CN117603955A - 一种谷氨酸脱羧酶、基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶、基因及其应用，该谷氨酸脱羧酶氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明的谷氨酸脱羧酶最适反应pH为5.0，最适反应温度为60℃，米氏常数（K m）为10.94 mM，催化效率（k cat/K m）为2.07 s‑1mM‑1；半失活温度（T 50 15）为62.08℃；55℃条件下的半衰期（t 1/2）约为104.46分钟。该谷氨酸脱羧酶呈现出较好的热稳定性和催化活性，具有良好的工业应用的前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种谷氨酸脱羧酶、基因及其应用。
背景技术
γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然存在的非蛋白氨基酸，具有抗抑郁、降血压、改善睡眠等多种重要的生理功能，在食品、医药化工及农业等领域应用广泛，市场前景广阔。谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD；EC 4.1.1.15)能够专一、不可逆地催化L-谷氨酸(L-Glu)或L-谷氨酸盐脱去α-羧基生成GABA并释放出CO2，是生物法合成GABA的关键限速酶。
截至目前，来源于米曲霉、绿色木霉、大肠杆菌、鸟肠球菌、嗜热链球菌、棉子糖肠球菌、乳酸乳球菌、布氏迟缓乳杆菌、短促生乳杆菌、老面促生乳杆菌、发酵粘液乳杆菌、清酒广泛乳杆菌、植物乳植物杆菌、巨大芽孢杆菌等微生物的GAD基因被克隆和异源表达，其酶学性质亦被研究。然而，天然的GAD普遍存在热稳定性差的缺陷。例如，短促生乳杆菌源GAD已被国内外企业应用于工业化生物法合成GABA，但其半失活温度(T50 15)为56.5℃，55℃条件下的半衰期(t1/2)仅为26.31分钟。近年来，国内外研究者通过易错PCR、定点突变、同源建模、脯氨酸效应、拉氏图信息、序列一致性、蛋白质表面电荷优化及祖先酶序列重构等方法在一定程度上提升了GAD的热稳定性(如以下专利：CN106754850A、CN110229805A、CN111607583A、CN112831488A、CN114480357A)，但在大规模酶法合成GABA的工业应用中仍受酶稳定性的制约。因此，如何获取稳定性较高的GAD已成为科研工作者与企业研发人员关注的热点。
发明内容
针对现有技术中存在的谷氨酸脱羧酶稳定性差问题，本发明提供一种新的谷氨酸脱羧酶基因及其编码蛋白的制备方法和应用，该谷氨酸脱羧酶具有较高的热稳定性，可应用于大规模酶法合成GABA。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种谷氨酸脱羧酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
该谷氨酸脱羧酶的最适反应pH为5.0，最适反应温度为60℃，米氏常数(Km)为10.94mM，催化效率(kcat/Km)为2.07s-1mM-1；半失活温度(T50 15)为62.08℃；55℃条件下的半衰期(t1/2)约为104.46分钟。
编码上述谷氨酸脱羧酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
含有上述基因的重组表达载体。在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体为重组质粒。
含有上述基因或重组表达载体的基因工程菌。
上述谷氨酸脱羧酶在催化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐脱去α-羧基生成γ-氨基丁酸中的应用。
上述基因在催化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐脱去α-羧基生成γ-氨基丁酸中的应用。
本发明的创新性在于采用鹑鸡肠球菌基因组作为谷氨酸脱羧酶基因的模板。其挖掘过程为：以晶体结构已报道的短促生乳杆菌源GAD(PDB ID.5GP4)氨基酸序列为模板，采用https://loschmidt.chemi.muni.cz/fireprotasr/在线系统获取其祖先酶蛋白相对应的氨基酸序列，而后利用美国国家生物技术信息中心数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Protein Blast功能(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)获取相似性最高的潜在稳定性GAD，即鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)GAD。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：所挖掘的谷氨酸脱羧酶的半失活温度(T50 15)为62.08℃，比短促生乳杆菌源GAD(56.5℃)高5.58℃；55℃条件下的半衰期(t1/2)为104.46分钟，是短促生乳杆菌源GAD的4.42倍，呈现出更为良好的热稳定性和催化活性，具有大规模工业应用的前景。
附图说明
图1为谷氨酸脱羧酶EgGAD、短促生乳杆菌源GAD(LbGAD)、大肠杆菌源GAD(EcGAD)的一致性分析结果。
图2为重组子菌落PCR验证结果。
图3为纯化后的谷氨酸脱羧酶EgGAD的SDS-PAGE电泳结果，其中：M为蛋白Marker、1,2为纯化后的EgGAD。
图4为不同温度下谷氨酸脱羧酶EgGAD的相对活性检测结果。
图5为不同pH下谷氨酸脱羧酶EgGAD的相对活性测试结果。
图6为谷氨酸脱羧酶EgGAD的半失活温度测定结果。
具体实施方式
本发明提供了一种谷氨酸脱羧酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码该谷氨酸脱羧酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
该谷氨酸脱羧酶的最适反应pH为5.0，最适反应温度为60℃，米氏常数(Km)为10.94mM，催化效率(kcat/Km)为2.07s-1mM-1；半失活温度(T50 15)为62.08℃；55℃条件下的半衰期(t1/2)约为104.46分钟。
该谷氨酸脱羧酶可用于催化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐脱去α-羧基生成γ-氨基丁酸。
本发明还提供了上述谷氨酸脱羧酶的制备方法，包括以下步骤：
步骤101：以鹑鸡肠球菌(E.gallinarum CGMCC1.9125)基因组为模板，设计引物，并通过PCR克隆所述核甘酸序列；
扩增引物为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4；
步骤102：使用PCR产物纯化试剂盒，从克隆产物中分离纯目的核甘酸序列；
步骤201：利用限制性内切酶BamHI和HindIII分别酶切目的核甘酸序列与载体质粒，37℃酶切30分钟；
步骤202：酶切后，通过DNA凝胶回收试剂盒，获得酶切后的核甘酸序列和载体质粒；
步骤203：使用T4-DNA快速连接酶将回收到核甘酸序列和载体质粒在25℃条件下连接15分钟，获得重组质粒；
步骤301：通过热激法将重组质粒导入到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中；
步骤302：将转化液涂布于含有50μg/mL卡纳霉素(Kan)的LB固体平板，37℃培养12小时，获得菌落；
步骤303：通过PCR法筛选和DNA测序验证菌落重组子，获得目的工程菌；
步骤401：取所述目的工程菌进行扩大培养后，通过IPTG或乳糖诱导表达蛋白；
步骤402：通过细胞破碎、亲和层析的方法，从表达蛋白的细胞中提取并纯化谷氨酸脱羧酶。
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
鹑鸡肠球菌(E.gallinarum CGMCC1.9125)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
细菌基因组提取试剂盒与PCR产物纯化试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。
实施例1
一、重组质粒的获取
步骤101：将-80℃冰箱保存的鹑鸡肠球菌(E.gallinarum CGMCC1.9125)接种至5mL MRS液体培养基中，37℃静置培养24h；
步骤102：离心收集菌体细胞，采用细菌基因组提取试剂盒获取该菌株基因组DNA；
步骤103：设计引物EgGAD-F和EgGAD-R，并通过PCR克隆所述核甘酸序列，引物序列如下：
EgGAD-F：CGCGGATCCATGTTATATGGAAAAGAAAACCGCGAAG(SEQ ID No.3)
EgGAD-R：CCCAAGCTTTTAATGAGTAAAGCCGTAGGTTTTGAT(SEQ ID No.4)；
步骤104：使用PCR产物纯化试剂盒，从克隆产物中纯化出目的核甘酸序列，核苷酸序列如下：
ATGTTATATGGAAAAGAAAACCGCGAAGAAGCAGACTATTTGGAACCAATTTTTGGAGCTGTTTGTGAAGGAGAAGATTTACCGAAATACAAACTAAATCCACAATCTGTTGAACCTAGAATGGCCTATCAGCTCGTACAAGATCAGCTACTTGATGAAGGAAATGCCCGTTTGAATTTAGCTACATTCTGTCAAACCTACATGGAACCGGAAGCAGTTAAGCTGATGACACAAACTCTAGAAAAAAATGCCATCGACAAATCCGAGTATCCACGAACAGCAGAAATTGAAAATCGCTGTGTGAATATCATTGCAGATTTGTGGCATGCAAGCAAAGAAGAAAAATTCATGGGCACTTCTACCATTGGTTCTTCAGAAGCCTGTATGTTAGGTGGGATGGCAATGAAATTTGCTTGGCGTAATCGGGCGGAAAAACTCGGTCTCGATCTAAATGCTCATAAACCTAATTTAGTGATTTCAAGCGGTTATCAAGTTTGTTGGGAAAAATTTTGTGTCTACTGGGATATCGAGATGAGAGAAGTCCCTATGGATGAAAACCATTTGTCGATCAATCTTGATAAAGTGATGGACTATGTTGATGAATATACGATCGGCATCGTTGGCATTCTAGGAATCACCTATACAGGACGCTATGACGACATTAAAGGATTGAATGAACTTGTTGAACAATACAACCAAACAACGGACTATAAAGTCTACATTCATGTGGATGCTGCTTCTGGTGGTCTCTATACCCCTTTTACTGAACCGGATCTCGTCTGGGACTTTCAATTACCAAATGTCATATCAATCAACACATCGGGTCATAAATACGGTCTCGTTTATCCGGGTGTGGGTTGGGTACTTTGGCGCGATCAATCTTACTTGCCTCAAGAACTTGTATTTAAAGTCAGCTATTTAGGCGGTGAGTTACCAACCATGGCCATCAACTTCTCCCATAGTGCTGCTCAGTTGATCGGACAATACTATAATTTTGTGCGCTATGGTTTTGATGGTTACAAAGCGATTCATGACAAGACCCATAAAGTTGCTCTTTATTTGGCAAAAGAAATCGAAAAAACCGATCTATTCGAAATGATCAATGATGGCGCTCAACTTCCGATCGTCTGCTACAAATTGAAAGACGATCCAAAACGGGAATGGACGTTGTATGACTTAGCAGACCGTTTACTCATGAAAGGTTGGCAAGTTCCAGCTTATCCATTACCAGCCAATTTAGACGACCAAATCATCCAACGATTGGTCATTCGTGCAGACTTTGGTATGAATATGGCCCACGATTATATTCAAGACATGAAAGAAGCTCTGCTGGCACTTGATCAGGCTCATCTGGTCTATCATAAAAAACAAGAAATCAAAACCTACGGCTTTACTCATTAA(SEQ ID No.1)；
步骤201：利用限制性内切酶BamHI和HindIII分别酶切目的核甘酸序列与载体质粒pET28a，37℃酶切30分钟；
步骤202：酶切后，通过胶回收的方法，获得酶切后的核甘酸序列和载体质粒；
步骤203：使用T4-DNA快连接酶将回收到核甘酸序列和载体质粒在25℃条件下连接15分钟，获得重组质粒。
二、工程菌的获得
步骤301：通过热激法将重组质粒导入到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中；
步骤302：将转化液涂布于含有50μg/mL卡纳霉素(Kan)的LB固体平板，37℃培养12小时，获得菌落；
步骤303：通过PCR法筛选和DNA测序验证菌落重组子，获得目的工程菌。
具体的，转化液涂布于含有50μg/mL卡纳霉素(Kan)的LB固体平板，37℃培养12小时。获得的菌落经PCR初步筛选重组子，而后进行DNA测序验证，获取正确的目的工程菌，即为表达EgGAD的目的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-EgGAD。
如图1所示，EgGAD与短促生乳杆菌源GAD(LbGAD)及大肠杆菌源GAD(EcGAD)的序列一致性分别为72.75％和46.17％。
重组子菌落PCR验证如图2所示。
三、酶的表达及分离纯化
步骤401：取所述目的工程菌进行扩大培养后，通过IPTG或乳糖诱导表达重组酶EgGAD。
步骤402：通过细胞破碎、亲和层析的方法，从表达蛋白的细胞中提取并纯化谷氨酸脱羧酶EgGAD。
具体的，挑取测序验证正确的单克隆菌落接种于5mL含有终浓度为50μg/mL Kan的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养12h。随后，以2％(V/V)接种量接种于200mL含有终浓度为50μg/mL Kan的LB液体培养基中，37℃、220rpm条件下继续培养细胞。当菌悬液OD600值达到0.5左右时，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导。30℃、150rpm条件下诱导6-8h，6000rpm、4℃离心15min收集菌体细胞，并采用无菌生理盐水离心洗涤2次。取经IPTG诱导后菌体细胞，采用10％培养体积的破胞缓冲液(0.1M PBS，1mM PMSF，pH 7.5)溶解细胞沉淀，随后采用高压匀浆机破碎细胞(75Mpa,2min)，处理完毕后，将细胞破碎液进行离心(13,000×g，30min，4℃)，获取上清液，即粗酶液。粗酶液经0.45μm的滤膜过滤后，采用镍离子亲和层析法对目的蛋白EgGAD进行分离纯化。
纯化后，进行蛋白含量和纯度测试：通过改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒建立蛋白含量标准曲线，测定纯酶的浓度。采用SDS-PAGE方法鉴定纯化后蛋白的纯度和分子量，浓缩胶与分离胶分别为5％和12％。
所述谷氨酸脱羧酶EgGAD的氨基酸序列如下：
MLYGKENREEADYLEPIFGAVCEGEDLPKYKLNPQSVEPRMAYQLVQDQLLDEGNARLNL
ATFCQTYMEPEAVKLMTQTLEKNAIDKSEYPRTAEIENRCVNIIADLWHASKEEKFMGTSTI
GSSEACMLGGMAMKFAWRNRAEKLGLDLNAHKPNLVISSGYQVCWEKFCVYWDIEMRE
VPMDENHLSINLDKVMDYVDEYTIGIVGILGITYTGRYDDIKGLNELVEQYNQTTDYKVYI
HVDAASGGLYTPFTEPDLVWDFQLPNVISINTSGHKYGLVYPGVGWVLWRDQSYLPQELVF
KVSYLGGELPTMAINFSHSAAQLIGQYYNFVRYGFDGYKAIHDKTHKVALYLAKEIEKTDL
FEMINDGAQLPIVCYKLKDDPKREWTLYDLADRLLMKGWQVPAYPLPANLDDQIIQRLVIR
ADFGMNMAHDYIQDMKEALLALDQAHLVYHKKQEIKTYGFTH(SEQ ID No.2)。
图3示出了纯化后的EgGAD电泳图，其中，M为蛋白Marker；1,2为纯化后的EgGAD。
可见所纯化的重组EgGAD亚基分子量约为55kDa，且纯度较高。
四、EgGAD酶学特性分析
配置不同pH的底物溶液(0.2M醋酸-醋酸钠缓冲液，pH 3.5-5.5；0.1M磷酸钠缓冲液，pH 6.0-6.5；内含0.01mM PLP与100mM L-Glu)；取480μL底物溶液，向其加入20μL纯化后的EgGAD，反应5min后利用0.2M NaHCO3溶液(pH 9.8)终止反应后，并采用HPLC法测定反应生成的GABA含量。
动力学参数于含有不同底物浓度的反应体系中测定。图4和图5中分别测试了EgGAD在不同温度和pH下的相对活性。如图4所示，EgGAD的最适反应温度为60℃。如图5所示，EgGAD的最适反应pH为pH 5.0。经计算，EgGAD的Km值为10.94mM，kcat/Km为2.07s-1mM-1。
其中，GABA含量采用柱前衍生化RP-HPLC法测定。衍生化条件如下：将100μL经0.5MNaHCO3稀释后的待测样品，200μL 0.5M NaHCO3溶液，100μL 4g/L DNS-Cl(丹璜酰氯)丙酮溶液，混合均匀后置于40℃下避光衍生1h，随后用0.22μm微孔滤膜过滤。
HPLC操作条件如下：色谱分离柱为Hypersil ODS2 C18(250mm×4.6mm)，紫外检测波长设置为254nm，进样量为10μL，流速为1mL/min，流动相A为含0.01％三氯乙酸的甲醇溶液，流动相B：四氢呋喃：甲醇：0.05M醋酸钠(pH 6.2)为5:75:420(v/v)。梯度洗脱程序见下表1。
表1梯度洗脱程序
| t(min) | 0 | 3 | 18 | 22 | 24 | 25 | 30 |
| A | 20 | 20 | 50 | 100 | 100 | 20 | 20 |
| B | 80 | 80 | 50 | 0 | 0 | 80 | 80 |
五、动力学稳定性的测定
(1)半失活温度(T50 15)的测定：T50 15是指纯酶在不同温度条件下孵育15min后，酶残余活力降低到50％时所对应的温度。具体的，将纯化后的EgGAD分别在25-65℃条件下孵育15min，孵育结束后迅速放置冰上冷却5min，而后测定EgGAD的残余活力。以温度为横坐标，以热处理后与未经热处理的酶活力比值(相对活性)为纵坐标，运Boltzmann S型函数拟合曲线，计算T50 15。
如图6所示，EgGAD的T50 15为62.08℃。
(2)半衰期(t1/2)的测定：将纯酶分别在55℃下孵育不同时间后，迅速放到冰上冷却5min，而后采用如上所述方法测定残余酶活。以未经孵育处理的酶活为100％，利ExpGro1型函数拟合曲线，计算当酶活力降至50％时所对应的时间，即为t1/2。
EgGAD在55℃条件下的半衰期t1/2为104.46分钟。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1. 一种谷氨酸脱羧酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.编码权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶的基因。
3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.含有权利要求2所述基因的重组表达载体。
5.含有权利要求2所述基因或权利要求4所述重组表达载体的基因工程菌。
6.权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶在催化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐脱去α-羧基生成γ-氨基丁酸中的应用。
7.权利要求2所述的基因在催化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐脱去α-羧基生成γ-氨基丁酸中的应用。
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