CN114107278A - 一种固定化双酶-无机杂化纳米花及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及酶固定化技术领域，尤其涉及一种固定化双酶‑无机杂化纳米花及其制备方法与应用。所述固定化双酶‑无机杂化纳米花的制备方法包括以下步骤：(1)将酶液与磷酸氢二钾混合，然后调节pH至6.0～6.1，得到酶的磷酸盐溶液；(2)将步骤(1)得到的酶的磷酸盐溶液静置，离心得沉淀，并将沉淀洗涤。本发明解决了传统固定化酶技术操作复杂，成本高，所得固定化酶活力低的技术问题，本发明制备得到的固定化双酶‑无机杂化纳米花的稳定性优于传统树脂载体固定化酶，而且酶活高于传统固定化酶活。
Description
技术领域
本发明涉及酶固定化技术领域，尤其涉及一种固定化双酶-无机杂化纳米花及其制备方法与应用。
背景技术
D-(-)-对羟基苯甘氨酸，化学名为D-α-氨基对羟基苯乙酸，分子式为(OH)C6H4NH2CHCOOH，分子量为167.2，化学结构式如式Ⅰ所示。
D-(-)-对羟基苯甘氨酸是β-内酰胺类半合成抗生素阿莫西林、阿扑西林、头孢羟氨苄、头孢拉定、头孢罗奇和头孢哌酮等的侧链，是国家重点发展的一种药物中间体。国内的D-(-)-对羟基苯甘氨酸长期依赖进口，仅河北省制药行业每年为此花费上千万美元的外汇，因此有必要对该中间体的生产进行系统研究，研发一种经济高效的新生产方法。
生物酶催化具有作用条件温和、绿色无污染、独特和高效的底物选择性等优点，被广泛应用在医药、食品、化工以及环境保护方面。但是游离酶在使用过程中常常表现出稳定性差、难以重复使用、使用成本高等问题。酶的固定化技术是提高酶稳定性、改善酶催化性能的主要方法。固定化的酶不仅易于与底物、产物分离，而且可以长时间内重复使用，降低成本。并能够在绝大多数情况下提高酶的稳定性，且能够用于多酶级联反应。但是，传统的酶固定化制备过程繁琐，载体的存在导致酶和底物的传质阻力增大，以及共价键的形成使酶分子构象发生改变，从而导致酶活损失较大所制备的固定化酶酶活较低。因此，开发新的催化活力高、稳定性好的酶固定化方法成为提高酶催化性能亟待解决的问题。
酶-无机杂化纳米花是近年来发展起来的一种新型固定化酶方法，它具有合成步骤简单、条件温和的特点。而且与游离酶相比，所制备的杂化纳米花固定化酶表现出更好的催化性能。因此，酶-无机杂化纳米花是一种极大潜力的固定化酶方法。纳米花在化学中是指某元素的化合物，从微观观点形成了花，称为纳米花。这些形成物的长度和厚度都在纳米范围，因此只能用电子显微镜观察。固定化双酶-无机杂化纳米花技术，不仅大大降低了传统固定化载体的成本，同时实现了一酶双用，而且提高了固定化收率，固定化纳米花的酶活远远高于固定化载体的酶活，稳定性也远远高于固定化载体。
因此，如何克服传统固定化树脂载体的活性不高，稳定性差和重复使用性差的缺点，提供一种操作简单、成本低、重复性好，所得固定化酶活力高的固定化双酶-无机杂化纳米花的制备方法，是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种固定化双酶-无机杂化纳米花及其制备方法与应用，解决了传统固定化酶技术操作复杂，成本高，所得固定化酶活力低的技术问题。本发明制备得到的固定化双酶-无机杂化纳米花的稳定性优于传统以树脂为载体的固定化酶，而且酶活高于传统固定化酶活。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种固定化双酶-无机杂化纳米花的制备方法，包括以下步骤：
(1)将酶液与磷酸氢二钾混合(混合后的溶液pH为8.0)，然后调节pH至6.0～6.1，得到酶的磷酸盐溶液；
(2)将步骤(1)得到的酶的磷酸盐溶液静置，离心得沉淀，并将沉淀洗涤。
优选的，步骤(1)所述磷酸氢二钾与酶液的质量体积比为1～3g∶80～120ml。
优选的，步骤(1)所述酶液中含有D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶。
优选的，步骤(1)所述调节pH所用试剂为质量浓度为20～30％的氯化锰溶液。
优选的，所述D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶的酶活独立为4～8MU/ml。
优选的，步骤(2)所述静置时间为10～14h。
优选的，步骤(2)所述离心转速为4000～5000转/分钟，时间为4～6min。
优选的，步骤(2)所述洗涤所用试剂为质量浓度为0.05～0.15％的氯化锰溶液。
优选的，步骤(2)所述沉淀与氯化锰溶液的质量体积比为2～4g∶8～16ml。
本发明还提供了所述的一种固定化双酶-无机杂化纳米花的制备方法制备得到的固定化双酶-无机杂化纳米花。
本发明还进一步的提供了所述的固定化双酶-无机杂化纳米花在制备D-(-)-对羟基苯甘氨酸中的应用。
本发明对所述D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶的来源没有特殊限定，在本发明具体实施过程中，优选的通过细菌发酵制得，具体为：
(1)将大肠杆菌BL21(DE3)发酵后离心(4500转/min，15-30min)，收集菌体，将菌体用0.02～0.03M的磷酸盐缓冲液稀释定容，将菌浓稀释到17％-18％(菌浓是指单位体积培养液中菌体的含量，是百分含量，例如离心10毫升发酵液，菌体所占体积为1.7-1.8毫升，计算公式为1.7/10*100＝17％)；
(2)将步骤(1)稀释好的菌液进行细胞破碎，将蛋白释放到清液中，破碎率达到93～97％以上，破碎完后加入发酵液体积的0.5～0.7％的絮凝剂-聚丙烯酰胺，离心收集上清液，将上清液进超滤浓缩，得到超滤浓缩液。超滤浓缩液即为D-对羟基苯海因酶蛋白液或N-氨甲酰水解酶蛋白液。
优选的，在超滤浓缩过程中，超滤膜截留分子量为10000，进膜压力0.3兆帕。
优选的，步骤(2)所述离心转速为4000～5000转/分钟，时间为4～6min。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、生物酶因其优异的催化活性和反应特异性被广泛应用于医药领域，但酶稳定性差，不可回收而造成的高昂研究成本限制了其发展。为提高其催化活性和稳定性，各种酶固定化技术不断涌现。近年来，为了克服传统的固定化酶法，一种新型、简单的酶-无机杂化纳米花材料被提出。它通过金属化合物与磷酸缓冲溶液还有酶自组装形成各种各样的杂化纳米结构，因为体系中含有酶分子，所以也有人将此材料称为有机-无机杂化纳米材料。由于这种材料比表面积大，传质阻力小，这种方法通常能将酶活提高数十倍，且不需要添加任何有毒元素，也不需要极端条件，所以这种方法受到广泛关注。
金属离子的价态对纳米花的形态和活性有显著影响。相比于一价和三价金属离子(Ag+、Al3+、Fe3+)，二价金属离子(Mn2+、Zn2+、Ca2+)与蛋白酶更容易形成规则形状的杂化纳米花。使用一价和三价金属离子(Ag+、Al3+、Fe3+)合成的纳米花酶活较低或者没有酶活，但是使用二价金属离子(Mn2+、Zn2+、Ca2+)合成杂化纳米花酶活更高，稳定性更好。酶-无机杂化纳米花技术具有制备简单、所制备的杂化纳米花固定化酶酶活高、稳定性好的特点。与传统固定化酶的形成过程不同，酶-无机杂化纳米花是由酶和磷酸金属盐自组装形成的，其合成过程分为三步：成核、异向生长和形成花型。
杂化纳米花固定化酶技术因在提高酶稳定性和重复利用度的同时，可大大增强酶活。本发明公开了一种固定化苯海因酶与氨甲酰酶双酶杂化纳米花的制备方法与用途，以磷酸锰为骨架，蛋白结合到骨架上，建立了以磷酸锰为无机部分，以苯海因酶和氨甲酰酶为目标酶分子，通过自组装形成固定化酶体系，解决了传统固定化树脂载体制备的固定化酶的活性不高，稳定性差和重复使用性差的缺点。本发明方法操作简单、成本低、重复性好，所得固定化苯海因酶与氨甲酰酶双酶杂化纳米花酶活力高，稳定性和重复性好，是一种高效的苯海因与氨甲酰固定化方法。
2、本发明所述固定化酶酶活提高原因：(1)纳米花具有较大的比表面积，传质阻力较小；(2)固定化酶载体与酶分子的协同作用；(3)微环境中酶分子与金属离子的相互促进作用。
具体实施方式
本发明提供了一种固定化双酶-无机杂化纳米花的制备方法，包括以下步骤：
(1)将酶液与磷酸氢二钾混合，然后调节pH至6.0～6.1，得到酶的磷酸盐溶液；
(2)将步骤(1)得到的酶的磷酸盐溶液静置，离心得沉淀，并将沉淀洗涤。
优选的，步骤(1)所述调节pH至6.0。
在本发明中，步骤(1)所述磷酸氢二钾与酶液的质量体积比为1～3g∶80～120ml；优选为1.5～2.5g∶90～110ml；进一步优选为2g∶95～105ml；更优选为2g∶100ml。
在本发明中，步骤(1)所述酶液中含有D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶。
在本发明中，所述D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶的酶活独立为4～8MU/ml；优选为5～7MU/ml；进一步优选为5.5～7.5MU/ml；更优选为6MU/ml。
在本发明中，步骤(1)所述调节pH所用试剂为质量浓度为20～30％的氯化锰溶液；优选为22～28％；进一步优选为24～26％；更优选为25％。
在本发明中，步骤(2)所述静置时间为10～14h；优选为11～13h；进一步优选为12h。
在本发明中，步骤(2)所述离心转速为4000～5000转/分钟；优选为4200～4800转/分钟；进一步优选为4400～4600转/分钟；更优选为4500转/分钟。
在本发明中，步骤(2)所述离心时间为4～6min；优选为4.5～5.5min；进一步优选为5min。
在本发明中，步骤(2)所述洗涤所用试剂为质量浓度为0.05～0.15％的氯化锰溶液；优选为0.07～0.13％；进一步优选为0.09～0.11％；更优选为0.1％。
在本发明中，步骤(2)所述沉淀与氯化锰溶液的质量体积比为2～4g∶8～16ml；优选为2.5～3.5g∶9～15ml；进一步优选为3g∶10～14ml；更优选为3g∶12ml。
本发明还提供了所述的一种固定化双酶-无机杂化纳米花的制备方法制备得到的固定化双酶-无机杂化纳米花。
本发明还进一步的提供了所述的固定化双酶-无机杂化纳米花在制备D-(-)-对羟基苯甘氨酸中的应用。
下面结合实施例对本发明提供技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例所要用到的原材料及仪器：
原材料：
磷酸氢二钾(江苏科伦多技术有限公司)
氯化锰(天津博迪化工股份有限公司)
仪器：
数显定时电动搅拌器(金坛区西城新瑞仪器厂)
电子显微镜(江南光电集团股份有限公司)
pH计(上海雷磁)
离心机(北京医药离心机厂)
干燥箱(北京电器仪器厂)
752N分光光度计(上海仪分)
以下实施例所要用到的检测方法：
酶活检测方法：
液相(HPLC)方法检测双酶杂化纳米花酶活，以及上清酶活；考马斯亮蓝方法检测蛋白含量。
①液相条件
柱子型号：Inertsil ODS-sp
流动相配置：在1L烧杯中加入900mL纯化水，加入磷酸11.53克，再加入乙腈40mL，用15％氢氧化钾溶液调pH至3.0，定容至1L。
波长：210nm 温度：25℃ 流速：1mL/min
标准配置：
氨甲酰：取0.025g氨甲酰标准，流动相定容25mL，摇匀，取20μL进液相，记录色谱图标准。
D-对羟基苯甘氨酸:取0.25gD-对羟基苯甘氨酸标准，溶于85mL纯水中，滴加氨水溶解，定容100mL容量瓶，摇匀，取1mL流动相定容25mL，摇匀，取20μL进液相，记录色谱图标准。
D-对羟基苯海因酶液体酶活检测方法
A、缓冲液的配制(0.05M硼酸)
称取硼酸3.10g，溶于950ml去离子水中，预热37℃，用1M NaOH溶液调PH至9.0，用去离子水定容到1000ml。
B、反应液的配制
称D-对羟基苯海因1.0g，加入0.05M，PH9.0的硼酸缓冲液85ml，水浴37℃，用1MNaOH调PH至9.0，使其完全溶解，并用缓冲液定容到100ml。
C、检测
量取反应液20ml加入100ml烧杯在中(提前预热至37℃)，开启搅拌，加入1ml酶液，恒温37℃反应10min。立即加入20ml丙酮，3000r/min离心2min，取上清。
D、进样检测
取1ml离心上清50倍流动相稀释，滤头过滤进液相。
E空白对照
量取反应液20ml加入100ml烧杯在中(提前预热至37℃)，开启搅拌，加入1ml缓冲液，恒温37℃反应10min。立即加入20ml丙酮，3000r/min离心2min，取上清。取1ml离心上清50倍流动相稀释，滤头过滤进液相。
F计算公式
S1：标准峰面积
S2：样品峰面积
C1：标准浓度
N-氨甲酰水解酶液体酶活检测
A、缓冲液的配制
称取K2HPO4 21.45g，KH2PO4 0.8g，定容至1L，PH控8.0。
B、反应液的配制
称取氨甲酰0.3g，加入30ml的缓冲液，混匀，PH控6.9-7.1，此为反应液。
C、检测
量取9.9ml反应液(提前预热至36℃)，放入25ml烧杯中，开启搅拌然后取0.1ml酶液放入，36℃反应30min，然后立即加入0.2ml 6M Hcl，2000r/min离心2分钟，取上清。
D、空白
量取9.9ml反应液，放入25ml烧杯中，然后取0.1ml缓冲液放入，此为反空白液。
E、进样
36℃反应30min，然后立即加入0.2ml 6M Hcl，2000r/min离心2分钟，上清进液相。
F、50倍稀释
S1：标准峰面积
S2：样品峰面积
C1：标准浓度
固定化双酶-无机杂化纳米花酶活检测方法
D-对羟基苯海因酶活性
A、缓冲液的配制
称取K2HPO4 21.45g，KH2PO4 0.8g，定容至1L，PH控8.0。
B、反应液的配制
称取0.91g D-对羟苯海因，加入30ml缓冲液，混匀，PH控7.9-8.1。
C、检测
量取反应液10ml，至25ml烧杯中，控温36℃，放入0.2g固定化杂化纳米花，纳米花提前洗好。反应15min，立即加入10ml丙酮，10s后，吸取1ml上清50倍流动相稀释进样。
D、空白
量取反应液10ml，至25ml烧杯中，控温36℃，反应15min，立即加入10ml丙酮，10s后，吸取1ml上清50倍流动相稀释进样。
E、计算公式
S1：标准峰面积
S2：样品峰面积
C1：标准浓度
M：纳米花质量(g)
T：时间(min)
N-氨甲酰水解酶
A、缓冲液的配制
称取K2HPO4 21.45g，KH2PO4 0.8g，定容至1L，PH控8.0。
B、反应液的配制
称取0.3g氨甲酰，加入30ml缓冲液，混匀，PH控7.9-8.1。
C、检测
量取反应液10ml，至25ml烧杯中，控温36℃稳定后，放入0.2g固定化杂化纳米花，纳米花提前洗好。反应15min立即加入0.2ml 6MHcl，10s后取上清，1ml大肚吸管50倍流动相稀释进液相。
D、空白
量取反应液10ml，至25ml烧杯中，控温36℃，为空白对照。反应15min立即加入0.2ml 6MHcl，10s后取上清，1ml大肚吸管50倍流动相稀释进液相。
E、计算公式
S1：标准峰面积
S2：样品峰面积
C1：标准浓度
M：纳米花质量(g)
T：时间(min)
实施例1
一种固定化双酶-无机杂化纳米花的制备方法，步骤如下：
(1)将磷酸氢二钾与含有D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶的混合酶液(酶活独立为4MU/ml)按质量体积比为1g∶80ml混合，然后使用质量浓度为20％的氯化锰溶液调节pH至6.0，得到酶的磷酸盐溶液；
(2)将步骤(1)得到的酶的磷酸盐溶液静置10h，4000转/分钟离心4min得沉淀，并将沉淀使用质量浓度为0.05％的氯化锰溶液洗涤，其中，沉淀与氯化锰溶液的质量体积比为2g∶8ml。
实施例2
一种固定化双酶-无机杂化纳米花的制备方法，步骤如下：
(1)将磷酸氢二钾与含有D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶的混合酶液(酶活独立为8MU/ml)按质量体积比为3g∶120ml混合，然后使用质量浓度为30％的氯化锰溶液调节pH至6.1，得到酶的磷酸盐溶液；
(2)将步骤(1)得到的酶的磷酸盐溶液静置14h，5000转/分钟离心6min得沉淀，并将沉淀使用质量浓度为0.15％的氯化锰溶液洗涤，其中，沉淀与氯化锰溶液的质量体积比为4g∶16ml。
实施例3
一种固定化双酶-无机杂化纳米花的制备方法，步骤如下：
(1)将磷酸氢二钾与含有D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶的混合酶液(酶活独立为6MU/ml)按质量体积比为2g∶100ml混合，然后使用质量浓度为25％的氯化锰溶液调节pH至6.0，得到酶的磷酸盐溶液；
(2)将步骤(1)得到的酶的磷酸盐溶液静置12h，4500转/分钟离心5min得沉淀，并将沉淀使用质量浓度为0.1％氯化锰溶液洗涤，其中，沉淀与氯化锰溶液的质量体积比为3g∶12ml；
检测固定化双酶-无机杂化纳米花的D-对羟基苯海因酶活性是47.15u/g，N-氨甲酰水解酶是61.35u/g。
实施例4
按照实施例3的方法，仅做如下改动：步骤(1)使用质量浓度为25％的氯化钙溶液调节pH。检测固定化双酶-无机杂化纳米花的D-对羟基苯海因酶活性是8u/g，N-氨甲酰水解酶是70u/g。
实施例5
按照实施例3的方法，仅做如下改动：步骤(1)使用质量浓度为25％的硫酸铜溶液调节pH。检测固定化双酶-无机杂化纳米花的D-对羟基苯海因酶活性是0u/g，N-氨甲酰水解酶是0u/g。
通过实施例3～5的结果可知，Mn2+对苯海因酶和氨甲酰酶固定化效果最好，优选Mn2+作为固定化双酶-无机杂化纳米花的无机部分。
实施例6
按照实施例3的方法，仅做如下改动：步骤(1)磷酸氢二钾与酶液的质量体积比为4g∶100ml。检测固定化双酶-无机杂化纳米花的D-对羟基苯海因酶活性是44.22u/g，N-氨甲酰水解酶是60.35u/g。
实施例7
按照实施例3的方法，仅做如下改动：步骤(1)磷酸氢二钾与酶液的质量体积比为6g∶100ml。检测固定化双酶-无机杂化纳米花的D-对羟基苯海因酶活性是42.37u/g，N-氨甲酰水解酶是61.11u/g。
实施例8
按照实施例3的方法，仅做如下改动：步骤(1)磷酸氢二钾与酶液的质量体积比为8g∶100ml。检测固定化双酶-无机杂化纳米花的D-对羟基苯海因酶活性是50.81u/g，N-氨甲酰水解酶是60.43u/g。
结合实施例3、6、7、8，酶液总活相等的前提下，磷酸氢二钾的浓度对苯海因酶和氨甲酰酶固定化影响不大，优选质量浓度2％磷酸氢二钾作为最佳浓度。
实施例9
按照实施例3的方法，仅做如下改动：步骤(1)使用质量浓度为35％氯化锰溶液调整pH。检测固定化双酶-无机杂化纳米花的D-对羟基苯海因酶活性是51.11u/g，N-氨甲酰水解酶是61.11u/g。
实施例10
按照实施例3的方法，仅做如下改动：步骤(1)使用质量浓度为45％氯化锰溶液调整pH。检测固定化双酶-无机杂化纳米花的D-对羟基苯海因酶活性是47.07u/g，N-氨甲酰水解酶是55.03u/g。
实施例11
按照实施例3的方法，仅做如下改动：步骤(1)使用质量浓度为55％氯化锰溶液调整pH。检测固定化双酶-无机杂化纳米花的D-对羟基苯海因酶活性是45.33u/g，N-氨甲酰水解酶是50.05u/g。
综合实施例3、9、10、11，酶液总活相等的前提下，Mn2+的浓度越大苯海因酶和氨甲酰酶固定化酶活反而越小，所以优选质量浓度为25％氯化锰溶液作为最佳浓度。
实施例12
按照实施例3的方法，仅做如下改动：步骤(1)所述D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶的酶活分别为6MU/ml和12MU/ml。检测固定化双酶-无机杂化纳米花的D-对羟基苯海因酶活性是48.17u/g，N-氨甲酰水解酶是110.23u/g。
实施例13
按照实施例3的方法，仅做如下改动：步骤(1)所述D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶的酶活分别为12MU/ml和6MU/ml。检测固定化双酶-无机杂化纳米花的D-对羟基苯海因酶活性是100.41u/g，N-氨甲酰水解酶是57.36u/g。
综合实施例3、12、13，酶液总活不等的前提下，其他条件均相同的条件下，酶液的酶活越高，该固定化纳米花的酶活越高，可根据实际的反应需要，调节酶液的比例，达到最好的转化效果。
实施例14
按照实施例3的方法，仅做如下改动：步骤(1)中，将磷酸氢二钾替换为磷酸氢二钠。检测固定化双酶-无机杂化纳米花的D-对羟基苯海因酶活性是10.82u/g，N-氨甲酰水解酶是20.44u/g。
综合实施例1、14，酶液总活相等的前提下，缓冲液中K+对苯海因酶和氨甲酰酶固定化效果较好，优选磷酸氢二钾作为最佳固化底物。
实施例15：温度稳定性
(1)取制备好的固定化双酶-无机杂化纳米花，原始酶活分别是53.82u/g和64.77u/g，置于42℃水浴内维持30min，然后加入底物中检测D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶酶活分别是51.22u/g和62.38u/g。
(2)取制备好的原始酶液，原始酶液酶活分别是17540u/L和19620u/L，置于42℃水浴内维持30min，然后加入底物中检测D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶酶活分别是1990u/L和3724u/L。
(3)取制备好的固定化树脂载体，原始酶液酶活分别是34.12u/g和55u/g置于42℃水浴内维持30min，然后加入底物中检测D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶酶活分别是11.28u/g和25.36u/g。
实施例16：pH稳定性
(1)取制备好的固定化双酶-无机杂化纳米花，原始酶活分别是53.82u/g和64.77u/g，置于pH＝10的条件下维持30min，然后加入底物中检测D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶酶活分别是49.11u/g和54.73u/g。
(2)取制备好的原始酶液，原始酶液酶活分别是17540u/L和19620u/L，置于pH＝10的条件下维持30min，然后加入底物中检测D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶酶活分别是15446u/L和17288u/L。
(3)取制备好的固定化树脂载体，原始酶液酶活分别是34.12u/g和55.35u/g，置于pH＝10的条件下维持30min，然后加入底物中检测D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶酶活分别是31.75u/g和45.32u/g。
实施例17：储存稳定性
(1)取制备好的固定化双酶-无机杂化纳米花，原始酶活分别是53.82u/g和64.77u/g，将样品进行室温储存30天，然后加入底物中检测D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶酶活分别是43.13u/g和24.54u/g。
(2)取制备好的原始酶液，原始酶液酶活分别是17540u/L和19620u/L，将样品进行室温储存30天，然后加入底物中检测D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶酶活分别是5406u/L和7008u/L。
(3)取制备好的固定化树脂载体，原始酶液酶活分别是34.12u/g和55.35u/g，将样品进行室温储存30天，然后加入底物中检测D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶酶活分别是11.23u/g和25.11u/g。
实施例18：转化稳定性
(1)取制备好的固定化双酶-无机杂化纳米花，原始酶活分别是53.82u/g和64.77u/g，将样品进行10批正常的转化反应，然后加入底物中检测D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶酶活分别是52.11u/g和57.66u/g。
(2)取制备好的固定化树脂载体，原始酶液酶活分别是34.12u/g和55.35u/g，将样品进行10批正常的转化反应，然后加入底物中检测D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶酶活分别是28.36u/g和41.39u/g。
综合实施例15、16、17、18，固定化双酶-无机杂化纳米花的稳定性优于传统树脂载体固定化载体，而且纳米花酶活高于传统固定化酶活。
从环保方面考虑，因为传统的固定化需要戊二醛作为交联剂，但是戊二醛属于VOCs有机废气，需要上百万的环保设备进行废气处理，如果用纳米花固定化技术代替传统树脂固定化的话，蛋白提取、固定化工艺都会简单，而且没有有机废气产生，不仅节约成本，还符合国家环保要求。另一方面戊二醛是致癌物质，有基因毒性，是下游制药厂家重点检测的项目，直接关系到原料药的质量，纳米花固定化技术完美的避开了戊二醛的使用，无论是从环保方面考虑，还是成本节约方面考虑纳米花固定化技术的优势远远高于传统固定化技术。
从产品质量考虑，本发明的成品质量远远高于传统固定化技术所产的成品，不仅酶活高，而且稳定性好，并且在转化过程中反应速度更快，条件温和，更有利于分离。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种固定化双酶-无机杂化纳米花的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将酶液与磷酸氢二钾混合，然后调节pH至6.0～6.1，得到酶的磷酸盐溶液；
(2)将步骤(1)得到的酶的磷酸盐溶液静置，离心得沉淀，并将沉淀洗涤。
2.根据权利要求1所述的一种固定化双酶-无机杂化纳米花的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述磷酸氢二钾与酶液的质量体积比为1～3g∶80～120ml。
3.根据权利要求1所述的一种固定化双酶-无机杂化纳米花的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述酶液中含有D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶；步骤(1)所述调节pH所用试剂为质量浓度为20～30％的氯化锰溶液。
4.根据权利要求3所述的一种固定化双酶-无机杂化纳米花的制备方法，其特征在于，所述D-对羟基苯海因酶和N-氨甲酰水解酶的酶活独立为4～8MU/ml。
5.根据权利要求1所述的一种固定化双酶-无机杂化纳米花的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述静置时间为10～14h。
6.根据权利要求1所述的一种固定化双酶-无机杂化纳米花的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述离心转速为4000～5000转/分钟，时间为4～6min。
7.根据权利要求1所述的一种固定化双酶-无机杂化纳米花的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述洗涤所用试剂为质量浓度为0.05～0.15％的氯化锰溶液。
8.根据权利要求7所述的一种固定化双酶-无机杂化纳米花的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述沉淀与氯化锰溶液的质量体积比为2～4g∶8～16ml。
9.权利要求1～8任一项所述的一种固定化双酶-无机杂化纳米花的制备方法制备得到的固定化双酶-无机杂化纳米花。
10.权利要求9所述的固定化双酶-无机杂化纳米花在制备D-(-)-对羟基苯甘氨酸中的应用。
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