CN114606223A

CN114606223A - 一种d-氨基酸氧化酶-无机杂化纳米花及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114606223A
Application number: CN202210407885.1A
Authority: CN
Inventors: 储消和; 赵心怡; 徐顺清
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2022-04-19
Filing date: 2022-04-19
Publication date: 2022-06-10

Abstract

本发明公开了一种D‑氨基酸氧化酶‑无机杂化纳米花及其制备方法和应用，具体实施方法为配制磷酸盐缓冲液，以磷酸盐缓冲液为溶液，溶解D‑氨基酸氧化酶全细胞菌体；将全细胞菌液破碎，将破胞液离心，弃沉淀，取其上清，上清为溶液Ⅰ；配制可溶性盐水溶液，该溶液为溶液Ⅱ；将溶液Ⅰ经磷酸盐缓冲液稀释后加入到溶液Ⅱ中，并震荡混匀；混合液放置在25℃下孵育一定时间，离心收集沉淀，用超纯水洗涤3次，获得D‑氨基酸氧化酶‑无机杂化纳米花。本发明制备得到的D‑氨基酸氧化酶‑无机杂化纳米花稳定性相对于游离酶得到了有效的提高，实现了固定化酶的回收重复利用，从而降低了生产成本，制备得到的固化酶具有较高的生物活性。

Description

一种D-氨基酸氧化酶-无机杂化纳米花及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种D-氨基酸氧化酶-无机杂化纳米花及其制备方法和应用。

背景技术

D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase:Oxi-doreductase，DAAO（EC1.4.3.3）)是一种以黄素腺嘌呤(FAD)为辅基的典型黄素蛋白酶，目前广泛用于D-氨基酸的定性定量分析、生物传感器、L-氨基酸和α-酮酸的生产。该酶可氧化D-氨基酸的氨基生成相应的α-酮酸，并伴随H₂O₂和NH₃的产生。

目前DAAO主要的价值在于生产7-氨基头孢烷酸(7-ACA)，其工业生产主要采用化学裂解方法，但是该方法存在环境污染和劳动力保障等问题。而生物酶法制备医药中间体具有反应操作简单，副反应少，条件温和，低能耗，产率高等优点，很大程度降低了化工生产的能源浪费和对环境造成的影响，符合可持续发展理念，因此D-氨基酸氧化酶的研究得到日益重视。

由于游离DAAO在高温、极端情况下稳定性极差，从而大大影响了其催化效率；再者，游离酶在反应液中难以分离，导致回收率较低，从而增加了生产成本。所以在实际应用中，为了提高DAAO的催化效率、稳定性和重复利用性，必须对酶进行固定化研究。

固定化酶具有高效专一及温和的酶催化反应特性，并呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点，因此酶的固定化研究受到研究者日益重视。传统的固定化方式固然有众多优点，但劣势也有许多：通过物理法将酶与载体结合后，结合不牢固而脱落；采用化学法将酶固定化后，所用的交联剂等会使酶的结构发生改变，降低酶活；纳米材料固定化补足了传统方法的缺点：纳米酶颗粒在不使用表面活性剂和有毒试剂的情况下即可合成，制备方法简单，对酶活几乎没有影响；纳米颗粒通常含有一个晶核，在核外包裹着一个厚的酶壳，结合牢固不易脱落；纳米粒子形状可控且大小均一，可以根据应用范围不同而调控粒子大小，应变能力强。因此纳米花固定化是一种值得推广应用的酶固定方法，但是至今未见用纳米花固定氧化酶的相关报道。

在DAAO酶固定化研究中，张小飞使用聚苯乙烯树脂固定化酶（中国医药工业杂志，2007），但该方法在实际应用过程中，随着产物的生成和补料的加入，溶液pH或增大或减小，对DAAO酶的酶活性影响依旧较大；陈少欣使用聚甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂固定化DAAO酶（化学反应工程与工艺，2003），固定化酶的最佳反应温度升高至50℃，该温度条件并不适用于工业化生产；使用大孔高聚物和二种多糖固定化DAAO酶（CN202010143964.7），固定化效果较好，但是与蛋白质反应之前壳聚糖需用戊二醛活化，操作相对繁琐。

发明内容

本发明的目的在于提供一种D-氨基酸氧化酶-无机杂化纳米花及其制备方法和应用，以克服D-氨基酸氧化酶游离酶在不同的条件下对底物的催化能力不稳定，游离酶难以回收利用的问题。

为达到上述目的，提出以下技术方案：

一种D-氨基酸氧化酶-无机杂化纳米花的制备方法，包括如下步骤：

1）配制磷酸盐缓冲液，以磷酸盐缓冲液为溶液，溶解0.1g/ml-0.25g/ml的D-氨基酸氧化酶全细胞菌体；

2）将全细胞菌液破碎，将破胞液离心，弃沉淀，取其上清，上清为溶液Ⅰ；

3）配制可溶性盐水溶液，该溶液为溶液Ⅱ；

4）将溶液Ⅰ经磷酸盐缓冲液稀释后加入到溶液Ⅱ中，并震荡混匀；

5）将步骤4）的混合液放置在25℃下孵育一定时间，离心收集沉淀，用超纯水洗涤3次，获得D-氨基酸氧化酶杂化纳米花。

进一步地，所述的磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和水或磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和水或磷酸二氢钠、磷酸氢二钾和水或磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和水，优选为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和水。

进一步地，磷酸盐缓冲液的浓度为10mM，pH为7.2-7.8，优选为7.4。

进一步地，步骤3）中所述的可溶性盐为铜、锌、锰或铝的可溶性硫酸盐或氯化物，优选为硫酸锌。

进一步地，可溶性盐水溶液的浓度为20mmol/L-80mmol/L，优选为40mmol/L。

进一步地，步骤5）中的孵育时间为20-40小时。

一种采用所述的制备方法制备得到的D-氨基酸氧化酶-无机杂化纳米花，其特征在于有机组分为的D-氨基酸氧化酶，所述的无机组分为磷酸盐。

D-氨基酸氧化酶-无机杂化纳米花的应用，包括如下步骤：将D-氨基酸氧化酶-无机杂化纳米花加入pH值为7.5、浓度为10g/L的D-氨基酸或20g/L DL-氨基酸的溶液中，加入1%过氧化氢酶，在温度38℃、pH8.0条件下反应，生成相应的α-酮酸。

本发明的有益效果在于：

1）本发明提供了一种D-氨基酸氧化酶-无机杂化纳米花的制备方法，操作简单，条件温和，无有毒有害物质，符合绿色生产要求；

2）本发明制备得到的D-氨基酸氧化酶-无机杂化纳米花稳定性相对于游离酶得到了有效的提高，实现了固定化酶的回收重复利用，从而降低了生产成本，制备得到的固化酶具有较高的生物活性，用途广泛，工业化前景较好，可应用于食品、医药等领域。

附图说明

图1是不同金属无机盐溶液制得纳米花酶的相对酶活；

图2是不同金属无机盐溶液浓度制得纳米花酶的相对酶活；

图3是不同孵育时间制得的纳米花酶的相对酶活；

图4是纳米花酶和游离酶的热稳定性比较；

图5是纳米花酶和游离酶的pH稳定性比较；

图6是纳米花酶的重复使用稳定性验证；

图7是纳米花酶和游离酶分别催化酮亮氨酸的产量。

具体实施方式

下面结合实施例和说明书附图对本发明进行详细描述，但本发明并不限于以下实施例，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

（1）配制pH7.4，浓度为10mM的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和水，溶解0.1g/mL的D-氨基酸氧化酶全细胞菌体；

（2）将全细胞菌液破碎，将破胞液离心，弃沉淀，保留上清；

（3）分别配制40mmol/L的硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰和硫酸铝溶液；

（4）取四管上清50μL，分别用磷酸盐缓冲液稀释至900μL，混匀后分别加入硫酸铜、硫酸锌、硫酸锰和硫酸铝溶液100μL，震荡混匀；

（5）上述混合液分别放置在25℃下孵育20h，离心收集沉淀，用超纯水洗涤3次，获得D-氨基酸氧化酶杂化纳米花；

（6）上述所得纳米花酶测定其酶活，酶活测定方法如下：在此定义一个酶活单位为在一定反应条件下，一分钟内催化生成1 μmol 产物所需的酶量。酶活计算公式为

，单位U，其中：c：产物含量，单位g/L；V：反应体积，单位L；Mr：产物分子量，单位g/mol；t：反应时间，单位min；m：投入纳米花酶重量，单位g。

结果如图1所示，用锌离子制备的纳米花酶相对活性为游离酶的80%，优于铜离子、锰离子和铝离子制备的纳米花酶。

实施例2

（1）配制pH为7.4，浓度为10mM的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和水，溶解0.1g/mL的D-氨基酸氧化酶全细胞菌体；

（3）配制40mmol/L的硫酸锌溶液；

（4）取上清50μL用磷酸盐缓冲液稀释至900μL，混匀后加入硫酸锌溶液100μL，震荡混匀；

（5）上述混合液放置在25℃下孵育20h，离心收集沉淀，用超纯水洗涤3次，获得D-氨基酸氧化酶-无机杂化纳米花。

实施例3

（1）配制pH为7.4，浓度为10mM的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和水，溶解0.25g/mL的D-氨基酸氧化酶全细胞菌体；

（3）分别配制20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L、80mmol/L、100mmol/L的硫酸锌溶液；

（4）取上清50μL用磷酸盐缓冲液稀释至900μL，混匀后分别加入以上不同浓度的硫酸锌溶液100μL，震荡混匀；

酶活测定方法同实施例1中酶活测定方法。

结果如图2所示，将孵育20小时后的游离酶酶活设为100%，纳米花酶酶活呈现先升高后降低的趋势，金属离子终浓度为4mol/L时纳米花酶酶活最高，为85.17%，优于其他金属离子浓度。

实施例4

（3）配制40mmol/L的硫酸锌溶液；

（4）取上清250μL用磷酸盐缓冲液稀释至4500μL，混匀后加入硫酸锌溶液500μL，震荡混匀；

（5）将上述混合液分成五等分，分别放置在25℃下孵育10h、20h、30h、40h、50h，离心收集沉淀，用超纯水洗涤3次，获得D-氨基酸氧化酶-无机杂化纳米花。

酶活测定方法同实施例1中酶活测定方法。

结果如图3所示，将放置在25℃下孵育30小时后的固定化酶酶活设为100%，孵育10h、20h、30h、40h、50h后的纳米花固定化酶的相对酶活分别为78.23%、97.4%、100%、96.4%、79.1%，纳米花固定化的孵育时间为20-40h。

实施例5

将实施例2中制备好的D-氨基酸氧化酶杂化纳米花放入pH8.0磷酸缓冲溶液中，分别在温度24℃、28℃、32℃、36℃、40℃条件下放置8小时，测定放置8小时后纳米花酶活。

取相同终浓度的游离酶，按照上述条件放置相同时间，测定放置8小时后游离酶酶活。

酶活测定方法同实施例1中酶活测定方法。

结果如图4所示，将24℃下放置8小时后的固定化酶酶活设为100%，在36℃放置8小时，纳米花固定化酶相对剩余酶活为85.17%，游离梅相对剩余酶活为45.93%，纳米花固定化大大提高了酶的热稳定性。

实施例6

将实施例2中制备好的D-氨基酸氧化酶杂化纳米花分别置于pH值为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的磷酸缓冲溶液，在温度24℃条件下放置8小时。测定放置8小时后纳米花酶活。

酶活测定方法同实施例1中酶活测定方法。

结果如图5所示，将pH8.0放置8小时后的固定化酶酶活定义为100%，在pH 7.5的磷酸缓冲液中放置8小时，纳米花固定化酶相对剩余酶活为92.1%，游离梅相对剩余酶活为57.7%，纳米花固定化大大提高了酶的pH稳定性。

实施例7

将实施例2中制备好的D-氨基酸氧化酶杂化纳米花在温度35℃、pH8.0磷酸缓冲溶液中反应，对催化反应完成后的纳米花固定化酶进行回收利用，回收过程如下：反应15min后离心收集载体，而后用去离子水洗涤除去残留产物及底物后收集载体。将收集后的载体投入反应液中，重复反应5次，观察纳米花固定化酶的酶活力变化。

将第一次反应的酶活力设置为100%，其他酶活力按照比例计算。

酶活测定方法同实施例1中酶活测定方法。

结果如图6所示，随着使用的次数增加，纳米花酶的酶活逐渐下降。相对于第一次反应测得酶活，在第5次重复使用后，测得相对酶活为71.8%。

实施例8

将实施例2中制备好的D-氨基酸氧化酶杂化纳米花加入pH7.5、20g/L DL-亮氨酸的溶液中，加入1%的过氧化氢酶，在温度35℃条件下反应24小时，生成相应的α-酮酸，每2小时用HPLC测得生成的产物。

取相同终浓度的游离酶，按照上述反应条件催化反应24小时，每2小时用HPLC测得生成的产物。

结果如图7所示，催化反应24小时，纳米花酶催化生成酮亮氨酸16.8g/L，游离酶催化生成酮亮氨酸9.6g/L，大大提高该酶催化生产酮亮氨酸水平。

Claims

1.一种D-氨基酸氧化酶-无机杂化纳米花的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1）配制磷酸盐缓冲液，以磷酸盐缓冲液为溶液，溶解0.1g/ml-0.5g/ml的D-氨基酸氧化酶全细胞菌体；

3）配制可溶性盐水溶液，该溶液为溶液Ⅱ；

5）将步骤4）的混合液放置在25℃下孵育一定时间，离心收集沉淀，用超纯水洗涤3次，获得D-氨基酸氧化酶-无机杂化纳米花。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和水或磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和水或磷酸二氢钠、磷酸氢二钾和水或磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和水，优选为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和水。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于磷酸盐缓冲液的浓度为10mM，pH为7.2-7.8，优选为7.4。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3）中所述的可溶性盐为铜、锌、锰或铝的可溶性硫酸盐或氯化物，优选为硫酸锌。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于可溶性盐水溶液的浓度为20mmol/L-80mmol/L，优选为40mmol/L。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤5）中的孵育时间为20-40h。

7.一种采用如权利要求1所述的制备方法制备得到的D-氨基酸氧化酶-无机杂化纳米花，其特征在于有机组分为的D-氨基酸氧化酶，所述的无机组分为磷酸盐。

8.一种如权利要求8所述的D-氨基酸氧化酶-无机杂化纳米花的应用，其特征在于包括如下步骤：将D-氨基酸氧化酶-无机杂化纳米花加入pH7.5、浓度为10g/L的D-氨基酸或20g/L DL-氨基酸的溶液中，加入1%过氧化氢酶，在温度38℃、pH8.0条件下反应，生成相应的α-酮酸。