CN114921435A - 鸟氨酸乙酰转移酶突变体、编码基因、质粒、基因工程菌及应用 - Google Patents

鸟氨酸乙酰转移酶突变体、编码基因、质粒、基因工程菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸟氨酸乙酰转移酶突变体、编码基因、质粒、基因工程菌及其应用，其中鸟氨酸乙酰转移酶通过序列的突变形成鸟氨酸乙酰转移酶突变体、对编码鸟氨酸乙酰转移酶突变体的编码基因、携带编码基因的重组质粒、表达重组质粒的基因工程菌，最终制得的基因工程菌。该菌株在L‑精氨酸发酵生产过程中促进反应过程中的乙酰谷氨酸循环，极大程度促进L‑精氨酸的合成，提高产酸水平，降低了L‑精氨酸生产周期与生产成本，更加适用于工业生产。

Description

鸟氨酸乙酰转移酶突变体、编码基因、质粒、基因工程菌及 应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及一种鸟氨酸乙酰转移酶突变体、编码基因、重组质粒、基因工程菌及其应用。
背景技术
L-精氨酸(L-Arginine)，化学式为C6H14N4O2，分子量为174.20，一种碱性氨基酸，也是自然界20种天然氨基酸之一。L-精氨酸参与一氧化氮通路，是鸟氨酸循环的中间代谢物，能促使氨转变成为尿素。目前，氨基酸领域著名公司如日本味之素、协和公司和韩国大象等公司主要采用生物发酵技术进行大规模生产L-精氨酸。生物发酵技术的最为核心的关键为主要为高产菌株的选育、制备、进化。通过高产菌株提升来降低L-精氨酸生产成本，同时通过持续不断的努力对L-精氨酸菌株改造提升产酸水平，其中L-精氨酸菌株的改造主要均为围绕L-精氨酸合成路线。鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)参与精氨酸合成的第一步和第五步，又被成为精氨酸生物合成双功能蛋白，在整个路径中起着非常重要的作用，催化乙酰鸟氨酸L-谷氨酸生成乙酰谷氨酸和鸟氨酸。这反应的两个产物又可以重新加入整个代谢过程中去，因此其活力对整体代谢过程起着至关重要的作用，如图1所示。
目前为止，L-精氨酸的代谢途径已经被研究的非常透彻。其菌株选育技术也由早期的诱变筛选到目前以基因工程手段为主的代谢流程相关基因的选择、过表达、敲入、敲除等先进技术替代。有关L-精氨酸生物合成路线以及相关改造报道如下：
早在1944年，Neurosporae物种的L-精氨酸代谢路径就已经被阐述。精氨酸的生物合成始于谷氨酸氨基，由N-乙酰谷氨酸合酶(乙酰辅酶A：L-谷氨酸-N-乙酰转移酶；EC2.3.1.l；argA基因产物)催化开始合成乙酰谷氨酸，后面经过一系列酶的催化过程产生L-精氨酸。
1958年，Udaka等发现Microocctls gltltamictls物种具有更为经济的循环途径。该循环途径也在一些原核生物，包括产甲烷古菌、Bacills属和真核微生物的成员。乙酰鸟氨酸和谷氨酸之间的反乙酰化由aryJ基因产物鸟氨酸乙酰转移酶(N-乙酰-L-鸟氨酸：L-谷氨酸N-乙酰转移酶；EC 2.3.1.35)介导。因此，在依赖循环途径的生物体中， N-乙酰谷氨酸合酶具有回补功能。1996年Sakanyan V.等报道谷氨酸棒杆菌精氨酸生物合成基因簇ATCC13032包含argJ、argB和argD以及部分argC和argF的代谢路径。目前，大多L-精氨酸的发酵菌株也是基于此代谢路径构建而来。
2001年日本味之素在CN100365115C报道一株可以利用乙酸的生产L-精氨酸的大肠杆菌菌株，产量为23.9g/L。2009年星湖科技CN101586130申请改造后含有额外表达乙酰谷氨酸合成酶的生产L-精氨酸的大肠杆菌菌株，产量为36g/L。2013年 CN103966151A报道导入argH提升精氨酸产量9％，但总体产量仍较低21.8g/L。2019 年天津科技大学通过多基因改造获得L-精氨酸产量高达130-135g/L的大肠杆菌菌株，但高产量伴随的为发酵周期过长，约为50-55h。
因此，通过分子生物学的方法对鸟氨酸乙酰转移酶进行针对性的突变，以提高 L-精氨酸的产酸量且缩短发酵周期具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是提供一种鸟氨酸乙酰转移酶突变体、编码基因、质粒、基因工程菌及其应用，具体地说是，鸟氨酸乙酰转移酶通过序列的突变形成鸟氨酸乙酰转移酶突变体、对编码鸟氨酸乙酰转移酶突变体的编码基因、携带编码基因的重组质粒、表达重组质粒的基因工程菌，最终制得的基因工程菌L-精氨酸发酵生产过程中促进反应过程中的乙酰谷氨酸循环，促进L-精氨酸的产酸水平，降低了L-精氨酸生产周期与生产成本，更加适用于工业生产。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种鸟氨酸乙酰转移酶突变体，所述鸟氨酸乙酰转移酶突变体在SEQ ID NO.2 所示序列中第161位的苯丙氨酸突变，被其它氨基酸取代。其中鸟氨酸乙酰转移酶为来源自Corynebacterium glutamicum strain ATCC 13032的鸟氨酸乙酰转移酶，NCBI ReferenceSequence:WP_011014333.1。具有催化乙酰鸟氨酸和L-谷氨酸生成乙酰谷氨酸和鸟氨酸的能力，包括其突变体1，2等序列，由序列表中野生型序列1经过突变获得。其中序列1为Corynebacterium glutamicum cgArgJ核苷酸序列(1167bp)
Figure RE-GDA0003755056720000031
序列2(SEQ ID NO.2)为序列1为Corynebacterium glutamicum cgArgJ的蛋白质序列 (388aa)
Figure RE-GDA0003755056720000032
Figure RE-GDA0003755056720000041
优选的，所述161位苯丙氨酸突变为甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或丝氨酸。更具体地说，161位苯丙氨酸(F)可突变为甘氨酸(G)，得到F161G； 161位苯丙氨酸(F)可突变为丙氨酸(A)，得到F161A；161位苯丙氨酸(F)可突变为亮氨酸(L)，得到F161L；161位苯丙氨酸(F)可突变为甲硫氨酸(M)，得到 F161M；161位苯丙氨酸(F)可突变为苏氨酸(T)，得到F161T；161位苯丙氨酸(F) 可突变为丝氨酸(S)，得到F161S。
本发明还提供了一种编码基因，所述编码基因编码上述任一项所述的鸟氨酸乙酰转移酶突变体的基因。
本发明还提供了一种质粒，所述质粒携带上述的编码基因。
优选的，所述质粒的表达为游离过表达或1-3个基因组整合。
优选的，所述游离过表达载体为pTrc99a。所述的cgArgJ突变体的基因序列由Corynebacterium glutamicum基因组扩增成而来，通过双酶切单酶切方式连接入 pTrc99a载体中，通过分子克隆过程，连接，转化，鉴定。筛选到阳性克隆转化入 BL21(DE3)中表达。随机突变验证表达后的N-乙酰谷氨酸的合成活力。
优选的，所述基因组整合表达为基因组整合位置为Glycosyltransferase family9 protein所在区域。不仅包括pKOV系统整合方式，还包括Cre、Red、Crispr等常见基因组编辑方式。基因组上的插入位置也不局限于Glycosyltransferase family 9protein 所在区域，任何不影响该序列表达的方式和位置均在本发明的保护范围内。
本发明还提供了一种基因工程菌，以大肠杆菌为宿主，表达任一项上述的质粒。
本发明还提供了一种基因工程菌的应用，以上述的基因工程菌进行L-精氨酸发酵生产。
优选的，所述L-精氨酸发酵生产中所用的发酵培养基为M0、M1或M2中的任意一种；
其中M0包括：胰蛋白胨10g/L，K2HPO4.3H2O 15g/L，KH2PO4 3.2g/L，(NH4)2SO4 4g/L，MgSO4.7H2O 0.2g/L，FeSO4.7H2O 5mg/L，NaCl 1g/L，葡萄糖20g/L，甜菜碱 0.5g/L，VB15mg/L，VB23mg/L，VB33mg/L，VB63mg/L，VB122mg/L，复合微量元素 1mL/L，其中所述复合微量元素包括NaMoO4*2H2O 150mg/L，CoCl2*6H2O 0.5g/L， CuSO4*5H2O 0.25g/L，MnCl2*4H2O 0.5g/L，ZnSO4*7H2O 30mg/L，生物素0.5g/L；其中，M0的pH7.2-7.4；
M1包括：酵母粉5g/L，K2HPO4.3H2O 7.5g/L，KH2PO4 1.5g/L，MgSO4.7H2O 1.5g/L，FeSO4.7H2O 15mg/L，葡萄糖20g/L，甜菜碱0.3g/L，VB15mg/L，VB23mg/L，VB33mg/L， VB53mg/L，复合微量元素1mL/L，其中所述复合微量元素包括NaMoO4*2H2O 150mg/L，CoCl2*6H2O0.5g/L，CuSO4*5H2O 0.25g/L，MnCl2*4H2O 0.5g/L， ZnSO4*7H2O 30mg/L，生物素0.5g/L；其中，M1的pH7.2-7.4；
M2包括：胰蛋白胨3g/L，酵母粉5g/L，K2HPO4.3H2O 4g/L，KH2PO4 1g/L， MgSO4.7H2O1.5g/L，FeSO4.7H2O 15mg/L，葡萄糖25g/L，甜菜碱0.8g/L，VB15mg/L， VB23mg/L，VB33mg/L，VB53mg/L，复合微量元素1mL/L，其中所述复合微量元素包括NaMoO4*2H2O 150mg/L，CoCl2*6H2O 0.5g/L，CuSO4*5H2O 0.25g/L， MnCl2*4H2O 0.5g/L，ZnSO4*7H2O 30mg/L，生物素0.5g/L；其中，M2的pH7.2-7.4。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明提供了一种鸟氨酸乙酰转移酶突变体、编码基因、质粒、基因工程菌及其应用，具体地说是，鸟氨酸乙酰转移酶通过序列的突变形成鸟氨酸乙酰转移酶突变体、对编码鸟氨酸乙酰转移酶突变体的编码基因、携带编码基因的重组质粒、表达重组质粒的基因工程菌，鸟氨酸乙酰转移酶突变体催化反应活力更高，同时受乙酰谷氨酸反馈抑制较小。该突变体无论以游离方式表达或者通过基因组定点整合，尤其基因组定点整合后，可以极大程度促进L-精氨酸的合成。含有该突变体的菌株可以应用于L- 精氨酸发酵生产。本发明中制备的新菌株可以极大程度促进反应过程中的乙酰谷氨酸循环，对高浓度乙酰谷氨酸的反馈抑制不敏感，使整个代谢流程更为通畅顺利，极大程度促进L-精氨酸的合成，提高产酸水平，在发酵48h以内，可以达到L-精氨酸 142.34-147.2g/L的产酸量，并且降低了L-精氨酸生产周期与生产成本，更加适用于工业生产。
本发明适用于编码鸟氨酸乙酰转移酶突变体的编码基因、重组质粒、基因工程菌的制备，以及发酵生产L-精氨酸。
本发明下面将结合说明书附图与具体实施例作进一步详细说明。
附图说明
图1为鸟氨酸乙酰转移酶参与L-精氨酸合成路线；
图2为实施例4中30L的发酵产量与溶氧曲线图；
具体实施方式
实施例1一种编码鸟氨酸乙酰转移酶突变体
一种鸟氨酸乙酰转移酶突变体，其中鸟氨酸乙酰转移酶突变体通过随机突变获得来源自Corynebacterium glutamicum的ArgJ(cgArgJ，酶1)基因突变体序列。突变体，由序列表中序列1经过随机突变获得，所述的突变位置至少含有该序列的第161 的一个突变。尤其是涉及苯丙氨酸侧链减小的氨基酸。其中序列2为Corynebacterium glutamicum cgArgJ的蛋白质序列(388aa)
Figure RE-GDA0003755056720000071
Figure RE-GDA0003755056720000081
上述氨基酸序列三字母缩写代表的氨基酸名称，详见下图中所示：
Figure RE-GDA0003755056720000082
本实施例中的Corynebacterium glutamicum cgArgJ核苷酸序列(1167bp)如下(序列1)：
Figure RE-GDA0003755056720000083
Figure RE-GDA0003755056720000091
所述鸟氨酸乙酰转移酶突变体在SEQ ID NO.2所示序列中第161位的苯丙氨酸突变，被其它氨基酸取代。在本发明的一种较优的实施方式中，161位苯丙氨酸突变为甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或丝氨酸。更具体地说，161位苯丙氨酸(F)可突变为甘氨酸(G)，得到F161G；161位苯丙氨酸(F)可突变为丙氨酸 (A)，得到F161A；161位苯丙氨酸(F)可突变为亮氨酸(L)，得到F161L；161 位苯丙氨酸(F)可突变为甲硫氨酸(M)，得到F161M；161位苯丙氨酸(F)可突变为苏氨酸(T)，得到F161T；161位苯丙氨酸(F)可突变为丝氨酸(S)，得到F161S。
本发明采用原始氨基酸位置替换的氨基酸来表示突变体，其中位置的编号对应于鸟氨酸乙酰转移酶突变体的氨基酸序列位置。
以鸟氨酸乙酰转移酶突变体为161位苯丙氨酸突变为甘氨酸为例(cgArgJm1)，其突变后的核苷酸序列(Sequence3，序列3)，即cgArgJm1核苷酸序列(1167bp) 如下：
Figure RE-GDA0003755056720000092
Figure RE-GDA0003755056720000101
其突变后的蛋白质序列(Sequence4，序列4)，即对应的cgArgJm1蛋白质序列(388aa) 如下：
Figure RE-GDA0003755056720000102
本实施例中提供的鸟氨酸乙酰转移酶突变体，在SEQ ID NO.2所示序列中第161位的苯丙氨酸突变，被其它氨基酸取代，相较现有技术在后续L-精氨酸发酵生产过程中提高产酸水平，降低了L-精氨酸生产周期与生产成本，更加适用于工业生产。
实施例2一种编码鸟氨酸乙酰转移酶突变体的编码、携带上述基因的重组质粒及基因工程菌
根据Corynebacterium glutamicum的cgArgJ(NCBI Reference Sequence: WP_011014333.1)，(见序列1)，以及大肠杆菌的表达载体pTrc99a特点设计引物(参见表1)，提取Corynebacterium glutamicum的基因组酶切定向克隆(Nco1，EcoR1)，送测序。将测序正确的质粒产物质粒转化入E.coli BL21(DE3)获得野生表达菌株命名为cgArgJ。将cgArgJ表达菌株置于LB液体培养基，其中LB液体培养基包括：蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；NaCl10g/L；于37℃、200rpm震荡培养，菌密度OD600 为0.6-0.8左右时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，于20-22℃诱导18小时，6000rpm 离心10分钟收集菌体，配制成100g/L浓度超声裂解获得粗酶液，使用粗酶液测定乙酰谷氨酸的生成活力。
表1引物设计
引物 5’-3’
cgArgJF CATGCCATGGGTATGGCAGAAAAAGGCATTACC
cgArgJR CCGGAATTCTTAAGAGCTGTACGCGGAG
对上述鸟氨酸乙酰转移酶突变体形成的基因工程菌进行活性测试，具体方法如下：
采用QuickMutationTM基因随机突变试剂盒对cgArgJ的基因片段在PCR阶段进行随机突变，随机突变后的片段，参见实施例1中野生型构建方法进行定向克隆。随机挑取菌株进行活力测定，使用相同方法测定乙酰谷氨酸的生成活力。
活力测定方法：1mL体系内，含有L-谷氨酸10g/L和乙酰鸟氨酸10g/L，PBK缓冲液pH6.5 50mM，适量稀释酶液，37℃反应30min。煮沸终止反应，适量稀释后采用HPLC方法，C18色谱柱检测鸟氨酸生成量。以此条件下1min生成1ug鸟氨酸为 1U。
将活性上升菌株进行测序反应确定位置，根据近百株菌株测活结果，对乙酰谷氨酸合成能力具有显著提升的菌株进行测序，获得突变位点，而后对活力提升的3个菌株进行，在反应体系中加入5g/L乙酰谷氨酸的添加产物抑制实验，考察对酶活力的影响。
表2活性分析
Figure RE-GDA0003755056720000121
由上表2可知，活性上升稳定性升高的位置为161位的F161L突变体，初始易错 PCR中筛选中发现的F161L突变活力相较野生型提高约60％活力。设计饱和突变获得F161A，F161V，F161G，F161M，F161T，F161S等另外6个突变位置显著提升。发现161位置其它几个突变体也显著提升了酶的各项功能。尤其161G，161A突变，分别大于400％。以显著变化位置为模板设计饱和突变。而对活力提升菌株进行添加产物实验。表2可以看到，挑选活力明显提升的6个突变体经过添加产物抑制实验后，发现乙酰谷氨酸对酶的抑制活力F161G，F161A，F161T，F161S也明显大于野生型 (59.38)。其中，F161G，F161A分别为82.71，72.53表现更为突出。具体结果参见表2。发现相对于cgArgJ野生型而言，F161G、F161A、F161M、F161S表现的更为突出。其余酶在总活力达到要求可以能达到催化指标。
在本发明的其中一种实施方式中，质粒的表达为游离过表达或1-3个基因组整合，其中当质粒的表达为游离过表达载体时，游离过表达载体为pTrc99a。以鸟氨酸乙酰转移酶突变体为161位苯丙氨酸突变为甘氨酸为例(cgArgJm1)进行说明，制备大肠杆菌L-精氨酸生产菌株化学法转化感受态，并大量提取获得的cgArgJm1-pTrc99a质粒，将获得的重组载体化入L-精氨酸生产菌株，涂布LB-Amp平板，37摄氏度，生长24-36h，挑取3个Amp抗性单克隆菌株入LB-Amp培养基中培养，获得含有 cgArgJm1过表达的L-精氨酸生产菌株。该步骤中的cgArgJm1也可以替换为本发明涉及到的其它有益的突变体。
其中当质粒的表达为基因组整合表达时，基因组整合表达的基因组整合位置为Glycosyltransferase family 9protein所在区域。更具体的说，以鸟氨酸乙酰转移酶突变体为161位苯丙氨酸突变为甘氨酸为例(cgArgJm1)进行说明。制备大肠杆菌L-精氨酸生产菌株的电转化感受态，通过大肠杆菌重组pKOV系统将cgArgJm1基因整合入L-精氨酸生产用大肠杆菌基因组，单拷贝设计同源臂长度为50-55bp(参见表3)，分别为3个位置。同源重组位置设计为Glycosyltransferase family 9protein基因表达框所在位置，不同拷贝插入位置不同，除拷贝1外，拷贝2，和拷贝3分别连接25bp 连接序列后再插入。其中，25bp连接序列为(25bp)：TCTAGAGAAA GAGGAGAAAT ACTAG。
表3同源臂设计
Figure RE-GDA0003755056720000141
参见实施例1，酶切构建cgArgJm1入pKOV载体，更换切点为BamH1和Sal1，构建成功cgArgJm1-pKOV载体后，转化L-精氨酸生产菌株制备的电转化感受态后，涂布含有氯霉素30mg/L的氯霉素(34mg/L)抗性LB平板过夜生长，挑取PCR鉴定是否整合入染色体，鉴定引物同实施例1。挑取单克隆相同培养基活化浑浊。适当稀释后涂布5％w/v蔗糖平板上。5％蔗糖平板在30℃下过夜培养，挑取单克隆接种到 LB氯霉素平板上，以测试替换载体(cm抗性)的丢失。基因替换可以通过PCR确认。拷贝1完成后，再分别插入拷贝2，以及拷贝3，依次完成。最终获得的L-精氨酸改造后菌株无任何抗性。该步骤中的cgArgJm1也可以替换为本发明涉及到的其它有益的突变体。
实施例3基因工程菌的同条件小型发酵验证
种子活化：从－80度冰箱取用，相应菌株，除去过表达菌株含有氨苄抗性外，其余原始菌株以及改造后菌株均无抗性，氨苄抗性的使用浓度为100mg/L。种子活化体积为5mL，接种量为0.5-1％，37℃，200-220rpm，培养16-20h。
一级种子制备：种子活化后，仍选用LB培养基，将活化后种子接种于更大体积培养基，一般为150-500mL体积，接种量为1-5％，37℃，200-220rpm，培养16-24h。
一级种子制备完成后，更换发酵培养基配方为其中M0包括：胰蛋白胨10g/L，K2HPO4.3H2O 15g/L，KH2PO4 3.2g/L，(NH4)2SO4 4g/L，MgSO4.7H2O 0.2g/L， FeSO4.7H2O 5mg/L，NaCl 1g/L，葡萄糖20g/L，甜菜碱0.5g/L，VB15mg/L，VB23mg/L， VB33mg/L，VB63mg/L，VB122mg/L，复合微量元素1mL/L，其中所述复合微量元素包括NaMoO4*2H2O 150mg/L，CoCl2*6H2O 0.5g/L，CuSO4*5H2O 0.25g/L， MnCl2*4H2O 0.5g/L，ZnSO4*7H2O 30mg/L，生物素0.5g/L；MO的pH7.2-7.4。培养基为4L，接种量为10-20％，35℃，碳源流加50-80％葡萄糖，发酵，培养48h。取样测定L-精氨酸产量。发酵后L-精氨酸产量如表3所示，最高测试产量为142.34g/L。
过程控制：初始转速400rpm，采用氨水调节pH 7.0-7.4，氧控制：控制DO在25 —35％；溶氧≤25％时，提升转速调节。残糖控制：0.1-0.2％；
表4不同菌株发酵后L-精氨酸产量
序号 菌株名称 抗性 产量(g/L) 相对百分率(％)
1 原始菌株 无 118.36 100
2 cgArgJm1过表达菌株 Amp 126.66 107.01
3 cgArgJm1基因组敲入单拷贝 无 131.13 110.79
4 cgArgJm1基因组敲入双拷贝 无 140.18 118.43
5 cgArgJm1基因组敲入三拷贝 无 142.34 120.26
由上表4数据可知，和原始基因未改造前相比，外源过表达cgArgJm1基因，L- 精氨酸的产量约提升到107％左右，虽然游离过表达该基因拷贝数会比较高，但是由于引入抗性，造成整体培养过程中的菌体密度收到抗性影响，OD600明显低于其它菌株。基因组敲入后L-精氨酸的表达量随拷贝数提高明显提升，三个拷贝时达到峰值约为142.34g/L，较原始提高约20％，可见该基因明显可以提升L-精氨酸的产量。
实施例4放大发酵培养条件与控制
种子活化：从－80度冰箱取用，相应菌株，除去过表达菌株含有氨苄抗性外，其余原始菌株以及改造后菌株均无抗性，氨苄抗性的使用浓度为100mg/L。种子活化体积为5mL，接种量为0.5-1％，37℃，200-220rpm，培养16-20h。
一级种子制备：种子活化后，仍选用LB培养基，将活化后种子接种于更大体积培养基，一般为150-500mL体积，接种量为1-5％，37℃，200-220rpm，培养16-24h。
二级种子制备：一级种子制备完成后，更换发酵培养基配方为M1包括：酵母粉 5g/L，K2HPO4.3H2O 7.5g/L，KH2PO4 1.5g/L，MgSO4.7H2O 1.5g/L，FeSO4.7H2O 15mg/L，葡萄糖20g/L，甜菜碱0.3g/L，VB15mg/L，VB23mg/L，VB33mg/L，VB53mg/L，复合微量元素1mL/L，其中所述复合微量元素包括NaMoO4*2H2O 150mg/L，CoCl2*6H2O 0.5g/L，CuSO4*5H2O 0.25g/L，MnCl2*4H2O 0.5g/L，ZnSO4*7H2O 30mg/L，生物素 0.5g/L；M1的pH7.2-7.4。培养基为2-5L，接种量为10-15％，35℃，碳源流加50-80％葡萄糖，发酵，培养6-8h。OD600在12-14移种。
过程控制：初始转速400rpm，采用氨水调节pH 7.0-7.4，氧控制：控制DO在25 —35％；溶氧≤25％时，提升转速调节。残糖控制：0.1-0.2％；
发酵培养：二级种子制备完成后，更换发酵培养基配方为M2进行中试级别发酵验证，M2包括：胰蛋白胨3g/L，酵母粉5g/L，K2HPO4.3H2O 4g/L，KH2PO4 1g/L， MgSO4.7H2O1.5g/L，FeSO4.7H2O 15mg/L，葡萄糖25g/L，甜菜碱0.8g/L，VB15mg/L， VB23mg/L，VB33mg/L，VB53mg/L，复合微量元素1mL/L，其中所述复合微量元素包括NaMoO4*2H2O 150mg/L，CoCl2*6H2O 0.5g/L，CuSO4*5H2O 0.25g/L， MnCl2*4H2O 0.5g/L，ZnSO4*7H2O 30mg/L，生物素0.5g/L；M2的pH7.2-7.4。培养基为30-500L，接种量为10-20％，35℃，碳源流加80％葡萄糖，发酵，培养44-48h。其中过程控制为过程控制：初始转速400rpm，采用氨水调节pH 7.0-7.4，氧控制：控制DO在25—35％；溶氧≤25％时，提升转速调节。残糖控制：0.1-0.2％；最终经过 48h培养，L-精氨酸产量根据发酵批次、发酵体积略有不同，基本维持在 142.34-147.2g/L。图2显示为30L发酵实验获得的最高产量147.2g/L。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作出的简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明权利要求的保护范围。
Organization Applicant
----------------------
Street :如东洋口化学工业园区黄海三路7号
City : 南通市
State : 江苏省
Country : 中国
<110> OrganizationName : 南通紫琅生物医药科技有限公司
Application Project
-------------------
<120> Title : 鸟氨酸乙酰转移酶突变体、编码基因、质粒、基因工程菌及应用
<160>2
<170> PatentIn version 3.3
Sequence
--------
<213> OrganismName : 鸟氨酸乙酰转移酶突变体蛋白质序列
<400> PreSequenceString :
MetAlaGluLysGlyIleThrAlaProLysGlyPheValAlaSerAlaThrThrAlaGly
1 5 10 15 20
IleLysAlaSerGlyAsnProAspMetAlaLeuValValAsnGlnGlyProGluPheSer
21 25 30 35 40
AlaAlaAlaValPheThrArgAsnArgValPheAlaAlaProValLysValSerArgGlu
41 45 50 55 60
AsnValAlaAspGlyGlnIleArgAlaValLeuTyrAsnAlaGlyAsnAlaAsnAlaCys
61 65 70 75 80
AsnGlyLeuGlnGlyGluLysAspAlaArgGluSerValSerHisLeuAlaGlnAsnLeu
81 85 90 100 101
GlyLeuGluAspSerAspIleGlyValCysSerThrGlyLeuIleGlyGluLeuLeuPro
101 105 110 115 120
MetAspLysLeuAsnAlaGlyIleAspGlnLeuThrAlaGluGlyAlaLeuGlyAspAsn
121 125 130 135 140
GlyAlaAlaAlaAlaLysAlaIleMetThrThrAspThrValAspLysGluThrValVal
141 145 150 155 160
GlyAlaAspGlyTrpThrValGlyGlyMetGlyLysGlyValGlyMetMetAlaProSer
161 165 170 175 180
LeuAlaThrMetLeuValCysLeuThrThrAspAlaSerValThrGlnGluMetAlaGln
181 185 190 195 200
IleAlaLeuAlaAsnAlaThrAlaValThrPheAspThrLeuAspIleAspGlySerThr
201 205 210 215 220
SerThrAsnAspThrValPheLeuLeuAlaSerGlyAlaSerGlyIleThrProThrGln
221 225 230 235 240
AspGluLeuAsnAspAlaValTyrAlaAlaCysSerAspIleAlaAlaLysLeuGlnAla
241 245 250 255 260
AspAlaGluGlyValThrLysArgValAlaValThrValValGlyThrThrAsnAsnGlu
261 265 270 275 280
GlnAlaIleAsnAlaAlaArgThrValAlaArgAspAsnLeuPheLysCysAlaMetPhe
281 285 290 295 300
GlySerAspProAsnTrpGlyArgValLeuAlaAlaValGlyMetAlaAspAlaAspMet
301 305 310 315 320
GluProGluLysIleSerValPhePheAsnGlyGlnAlaValCysLeuAspSerThrGly
321 325 330 335 340
AlaProGlyAlaArgGluValAspLeuSerGlyAlaAspIleAspValArgIleAspLeu
341 345 350 355 360
GlyThrSerGlyGluGlyGlnAlaThrValArgThrThrAspLeuSerPheSerTyrVal
361 365 370 375 380
GluIleAsnSerAlaTyrSerSer
381 385
<212> Type : PRT
<211> Length : 388
Sequence
--------
<213> OrganismName : 鸟氨酸乙酰转移酶突变体核苷酸序列
<400> PreSequenceString :
atggcagaaa aaggcattac cgcgccgaaa ggcttcgttg cttctgcaac gaccgcgggt 60
attaaagctt ctggcaatcc tgacatggcg ttggtggtta accagggtcc agagttttcc 120
gcagcggccg tgtttacacg taaccgagtt ttcgcagcgc ctgtgaaggt gagccgagag 180
aacgttgctg atggccagat cagggctgtt ttgtacaacg ctggtaatgc taatgcgtgt 240
aatggtctgc agggtgagaa ggatgctcgt gagtctgttt ctcatctagc tcaaaatttg 300
ggcttggagg attccgatat tggtgtgtgt tccactggtc ttattggtga gttgcttccg 360
atggataagc tcaatgcagg tattgatcag ctgaccgctg agggcgcttt gggtgacaat 420
ggtgcagctg ctgccaaggc gatcatgacc actgacacgg tggataagga aaccgtcgtg 480
tttgctgatg gttggactgt cggcggaatg ggcaagggcg tgggcatgat ggcgccgtct 540
cttgccacca tgctggtctg cttgaccact gatgcatccg ttactcagga aatggctcag 600
atcgcgctgg ctaatgctac ggccgttacg tttgacaccc tggatattga tggatcaacc 660
tccaccaatg acaccgtgtt cctgctggca tctggcgcta gcggaatcac cccaactcag 720
gatgaactca acgatgcggt gtacgcagct tgttctgata tcgcagcgaa gcttcaggct 780
gatgcagagg gtgtgaccaa gcgcgttgct gtgacagtgg tgggaaccac caacaacgag 840
caggcgatta atgcggctcg cactgttgct cgtgacaatt tgttcaagtg cgcaatgttt 900
ggatctgatc caaactgggg tcgcgtgttg gctgcagtcg gcatggctga tgctgatatg 960
gaaccagaga agatttctgt gttcttcaat ggtcaagcag tatgccttga ttccactggc 1020
gctcctggtg ctcgtgaggt ggatctttcc ggcgctgaca ttgatgtccg aattgatttg 1080
ggcaccagtg gggaaggcca ggcaacagtt cgaaccactg acctgagctt ctcctacgtg 1140
gagatcaact ccgcgtacag ctcttaa 1167
<212> Type : DNA
<211> Length : 1167
Sequence
--------
<213> OrganismName : 连接序列
<400> PreSequenceString :
tctagagaaa gaggagaaat actag 25
<212> Type : DNA
<211> Length : 25

Claims (10)

1.一种鸟氨酸乙酰转移酶突变体，其特征在于，所述鸟氨酸乙酰转移酶突变体在SEQID NO.2所示序列中第161位的苯丙氨酸突变，被其它氨基酸取代。
2.根据权利要求1所述的鸟氨酸乙酰转移酶突变体，其特征在于，所述161位苯丙氨酸突变为甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或丝氨酸。
3.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因编码如权利要求1-2中任一项所述的鸟氨酸乙酰转移酶突变体的基因。
4.一种质粒，其特征在于，所述质粒携带如权利要求3所述的编码基因。
5.根据权利要求4所述的质粒，其特征在于，所述质粒的表达为游离过表达或1-3个基因组整合。
6.根据权利要求5所述的质粒，其特征在于，所述游离过表达载体为pTrc99a。
7.根据权利要求5所述的质粒，其特征在于，所述基因组整合表达为基因组整合位置为Glycosyltransferase family 9protein所在区域。
8.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达如权利要求5-7中任一项所述的质粒。
9.一种基因工程菌的应用，其特征在于，利用所述权利要求8中的基因工程菌进行L-精氨酸发酵生产。
10.根据权利要求9所述的基因工程菌的应用，其特征在于，所述L-精氨酸发酵生产中所用的发酵培养基为M0、M1或M2中的任意一种；
其中M0包括：胰蛋白胨10g/L，K2HPO4.3H2O 15g/L，KH2PO4 3.2g/L，(NH4)2SO44g/L，MgSO4.7H2O 0.2g/L，FeSO4.7H2O 5mg/L，NaCl 1g/L，葡萄糖20g/L，甜菜碱0.5g/L，VB15mg/L，VB23mg/L，VB33mg/L，VB63mg/L，VB122mg/L，复合微量元素1mL/L，其中所述复合微量元素包括NaMoO4*2H2O 150mg/L，CoCl2*6H2O 0.5g/L，CuSO4*5H2O 0.25g/L，MnCl2*4H2O 0.5g/L，ZnSO4*7H2O 30mg/L，生物素0.5g/L；其中M0的pH7.2-7.4；
M1包括：酵母粉5g/L，K2HPO4.3H2O 7.5g/L，KH2PO4 1.5g/L，MgSO4.7H2O 1.5g/L，FeSO4.7H2O 15mg/L，葡萄糖20g/L，甜菜碱0.3g/L，VB15mg/L，VB23mg/L，VB33mg/L，VB53mg/L，复合微量元素1mL/L，其中所述复合微量元素包括NaMoO4*2H2O 150mg/L，CoCl2*6H2O 0.5g/L，CuSO4*5H2O 0.25g/L，MnCl2*4H2O 0.5g/L，ZnSO4*7H2O 30mg/L，生物素0.5g/L；其中，M1的pH7.2-7.4；
M2包括：胰蛋白胨3g/L，酵母粉5g/L，K2HPO4.3H2O 4g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4.7H2O 1.5g/L，FeSO4.7H2O 15mg/L，葡萄糖25g/L，甜菜碱0.8g/L，VB15mg/L，VB23mg/L，VB33mg/L，VB53mg/L，复合微量元素1mL/L，其中所述复合微量元素包括NaMoO4*2H2O 150mg/L，CoCl2*6H2O0.5g/L，CuSO4*5H2O 0.25g/L，MnCl2*4H2O 0.5g/L，ZnSO4*7H2O 30mg/L，生物素0.5g/L；其中，M2的pH7.2-7.4。
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