar 1

5'-CAGAACCCGCACCGCTCCTGGACGACG-3'
3'-GTCTTGGGCGTCGCGAGGACCTGCTGC-5'

Primerpaar 2

5'-CAGGTGCCGACCCACAACATCGTCTAC-3'
3'-GTCCACGGCTGGGTGTTGTAGCAGATG-5'

Beispiel 2 Einführen der Leu B24 Arg, Phe B177 His, Arg B57 His, Gln B50 (Val oder Ala)

Ausgehend von dem an den Positionen Leu B24 Arg und Phe B177 His mutierten und isolierten ca. 1900 bp großen BamH1-HindIII Fragment wurden in Analogie zu Beispiel 1 die zusätzlichen Mutationen Arg B57 His und Gln B50 Val bzw. Gln B50 Ala in das bereits an den o. a. zwei Positionen mutierte Fragment eingeführt. Dazu wurden successive die mutagenen Primer Nr. 3 und Nr. 4 bzw. Nr. 3 und Nr. 5 verwendet. Rekombinante E. coli W3110 Klone, die nach Einklonieren der jeweiligen mutagenisierten und über DNA-Sequenzierung verifizierten beiden Fagmente in das 5290 bp Vektorfragment isoliert wurden, wurden selektioniert aufgrund ihrer Fähigkeit, auf 12 ug/ml Chloramphenicol zu wachsen und und Cephalosporin C umzusetzen zu 7-Aminocephalosporansäure.

Primerpaar 3

5'-CTGCCGGTCATCCACTTCGCCTTCACC-3'
3'-GACGGCCAGTAGGTGAAGCGGAAGTGG-5'

Primerpaar 4

5'-TATGGCGCGACCGTGATCGGCCTGCCG-3'
3'-ATACCGCGCTGGCACTAGCCGGACGGC-5'

Primerpaar 5

5'-TATGGCGCGACCGCGATCGGCCTGCCG-3'
3'-ATACCGCGCTGGCGCTAGCCGGACGGC-5'

Beispiel 3 5. Einführen der Leu B24 Arg, Phe B177 His, Arg B57 His, Gln B50 (Val oder Ala), Val B70 His

In Analogie zu Beispiel 2 wurden die zusätzlichen Mutationen der in Beispiel 1 benannte BamH1-HindIII Fragment eingeführt, die Mutationen durch DNA Sequenzierung bestätigt und rekombinante Klone hergestellt. Zum Austausch Val B70 His wurde das mutagene Primerpaar Nr. 6 verwendet. Die Selektion und Testung der rekombinanten W3110 E. coli Klone erfolgte wie in Beispiel 2.

Primerpaar 6

5'-ATCACCAATACCCACAACGGCATGGTG-3'
3'-TAGTGGTTATGGGTGTTGCCGTACCAC-5'

Beispiel 4 Einführen der Leu B24 Arg, Phe B177 His, Arg B57 His, Gln B50 (Val oder Ala), Val B70 His, Tyr B153 Leu Muationen

In Analogie zu Beispiel 3 wurden die zusätzlichen Mutationen der in Beispiel 3 benannten BamH1-HindIII Fragmente eingeführt, die Mutationen durch DNA Sequenzierung bestätigt und rekombinante Klone hergestellt. Zum Austausch Tyr B153 Leu wurde das mutagene Primerpaar Nr. 7 verwendet. Die Selektion und Testung der rekombinanten W3110 E. coli Klone erfolgte wie in Beispiel 2.

Primerpaar 7

5'-ATGCTCGAGCAGCTCTTCGACATGATC-3'
3'-TACGAGCTCGTCGAGAAGCTGTACTAG-5'

Beispiel 5 Einführen der Phe B177 His, Thr B176 Asp Mutation

In Analogie zu den Beispielen 1-4 wurden diese Mutationen unter Verwendung der Primerpaare 8 (Phe B177 His) und 9 (Thr B176 Asp) durchgeführt und getestet.

Primerpaar 8

5'-GTGCCGACCCACAACATCGTCTAC-3'
3'-CTCGGCTGGGTGTTGTAGCAGATG-5'

Primerpaar 9

5'-ATGGTGCCGGACCACAACATCGTC-3'
3'-TACCACGGCCTGGTGTTGTAGCAG-5'

Beispiel 6 Einführen der Phe B1 77 His, Thr B176 Asp, Tyr A150 Ala (Tyr A150 Ala aus sterischen Gründen)

In Analogie zu dem Beispiel 5 wurden diese Mutationen unter Verwendung der Primerpaare der mutierten DNA aus Beispiel 5 (Phe B177 His, Thr B176 Asp) durch Verwendung des Primerpaars 10 (Tyr A150 Ala) durchgeführt und getestet.

Primerpaar 10

5'-ATGAACTTCCTCGCTGTCGCGTCGCC-3'
3'-TACTTGAAGGACCGACAGCGCAGCGG-5'

Beispiel 7 Einführen der Phe B177 His, Thr B176 Asp, Leu B24 Arg, Arg B57 His Mutationen

In Analogie zu dem Beispiel 5 wurden diese Mutationen unter Verwendung des bereits in Beispiel 5 mutagenisierten Fragments und unter succesiver Nutzung der Primerpaare 1 und 3 durchgeführt und getestet.

Beispiel 8 Einführen der Phe B177 His, Thr B176 Asp, Leu B24 Arg, Arg B57 His, Tyr A150 Ala Mutationen

In Analogie zu dem Beispiel 7 wurden diese Mutationen unter Verwendung des bereits in Beispiel 7 mutagenisierten Fragments und anschließender Nutzung des Primerpaars 10 aus Beispiel 6 durchgeführt und getestet.

Beispiel 9 Einführen der Phe B177 His, Thr B176 Asp, Gln B50 Arg, Arg B57 His Mutationen

In Analogie zu dem Beispiel 5 wurden diese Mutationen unter Verwendung des bereits in Beispiel 5 mutagenisierten Fragments und unter succesiver Nutzung der Primerpaare 5 und 3 durchgeführt und getestet.

Beispiel 10 Einführen der Phe B177 His, Thr B176 Asp, Gln B50 Arg, Arg B57 His, Tyr A150 Ala Mutationen

Zur Einführung der Tyr A150 Ala Mutation wurde isolierte Vektor DNA des bereits mutierten Plasmids aus Beispiel 9 (Phe B177 His, Thr B176 Asp, Gln B50 Arg, Arg B57 His Mutationen) mit dem Enzym Sall komplett verdaut und die entstehenden drei Fragmente von ca. 750 bp, 1550 bp und 4350 bp nach elektrophoretischer Auftrennung mittels Elektroelution isoliert. Das 750 bp große Subfragment wurde in die Sall Schnittstelle des Vektor puC19 umkloniert und die Tyr A150 Ala Mutation mit Hilfe des Primerpaars 11 in das Fragment eingeführt und verifiziert. Aus isolierter Plasmid DNA wurde das mutagenisierte ca. 750 pb große Fragment nach Komplettverdau mit dem Restriktionsenzym Sall herausgeschnitten und wie oben isoliert. Es folgte eine Ligationsansatz zusammen mit den bereits isolierten Teilfragmenten von 1550 bp und 4350 bp. Nach Transformation von E. coli W3110 mit dem Ligationsgemisch wurden solche Klone selektioniert, die in Gegenwart von 12 ug/ml Chloramphenicol bei 28°C wachsen konnten und die VektorDNA mit dem komplett in der korrekten Proteinleserichtung mutierten Gluatrylamidasegen enthielten. Alle Mutationen wurden durch Restriktionsanalyse und DNA Sequenzierung verifiziert und rekombinante Klone auf Umsetzung von Cephalosporin C zu 7-ACS hin getestet.

Primerpaar 11

5'-TATGGCGCGACCCGGATCGGCCTGCCG-3'
3'-ATACCGCGCTGGGCCTAGCCGGACGGC-5'

Beispiel 11 Alternative in-vivo Selektion von rekombinanten E.coli Klonen, die Cephalosporin C zu 7-ACS umsetzen können

Der Stamm E. coli ESS 2231, erhältlich von Prof. A. Demain, MIT Cambridge, USA, ist in der Lage, auf Agarplatten mit LB Medium in Gegenwart von 7-ACS zu wachsen (0.5-2 ug/ml, Temperatur 28°C), während der Stamm nicht auf entsprechenden Medium wachsen kann, wenn 7-ACS durch Chepalosporin C in einer Konzentration von 0.5-2 ug/ml substituiert ist. Transformiert man nun kompetente gemachte E. coli ESS 2231 nach bekannten Transformationsverfahren mit rekombinanten Vektoren auf Bais von T 415, die nach Mutation der Glutarylamidase für eine CephalosporinC- Acylase Aktivität kodieren und die in transformierten E. coli ein entsprechendes funktionales Enzym bilden, so können diese Klone in Gegenwart von Cephalosporin wachsen, da Cephalosporin C in 7-ACS umgesetzt wird. Dies erlaubt eine direkte positive Selektion auf solche Klone, die Cephalosporin in 7 ACS spalten können. Die mit dem Vektor eingebrachte Chloramphenicol Resistenz ist ein zusätzliches Selektionskriterium, die Wachstum der Klone in Gegenwart von 2.5 ug Chloramphenicol/ml erlaubt.

Beispiel 12 Direkte enzymatische Umsetzung von Cehalosporin C zu 7-ACS

Zur Identifizierung solcher Klone mit mutierter Glutarylamidase, die Chepalosporin C direkt in 7-ACS umsetzen können, wurden ausgehend von Einzelkolonien rekombinante Zellen über Nacht bei 28°C in 200 ml eines Komplexmedium bestehend aus Bactotrypton, 1%, Hefeextrakt, 0,5% und NaCl, 0.5%, pH 7.2 in einem Erlenmeyerkolben bei 220 rpm inkubiert. Die Zellen wurden anschließend bei 4°C abzentrifugiert, das Zellpellet in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und die Zellen in ca. 1 ml Tris-HCl Puffer pH 8.2 aufgenommen, dem als Detergenz Cethyltrimethylammoniumchlorid oder Toluol in Verbindung mit EDTA oder Lysozym zur Permeabilisierung und Freisetzung der Enzymaktivität zugesetzt war. Nach 30 min Inkubationszeit bei 4°C wurden die Zellen abzentrifugiert und Aliquots des Überstandes in eine enzymatischen Assay eingesetzt, wie er bei Ishii, Y. et al (1995) beschrieben ist. Die Bildung von 7-ACS aus Cephalosporin C wurde mittels HLPC verfolgt.

Beispiel 13 Technische Umsetzung von Cephalosporin in 7-ACS

Rekombinante E. coli Klone mit Cephalosporin-Acylase Aktivität wurden nach dem im Patent EP-A0708180 beschriebenen Verfahren im 10 l Maßstab angezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation ankonzentriert, in kleinem Volumen mit 100 mM Phosphatpuffer pH 7.2 aufgenommen und mittels French Press aufgeschlossen. Zur Abtrennung der Zellreste wurde die Lösung bei 10.000 Upm für 15 Minuten zentrifugiert und der Überstand entnommen. Die Enzym-haltige Lösung wird in einer Amicon Ultrafiltrationszelle oder durch Diafiltration gegen 1-1.5 M Kaliumphosphatpuffer pH 7.8 bei 4°C bei gleichzeitiger Ankonzentrierung umgepuffert. Bei weiterem Stehenlassen der ankonzentrierten Lösung in Kälte kristallisiert das Enzym aus. Die Kristalle werden durch schonende Zentrifugation angereichert und mit o. a. Puffer gewaschen.

Die Proteinkristalle werden für die technische Umsetzung in 0.1 M Tris/HCl Puffer oder 0.1 M Kaliumphosphatpuffer pH. 8.2 gelöst und das Enzym in einer Konzentration von 2 mg/ml für die Umsetzung von Cephalosporin in 7-ACS eingesetzt. Substratkonzentration: 75 mM, Temperatur: 37°C. Reaktionszeit: 1 Std. Die Umsetzung wird über HPLC analytisch verfolgt.

Claims

1. Mutierte Glutarylamidase, dadurch gekennzeichnet, daß Aminosäuren in der Bindungstasche für Glutaryl-7-Aminocephalosporansäure ausgetauscht sind.

2. Verfahren zur Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure und deren Derivate aus Cephalosporinen unter Verwendung mutierter Glutarylamidase nach Anspruch 1.