CN114752589A - 谷氨酸脱羧酶突变体及在生产γ-氨基丁酸中的应用 - Google Patents

谷氨酸脱羧酶突变体及在生产γ-氨基丁酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了谷氨酸脱羧酶突变体及在生产γ‑氨基丁酸中的应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明构建了能够响应GABA的生物传感器，并应用该生物传感器筛选获得了一系列酶活提高的谷氨酸脱羧酶突变体，极大提高了谷氨酸脱羧酶突变体在pH6.0‑7.5下的活力。本发明还利用谷氨酸脱羧酶GAD酶突变体，构建了一株γ‑氨基丁酸产量提高的的谷氨酸棒杆菌工程菌株，可在pH 7.0条件下从葡萄糖一步法发酵生产GABA，GABA产量可达到82 g/L，是目前报道最高值，且极大降低了成本，使GABA生产成本可小于谷氨酸生产成本。

Description

谷氨酸脱羧酶突变体及在生产γ-氨基丁酸中的应用
技术领域
本发明涉及谷氨酸脱羧酶突变体及在生产γ-氨基丁酸中的应用，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
γ-氨基丁酸(GABA)是一种四碳的非蛋白氨基酸，它在自然界中广泛存在，从微生物到植物和动物，具有预防及治疗失眠、降压、抗焦虑、镇静、镇痛、利尿等功能，可用于治疗各种神经功能障碍。GABA作为合成2-吡咯烷酮和可生物降解材料-聚酰胺尼龙4的前体也受到了广泛的关注，进一步将其应用领域扩展到工业领域。
GABA的合成有很多方式，包括化学合成，酶促或全细胞生物催化和微生物发酵。与化学合成相比，GABA的生物合成具有许多优势，如简单的后处理程序，更温和的反应条件，较高的产品收率，更高的产物选择性以及更低的环境污染性等。GABA生物合成的主要途径是经L-谷氨酸由谷氨酸脱羧酶GAD催化的不可逆的脱羧反应。谷氨酸脱羧酶（GAD）能够以磷酸吡多醛（PLP）作为辅因子催化将谷氨酸（Glu）生成GABA，是GABA生产的关键性酶。已经有一些国内外的文献报道了关于用谷氨酸棒杆菌生产GABA，在2011年，研究人员首次报道了在谷氨酸棒杆菌中表达来自短乳杆菌Lb85的谷氨酸脱羧酶能够产低浓度但可检测的GABA。另有报道利用外源表达大肠杆菌W3110的GadB，重组谷氨酸棒杆菌经过优化的发酵过程可产生12.37 g/L的GABA。Zhang等人基于重组谷氨酸棒杆菌，从葡萄糖开发有效的直接生物合成途径，无需添加昂贵的PLP辅因子，通过两阶段pH控制策略发酵70小时，GABA产量达到70.6 g/L。
谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸生成GABA，该反应消耗质子，从而可以增加环境的pH值。许多谷氨酸脱羧酶在pH4至5范围内均表现出最佳活性，并且其活性在pH值高于6时急剧下降，在pH 7时几乎失活。有些研究报道了一些突变体，提高其在中性pH下活力，但目前研究中，谷氨酸脱羧酶突变体的最适pH都没有改变，大部分没能提高pH高于6时的酶活，在pH7.0条件下仍几乎失活。
发明内容
为解决现有的谷氨酸脱羧酶pH不适用于GABA生产等缺陷，本发明提供了一种GABA生物传感器和利用该生物传感器定向进化得到的GAD酶突变体。
本发明提供了一种GABA生物传感器，含有启动子P gabTDP 、P gabR ，报告基因、gabR基因；所述启动子P gabTDP 、P gabR ，报告基因、gabR基因位于同一载体上或同一基因组DNA上，构成所述生物传感器；所述P gabTDP 调控报告基因的表达；所述P gabR 和P gabTDP 上具有GABA-GabR结合物结合位点的序列，并调控报告基因表达；所述启动子P gabTDP 和启动子PgabR转录方向相反。
在一种实施方式中，所述报告基因为荧光蛋白基因，包括但不限于绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（mCherry）。
在一种实施方式中，编码所述启动子P gabTDP 的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码所述启动子PgabR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；编码所述gabR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述GABA-gabR结合物结合位点的序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供所述生物传感器在γ-氨基丁酸生产菌株的选育中的应用。
本发明还提供了谷氨酸脱羧酶突变体，在SEQ ID NO.3所示的谷氨酸脱羧酶的基础上，将第38位天冬氨酸、第92位天冬氨酸、第118位天冬氨酸、第202位天冬氨酸、第301位天冬氨酸、第371位天冬氨酸、第432位天冬氨酸、第451位亮氨酸、第457位赖氨酸、第461位酪氨酸中的任一个氨基酸进行取代得到的；或者，
将第51位组氨酸、第121位组氨酸、第206位异亮氨酸、第355位苯丙氨酸、第451位亮氨酸、第459位苏氨酸、第461位酪氨酸、第467位组氨酸中的任意两个氨基酸进行取代得到的；或者，
将第68位缬氨酸、第96位谷氨酰胺、第120位苏氨酸、第186位天冬酰胺、第436位亮氨酸、第451位亮氨酸中的任意三个氨基酸进行取代得到的；或者，
将第38位天冬氨酸、第89位异亮氨酸、第92位天冬氨酸、第93位谷氨酸、第153位丝氨酸、第202位天冬氨酸、第268位脯氨酸、第294位谷氨酸、第301位天冬氨酸、第355位苯丙氨酸、第432位天冬氨酸、第435位组氨酸、第451位亮氨酸中的任意四至十三个氨基酸进行取代得到的。
在一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.3的基础上，进行了四至十个氨基酸位点的突变；所述氨基酸位点选自如下（1）~（10）：
（1）第89位异亮氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或亮氨酸或酪氨酸或缬氨酸或脯氨酸或甲硫氨酸或丙氨酸或丝氨酸；
（2）第92位天冬氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或亮氨酸或酪氨酸或缬氨酸或脯氨酸或甲硫氨酸或丙氨酸或丝氨酸；
（3）第93位谷氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或亮氨酸或酪氨酸或缬氨酸或脯氨酸或甲硫氨酸或丙氨酸或丝氨酸；
（4）第153位丝氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或亮氨酸或酪氨酸或缬氨酸或脯氨酸或甲硫氨酸或丙氨酸或丝氨酸；
（5）第268位脯氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或亮氨酸或酪氨酸或缬氨酸或脯氨酸或甲硫氨酸或丙氨酸或丝氨酸；
（6）第301位天冬氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或亮氨酸或酪氨酸或缬氨酸或脯氨酸或甲硫氨酸或丙氨酸或丝氨酸；
（7）第355位苯丙氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或亮氨酸或酪氨酸或缬氨酸或脯氨酸或甲硫氨酸或丙氨酸或丝氨酸；
（8）第432位天冬氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或亮氨酸或酪氨酸或缬氨酸或脯氨酸或甲硫氨酸或丙氨酸或丝氨酸；
（9）第435位组氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或亮氨酸或酪氨酸或缬氨酸或脯氨酸或甲硫氨酸或丙氨酸或丝氨酸；
（10）第451位亮氨酸突变为终止密码子。
在一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.3的基础上，
将第355位苯丙氨酸突变为赖氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第355位苯丙氨酸突变为酪氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第355位苯丙氨酸突变为亮氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第89位异亮氨酸突变为甲硫氨酸，并将第355位苯丙氨酸突变为酪氨酸，并将第432位天冬氨酸突变为丙氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第89位异亮氨酸突变为谷氨酰胺，并将第355位苯丙氨酸突变为天冬酰胺，并将第432位天冬氨酸突变为缬氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第89位异亮氨酸突变为缬氨酸，并将第355位苯丙氨酸突变为酪氨酸，并将第432位天冬氨酸突变为天冬酰胺，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第89位异亮氨酸突变为亮氨酸，并将第355位苯丙氨酸突变为缬氨酸，并将第432位天冬氨酸突变为亮氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第89位异亮氨酸突变为天冬酰胺，并第93位谷氨酸突变为甲硫氨酸，并将第153位丝氨酸突变为谷氨酰胺，并将第268位脯氨酸突变为丙氨酸，并将第301位天冬氨酸突变为丝氨酸，并将第355位苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，并将第432位天冬氨酸突变为丙氨酸，并将第435位组氨酸突变为酪氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第89位异亮氨酸突变为谷氨酰胺，并第93位谷氨酸突变为天冬酰胺，并将第153位丝氨酸突变为谷氨酰胺，并将第268位脯氨酸突变为谷氨酰胺，并将第301位天冬氨酸突变为谷氨酰胺，并将第355位苯丙氨酸突变为天冬酰胺，并将第432位天冬氨酸突变为甲硫氨酸，并将第435位组氨酸突变为脯氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第89位异亮氨酸突变为甲硫氨酸，并第93位谷氨酸突变为酪氨酸，并将第153位丝氨酸突变为丙氨酸，并将第268位脯氨酸突变为酪氨酸，并将第301位天冬氨酸突变为甲硫氨酸，并将第355位苯丙氨酸突变为缬氨酸，并将第432位天冬氨酸突变为酪氨酸，并将第435位组氨酸突变为谷氨酰胺，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第38位天冬氨酸突变为天冬酰胺，并将第89位异亮氨酸突变为缬氨酸，并将第92位天冬氨酸突变为天冬酰胺，并将第93位谷氨酸突变为天冬酰胺，并将第153位丝氨酸突变为苏氨酸，并将第202位天冬氨酸突变为谷氨酰胺，并将第268位脯氨酸突变为苏氨酸，并将第294位谷氨酸突变为丝氨酸，并将第301位天冬氨酸突变为谷氨酰胺，并将第355位苯丙氨酸突变为缬氨酸，并将第432位天冬氨酸突变为谷氨酰胺，并将第435位组氨酸突变为酪氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第38位天冬氨酸突变为缬氨酸，并将第89位异亮氨酸突变为丙氨酸，并将第92位天冬氨酸突变为谷氨酰胺，并将第93位谷氨酸突变为脯氨酸，并将第153位丝氨酸突变为丝氨酸，并将第202位天冬氨酸突变为丝氨酸，并将第268位脯氨酸突变为天冬酰胺，并将第294位谷氨酸突变为酪氨酸，并将第301位天冬氨酸突变为丝氨酸，并将第355位苯丙氨酸突变为丙氨酸，并将第432位天冬氨酸突变为甲硫氨酸，并将第435位组氨酸突变为丝氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第38位天冬氨酸突变为谷氨酰胺，并将第89位异亮氨酸突变为谷氨酰胺，并将第92位天冬氨酸突变为丝氨酸，并将第93位谷氨酸突变为缬氨酸，并将第153位丝氨酸突变为天冬酰胺，并将第202位天冬氨酸突变为谷氨酰胺，并将第268位脯氨酸突变为天冬酰胺，并将第294位谷氨酸突变为丙氨酸，并将第301位天冬氨酸突变为谷氨酰胺，并将第355位苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，并将第432位天冬氨酸突变为丝氨酸，并将第435位组氨酸突变为亮氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第38位天冬氨酸突变为天冬酰胺，并将第89位异亮氨酸突变为缬氨酸，并将第92位天冬氨酸突变为天冬酰胺，并将第93位谷氨酸突变为谷氨酰胺，并将第153位丝氨酸突变为苏氨酸，并将第202位天冬氨酸突变为天冬酰胺，并将第268位脯氨酸突变为苏氨酸，并将第294位谷氨酸突变为精氨酸，并将第301位天冬氨酸突变为天冬酰胺，并将第355位苯丙氨酸突变为酪氨酸，并将第432位天冬氨酸突变为天冬酰胺，并将第435位组氨酸突变为谷氨酰胺，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子。
本发明还提供了编码所述突变体的基因。
在一种实施方式中，编码所述突变体D38N/I89V/D92N//E93Q/S153T/D202N/P268T/E294R/D301N/F355Y/D432N/H435Q/L451*的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了携带所述基因的表达载体。
在一种实施方式中，所述表达载体包括但不限于pCES，pJC1，pAN6质粒，所述质粒pCES公开于论文《Development of a high-copy-number plasmid via adaptivelaboratory evolution of Corynebacterium glutamicum》中，所述质粒pJC1、pAN6公开于论文《Regulation of γ-aminobutyrate (GABA) utilization in Corynebacterium glutamicum by the PucR-type transcriptional regulator GabR and by alternativenitrogen and carbon sources》中。
本发明还提供表达所述谷氨酸脱羧酶突变体的重组微生物细胞。
在一种实施方式中，所述重组微生物细胞以细菌或真菌细胞为宿主细胞。
在一种实施方式中，所述重组微生物是重组谷氨酸棒杆菌，作为宿主的谷氨酸棒杆菌包括但不限于ATCC 13032、ATCC 13869。
本发明还提供了应用所述重组谷氨酸棒杆菌在生产γ-氨基丁酸中的应用，所述应用是将所述重组谷氨酸棒杆菌接种至发酵培养基中，发酵至少40 h。
在一种实施方式中，所述发酵培养基以谷氨酸棒杆菌可利用的单糖、多糖或其混合物为碳源，包括但不限于葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜等。
在一种实施方式中，所述发酵培养基含有：葡萄糖 100g/L, 硫酸铵 12g/L, 硫酸镁 0.87g/L, 玉米浆 3ml/L, 磷酸 0.4ml/L, 氯化钾 0.53g/L, 硫酸亚铁 120mg/L, 硫酸锰 120mg/L, 烟酰胺 42mg/L, 泛酸钙 6.3 mg/L, 维生素B1 6.3mg/L, 生物素0.05mg/L。
在一种实施方式中，发酵过程还控制pH为7.0±0.2。
在一种实施方式中，还控制发酵温度为30℃，溶氧30%。
本发明还提供所述谷氨酸脱羧酶突变体、所述谷氨酸棒杆菌或所述方法在生产含γ-氨基丁酸的产品中的应用。
有益效果：
（1）本发明构建的GABA生物传感器是第一次在原核生物中构建的GABA生物传感器，随着GABA浓度提高，其荧光信号相应也越高，能够用于GABA生产菌株的高效选育。
（2）本发明提供的谷氨酸脱羧酶突变体，极大提高了其pH6.0-7.5条件下的活力，pH7.0时比酶活可达10.29 U/mg。
（3）本发明的谷氨酸脱羧酶GAD酶突变体可用于构建用于γ-氨基丁酸生产的工程菌株，可在pH 7.0条件下生产GABA，GABA产量可达到82 g/L。
附图说明
图1为生物传感器构建。
图2为谷氨酸脱羧酶定向进化方法。
图3为GAD突变库的构建与流式细胞仪FACS筛选测试。
图4为野生型谷氨酸脱羧酶与突变体GAD MUT 128的比酶活测定。
具体实施方式
技术术语：
谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）：谷氨酸脱羧酶是生物体内正常合成的一种酶蛋白，能够将L-谷氨酸的α-羧基脱去一分子CO2得到γ-氨基丁酸。
编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，所述多核苷酸直接规定了谷氨酸脱羧酶突变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，所述可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
表达：术语“表达”包括涉及谷氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶突变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，所述分子包含编码本发明的谷氨酸脱羧酶突变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
突变体：意指具有谷氨酸脱羧酶活性的、在一个或多个(例如若干个)位置包含改变(即取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。本发明的突变体母本具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，并在第38位、第89位、第92位、第93位、第153位、第202位、第268位、第294位、第301位、第355位、第371位、第432位、第435位、第451位、第461位中的至少一处发生取代；在此基础上，还可同时发生第38位、第89位、第92位、第93位、第153位、第202位、第268位、第294位、第301位、第355位、第432位、第435位、第451位的取代。本发明的谷氨酸脱羧酶突变体的活性为母本谷氨酸脱羧酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。
野生型谷氨酸脱羧酶：术语“野生型”谷氨酸脱羧酶意指由见于自然界中的天然存在的微生物(如细菌、酵母或丝状真菌)表达的谷氨酸脱羧酶。
突变：对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。例如，将在位置38处的天冬氨酸被天冬酰胺取代表示为“Asp38Asn”或“D38N”。多个突变通过符号(“/”)分开，例如“D38N/I89V/D92N//E93Q/S153T/D202N/P268T/E294R/D301N/F355Y/D432N/H435Q/L451*”代表在位置38处的天冬氨酸被天冬酰胺取代，在位置89处的异亮氨酸被缬氨酸取代，在位置92处的天冬氨酸被天冬酰胺取代，在位置93处的谷氨酸被谷氨酰胺，在位置153处的丝氨酸被苏氨酸取代，在位置202处的天冬氨酸被天冬酰胺取代，在位置268处的脯氨酸被苏氨酸取代，在位置294处的谷氨酸被精氨酸取代，在位置301处的天冬氨酸被天冬酰胺取代，在位置355处的苯丙氨酸被酪氨酸取代，在位置432处的天冬氨酸被天冬酰胺取代，在位置435处的组氨酸被谷氨酰胺取代，在位置451处的亮氨酸被终止密码子取代。
发酵液：“发酵液”是指由细胞发酵产生的、未经回收或经过回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。所述发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的内容物。例如，所述发酵液包含被微生物利用后的培养基成分以及可通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)后存在的细胞碎片。
培养基：
CGXII培养基：葡萄糖 50g/L，(NH4)2SO4 20g/L，尿素 5g/L，KH2PO4 1g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，CaCl2·2H2O 13.3mg/L，MOPS 42g/L，生物素 0.2mg/L，微量元素溶液 1ml/L，运用KOH 将pH 调节到 7.0；其中，微量元素溶液：FeSO4·7H2O 10g/L，MnSO4·1H2O 10g/L，ZnSO4·7H2O 1g/L，CuSO4·5H2O 313mg/L，NiCl·6H2O 20mg/L。
发酵培养基：葡萄糖 100g/L, 硫酸铵 12g/L, 硫酸镁 0.87g/L, 玉米浆 3ml/L,磷酸 0.4ml/L, 氯化钾 0.53g/L, 硫酸亚铁 120mg/L, 硫酸锰 120mg/L, 烟酰胺 42mg/L, 泛酸钙 6.3 mg/L, 维生素B1 6.3mg/L, 生物素 0.5mg/L。
检测方法：
谷氨酸脱羧酶的测定：通过高效液相法检测酶反应体系或发酵液中的GABA含量（方法参照2020年公开的论文《Regulation of γ-aminobutyrate (GABA) utilizationin Corynebacterium glutamicum by the PucR-type transcriptional regulator GabRand by alternative nitrogen and carbon sources》），根据GABA含量计算谷氨酸脱羧酶酶活。每分钟生成1微摩尔GABA所需的酶量定义为一个酶活单位（U）。比酶活表示为每毫克蛋白质有多少U谷氨酸脱羧酶。
实施例1 GABA生物传感器的构建
GABA生物传感器的设计：如图1所示，含有启动子P gabTDP 、P gabR ，报告基因、gabR基因；所述启动子P gabTDP 、P gabR ，报告基因、gabR基因位于同一载体上或基因组上，构成所述生物传感器；所述P gabTDP 调控报告基因的表达；所述P gabR 和P gabTDP 上具有GABA-GabR结合物结合位点的序列，并调控报告基因表达；所述启动子P gabTDP 和启动子P gabR 转录方向相反；编码所述启动子P gabTDP 的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码所述启动子P gabR 的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；编码所述gabR基因（cg0565）的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述GABA-gabR结合物结合位点的序列如SEQ ID NO.8所示。
GABA生物传感器的工作原理：GABA会与调控蛋白GabR结合，形成的结合物能够与SEQ ID NO.8所示的位点结合，使启动子P gabTDP 起始转录，调控报告基因的表达。以超折叠绿色荧光蛋白（sfgfp）为例，当菌株的生长环境中产生GABA时gabTDP启动子就会开始转录，进而生成绿色荧光蛋白，启动子P gabTDP 能够响应不同浓度的GABA，进而调控不同强度的绿色荧光蛋白表达，通过对荧光的检测筛选高产GABA的菌株。
GABA生物传感器在基因组上的构建：启动子P gabR 和gabR基因（cg0565）位于谷氨酸棒杆菌基因组上；以Pk18mobsacB质粒为骨架，以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，分别克隆gabTD基因上下游1000 bp的同源臂，与sfgfp基因，构建ΔgabTD敲除框，将敲除框与Pk18mobsacB骨架通过Gibson方法相连，构建Pk18mobsacB-ΔgabTD::sfgfp质粒。然后将Pk18mobsacB-ΔgabTD::sfgfp转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，验证正确的质粒命名为Pk18mobsacb-ΔgabTD::sfgfp。将Pk18mobsacB-ΔgabTD::sfgfp质粒转到化感受态谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中。首先通过卡那霉素抗性的选择，然后选择对蔗糖的耐受性的选择进行第二次重组。通过菌落PCR确认了sfgfp对gabTD的成功替换，构建含GABA生物传感器的重组谷氨酸棒杆菌，命名为FF1。
实施例2 谷氨酸脱羧酶突变体、重组质粒和重组菌的构建
运用易错PCR的方法，对GAD进行定向进化，通过实施例1构建的GABA生物传感器筛选出在中性pH时具有活力的GAD。敲除GABA向胞内转运蛋白GabP，消除细胞外的GABA浓度对荧光的影响，让生成的荧光强度相应代表所生产的GABA的浓度。定向进化方法如图2所示。
为了筛选出最好的谷氨酸脱羧酶的基因序列，设计扩增引物：
GADF: CTTGGTTGGTAGGAGTAGCATGGGATCCATGCCTCAATGGCATCCGCATCGTGA，
GADR:CTACTGCCGCCAGGCAGCGGCCGCTTAATGATGAAATCCATTGTCCTATTTC，
以巨大芽孢杆菌(Bacillus magaterium)CICC 10055基因组为模板，通过易错PCR进行约25轮的扩增，获得SEQ ID NO.1所示野生型谷氨酸脱羧酶基因的随机突变库，将扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化后，通过Gibson将易错PCR扩增产物和质粒pCES（质粒公开于论文《Development of a high-copy-number plasmid via adaptive laboratoryevolution of Corynebacterium glutamicum》）的主干片段相连，转化至E.coli DH5α中，构建突变质粒。然后将突变质粒转入实施例2构建的含有GABA生物传感器的谷氨酸棒状杆菌FF1中，将含有GAD突变库的菌株FF1在适合GABA生产的CGXII培养基中，在30℃培养30小时后，根据绿色荧光蛋白信号通过流式细胞仪FACS筛选出绿色荧光效果最强的突变菌株，依靠高效液相HPLC检测GABA产量进一步复筛确认酶活增加的突变株。对突变株的基因序列进行测序分析，从而得到GABA的产量以及相应突变位点的关联信息。GAD突变库的构建与FACS筛选测试如图3所示，GAD的突变库在培养后有更高的荧光，而且经分选后也可以得到这些荧光高的突变体，说明可以成功构建突变库，且能够分选得到这些荧光提高的突变菌株。
实施例3 谷氨酸脱羧酶突变体的测试
将实施例2构建的含GAD突变体的重组谷氨酸棒杆菌，在含添加10g/L谷氨酸钠的CGXII培养基的摇瓶中，于pH7.0，30℃下振荡培养40小时后检测GABA产量。以在FF1中表达野生型GAD（GAD WT）的菌株为对照，结果如表1所示，表达野生型谷氨酸脱羧酶的重组菌GABA产量很低，而所有突变体在该条件下都能产更多的GABA，其中，具有第38位、51位，68位、89位、92位、93位、96位、118位、120位、121位、153位、186位、202位、206位、268位、294位、301位、355位、371位、432位、436位、451位、457位、459位、461位或467位中一个或多个突变的突变体的GABA含量相比野生型GAD均有提高；具有多个位点突变的突变体GAD MUT 128（氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示）产量相对较高，可达5.12 g/L，是野生型的36倍。
表1 GAD野生型及突变体pH7.0时摇瓶中GABA产量
菌株 突变位点 GABA（g/L）
GAD WT / 0.14
GAD MUT 1 D38K 1.02
GAD MUT 2 D38N 0.95
GAD MUT 3 D38Y 1.20
GAD MUT 4 D92K 2.01
GAD MUT 5 D92N 2.62
GAD MUT 6 D92H 2.10
GAD MUT 7 D118A 0.85
GAD MUT 8 D118V 0.64
GAD MUT 9 D118N 0.65
GAD MUT 10 D202N 0.63
GAD MUT 11 D202M 0.57
GAD MUT 12 D202Q 0.89
GAD MUT 13 D301Y 0.76
GAD MUT 14 D301K 0.86
GAD MUT 15 D301N 0.87
GAD MUT 16 D371S 0.76
GAD MUT 17 D371N 0.83
GAD MUT 18 D371Y 0.86
GAD MUT 19 D432L 0.98
GAD MUT 20 D432N 0.73
GAD MUT 21 D432V 1.06
GAD MUT 22 L451* 2.11
GAD MUT 23 L451N 2.03
GAD MUT 24 L451L 1.98
GAD MUT 25 K457Q 1.86
GAD MUT 26 K457N 0.82
GAD MUT 27 K457* 1.85
GAD MUT 28 K457S 1.76
GAD MUT 29 Y461L 0.89
GAD MUT 30 Y461Y 0.78
GAD MUT 31 Y461* 2.18
GAD MUT 32 Y461V 1.86
GAD MUT 33 H51L/Y461Q 2.56
GAD MUT 34 H51D/Y461* 2.51
GAD MUT 35 H51Q/Y461P 2.76
GAD MUT 36 H51Q/Y461* 2.43
GAD MUT 37 H51N/Y461* 2.34
GAD MUT 38 H121N/ H467Q 2.56
GAD MUT 39 H121L/ H467Y 1.69
GAD MUT 40 H121Y/ H467Y 1.89
GAD MUT 41 H121A/ H467* 1.45
GAD MUT 42 I206N/H467Y 1.68
GAD MUT 43 I206Y/H467Q 1.76
GAD MUT 44 I206H/H467A 1.86
GAD MUT 45 I206V/H467P 2.32
GAD MUT 46 F355K/ L451Y 1.37
GAD MUT 47 F355Y/ L451N 2.76
GAD MUT 48 F355L/ L451* 2.36
GAD MUT 49 F355Y/ L451Q 2.78
GAD MUT 50 F355L/ L451N 2.69
GAD MUT 51 T459N/H467N 1.89
GAD MUT 52 T459M/H467Y 1.66
GAD MUT 53 T459Y/H467L 1.53
GAD MUT 54 V68N/Q96Y/N186A 1.24
GAD MUT 55 V68A/Q96L/N186S 1.03
GAD MUT 56 V68A/Q96N/N186L 1.29
GAD MUT 57 V68V/Q96P/N186* 1.57
GAD MUT 58 T120N/L436V/L451* 1.56
GAD MUT 58 T120V/L436N/L451* 1.79
GAD MUT 60 T120A/L436S/L451* 1.56
GAD MUT 61 T120L/L436Y/L451* 1.58
GAD MUT 62 I89N/ F355L/D432L /L451* 2.76
GAD MUT 63 I89M/ F355Y/D432A /L451* 2.85
GAD MUT 64 I89Q/ F355N/D432V /L451* 3.02
GAD MUT 65 I89V/ F355Y/D432N /L451* 3.12
GAD MUT 66 I89L/ F355V/D432L /L451* 3.21
GAD MUT 67 I89Y/ P268S/F355Q/D432Q/H435A/L451* 4.20
GAD MUT 68 I89V/ P268T/F355Y/D432N/H435Q/L451* 4.08
GAD MUT 69 I89S/ P268N/F355N/D432L/H435P/L451* 3.98
GAD MUT 70 I89N/ P268M/F355A/D432A/H435L/L451* 3.86
GAD MUT 71 I89P/ P268Q/F355S/D432Y/H435N/L451* 3.56
GAD MUT 72 I89N/D92L/P268S/F355S/D432H/H435P/L451* 3.96
GAD MUT 73 I89V/D92N/P268T/F355Y/D432N/H435Q/L451* 3.93
GAD MUT 74 I89M/D92M/P268L/F355A/D432A/H435V/L451* 4.02
GAD MUT 75 I89S/D92Y/P268P/F355Q/D432MH435L/L451* 4.56
GAD MUT 76 I89L/D92L/P268Q/F355N/D432Q/H435Y/L451* 4.37
GAD MUT 77 I89V/S153A/P268T/F355Y/D432N/H435Q/L451* 4.50
GAD MUT 78 I89A/D92Q/P268N/F355L/D432N/H435A/L451* 4.53
GAD MUT 79 I89M/S153A/P268T/F355Y/D432Y/H435N/L451* 4.86
GAD MUT 80 I89Y/S153M/P268Q/F355A/D432Q/H435Y/L451* 4.76
GAD MUT 81 I89S/D92P/S153Q/P268V/F355P/D432M/H435L/L451* 4.38
GAD MUT 82 I89V/D92N/S153A/P268T/F355Y/D432N/H435Q/L451* 4.36
GAD MUT 83 I89V/D92S/S153P/P268M/F355L/D432Q/H435Y/L451* 4.53
GAD MUT 84 I89V/D92A/S153N/P268A/F355Q/D432P/H435P/L451* 4.58
GAD MUT 85 I89N/D92M/S153Q/P268S/F355N/D432V/H435A/L451* 4.76
GAD MUT 86 I89Y/D92N/S153Y/P268L/F355N/D432S/H435Q/L451* 4.53
GAD MUT 87 I89V/D92P/S153L/P268Q/F355L/D432A/H435N/L451* 4.87
GAD MUT 88 I89P/D92Y/S153Q/P268N/F355Y/D432M/H435M/L451* 4.56
GAD MUT 89 I89M/D92L/S153S/P268Y/F355V/D432Y/H435S/L451* 4.96
GAD MUT 90 I89A/D92N/S153A/P268T/F355Q/D432N/H435Q/L451* 4.57
GAD MUT 91 I89N/D92Q/S153L/P268T/F355N/D432N/H435A/L451* 4.32
GAD MUT 92 I89Y/D92Y/S153Q/P268T/F355V/D432N/H435S/L451* 4.23
GAD MUT 93 I89L/D92P/S153N/P268T/F355P/D432N/H435P/L451* 4.25
GAD MUT 94 I89A/D92A/S153A/P268T/F355M/D432N/H435Y/L451* 4.26
GAD MUT 95 I89V/D92N/S153T/P268T/F355Y/D432N/H435Q/L451* 4.30
GAD MUT 96 I89Q/D92Y/S153N/P268N/F355M/D432Q/H435Y/L451* 4.29
GAD MUT 97 I89N/D92A/S153Q/P268Y/F355V/D432L/H435N/L451* 4.57
GAD MUT 98 I89L/D92S/S153L/P268L/F355Q/D432Y/H435M/L451* 4.68
GAD MUT 99 I89Y/D92N/S153Y/P268Q/F355N/D432V/H435Y/L451* 4.53
GAD MUT 100 I89P/D92M/S153V/P268N/F355S/D432P/H435L/L451* 4.16
GAD MUT 101 I89V/D92N/S153P/P268M/F355Y/D432M/H435S/L451* 4.37
GAD MUT 102 I89V/D92V/S153A/P268T/F355P/D432S/H435A/L451* 4.39
GAD MUT 103 I89V/D92Y/S153A/P268Y/F355L/D432A/H435P/L451* 4.57
GAD MUT 104 I89V/D92L/S153S/P268V/F355Q/D432N/H435V/L451* 4.56
GAD MUT 105 I89V/D92Q/S153L/P268P/F355N/D432L/H435L/L451* 4.27
GAD MUT 106 I89Q/E93N/S153N/P268M/D301A/F355Y/D432N/H435N/L451* 4.37
GAD MUT 107 I89N/E93M/S153Q/P268A/D301S/F355Q/D432A/H435Y/L451* 4.26
GAD MUT 108 I89P/E93S/S153Y/P268S/D301M/F355S/D432N/H435P/L451* 4.86
GAD MUT 109 I89A/E93A/S153M/P268N/D301V/F355M/D432S/H435M/L451* 4.23
GAD MUT 110 I89M/E93Y/S153A/P268Q/D301Q/F355A/D432V/H435S/L451* 4.86
GAD MUT 111 I89V/E93Q/S153T/P268T/D301N/F355Y/D432N/H435Q/L451* 4.31
GAD MUT 112 I89N/E93Q/S153L/P268N/D301S/F355N/D432A/H435S/L451* 5.36
GAD MUT 113 I89Q/E93N/S153Q/P268Q/D301Q/F355N/D432M/H435P/L451* 4.23
GAD MUT 114 I89P/E93L/S153N/P268L/D301Y/F355M/D432Q/H435M/L451* 4.52
GAD MUT 115 I89M/E93Y/S153A/P268Y/D301M/F355V/D432Y/H435Q/L451* 4.38
GAD MUT 116 I89A/E93M/S153S/P268V/D301P/F355A/D432L/H435N/L451* 4.26
GAD MUT117 I89S/E93A/S153P/P268M/D301V/F355P/D432N/H435P/L451* 4.53
GAD MUT 118 I89L/E93S/S153V/P268S/D301P/F355Q/D432N/H435A/L451* 4.86
GAD MUT 119 I89Q/E93N/S153L/P268A/D301A/F355V/D432N/H435M/L451* 4.56
GAD MUT 120 I89L/E93Q/S153T/P268T/D301M/F355Y/D432N/H435Y/L451* 4.76
GAD MUT 121 I89V/E93P/S153M/P268T/D301N/F355L/D432N/H435Q/L451* 4.59
GAD MUT12 2 I89M/E93Q/S153T/P268V/D301S/F355Y/D432N/H435Y/L451* 4.53
GAD MUT 123 D38N/I89V/D92N//E93N/S153T/D202Q/P268T/E294S/D301Q/F355V/D432Q/H435Y/L451* 4.62
GAD MUT 124 D38Q/I89S/D92Y//E93Q/S153N/D202P/P268V/E294N/D301A/F355Q/D432V/H435L/L451* 4.65
GAD MUT 125 D38V/I89A/D92Q//E93P/S153S/D202S/P268N/E294Y/D301S/F355A/D432M/H435S/L451* 4.86
GAD MUT 126 D38Q/I89Q/D92S//E93V/S153N/D202Q/P268N/E294A/D301Q/F355Q/D432S/H435L/L451* 4.96
GAD MUT 127 D38S/I89M/D92L//E93M/S153L/D202M/P268S/E294P/D301M/F355N/D432M/H435Y/L451* 4.87
GAD MUT 128 D38N/I89V/D92N//E93Q/S153T/D202N/P268T/E294R/D301N/F355Y/D432N/H435Q/L451* 5.12
GAD MUT 129 D38M/I89A/D92Q//E93V/S153M/D202S/P268V/E294L/D301V/F355A/D432V/H435V/L451* 5.11
将GAD突变体GAD MUT128重新构建到pET质粒中，并转化进大肠杆菌BL21（DE3）后，在LB培养基中于37°C振荡培养。当OD600达到 0.6~0.8 时，加入终浓度0.2 mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)诱导基因表达。在25℃诱导8小时后，通过离心收获细胞。将收获的细胞重新悬浮在结合缓冲液（20 mM Tris-HCl [pH 7.8]、500 mM氯化钠和10 mM咪唑）中，接着通过超声破碎。收集破碎后的上清液，通过镍亲和层析来纯化GAD。纯化后的蛋白利用 HisTrap HP 5-ml 脱盐柱进行脱盐。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测蛋白纯化质量。以牛血清白蛋白为标准，采用 Bradford 法测定蛋白质浓度。纯化后，以谷氨酸为底物，PLP作为辅酶，在pH 7.0条件下测定GAD活性。通过添加酶开始反应，添加氢氧化钠结束反应，检测相应GABA的产量。结果如表1和图4所示，谷氨酸脱羧酶野生型（GAD WT）在pH 7.0条件下比酶活是0.84 U/mg，而本发明构建的谷氨酸脱羧酶突变体D38N/I89V/D92N/E93Q/S153T/D202N/P268T/E294R/D301N/F355Y/D432N/H435Q/L451*（GADMUT128）的比酶活是10.29 U/mg，与野生型相比提高了12.25倍。
实施例4 利用谷氨酸棒杆菌工程菌株发酵生产γ-氨基丁酸
将按照实施例3的策略得到的携带突变体GAD MUT128编码序列的表达载体pCES-GAD MUT128转化到谷氨酸棒杆菌工程菌株FF1中，用于一步法从葡萄糖发酵生产γ-氨基丁酸。以在菌株FF1中表达谷氨酸脱羧酶野生型（GAD WT）的菌株为对照。
将菌株FF1 pCES-GAD MUT128在BHIS培养基中，于30℃培养24小时，获得种子液；将500mL发酵培养基加到1L发酵罐中，按10%的接种率接种到发酵罐，发酵温度为30℃，溶氧30%，利用氨水来调节pH 7.0±0.2。
以在FF1中表达谷氨酸脱羧酶野生型（GAD WT）的菌株为对照，采用两步法发酵，首先在发酵培养基中于初始pH7.0发酵生产谷氨酸，随着发酵的进行，76小时后 pH降为5.5，至168h可发酵生产17 g/L GABA。以FF1为宿主表达谷氨酸脱羧酶突变体（GAD MUT 128）的菌株发酵168小时后，GABA产量可达82 g/L，是对照菌株的4.8倍多。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 森瑞斯生物科技（深圳）有限公司
中国科学院深圳先进技术研究院
<120> 谷氨酸脱羧酶突变体及在生产γ-氨基丁酸中的应用
<130> IBAA220670A
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1404
<212> DNA
<213> Bacillus magaterium
<400> 1
atgcctcaat ggcatccgca tcgtgaacaa aaaaatttac ctgatgaatt tcctgttaat 60
ccgctttttt ctcgacaagg agaagtgaca attccaagac tgcgtatcgg tgatcaaggt 120
atgcttccgg aaacggctta tcaaatcatt catgacgaaa ttgctttaga cggaaatgcc 180
cgcttgaatt tagctacgtt tgttactacg tggatggagc ctgatgcaaa gcgtttgtac 240
ggagaatctt ttgataaaaa tatgatcgat aaagatgagt atccgcagac agcggctatt 300
gaagagagat gtgtacgtat tttagcggat ttgtggaatt cacctaatcc tgataccacg 360
atgggcgttt ctactacagg ttcatctgaa gcatgtatgc ttggtggact agcgttaaaa 420
agacgatggc agaaactgcg taaaagtaaa gggctatcaa cggaccgccc caatattgta 480
tttagttcat cggttcaagt ggtatgggag aagttcgcaa actattggga cgtagagcct 540
cgttatgtga atattaatcc agatcatcct tatttagatg cagaaggcgt gattaatgcg 600
gttgacgaaa atacaattgg cgtcgtaccg attcttggag tcacgtatac agggggttac 660
gaaccaatag ctgctatcgc aaaagcatta gatgagttac aggaaaaaac agggttggat 720
attcctatcc atgtagatgc tgcttctgga ggttttatcg ctccatttct tcaaccagac 780
cttatctggg atttccgctt gccgcgagta aagtccatta acgtgtcagg acacaagtat 840
ggtttagttt accctggctt gggatgggtg atttggagag aaaaagagga cttgcctgaa 900
gatcttattt tccgcgtttc ttatttaggg ggcaacatgc caacttttgc gctcaacttc 960
tctagaccag gagcacaagt ccttttgcag tactacaatt tcttgcgttt aggtaaagac 1020
ggctattatg ccgtgcaaaa aacctcccaa gaaaacgcgc tgtttcttag caaagaaatt 1080
ggagaaatgg acgcattcga aattcttgct gatggttcag atatcccggt tcttgcttgg 1140
aaactgaaag aagactatac accaaactgg actctttatg atttgtctag acaactgcgt 1200
acgtacggat ggcaagttcc tgcttaccca ctcccagcag acatggaaga aatcacaatc 1260
atgcgcattg ttgttagaaa tgggttttca agagaccttg ctcatttatt tatggttaat 1320
ttcaaacaag ccgttgaatt tcttaactcg ttggatagac ctgttcttaa agacacgaaa 1380
tacgacaatg gatttcatca ttaa 1404
<210> 2
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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ccgctttttt ctcgacaagg agaagtgaca attccaagac tgcgtatcgg taatcaaggt 120
atgcttccgg aaacggctta tcaaatcatt catgacgaaa ttgctttaga cggaaatgcc 180
cgcttgaatt tagctacgtt tgttactacg tggatggagc ctgatgcaaa gcgtttgtac 240
ggagaatctt ttgataaaaa tatggtcgat aaaaatcagt atccgcagac agcggctatt 300
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gttaatgaaa atacaattgg cgtcgtaccg attcttggag tcacgtatac agggggttac 660
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ttcaaacaag ccgttgaatt tcttaactcg tag 1353
<210> 3
<211> 467
<212> PRT
<213> Bacillus magaterium
<400> 3
Met Pro Gln Trp His Pro His Arg Glu Gln Lys Asn Leu Pro Asp Glu
1 5 10 15
Phe Pro Val Asn Pro Leu Phe Ser Arg Gln Gly Glu Val Thr Ile Pro
20 25 30
Arg Leu Arg Ile Gly Asp Gln Gly Met Leu Pro Glu Thr Ala Tyr Gln
35 40 45
Ile Ile His Asp Glu Ile Ala Leu Asp Gly Asn Ala Arg Leu Asn Leu
50 55 60
Ala Thr Phe Val Thr Thr Trp Met Glu Pro Asp Ala Lys Arg Leu Tyr
65 70 75 80
Gly Glu Ser Phe Asp Lys Asn Met Ile Asp Lys Asp Glu Tyr Pro Gln
85 90 95
Thr Ala Ala Ile Glu Glu Arg Cys Val Arg Ile Leu Ala Asp Leu Trp
100 105 110
Asn Ser Pro Asn Pro Asp Thr Thr Met Gly Val Ser Thr Thr Gly Ser
115 120 125
Ser Glu Ala Cys Met Leu Gly Gly Leu Ala Leu Lys Arg Arg Trp Gln
130 135 140
Lys Leu Arg Lys Ser Lys Gly Leu Ser Thr Asp Arg Pro Asn Ile Val
145 150 155 160
Phe Ser Ser Ser Val Gln Val Val Trp Glu Lys Phe Ala Asn Tyr Trp
165 170 175
Asp Val Glu Pro Arg Tyr Val Asn Ile Asn Pro Asp His Pro Tyr Leu
180 185 190
Asp Ala Glu Gly Val Ile Asn Ala Val Asp Glu Asn Thr Ile Gly Val
195 200 205
Val Pro Ile Leu Gly Val Thr Tyr Thr Gly Gly Tyr Glu Pro Ile Ala
210 215 220
Ala Ile Ala Lys Ala Leu Asp Glu Leu Gln Glu Lys Thr Gly Leu Asp
225 230 235 240
Ile Pro Ile His Val Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Ile Ala Pro Phe
245 250 255
Leu Gln Pro Asp Leu Ile Trp Asp Phe Arg Leu Pro Arg Val Lys Ser
260 265 270
Ile Asn Val Ser Gly His Lys Tyr Gly Leu Val Tyr Pro Gly Leu Gly
275 280 285
Trp Val Ile Trp Arg Glu Lys Glu Asp Leu Pro Glu Asp Leu Ile Phe
290 295 300
Arg Val Ser Tyr Leu Gly Gly Asn Met Pro Thr Phe Ala Leu Asn Phe
305 310 315 320
Ser Arg Pro Gly Ala Gln Val Leu Leu Gln Tyr Tyr Asn Phe Leu Arg
325 330 335
Leu Gly Lys Asp Gly Tyr Tyr Ala Val Gln Lys Thr Ser Gln Glu Asn
340 345 350
Ala Leu Phe Leu Ser Lys Glu Ile Gly Glu Met Asp Ala Phe Glu Ile
355 360 365
Leu Ala Asp Gly Ser Asp Ile Pro Val Leu Ala Trp Lys Leu Lys Glu
370 375 380
Asp Tyr Thr Pro Asn Trp Thr Leu Tyr Asp Leu Ser Arg Gln Leu Arg
385 390 395 400
Thr Tyr Gly Trp Gln Val Pro Ala Tyr Pro Leu Pro Ala Asp Met Glu
405 410 415
Glu Ile Thr Ile Met Arg Ile Val Val Arg Asn Gly Phe Ser Arg Asp
420 425 430
Leu Ala His Leu Phe Met Val Asn Phe Lys Gln Ala Val Glu Phe Leu
435 440 445
Asn Ser Leu Asp Arg Pro Val Leu Lys Asp Thr Lys Tyr Asp Asn Gly
450 455 460
Phe His His
465
<210> 4
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Pro Gln Trp His Pro His Arg Glu Gln Lys Asn Leu Pro Asp Glu
1 5 10 15
Phe Pro Val Asn Pro Leu Phe Ser Arg Gln Gly Glu Val Thr Ile Pro
20 25 30
Arg Leu Arg Ile Gly Asn Gln Gly Met Leu Pro Glu Thr Ala Tyr Gln
35 40 45
Ile Ile His Asp Glu Ile Ala Leu Asp Gly Asn Ala Arg Leu Asn Leu
50 55 60
Ala Thr Phe Val Thr Thr Trp Met Glu Pro Asp Ala Lys Arg Leu Tyr
65 70 75 80
Gly Glu Ser Phe Asp Lys Asn Met Val Asp Lys Asn Gln Tyr Pro Gln
85 90 95
Thr Ala Ala Ile Glu Glu Arg Cys Val Arg Ile Leu Ala Asp Leu Trp
100 105 110
Asn Ser Pro Asn Pro Asp Thr Thr Met Gly Val Ser Thr Thr Gly Ser
115 120 125
Ser Glu Ala Cys Met Leu Gly Gly Leu Ala Leu Lys Arg Arg Trp Gln
130 135 140
Lys Leu Arg Lys Ser Lys Gly Leu Thr Thr Asp Arg Pro Asn Ile Val
145 150 155 160
Phe Ser Ser Ser Val Gln Val Val Trp Glu Lys Phe Ala Asn Tyr Trp
165 170 175
Asp Val Glu Pro Arg Tyr Val Asn Ile Asn Pro Asp His Pro Tyr Leu
180 185 190
Asp Ala Glu Gly Val Ile Asn Ala Val Asn Glu Asn Thr Ile Gly Val
195 200 205
Val Pro Ile Leu Gly Val Thr Tyr Thr Gly Gly Tyr Glu Pro Ile Ala
210 215 220
Ala Ile Ala Lys Ala Leu Asp Glu Leu Gln Glu Lys Thr Gly Leu Asp
225 230 235 240
Ile Pro Ile His Val Asp Ala Ala Ser Gly Gly Phe Ile Ala Pro Phe
245 250 255
Leu Gln Pro Asp Leu Ile Trp Asp Phe Arg Leu Thr Arg Val Lys Ser
260 265 270
Ile Asn Val Ser Gly His Lys Tyr Gly Leu Val Tyr Pro Gly Leu Gly
275 280 285
Trp Val Ile Trp Arg Arg Lys Glu Asp Leu Pro Glu Asn Leu Ile Phe
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Ser Arg Pro Gly Ala Gln Val Leu Leu Gln Tyr Tyr Asn Phe Leu Arg
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Leu Gly Lys Asp Gly Tyr Tyr Ala Val Gln Lys Thr Ser Gln Glu Asn
340 345 350
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Leu Ala Asp Gly Ser Asp Ile Pro Val Leu Ala Trp Lys Leu Lys Glu
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Asp Tyr Thr Pro Asn Trp Thr Leu Tyr Asp Leu Ser Arg Gln Leu Arg
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Leu Ala Gln Leu Phe Met Val Asn Phe Lys Gln Ala Val Glu Phe Leu
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Asn Ser
450
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<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttctctccga ggcaacgaag ttaatatgtc catgagggcg aagttgtaga caatatttcg 60
cccatatgga taattgacag gagtttaacg cc 92
<210> 7
<211> 1515
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atggaaaccc caacccaaga catggatgtc cgctggttat acacccaaag ccagctcaaa 60
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gaaacgcccg acgggcttcg cgattgggca caccgactcg ccgacgcagg ggtcatcgcg 240
atcgggttcg gctccggcct caccttccca caggttccgc aggcgcttat cgacgcctcc 300
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gaacaggaac ggcttaactc catcgccatc tccggtggca tcgaagccct gtgccgtgct 480
gccgccgact atttgggtgg tgcagtagcc atcgtggaca gcgacggccg cgtggcttgc 540
tctattacca ccgatgacct agacgcactc ccccaagctg tctcgcgcct taacggatcc 600
agtcaagcac tcacggatgc caccaacttt ggattcatcc accgtatgac ccggtacggc 660
gaccgccacc acgtgctctc agtccttatg cccacccgcc ccagcgaaca acaccgcgca 720
ctgatcagac actgcgcagg ccttgccgat attttgcttc aacgccccga agccatgcgc 780
gaccgagaaa tcgaagtgcg ctcacttgcc atgtcactac ttctgggtcg aagcgacgac 840
ctagccacca ttcaccgcgt gttcgctgac atcactgatg cttccggaaa tatccgcccc 900
atcctcatca ccggcaacac accccaatca gtacgaaaag cactctccag tgtcgccacc 960
gcactgtaca aacaggaacg agcactagct catctacgcc tcgccgaatc caccgaactc 1020
ctcttccttc gcggaagccg cagcgtgcac aacatcgtgc aactttttgg tactgccgca 1080
agcggagttc gcctctgcat tggtctgccc acccgagcgg aaaacatcga taagaaactc 1140
atccgcgaac tcactgccac cgcaaaaacc ctacaacttg gaacccacgc cgaaccccgt 1200
gacggcacct tgctgtggct ccaaaacccc gagctgcgca aaatccttaa gatccgatcc 1260
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<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
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Claims (10)

1.谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，所述突变体是在SEQ ID NO.3的基础上，将第38位天冬氨酸、第92位天冬氨酸、第118位天冬氨酸、第202位天冬氨酸、第301位天冬氨酸、第371位天冬氨酸、第432位天冬氨酸、第451位亮氨酸、第457位赖氨酸、第461位酪氨酸中的任一个氨基酸进行取代得到的；或者，
将第51位组氨酸、第121位组氨酸、第206位异亮氨酸、第355位苯丙氨酸、第451位亮氨酸、第459位苏氨酸、第461位酪氨酸、第467位组氨酸中的任意两个氨基酸进行取代得到的；或者，
将第68位缬氨酸、第96位谷氨酰胺、第120位苏氨酸、第186位天冬酰胺、第436位亮氨酸、第451位亮氨酸中的任意三个氨基酸进行取代得到的；或者，
将第38位天冬氨酸、第89位异亮氨酸、第92位天冬氨酸、第93位谷氨酸、第153位丝氨酸、第202位天冬氨酸、第268位脯氨酸、第294位谷氨酸、第301位天冬氨酸、第355位苯丙氨酸、第432位天冬氨酸、第435位组氨酸、第451位亮氨酸中的任意四至十三个氨基酸进行取代得到的。
2.根据权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，所述突变体是在SEQ IDNO.3的基础上，进行了四至十个氨基酸位点的突变；所述氨基酸位点选自如下（1）~（10）：
（1）第89位异亮氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或亮氨酸或酪氨酸或缬氨酸或脯氨酸或甲硫氨酸或丙氨酸或丝氨酸；
（2）第92位天冬氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或亮氨酸或酪氨酸或缬氨酸或脯氨酸或甲硫氨酸或丙氨酸或丝氨酸；
（3）第93位谷氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或亮氨酸或酪氨酸或缬氨酸或脯氨酸或甲硫氨酸或丙氨酸或丝氨酸；
（4）第153位丝氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或亮氨酸或酪氨酸或缬氨酸或脯氨酸或甲硫氨酸或丙氨酸或丝氨酸；
（5）第268位脯氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或亮氨酸或酪氨酸或缬氨酸或脯氨酸或甲硫氨酸或丙氨酸或丝氨酸；
（6）第301位天冬氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或亮氨酸或酪氨酸或缬氨酸或脯氨酸或甲硫氨酸或丙氨酸或丝氨酸；
（7）第355位苯丙氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或亮氨酸或酪氨酸或缬氨酸或脯氨酸或甲硫氨酸或丙氨酸或丝氨酸；
（8）第432位天冬氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或亮氨酸或酪氨酸或缬氨酸或脯氨酸或甲硫氨酸或丙氨酸或丝氨酸；
（9）第435位组氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酰胺或亮氨酸或酪氨酸或缬氨酸或脯氨酸或甲硫氨酸或丙氨酸或丝氨酸；
（10）第451位亮氨酸突变为终止密码子。
3.根据权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，所述突变体是在SEQ IDNO.3的基础上，
将第355位苯丙氨酸突变为赖氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第355位苯丙氨酸突变为酪氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第355位苯丙氨酸突变为亮氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第89位异亮氨酸突变为甲硫氨酸，并将第355位苯丙氨酸突变为酪氨酸，并将第432位天冬氨酸突变为丙氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第89位异亮氨酸突变为谷氨酰胺，并将第355位苯丙氨酸突变为天冬酰胺，并将第432位天冬氨酸突变为缬氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第89位异亮氨酸突变为缬氨酸，并将第355位苯丙氨酸突变为酪氨酸，并将第432位天冬氨酸突变为天冬酰胺，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第89位异亮氨酸突变为亮氨酸，并将第355位苯丙氨酸突变为缬氨酸，并将第432位天冬氨酸突变为亮氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第89位异亮氨酸突变为天冬酰胺，并第93位谷氨酸突变为甲硫氨酸，并将第153位丝氨酸突变为谷氨酰胺，并将第268位脯氨酸突变为丙氨酸，并将第301位天冬氨酸突变为丝氨酸，并将第355位苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，并将第432位天冬氨酸突变为丙氨酸，并将第435位组氨酸突变为酪氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第89位异亮氨酸突变为谷氨酰胺，并第93位谷氨酸突变为天冬酰胺，并将第153位丝氨酸突变为谷氨酰胺，并将第268位脯氨酸突变为谷氨酰胺，并将第301位天冬氨酸突变为谷氨酰胺，并将第355位苯丙氨酸突变为天冬酰胺，并将第432位天冬氨酸突变为甲硫氨酸，并将第435位组氨酸突变为脯氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第89位异亮氨酸突变为甲硫氨酸，并第93位谷氨酸突变为酪氨酸，并将第153位丝氨酸突变为丙氨酸，并将第268位脯氨酸突变为酪氨酸，并将第301位天冬氨酸突变为甲硫氨酸，并将第355位苯丙氨酸突变为缬氨酸，并将第432位天冬氨酸突变为酪氨酸，并将第435位组氨酸突变为谷氨酰胺，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第38位天冬氨酸突变为天冬酰胺，并将第89位异亮氨酸突变为缬氨酸，并将第92位天冬氨酸突变为天冬酰胺，并将第93位谷氨酸突变为天冬酰胺，并将第153位丝氨酸突变为苏氨酸，并将第202位天冬氨酸突变为谷氨酰胺，并将第268位脯氨酸突变为苏氨酸，并将第294位谷氨酸突变为丝氨酸，并将第301位天冬氨酸突变为谷氨酰胺，并将第355位苯丙氨酸突变为缬氨酸，并将第432位天冬氨酸突变为谷氨酰胺，并将第435位组氨酸突变为酪氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第38位天冬氨酸突变为缬氨酸，并将第89位异亮氨酸突变为丙氨酸，并将第92位天冬氨酸突变为谷氨酰胺，并将第93位谷氨酸突变为脯氨酸，并将第153位丝氨酸突变为丝氨酸，并将第202位天冬氨酸突变为丝氨酸，并将第268位脯氨酸突变为天冬酰胺，并将第294位谷氨酸突变为酪氨酸，并将第301位天冬氨酸突变为丝氨酸，并将第355位苯丙氨酸突变为丙氨酸，并将第432位天冬氨酸突变为甲硫氨酸，并将第435位组氨酸突变为丝氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第38位天冬氨酸突变为谷氨酰胺，并将第89位异亮氨酸突变为谷氨酰胺，并将第92位天冬氨酸突变为丝氨酸，并将第93位谷氨酸突变为缬氨酸，并将第153位丝氨酸突变为天冬酰胺，并将第202位天冬氨酸突变为谷氨酰胺，并将第268位脯氨酸突变为天冬酰胺，并将第294位谷氨酸突变为丙氨酸，并将第301位天冬氨酸突变为谷氨酰胺，并将第355位苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，并将第432位天冬氨酸突变为丝氨酸，并将第435位组氨酸突变为亮氨酸，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子；或
将第38位天冬氨酸突变为天冬酰胺，并将第89位异亮氨酸突变为缬氨酸，并将第92位天冬氨酸突变为天冬酰胺，并将第93位谷氨酸突变为谷氨酰胺，并将第153位丝氨酸突变为苏氨酸，并将第202位天冬氨酸突变为天冬酰胺，并将第268位脯氨酸突变为苏氨酸，并将第294位谷氨酸突变为精氨酸，并将第301位天冬氨酸突变为天冬酰胺，并将第355位苯丙氨酸突变为酪氨酸，并将第432位天冬氨酸突变为天冬酰胺，并将第435位组氨酸突变为谷氨酰胺，并将第451位亮氨酸突变为终止密码子。
4.编码权利要求1-3任一所述谷氨酸脱羧酶突变体的基因。
5.携带权利要求4所述基因的表达载体。
6.表达权利要求1-3任一所述谷氨酸脱羧酶突变体的重组微生物细胞。
7.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，表达权利要求1-3任一所述的谷氨酸脱羧酶突变体。
8.权利要求7所述的重组谷氨酸棒杆菌在生产γ-氨基丁酸中的应用。
9.一种用于筛选权利要求1-3任一所述谷氨酸脱羧酶突变体的γ-氨基丁酸生物传感器，其特征在于，含有启动子P gabTDP 、P gabR ，报告基因、gabR基因；所述启动子P gabTDP 、P gabR ，报告基因、gabR基因位于同一载体上或同一基因组DNA上，构成所述生物传感器；所述P gabTDP 调控报告基因的表达；所述P gabR 和P gabTDP 上具有GABA-GabR结合物结合位点的序列，并调控报告基因表达；所述启动子P gabTDP 和启动子PgabR转录方向相反。
10.权利要求9所述的生物传感器在γ-氨基丁酸生产菌株的选育中的应用。
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