JP2017131188A - 組換え微生物の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】目的の改変細胞を容易に選択することができる組換え微生物の製造方法の提供。【解決手段】組換え微生物の製造方法。該方法は、第１の変異対象領域と置換された第１の加水分解酵素発現カセットと、第１の選択マーカーとを共発現する宿主微生物の細胞を調製すること；該細胞を、該第１の加水分解酵素の基質を含有する該第１の選択マーカー保有株選択培地で培養し、該培地上で増殖かつハローを形成した細胞を、該第１の加水分解酵素発現カセットを含有する細胞として選択すること；選択した細胞に第２の選択マーカーの発現能を付与し、かつ該第１の加水分解酵素発現カセットを第１の組換えカセットで置換すること；次いで、該細胞を、該第１の加水分解酵素の基質を含有する該第２の選択マーカー保有株選択培地で培養し、該培地上でハローを形成せずに増殖する細胞を、該第１の組換えカセットを含有する細胞として選択すること、を包含する。【選択図】なし

Description

本発明は、組換え微生物の製造方法に関する。

従来、遺伝子工学分野においては、形質転換体の選択手段として、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性関連遺伝子等の選択マーカー遺伝子が使用され、これらのマーカー遺伝子によって欠損又は獲得した薬剤耐性や栄養要求性の形質を指標に、目的の遺伝子改変が施された形質転換体の選択が行われてきた。この際、目的の遺伝子改変が施された形質転換体のみが増殖可能であるポジティブセレクションが、選抜効率の良さから望まれている。

選択マーカー遺伝子は、形質転換体を選択するためには有用であるが、形質転換後の細胞に残存し続けることによっていくつかの問題をもたらす。例えば、１つの宿主に複数の遺伝子改変を施す場合、細胞に残存するマーカー遺伝子の種類に注意する必要がある。また、形質転換体の選択に使用可能なマーカー遺伝子の種類には限りがあることから、形質転換体に蓄積したマーカー遺伝子は、遺伝子改変の回数を制限する。さらに、形質転換体に残存するマーカー遺伝子は、野生型微生物の該マーカー遺伝子による汚染など、環境に悪影響を及ぼすという問題がある。したがって、選択マーカー遺伝子を保有しない形質転換体の開発が望まれている。

形質転換体から選択マーカー遺伝子を除去する方法が開示されている。特許文献１には、宿主ＤＮＡの欠失対象領域の５’末端側領域に、該欠失対象領域の５’末端側領域及び３’末端側領域、マーカー遺伝子ならびにリプレッサー遺伝子を連結したカセットを相同組換えによって組込み、該マーカー遺伝子の発現によって該カセットが組込まれた細胞を選択した後、第２相同組換えによって該カセットを欠失させることで、該欠失対象領域を欠失させる方法が記載されている。この方法では、欠失対象領域の下流に第２のマーカー遺伝子が配置されており、該カセット中のリプレッサーの欠失により該第２のマーカーが発現することで、欠失対象領域が欠失した目的の細胞がポジティブセレクションされる。しかし、この方法では、第２のマーカー遺伝子が細胞内に残存する。

特許文献２には、宿主ＤＮＡの欠失対象領域の５’末端側領域に、該欠失対象領域の５’末端側領域及び３’末端側領域（又はこれらの間に位置する目的遺伝子）、第１マーカー遺伝子ならびにプロモーターと結合した第２マーカー遺伝子を連結したカセットを相同組換えによって組込み、該第１マーカー遺伝子の発現によって該カセットが組込まれた細胞を選択した後、第２相同組換えによって該カセットを欠失した細胞を、該第２マーカー遺伝子の発現の喪失を指標に選択することで、所望の遺伝子改変がなされ、かつマーカー遺伝子の残存のない細胞を選択する方法が記載されている。第２マーカー遺伝子としては、lacZ、amyEなどが例示されている。

非特許文献１及び特許文献３には、細胞の遺伝子改変を繰り返す際に、２種類の薬剤耐性遺伝子を相互交換的に発現させ、選択マーカー遺伝子として用いたことが開示されている。これらの薬剤耐性遺伝子は、宿主の栄養要求性関連遺伝子領域に導入されてマーカー遺伝子として使用された後、最終的に栄養要求性関連遺伝子と再置換されるので、得られた形質転換体中に残存しない。

特開２００７−１１１０１５号公報 特開２００９−２５４３５０号公報 特開２０１３−００９６０４号公報

H. Nanamiya, et al., Microbiology, 2010, 156:2944-2952

本発明は、目的の改変が成された改変細胞を容易にポジティブセレクションすることができ、かつ改変細胞への選択マーカー遺伝子の蓄積を抑制することができる組換え微生物の製造方法を提供する。

本発明者らは、宿主細胞ＤＮＡ中の変異対象領域を予め加水分解酵素遺伝子で置換し、次いで該加水分解酵素遺伝子を目的ＤＮＡ又は欠失用断片と置換することによって、該細胞を培養した培地上のハローの形成の有無に基づいて、目的ＤＮＡで変異対象領域が置換された組換え細胞、又は変異対象領域が欠失した細胞を容易に選択することができること、さらにその際に、宿主細胞に対して該加水分解酵素遺伝子とは別に薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を導入することによって、ハローの形成を判定する対象を該マーカーにより選択された細胞のみに絞り込むことができるため、ハローの形成の有無の判定がより容易になることを見出した。すなわち、ハローの形成に基づく選択とマーカー遺伝子による選択とを組み合わせることによって、目的の改変が成された細胞を容易に選択することができる。さらに、該遺伝子改変操作を繰り返した場合であっても、選択マーカー遺伝子を相互交換的に切り替えて使用することによって、目的の改変が成された細胞を容易に選択することができ、かつ使用するマーカー遺伝子の数を抑えることができる。

したがって、一態様において、本発明は、組換え微生物の製造方法であって、
（１）第１の加水分解酵素発現カセットと第１の選択マーカーとを共発現する宿主微生物の細胞を調製すること、
ここで、
該第１の加水分解酵素発現カセットは、プロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結された第１の加水分解酵素遺伝子とを含むＤＮＡであり、かつ
該第１の加水分解酵素発現カセットは、該細胞のＤＮＡ中の第１の変異対象領域と置換されている；
（２）該細胞を、該第１の加水分解酵素の基質を含有する該第１の選択マーカー保有株選択培地で培養し、該培地上で増殖かつハローを形成した細胞を、該第１の加水分解酵素発現カセットを含有する細胞として選択すること；
（３）該（２）で選択した細胞に第２の選択マーカーの発現能を付与し、かつ該第１の加水分解酵素発現カセットを第１の組換えカセットで置換すること；及び、
（４）該（３）で調製した細胞を、該第１の加水分解酵素の基質を含有する該第２の選択マーカー保有株選択培地で培養し、該培地上でハローを形成せずに増殖する細胞を、該第１の組換えカセットを含有する細胞として選択すること、
を包含する方法を提供する。

さらなる態様において、本発明は、組換え微生物の宿主細胞の製造方法であって、
微生物細胞に、プロモーターに作動可能に連結された加水分解酵素遺伝子を含むＤＮＡを導入するか、又はプロモーターを導入して該細胞中の加水分解酵素遺伝子と作動可能に連結させること、及び選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡを導入すること；ならびに
該細胞を、該加水分解酵素の基質を含有する該選択マーカー保有株選択培地で培養し、該培地上で増殖かつハローを形成した細胞を選択すること、
を包含する方法を提供する。

本発明の組換え微生物の製造方法によれば、宿主細胞への遺伝子導入を繰り返した場合であっても、目的ＤＮＡが導入された細胞、又は標的のＤＮＡ領域が欠失した細胞を容易に選択することができる。さらに本発明の方法によれば、改変後の細胞に残存する選択マーカー遺伝子の数を抑制することができ、また一連の改変後に選択マーカー遺伝子を組換え微生物から削除することも可能である。したがって、本発明によれば、選択マーカー遺伝子の残存のない又は極めて少ない組換え微生物が提供される。

本発明の組換え微生物の製造方法の概念図。 本発明の組換え微生物の製造方法の概念図：２種類の選択マーカー遺伝子を相互交換的に発現させる場合を示す。 本発明の組換え微生物の製造方法の概念図：組換え細胞からの選択マーカー遺伝子の削除手順を示す。図中では、trpBA遺伝子領域と置換されたマーカー遺伝子を、trpBAで再置換することで削除している。

（１．定義）
本明細書において、「変異対象領域」とは、宿主微生物のＤＮＡ中の領域であって、目的ＤＮＡと置換されるか、又は該領域が欠失することによって、変異導入されるべき領域をいう。変異対象領域としては、宿主ＤＮＡの不要な領域、例えば宿主の物質生産に不要な領域（胞子形成関連遺伝子等）、宿主の生育若しくは物質生産を阻害する領域（ファージ領域等）、及び宿主内で多数重複している遺伝子や遺伝子グループ（２成分制御系遺伝子等）などが挙げられるが、これらに限定されない。変異対象領域は、宿主微生物の野生型のＤＮＡに存在する領域であってもよく、又は本発明の方法適用前に宿主に人為的に導入された領域であってもよい。人為的に導入された領域としては、例えば、選択マーカー遺伝子やレポーター遺伝子を含む領域などが挙げられる。好ましくは、変異対象領域は、宿主微生物の生育に必須な遺伝子（以下、「生育必須遺伝子」という）を含まないように選択される。ここで生育必須遺伝子とは、外部から培地へ添加する等の方法によっても補うことのできない機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であって、宿主ゲノムから削除されると致死となる遺伝子をいう。換言すると、宿主ゲノムから削除されると宿主が生存できない、すなわち致死となることが知られる致死遺伝子であっても、培地に補完物質（例えば代謝関連物質等）を添加することによって宿主の生育を維持できるのであれば、本明細書における「生育必須遺伝子」には含まれない。

本発明の組換え微生物の製造方法に用いられる変異対象領域のサイズは、特に限定されないが、１ｂｐ以上が好ましく、０．２ｋｂ以上がより好ましく、０．５ｋｂ以上がさらに好ましく、一方で、該変異対象領域のサイズは、２００ｋｂ以下が好ましく、１６０ｋｂ以下がより好ましく、１２０ｋｂ以下がさらに好ましく、８０ｋｂ以下がさらにより好ましく、４０ｋｂ以下がなお好ましい。対象領域のサイズを２００ｋｂ以下とした場合には、生育必須遺伝子を含まない蓋然性が高い。なお、枯草菌において、生育必須遺伝子を含まない最大の領域は、dltA遺伝子〜yycH遺伝子間の約２００ｋｂであることが知られている（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００３，１００，４６７８−４６８３参照）。

本明細書において、「目的ＤＮＡ」とは、宿主微生物に導入すべきＤＮＡをいう。該目的ＤＮＡの種類は、特に限定されず、タンパク質、ペプチド若しくはポリペプチドをコードするＤＮＡ、ノンコーディングＲＮＡをコードするＤＮＡ、プロモーターＤＮＡ、ターミネーターＤＮＡ、抑制因子や活性化因子等の各種因子が結合する転写調節領域のＤＮＡなどが挙げられる。該目的ＤＮＡは、それらのＤＮＡが導入される宿主微生物が生来的に発現する種類のものであってもよいが、好ましくは、該宿主微生物が生来的に発現しない種類のもの、より好ましくは異種ＤＮＡである。該目的ＤＮＡのうち、タンパク質、ペプチド若しくはポリペプチド、又はノンコーディングＲＮＡをコードするＤＮＡは、本明細書において「目的遺伝子」とも称される。該目的遺伝子にコードされる該タンパク質、ペプチド若しくはポリペプチドの例としては、これらに限定されないが、収縮タンパク質、輸送タンパク質、シグナルタンパク質、生体防御タンパク質、受容体タンパク質、構造タンパク質、遺伝子調節タンパク質、酵素、及び貯蔵タンパク質等の機能性のタンパク質、ペプチド又はポリペプチド；ならびに、食品、医薬品、化粧品、洗浄剤、繊維、医療検査などの分野で用いられる産業上有用な酵素又は生理活性因子として働くタンパク質、ペプチド又はポリペプチドが挙げられる。当該産業上有用な酵素としては、酸化還元酵素（オキシドレダクターゼ）、転移酵素（トランスフェラーゼ）、加水分解酵素（ヒドロラーゼ）、脱離酵素（リアーゼ）、異性化酵素（イソメラーゼ）、合成酵素（リガーゼ／シンセターゼ）などが挙げられ、好適には、セルラーゼ等のグリコシドハイドロラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼなどの加水分解酵素、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの転移酵素が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において、遺伝子と制御領域とが「作動可能に連結されている」とは、遺伝子と、該遺伝子の転写、翻訳又は分泌に関わる制御領域（例えば、プロモーター）とが、当該制御領域による制御の下に当該遺伝子を発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。

本明細書において、ＤＮＡ領域の「置換」とは、該ＤＮＡ領域の一部又は全部を別のＤＮＡで置き換えることをいう。例えば、本明細書におけるＤＮＡ領域の「置換」は、該ＤＮＡ領域の全体を別のＤＮＡで置き換えること、該ＤＮＡ領域の一端を残して、残りを別のＤＮＡで置き換えること、該ＤＮＡ領域の両端を残して、その間を別のＤＮＡで置き換えること、及び該ＤＮＡ領域中の任意の位置に別のＤＮＡを挿入することを含む。

本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「生来的」とは、該機能や性状、形質が、該細胞の野生型、又は改変処理前の細胞（例えば宿主細胞）に存在していることを表すために使用される。

本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「外来」とは、細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。

本明細書において、「加水分解酵素遺伝子」とは、宿主微生物を培養する培地に含まれるタンパク質、デンプン、糖類などの基質を加水分解することで、該培地上にハローを形成することができる酵素をコードする遺伝子である。加水分解酵素遺伝子の例としては、プロテアーゼ遺伝子、アミラーゼ遺伝子、セルラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、リパーゼ遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において、「ハローを形成する」とは培地上でコロニーの周囲が当初の培地に比較し透明又は半透明に変化すること、又はコロニーの周囲の色が当初の培地の色と異なる色に変化することをいう。また、加水分解酵素の発現により培地上のコロニーの色が変化することも含まれる。

本明細書において、培地に含有される「加水分解酵素の基質」は、上記加水分解酵素遺伝子にコードされる酵素の基質である。該基質の例としては、限定ではないが、加水分解酵素がプロテアーゼであれば、スキムミルク、ペプチド−ｐＮＡ、ペプチド−ＭＣＡ、ペプチド−ＡＦＣなどが挙げられ、加水分解酵素がアミラーゼであれば、デンプン、アミロース、アミロペクチン、プルラン、オリゴ糖-ＣＮＰ、オリゴ糖−４ＮＰ、オリゴ糖-ＰＮＰなどが挙げられ、加水分解酵素がセルラーゼであれば、セルロース、ＣＭＣなどが挙げられ、加水分解酵素がβ−ガラクトシダーゼであれば、ＯＮＰＧ、サーモンＧＡＬ、Ｘ−ｇａｌなどが挙げられ、加水分解酵素がβ−グルクロニダーゼであれば、ＭＵＧ、Ｘ−ＧＬＵＣなどが挙げられ、加水分解酵素がリパーゼであれば、トリブチリン、ＢＡＬＢなどが挙げられる。

本明細書において、「選択マーカー遺伝子」とは、形質転換体の選択手段として使用される形質をもたらす遺伝子であり、例としては、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性関連遺伝子、致死遺伝子などが挙げられる。薬剤耐性遺伝子の例としては、これらに限定されないが、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子などが挙げられる。薬剤耐性遺伝子のより具体的な例としては、それぞれ、ストレプトコッカス属細菌由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子、ラクトバチルス属細菌由来のエリスロマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイセス属放線菌由来のネオマイシン耐性遺伝子、コリネバクテリウム属細菌由来のスペクチノマイシン耐性遺伝子、大腸菌由来のカナマイシン耐性遺伝子、サルモネラ属細菌由来のテトラサイクリン耐性遺伝子、バチルス属細菌由来のブラストサイジンＳ耐性遺伝子、大腸菌由来のアンピシリン耐性遺伝子などが挙げられる。栄養要求性関連遺伝子の例としては、これらに限定されないが、アミノ酸生合成経路、核酸生合成経路、ビタミン生合成経路などに関わる遺伝子が挙げられる。例えば、栄養要求性関連遺伝子は、宿主細胞に生来的に存在するアミノ酸生合成関連遺伝子が、該アミノ酸の要求性を示すように変異したものであり得る。

本明細書において、細胞が「選択マーカーの発現能を有する」又は「選択マーカーを発現する」とは、選択マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子の場合、該細胞が該薬剤耐性遺伝子を発現して該薬剤耐性を獲得していることを意味する。一方、選択マーカー遺伝子が栄養要求性関連遺伝子の場合、細胞が「選択マーカーの発現能を有する」又は「選択マーカーを発現する」とは、細胞が生存のために必須な栄養を生合成する能力を有することを意味する。例えば、選択マーカー遺伝子がアミノ酸要求性関連遺伝子の場合、「選択マーカーの発現能を有する」又は「選択マーカーを発現する」とは、細胞が生来的に生合成能力を有さないアミノ酸の遺伝子を発現し、該アミノ酸の生合成能を獲得していることを意味する。

本明細書において、「選択マーカー保有株選択培地」とは、選択マーカーの遺伝子を発現する細胞を選択するための培地をいう。例えば、選択マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子の場合、選択マーカー保有株選択培地は、該薬剤含有培地である。選択マーカー遺伝子が栄養要求性関連遺伝子の場合、選択マーカー保有株選択培地は、該栄養欠乏培地である。

（２．組換え微生物の製造方法）
一態様において、本発明は、組換え微生物の製造方法を提供する。本発明の組換え微生物の製造方法では、細胞のハロー形成能を指標に、目的の細胞を選択する。

より詳細には、本発明の方法においては、まず、目的ＤＮＡで置換したい変異対象領域が、加水分解酵素遺伝子を含む発現カセット（以下、加水分解酵素発現カセットと称する）で置換された細胞を調製する。次いで、該細胞を、該加水分解酵素の基質を含有する培地で培養し、該培地上でのハローの形成を指標に、該加水分解酵素発現カセットを含有する細胞を選択する（第１選択工程）。

ただし、上記第１選択工程において、培地上で制限なく細胞が増殖すると、多くのコロニーが発生して、隣接するコロニー同士が接触したり１つのハローが隣接するコロニー周辺にまで広がってしまうことにより、ハロー形成したコロニーの判別が困難になる。したがって、本発明の方法においては、上記加水分解酵素遺伝子が導入された細胞が選択的に培地中で増殖できるように、培地に選択圧をかけることが望ましい。例えば、本発明の方法においては、宿主微生物に、上記加水分解酵素に加えて第１の選択マーカーを共発現させる。例えば、宿主微生物に、上記加水分解酵素発現カセットに加えて、第１の選択マーカー遺伝子（Ｍ１）を導入する。一方で、培地には該第１の選択マーカー選択用培地を使用する。該選択用培地は、該加水分解酵素の基質を含有する。これによって、遺伝子組換えが起こらなかった細胞は除外され、培地に発生するコロニーは、該加水分解酵素と該第１の選択マーカーの両方を発現する細胞のコロニー、及び該第１の選択マーカーのみを発現する細胞のコロニーのいずれかとなる。本発明の方法によれば、過剰なコロニー形成を防止することができるので、培地上のコロニーからハローを形成するコロニーを容易に選択することができる。上記第１選択工程で選択された、培地上で増殖しかつハロー形成能を有する細胞は、加水分解酵素発現カセットを含み、かつ第１の選択マーカー発現能を有する細胞である（図１参照）。

続いて、選択された細胞の該加水分解酵素発現カセットを、目的ＤＮＡを含む組換えカセットで置換し、次いで該細胞を該加水分解酵素の基質を含有する培地で培養する。該組換えカセットが導入された細胞は、加水分解酵素発現カセットを失っているため、ハローを形成しない。したがって、培地上でハローの形成がないことを指標に細胞を選択すれば、変異対象領域が目的ＤＮＡで置換された組換え細胞を取得することができる（第２選択工程）。

ただし、上記第２選択工程においても、培地上で制限なく細胞が増殖すると、ハロー形成の有無の判別が困難になる。したがって、本発明の方法においては、加水分解酵素発現カセットを組換えカセットで置換することと並行して、細胞に第２の選択マーカーの発現能を付与することが望ましい。例えば、第１選択工程で選択した細胞に対し、上記組換えカセットに加えて該第２の選択マーカーの遺伝子（Ｍ２）を導入する。この細胞を、該加水分解酵素の基質を含有する該第２の選択マーカー選択用培地で培養すれば、遺伝子組換えが起こらなかった細胞は除外される。培地上で増殖する細胞は、該組換えカセットを含み、第２の選択マーカーを発現するが加水分解酵素を発現しない細胞、及び該組換えカセットを含まず、第２の選択マーカーと加水分解酵素をともに発現する細胞のいずれかである。したがって、培地上に形成されたコロニーの中から、ハローを形成しないコロニーを選択することで、目的ＤＮＡを含む組換えカセットが導入された目的の組換え細胞を取得することができる。この方法によれば、過剰なコロニー形成を防止することができるので、培地上のコロニーから、目的の細胞を含むハローを形成しないコロニーを容易に選択することができる。上記第２選択工程で選択された、培地上で増殖するがハロー形成しない細胞は、組換えカセットを含み、かつ第２の選択マーカー発現能を有する細胞である（図１参照）。

上記手順で得られた組換え細胞に対して、同様の手順を繰り返すことによって、第２の変異対象領域が第２の目的ＤＮＡで置換された二重組換え細胞を取得することができる。さらに同様の工程を繰り返せば、第３又はさらなる変異対象領域が第３の又はさらなる目的ＤＮＡで置換された多重組換え細胞を取得することができる（図１参照）。

本発明の方法においては、上記組換えカセットとして、相同組換えにより変異対象領域を目的ＤＮＡで置換するための遺伝子置換用断片を使用することで、変異対象領域が目的ＤＮＡで置換された組換え細胞を作製することができる。あるいは、本発明の方法においては、上記組換えカセットとして目的ＤＮＡを含まない遺伝子欠失用断片を使用することで、変異対象領域が欠失した組換え細胞を作製することができる。したがって、本発明の組換え微生物の製造方法によれば、宿主ＤＮＡに対して１個以上の遺伝子が置換又は欠失された組換え微生物が製造される。好ましくは、本発明の組換え微生物の製造方法によれば、多重変異を有する組換え微生物が製造される。

（２．１．一次組換え）
好ましい実施形態において、本発明の組換え微生物の製造方法は、少なくとも以下の（１）〜（４）を包含する。
（１）第１の加水分解酵素発現カセットと第１の選択マーカーとを共発現する宿主微生物の細胞を調製すること
（２）該細胞を、該第１の加水分解酵素の基質を含有する該第１の選択マーカー保有株選択培地で培養し、該培地上で増殖かつハローを形成した細胞を、該第１の加水分解酵素発現カセットを含有する細胞として選択すること
（３）該（２）で選択した細胞に第２の選択マーカーの発現能を付与し、かつ該第１の加水分解酵素発現カセットを第１の組換えカセットで置換すること
（４）該（３）で調製した細胞を、該第１の加水分解酵素の基質を含有する該第２の選択マーカー保有株選択培地で培養し、該培地上でハローを形成せずに増殖する細胞を、該第１の組換えカセットを含有する細胞として選択すること

本発明の組換え微生物の製造方法に用いられる宿主微生物としては、特に限定されないが、バチルス属菌が好ましく、バチルス属菌の例としては、枯草菌（Bacillus subtilis）、Bacillus cereus、Bacillus coagulans、Bacillus clausii、Bacillus circulans、Bacillus licheniformis、Paenibacillus sp.など、及びその変異株が挙げられる。このうち、枯草菌及びその変異株が、本発明の方法に用いる宿主微生物としてより好ましい。

上記本発明の方法の工程（１）で調製される宿主微生物の細胞に含まれる第１の加水分解酵素発現カセットは、第１の加水分解酵素遺伝子を含むＤＮＡである。該第１の加水分解酵素遺伝子は、宿主微生物を培養する培地中の基質を加水分解することで、該培地上にハローを形成することができる酵素をコードする遺伝子であればよい。該第１の加水分解酵素遺伝子は、好ましくはプロテアーゼ遺伝子、アミラーゼ遺伝子、セルラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子及びリパーゼ遺伝子からなる群より選択され、より好ましくはプロテアーゼ遺伝子、アミラーゼ遺伝子、セルラーゼ遺伝子及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子からなる群より選択される。プロテアーゼ遺伝子の例としてはnprE、aprEなど、アミラーゼ遺伝子の例としてはamyEなど、セルラーゼ遺伝子の例としてはアルカリセルラーゼ遺伝子など、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の例としてはlacZなど、β−グルクロニダーゼ遺伝子の例としてはGUSなど、リパーゼ遺伝子の例としてはlipAなどが挙げられ、より具体的な例としては、それぞれ、枯草菌由来のnprE及びaprE遺伝子、枯草菌由来のamyE遺伝子、Bacillus sp. KSM-S237株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号公報）、大腸菌由来のlacZ遺伝子、大腸菌由来のGUS遺伝子、アスペルギル属不完全菌由来のリパーゼ遺伝子lipA及びAO60（特開２００２−１８６４８３号公報、特開２０１１−１６７１１７号公報）などが挙げられるが、ハロー形成により発現の有無を確認できる加水分解酵素をコードする遺伝子であればよく、上述の遺伝子に限定されない。

上記加水分解酵素によるハローの形成を肉眼で視認できる程度に明瞭にするためには、該加水分解酵素遺伝子をプロモーターと作動可能に連結して、該プロモーターの制御下で発現させることが好ましい。したがって、本発明で好適に使用される第１の加水分解酵素発現カセットとは、プロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結された第１の加水分解酵素遺伝子とを含むＤＮＡである。

上記第１の加水分解酵素発現カセットは、宿主微生物細胞のＤＮＡ中の第１の変異対象領域と置換されている。一実施形態において、上記第１の加水分解酵素遺伝子は、外来の加水分解酵素遺伝子を含む。別の実施形態において、上記第１の加水分解酵素遺伝子は、宿主微生物に生来的に存在する加水分解酵素遺伝子であってもよい。この場合、宿主微生物に生来的に存在する加水分解酵素遺伝子及びその制御領域が、第１の変異対象領域に相当する。あるいは、宿主ＤＮＡ中の該生来的に存在する加水分解酵素遺伝子の上流の制御領域を外来のプロモーター領域で置換することによって、プロモーター及び該プロモーターに作動可能に連結された加水分解酵素遺伝子を含む第１の加水分解酵素発現カセットが、第１の変異対象領域に配置される。

本発明の方法においては、上記宿主細胞はまた、第１の選択マーカーの発現能を有する。好ましい実施形態において、該宿主細胞は、第１の選択マーカー発現カセットが導入されることによって該第１の選択マーカーを発現する。好ましい実施形態において、該第１の選択マーカー発現カセットは、プロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子（Ｍ１）とを含むＤＮＡである。

上記第１の選択マーカー遺伝子（Ｍ１）の種類は、選択マーカー遺伝子として使用可能なものであれば特に限定されない。好ましい実施形態において、該第１の選択マーカー遺伝子は薬剤耐性遺伝子である。別の好ましい実施形態において、該第１の選択マーカー遺伝子は栄養要求性関連遺伝子である。

したがって、本発明の方法に用いられる宿主微生物の細胞は、上記第１の加水分解酵素発現カセットと、第１の選択マーカーとを共発現する細胞である。好ましくは、該宿主微生物細胞は、上記第１の選択マーカー発現カセットを細胞内に導入するとともに、そのＤＮＡ中の第１の変異対象領域を上記第１の加水分解酵素発現カセットで置換することによって調製される。

上記本発明の方法の工程（２）においては、上記工程（１）で調製された細胞を、第１の加水分解酵素の基質を含有する第１の選択マーカー保有株選択培地で培養する。該培地で増殖する細胞は、第１の選択マーカー発現能を有する細胞であり、この中には、第１の加水分解酵発現カセットを有する細胞と、第１の加水分解酵素発現カセットを有さない細胞とが含まれる。第１の加水分解酵素発現カセットを有する細胞は、第１の加水分解酵素を発現し、該酵素は培地中の基質を分解してハローを形成する。したがって、培地上の第１の加水分解酵素発現カセットを有する細胞のコロニー周辺にはハローが形成される。一方で、第１の加水分解酵素発現カセットを有さない細胞は、第１の加水分解酵素を発現しないためハローを形成しない。

したがって、上記培地上での細胞増殖とハロー形成を指標に、第１の加水分解酵素発現カセットを含有する目的の細胞を選択することができる（第１選択工程）。より詳細には、該培地上で増殖しかつハローを形成した細胞を、第１の加水分解酵素発現カセットで第１の変異対象領域が置換された目的の細胞として選択する。ハロー形成した細胞は、コロニー周辺のハローの相対的な大小により、目視によって容易に判定することができる。例えば、培地上に形成されたコロニーのうち、図１のように目視でハローの形成が明瞭に確認できるもの、好ましくは相対的により大きなハローを形成しているものを、目的の細胞として選択すればよい。あるいは、第１の加水分解酵素がβ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ又はリパーゼの場合、Ｘ−ｇａｌ、Ｘ−ＧＬＵＣ、ＢＡＬＢ等の試薬を添加した培地の発色を指標に目的の細胞を選択することもできる。

本発明に基づく上記第１選択工程の手順において、宿主細胞の第１の選択マーカー発現能が、第１の選択マーカー発現カセットの導入によって獲得された性質である場合、選択された細胞は、第１の加水分解酵素発現カセットと第１の選択マーカー発現カセットとの両方の導入に成功した細胞である。このような細胞は、遺伝子導入処理を行った細胞の中でも、遺伝子組換えが極めて生じやすい細胞であると判断される。すなわち、細胞に加水分解酵素発現カセットと選択マーカー発現カセットの両方の導入処理を行い、次いで上記手順に従って細胞増殖とハロー形成に基づいて細胞を選択することにより、遺伝子組換えが極めて生じやすい、組換え細胞の宿主として好適なコンピテント細胞を選択することができる。したがって、本発明に基づく上記手順は、コンピテント細胞を製造する方法に応用することができ、該応用は本発明の一態様として提供される。

上記本発明の方法の工程（３）においては、上記工程（２）（第１選択工程）にて細胞増殖とハロー形成に基づいて選択された細胞において、第１の加水分解酵素発現カセットを、第１の組換えカセットで置換する。上記第１の組換えカセットは、第１の目的ＤＮＡを含むＤＮＡであっても、目的ＤＮＡを含まないＤＮＡ（遺伝子欠失用断片）であってもよい。組換えカセットが目的ＤＮＡを含む場合、該細胞の第１の変異対象領域は、第１の目的ＤＮＡを含むＤＮＡで置換され、組換えカセットが目的ＤＮＡを含まない場合、細胞のＤＮＡから第１の変異対象領域が削除される。

上記第１の組換えカセット中の第１の目的ＤＮＡが目的遺伝子である場合、好ましくは、該目的遺伝子は、制御領域と作動可能に連結されている。言い換えると、該第１の組換えカセットは、制御領域及び該制御領域に作動可能に連結された第１の目的遺伝子を含有し得る。これにより、該組換えカセットを導入した組換え微生物で、該目的遺伝子を制御領域の制御下で発現させることができる。制御領域としては、転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチドが挙げられる。転写開始制御領域としては、プロモーター及び転写開始点が挙げられる。翻訳開始領域としては、リボソーム結合部位及び開始コドンが挙げられる。分泌シグナルペプチドは、目的遺伝子の発現産物の分泌の制御に関わる領域である。

あるいは、上記第１の目的遺伝子を、宿主内に生来的に存在する制御領域と作動可能に連結するように組換えカセットを第１の加水分解酵素発現カセットと置換することによって、該目的遺伝子を制御領域の制御下で発現させることができる。またあるいは、上記第１の目的遺伝子が、上記第１の加水分解酵素発現カセット中に含まれていたプロモーターと作動可能に連結するように組換えカセットを第１の加水分解酵素発現カセットと置換することによって、該目的遺伝子を制御領域の制御下で発現させることができる。

また、上記工程（３）においては、上記工程（２）（第１選択工程）で選択された細胞に対して、上記第１の組換えカセットの置換に加えて、第２の選択マーカーの発現能を付与する。この第２の選択マーカーは、上記第１選択マーカーとは異なる選択マーカーである。好ましい実施形態において、該細胞に第２の選択マーカー発現カセットを導入することによって、該細胞に第２の選択マーカー発現能を付与する。工程（３）において、第１の組換えカセットと第２の選択マーカー発現カセットを細胞に導入する順序は、それらが細胞内で共発現する限り、特に限定はない。

好ましい実施形態において、上記第２の選択マーカー発現カセットは、プロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子（Ｍ２）とを含むＤＮＡである。該第２の選択マーカー遺伝子（Ｍ２）の種類は、選択マーカー遺伝子として使用可能なものであれば特に限定されず、例えば、上記第１の選択マーカー遺伝子（Ｍ１）について例示した薬剤耐性遺伝子及び栄養要求性関連遺伝子が挙げられる。ただし、該第１の選択マーカー遺伝子（Ｍ１）と第２の選択マーカー遺伝子（Ｍ２）は、異なる遺伝子である。

好ましい実施形態において、上記本発明の方法の工程（３）はさらに、工程（２）で得られた細胞の第１の選択マーカーの発現能を欠失させることを含む。好ましくは、上記第２の選択マーカー発現カセットで該細胞中の第１の選択マーカー発現カセットを置換することによって、第１の選択マーカーの発現能を欠失させるとともに、該細胞に第２の選択マーカーの発現能を付与する。第１の選択マーカーを欠失させることにより、組換え細胞内への選択マーカー遺伝子の蓄積を防止することができる。

より好ましい実施形態において、上記第１の選択マーカー発現カセットは、プロモーター、第１の選択マーカー遺伝子（Ｍ１（ｒ））、及び不活性化された第２の選択マーカー遺伝子（Ｍ２（ｓ））を含むＤＮＡであり、かつ上記第２の選択マーカー発現カセットは、プロモーター、不活性化された第１の選択マーカー遺伝子（Ｍ１（ｓ））、及び第２の選択マーカー遺伝子（Ｍ２（ｒ））を含むＤＮＡである。上記カセット中、第１の選択マーカー遺伝子（Ｍ１（ｒ））、及び第２の選択マーカー遺伝子（Ｍ２（ｒ））は、それぞれ、該カセット中のプロモーターと作動可能に連結されている。

不活性化された第１及び第２の選択マーカー遺伝子Ｍ１（ｓ）及びＭ２（ｓ）としては、マーカーを発現しない改変を有するマーカー遺伝子、及びマーカー機能を喪失する改変を有するマーカー遺伝子が挙げられる。マーカーを発現しない改変としては、シャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列の改変、例えば、ＳＤ配列の欠失、及びＳＤ配列のアンチＳＤ配列への置換が挙げられる。マーカー機能を喪失する改変を有するマーカー遺伝子としては、所与の薬剤耐性遺伝子に点変異を生じさせて薬剤耐性を喪失させたものが挙げられる。

上記第１及び第２の選択マーカー発現カセットにおける第１の選択マーカー遺伝子と第２の選択マーカー遺伝子の配置の順序は特に限定されず、どちらが上流であってもよい。ただし、２つの遺伝子の配置の順序が第１の選択マーカー発現カセットと第２の選択マーカー発現カセットとで同じになるようにする。例えば、第１の選択マーカー発現カセットは、プロモーター、Ｍ１（ｒ）及びＭ２（ｓ）をこの順序で含むＤＮＡであり、かつ第２の選択マーカー発現カセットは、プロモーター、Ｍ１（ｓ）及びＭ２（ｒ）をこの順序で含むＤＮＡである。また例えば、第１の選択マーカー発現カセットは、プロモーター、Ｍ２（ｓ）及びＭ１（ｒ）をこの順序で含むＤＮＡであり、かつ第２の選択マーカー発現カセットは、プロモーター、Ｍ２（ｒ）及びＭ１（ｓ）をこの順序で含むＤＮＡである。第１及び第２の選択マーカー発現カセットを上記のような構成にすることにより、第１及び第２の選択マーカー発現カセットの間での置換が起こりやすくなるため、第１の選択マーカー発現カセットと第２の選択マーカー発現カセットとの交換が容易になる。

次いで、上記本発明の方法の工程（４）では、上記組換えカセットと第２の選択マーカーを導入した細胞を、第１の加水分解酵素の基質を含有する第２の選択マーカー保有株選択培地で培養する。該培地で増殖する細胞は、第２の選択マーカー発現能を有する細胞であり、この中には、第１の組換えカセットでの置換により第１の加水分解酵素発現カセットを失った細胞と、該置換が起こらず第１の加水分解酵素発現カセットを保持している細胞とが含まれる。第１の加水分解酵素発現カセットの代わりに第１の組換えカセットを有する細胞は、第１の加水分解酵素を発現しないので、該培地上にハローを形成しない。

したがって、上記培地上での細胞増殖とハロー形成しないことを指標に、第１の組換えカセットを含有する目的の細胞を選択することができる（第２選択工程）。より詳細には、該培地上で増殖するがハローを形成しない細胞を、第１の組換えカセットで第１の加水分解酵素発現カセットが置換された目的の細胞として選択する。例えば、培地上に形成されたコロニーのうち、明瞭なハローの形成が目視で確認できないものを目的の細胞として選択すればよい。あるいは、加水分解酵素がβ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ又はリパーゼの場合、Ｘ−ｇａｌ、Ｘ−ＧＬＵＣ、ＢＡＬＢ等の試薬を添加した培地の発色がないことを指標に目的の細胞を選択することができる。該第１の加水分解酵素発現カセットは、第１の変異対象領域に配置されていたものであるから、選択された細胞は、結果的に、第１の変異対象領域が第１の組換えカセットで置換された組換え細胞である。

以上の手順で、第１の変異対象領域が目的ＤＮＡで置換された、又は第１の変異対象領域が欠失した、目的の組換え微生物を製造することができる。

（２．２．さらなる組換え）
本発明の組換え微生物の製造方法の一実施形態においては、上記一次組換え操作に続いて、さらなる組換え操作を行ってもよい。該さらなる組換えでは、基本的には、上記一次組換えで得られた細胞に対して、一次組換えと同じ手順を繰り返す。より詳細には、該一次組換えで得られた細胞のＤＮＡ中の新たな変異対象領域を、加水分解酵素発現カセットで置換し、細胞増殖とハロー形成を指標に細胞を選択し、次いで、該加水分解酵素発現カセットを組換えカセットで置換し、ハロー形成のないことを指標に目的の組換え細胞を選択する。該さらなる組換えを１回以上繰り返すことによって、多重変異を有する組換え微生物が製造される。

好ましい実施形態において、本発明の組換え微生物の製造方法は、上記（１）〜（４）に続いて、さらに上記（１’）〜（４’）を１回以上繰り返す。
（１’）上記（４）で選択された細胞のＤＮＡ中のさらなる変異対象領域を、さらなる加水分解酵素発現カセットで置換し、かつ該細胞にさらなる選択マーカーの発現能を付与すること；
（２’）該細胞を、該さらなる加水分解酵素の基質を含有する該さらなる選択マーカー保有株選択培地で培養し、該培地上で増殖かつハローを形成した細胞を、該さらなる加水分解酵素発現カセットを含有する細胞として選択すること；
（３’）該（２’）で選択した細胞に、該さらなる選択マーカーとは別の選択マーカーの発現能を付与し、かつ該さらなる加水分解酵素発現カセットを、さらなる組換えカセットで置換すること；及び
（４’）該（３’）で調製した細胞を、該さらなる加水分解酵素の基質を含有する該別の選択マーカー保有株選択培地で培養し、該培地上でハローを形成せずに増殖する細胞を、該さらなる組換えカセットを含有する細胞として選択すること

上記工程（１’）において、さらなる加水分解酵発現カセットと置換されるさらなる変異対象領域は、上記第１の変異対象領域と同じ又は重複する領域であってもよいが、好ましくは上記第１の変異対象領域とは異なる領域である。上記さらなる加水分解酵素発現カセットは、さらなる加水分解酵素遺伝子を含むＤＮＡである。好ましくは、該さらなる加水分解酵素発現カセットは、プロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結されたさらなる加水分解酵素遺伝子とを含むＤＮＡである。

一実施形態において、上記さらなる加水分解酵素遺伝子は、外来の加水分解酵素遺伝子である。別の実施形態において、上記さらなる加水分解酵素遺伝子は、宿主微生物に生来的に存在する加水分解酵素遺伝子であってもよい。この場合、宿主微生物に生来的に存在する加水分解酵素遺伝子及びその制御領域が、さらなる変異対象領域に相当する。あるいは、宿主ＤＮＡ中の該生来的に存在する加水分解酵素遺伝子の上流の制御領域をプロモーター領域で置換することによって、プロモーター及び該プロモーターに作動可能に連結された加水分解酵素遺伝子を含むさらなる加水分解酵素発現カセットが、さらなる変異対象領域に配置される。

上記さらなる加水分解酵素遺伝子の例としては、上記で第１の加水分解酵素遺伝子について例示したものを挙げることができる。該第１及びさらなる加水分解酵素遺伝子は、同じ遺伝子であっても異なる遺伝子であってもよいが、好ましくは同じ遺伝子である。第１及びさらなる加水分解酵素遺伝子が同じ遺伝子であれば、一次組換え操作とさらなる組換え操作で用いる培地に同一の基質を使用することができる。好ましくは、該さらなる加水分解酵素発現カセットとしては、上記第１の加水分解酵素発現カセットが使用される。

また、上記工程（１’）においては、上記（４）で得られた細胞に対して、上記加水分解酵素発現カセットによるさらなる変異対象領域の置換に加えて、さらなる選択マーカーの発現能を付与する。該さらなる選択マーカーは、上記第２選択マーカーとは異なる選択マーカーであり、好ましくは上記第１選択マーカーである。あるいは、該さらなる選択マーカーは、上記第１及び第２選択マーカーのいずれとも異なる選択マーカーであり得る。好ましい実施形態においては、該細胞にさらなる選択マーカー発現カセットを導入することによって、該細胞にさらなる選択マーカーの発現能を付与する。工程（１’）において、加水分解酵素発現カセットと選択マーカー発現カセットを細胞に導入する順序は、それらが細胞内で共発現する限り、特に限定はない。

好ましい実施形態において、上記さらなる選択マーカー発現カセットは、プロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結されたさらなる選択マーカー遺伝子（Ｍ３）とを含むＤＮＡである。該さらなる選択マーカー遺伝子（Ｍ３）の種類は、選択マーカー遺伝子として使用可能なものであれば特に限定されず、例えば、上記第１及び第２の選択マーカー遺伝子（Ｍ１及びＭ２）について例示した薬剤耐性遺伝子及び栄養要求性関連遺伝子が挙げられる。ただし、該さらなる選択マーカー遺伝子（Ｍ３）は、該第２の選択マーカー遺伝子（Ｍ２）とは異なる遺伝子であり、一方、該第１の選択マーカー遺伝子（Ｍ１）とは同じ遺伝子であっても異なる遺伝子であってもよい。好ましくは、該さらなる選択マーカー遺伝子（Ｍ３）は、上記第１の選択マーカー遺伝子（Ｍ１）と同じ遺伝子である。

好ましい実施形態において、上記さらなる選択マーカー発現カセットは、上記第１又は第２選択マーカー発現カセットと置換される。別の好ましい実施形態において、上記さらなる選択マーカー発現カセットは、上記第１及び第２選択マーカー発現カセットと置換される。なお別の実施形態において、上記さらなる選択マーカー発現カセットは、宿主ＤＮＡの上記第１又は第２選択マーカー発現カセットとは異なる領域に配置される。

上記工程（２’）においては、上記（２）と同様の手順に従って、工程（１’）で得られた細胞を、さらなる加水分解酵素の基質を含有するさらなる選択マーカー保有株選択培地で培養し、該培地上での細胞増殖とハロー形成を指標に、さらなる加水分解酵素発現カセットを含有する目的の細胞を選択する。より詳細には、該培地上で増殖しかつハローを形成した細胞を、さらなる加水分解酵素発現カセットでさらなる変異対象領域が置換された目的の細胞として選択する。あるいは、加水分解酵素がβ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ又はリパーゼの場合、Ｘ−ｇａｌ、Ｘ−ＧＬＵＣ、ＢＡＬＢ等の試薬を添加した培地の発色を指標に目的の細胞を選択することもできる。

上記工程（３’）においては、上記（３）と同様の手順に従って、上記工程（２’）で選択された細胞において、上記さらなる加水分解酵素発現カセットを、さらなる組換えカセットで置換する。該さらなる組換えカセットは、目的ＤＮＡを含むＤＮＡであっても、目的ＤＮＡを含まないＤＮＡ（遺伝子欠失用断片）であってもよい。該さらなる組換えカセット中の目的ＤＮＡは、上記第１の目的ＤＮＡと同じものであっても、異なるものであってもよい。該目的ＤＮＡが目的遺伝子である場合、該目的遺伝子は、制御領域と作動可能に連結されていてもよい。あるいは、該目的遺伝子を宿主内に生来的に存在する制御領域と作動可能に連結するように、該さらなる組換えカセットで該加水分解酵素発現カセットを置換してもよい。またあるいは、該目的遺伝子が、該さらなる加水分解酵素発現カセット中に含まれていたプロモーターと作動可能に連結するように、該さらなる組換えカセットで該加水分解酵素発現カセットを置換してもよい。該制御領域の種類は上述したとおりである。

また、上記工程（３’）においては、上記工程（２’）で選択された細胞に対して、上記さらなる組換えカセットの置換に加えて、さらに別の選択マーカーの発現能を付与する。この別の選択マーカーは、上記さらなる選択マーカーとは異なる選択マーカーであり、好ましくは上記第２選択マーカーである。好ましい実施形態においては、該細胞に別の選択マーカー発現カセットを導入することによって、該細胞に該別の選択マーカーの発現能を付与する。工程（３）において、上記さらなる組換えカセットと上記別の選択マーカー発現カセットを細胞に導入する順序は、それらが細胞内で共発現する限り、特に限定はない。

上記別の選択マーカー発現カセットは、プロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結された該別の選択マーカー遺伝子（Ｍ４）とを含むＤＮＡである。該別の選択マーカー遺伝子（Ｍ４）の種類は、選択マーカー遺伝子として使用可能なものであれば特に限定されず、例えば、上記第１及び第２の選択マーカー遺伝子（Ｍ１及びＭ２）について例示した薬剤耐性遺伝子及び栄養要求性関連遺伝子が挙げられる。ただし、該別の選択マーカー遺伝子（Ｍ４）は、該さらなる選択マーカー遺伝子（Ｍ３）とは異なる遺伝子である。好ましくは、該別の選択マーカー遺伝子（Ｍ４）は、上記第２の選択マーカー遺伝子（Ｍ２）と同じ遺伝子である。

好ましい実施形態において、上記工程（３’）では、工程（２’）で得られた細胞のさらなる選択マーカーの発現能を欠失させる。好ましくは、上記別の選択マーカー発現カセットで該細胞のＤＮＡ中のさらなる選択マーカー発現カセットを置換することによって、さらなる選択マーカーの発現能を欠失させるとともに、該細胞に別の選択マーカーの発現能を付与する。これにより、組換え細胞内への選択マーカー遺伝子の蓄積を防止することができる。

好ましい実施形態において、上記さらなる選択マーカー発現カセットは、プロモーター、第１の選択マーカー遺伝子（Ｍ１（ｒ））、及び不活性化された第２の選択マーカー遺伝子（Ｍ２（ｓ））を含むＤＮＡであり、かつ上記別の選択マーカー発現カセットは、プロモーター、不活性化された第１の選択マーカー遺伝子（Ｍ１（ｓ））、及び第２の選択マーカー遺伝子（Ｍ２（ｒ））を含むＤＮＡである。より好ましい実施形態において、上記さらなる選択マーカー発現カセットは、上記（２．１）で述べたプロモーター、Ｍ１（ｒ）及びＭ２（ｓ）を含む第１の選択マーカー発現カセットであり、上記別の選択マーカー発現カセットは、上記（２．１）で述べたプロモーター、Ｍ１（ｓ）及びＭ２（ｒ）を含む第２の選択マーカー発現カセットである。したがって、本発明の方法のより好ましい実施形態においては、一次組換え操作及びさらなる組換え操作を通して、細胞のＤＮＡ上に活性な第１の選択マーカー遺伝子と不活性な第２の選択マーカー遺伝子とのペアを含む領域、及び不活性な第１の選択マーカー遺伝子と活性な第２の選択マーカー遺伝子とのペアを含む領域が相互交換的に構築されて、第１の選択マーカー遺伝子と第２の選択マーカー遺伝子とが相互交換的に繰り返し発現され、該発現を指標に細胞が選択される（図２参照）。

次いで、上記工程（４’）においては、上記（４）と同様の手順に従って、工程（３’）で得られた細胞を、さらなる加水分解酵素の基質を含有する別の選択マーカー保有株選択培地で培養し、該培地上で細胞増殖とハロー形成しないことを指標に、さらなる組換えカセットを含有する目的の細胞を選択する。より詳細には、該培地上で増殖するがハローを形成しない細胞を、さらなる組換えカセットでさらなる加水分解酵素発現カセットが置換された目的の細胞として選択する。あるいは、加水分解酵素がβ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ又はリパーゼの場合、Ｘ−ｇａｌ、Ｘ−ＧＬＵＣ、ＢＡＬＢ等の試薬を添加した培地の発色がないことを指標に目的の細胞を選択することもできる。選択された細胞は、第１の変異対象領域が第１の組換えカセットで置換され、かつさらなる変異対象領域がさらなる組換えカセットで置換された、二重組換え細胞である。

さらに、上記工程（４’）で得られた細胞に対して再び上記（１’）〜（４’）を繰り返すことによって、ＤＮＡ上の複数の変異対象領域が、それぞれ任意の目的ＤＮＡで置換されているか又は欠失した組換え微生物を製造することができる。本発明の組換え微生物の製造方法においては、上記さらなる組換え操作を行う回数に特に制限はなく、１回又はそれ以上であればよく、あるいは行わなくともよい。したがって、本発明の組換え微生物の製造方法によれば、１個の遺伝子が置換又は欠失した組換え微生物、あるいは２個又はそれ以上の遺伝子が置換又は欠失した多重変異を有する組換え微生物を製造することができる。

（２．３．選択マーカー遺伝子の削除）
好ましい実施形態において、本発明の組換え微生物の製造方法は、上記一次又はさらなる組換え操作で得られた組換え微生物から、細胞の選択に用いた選択マーカー遺伝子を削除することをさらに包含する。本実施形態においては、一次組換え操作において、第１の選択マーカー発現カセットは、宿主微生物ＤＮＡ中の、該宿主の形質発現に関わる領域と置換される。該形質と第１の選択マーカーの発現とを指標に、所望の位置に選択マーカーが導入された細胞を選択することができる。すなわち、該形質の発現がなく、かつ第１の選択マーカーが発現している細胞は、第１の選択マーカー発現カセットが該形質発現に関わる領域と置換された細胞である。本実施形態においては、細胞中の選択マーカー発現カセットは、後から導入される選択マーカー発現カセットと置換されて欠失する。したがって、最終的に得られた組換え細胞に残存する選択マーカー発現カセットは、工程（４）においては第２選択マーカー発現カセットであり、工程（４’）においては別の選択マーカー発現カセットである。次いで、上記組換え細胞に残存する選択マーカー発現カセットを、最初に第１の選択マーカー発現カセットで置き換えた形質発現に関わる領域で置換し、該形質と選択マーカーの発現とを指標に、選択マーカーが削除された細胞を選択することができる。該形質が発現している細胞は、細胞の選択に用いた選択マーカー遺伝子の残存のない組換え微生物である。

上記形質発現に関わる領域としては、宿主細胞の生育必須遺伝子でなく、かつその欠失が通常の計測手段で容易に確認できる遺伝子の領域が挙げられる。例えば、該形質発現に関わる領域は、宿主が生来的に有している選択マーカー遺伝子、例えば、薬剤耐性遺伝子又は栄養要求性関連遺伝子（アミノ酸生合成経路関連遺伝子など）（ただし上記第１の選択マーカー遺伝子とは異なる）の領域が挙げられる。

したがって、本発明の方法の好ましい実施形態においては、工程（１）の前に、予め、宿主細胞の形質発現に関わる領域を第１選択マーカー発現カセットで置換し、該形質の発現がなく、かつ第１の選択マーカーが発現している細胞を選択する。次いで、該細胞の第１の変異対象領域を第１の加水分解酵素発現カセットで置換して、宿主細胞を調製する（工程（１））。調製した細胞を用いて、上記工程（２）〜（４）又はさらに、工程（１’）〜（４’）を行う。好ましくは、これらの工程では、第１選択マーカー発現カセットと第２の選択マーカー発現カセットとを相互交換的に使用する。その後、得られた組換え細胞中に残存する選択マーカー発現カセットを、該形質発現に関わる領域で置換し、次いで該形質を発現する細胞を選択する（図３参照）。これにより、所望の遺伝子改変を有し、かつ選択マーカー遺伝子の残存のない組換え微生物を獲得することができる。

（２−４．遺伝子改変手順及びプロモーター）
本発明の組換え微生物の製造方法において、ＤＮＡ断片の調製及びＤＮＡ領域の置換は、当該分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、各種加水分解酵素発現カセット、選択マーカー発現カセット、及び組換えカセットは、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（例えば、Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１−６８）などの方法に従って構築することができる。より具体的には各カセット構築に必要な遺伝子、プロモーターなどのＤＮＡ断片を常法のＰＣＲ法等を用いて調製した後、各ＤＮＡ断片をＳＯＥ−ＰＣＲ法を用いて所望する順に連結することにより、各カセットを構築することができる。各カセットと細胞内ＤＮＡ領域との置換は、相同組換え法などの通常行われる方法に従って行うことができる。カセットの細胞内への導入には、一般的な形質転換法、例えばエレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクル・ガン法、アグロバクテリウム法等を用いることができる。例えば、上流から、宿主の変異対象領域の５’側領域、プロモーター、加水分解酵素遺伝子、及び該変異対象領域の３’側領域の順で連結されたＤＮＡ断片をＳＯＥ−ＰＣＲ法によって構築し、これを加水分解酵素発現カセットとして宿主細胞内に導入すれば、相同組換えによって宿主ＤＮＡの変異対象領域と置換される。選択マーカー発現カセット及び組換えカセットについても同様である。

本発明の方法の各組換え工程においては、加水分解酵素遺伝子による形質転換と選択マーカー遺伝子による形質転換がそれぞれ独立して起こるように、選択マーカー遺伝子は、加水分解酵素遺伝子と置換される領域（すなわち変異対象領域）とは近接又は連鎖していないＤＮＡ領域と置換することが好ましい。

本発明の方法に用いる上記第１及びさらなる加水分解酵素発現カセット、上記第１及び第２選択マーカー発現カセット、上記さらなる選択マーカー発現カセット、並びに上記別の選択マーカー発現カセットに含まれ得るプロモーターとしては、宿主微生物で機能する高発現プロモーターが好ましい。高発現プロモーターの例として、宿主微生物の対数増殖期に発現するプロモーターが挙げられ、好ましい例としては、ｒＲＮＡオペロンプロモーター、例えばPrrnO、PrrnA、PrrnB、PrrnD、PrrnE、PrrnI、PrrnJなどが挙げられる。より好ましい例としては、バチルス属細菌由来の、PrrnO、PrrnA、PrrnB、PrrnD、PrrnE、PrrnI、PrrnJなどが挙げられる。上記加水分解酵素発現カセット及び上記選択マーカー発現カセットに含まれ得るプロモーターは、互いに同じプロモーターであっても、異なるプロモーターであってもよい。

（３．目的物質の生産方法）
さらなる一態様において、本発明は、上記本発明の組換え微生物を培養する工程を含む目的物質の生産方法を提供する。本発明の目的物質の生産方法においては、該目的物質をコードする遺伝子又は該目的物質の生合成を促進する遺伝子を組み込まれた本発明の組換え微生物を、同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の培養法にて培養する。培養されている細胞では該目的遺伝子が発現し、目的物質が生産される。次いで、該目的物質を培養物から回収又は精製すればよい。

本発明の組換え微生物の培養に使用される培地の組成及び培養条件、ならびに目的物質の回収及び精製等の手順については、使用する組換え微生物の種、目的物質の種類等にしたがって、当業者が適宜選択することができる。

当該方法で製造する目的物質としては、上述した本発明の組換え微生物に含まれる目的遺伝子にコードされる物質、又は該目的遺伝子の発現に伴って生合成が促進される物質（例えば、目的遺伝子にコードされる酵素によって生合成される物質）であれば特に限定されない。該目的遺伝子は、該組換え微生物の宿主が生来的に有する遺伝子であっても、異種遺伝子であってもよい。

本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、あるいは方法をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。

〔１〕組換え微生物の製造方法であって、
（１）第１の加水分解酵素発現カセットと第１の選択マーカーとを共発現する宿主微生物の細胞を調製すること、
ここで、
該第１の加水分解酵素発現カセットは、プロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結された第１の加水分解酵素遺伝子とを含むＤＮＡであり、かつ
該第１の加水分解酵素発現カセットは、該細胞のＤＮＡ中の第１の変異対象領域と置換されている；
（２）該（２）で選択した細胞を、該第１の加水分解酵素の基質を含有する該第１の選択マーカー保有株選択培地で培養し、該培地上で増殖かつハローを形成した細胞を、該第１の加水分解酵素発現カセットを含有する細胞として選択すること；
（３）該細胞に第２の選択マーカーの発現能を付与し、かつ該第１の加水分解酵素発現カセットを第１の組換えカセットで置換すること；及び、
（４）該（３）で調製した細胞を、該第１の加水分解酵素の基質を含有する該第２の選択マーカー保有株選択培地で培養し、該培地上でハローを形成せずに増殖する細胞を、該第１の組換えカセットを含有する細胞として選択すること、
を包含する、方法。

〔２〕好ましくは、上記第１の選択マーカーを発現する細胞が、第１の選択マーカー発現カセットを導入された細胞であり、該第１の選択マーカー発現カセットが、プロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子とを含むＤＮＡである、〔１〕記載の方法。

〔３〕好ましくは、上記細胞への上記第２の選択マーカーの発現能の付与が、該細胞への第２の選択マーカー発現カセットの導入であり、該第２の選択マーカー発現カセットが、プロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子とを含むＤＮＡである、〔１〕又は〔２〕記載の方法。

〔４〕好ましくは、上記（３）において、上記細胞の上記第１の選択マーカーの発現能を欠失させることをさらに含む、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の方法。

〔５〕好ましくは、上記第１の選択マーカーの発現能の欠失が、上記第２の選択マーカー発現カセットによる上記第１の選択マーカー発現カセットの置換である、〔４〕記載の方法。

〔６〕好ましくは、上記第１の選択マーカー発現カセットが、プロモーター、上記第１の選択マーカー遺伝子、及び不活性化された上記第２の選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡであり、かつ上記第２の選択マーカー発現カセットが、プロモーター、不活性化された上記第１の選択マーカー遺伝子、及び上記第２の選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡである、
〔５〕記載の方法。

〔７〕好ましくは、上記不活性化された第１の選択マーカー遺伝子及び上記不活性化された第２の選択マーカー遺伝子が、該マーカーを発現しないか、又は該マーカー機能を喪失する改変を有する遺伝子である、〔６〕記載の方法。

〔８〕好ましくは、上記第１の加水分解酵素発現カセットに含まれるプロモーター、上記第１の選択マーカー発現カセットに含まれるプロモーター、及び上記第２の選択マーカー発現カセットに含まれるプロモーターが、同一又は別々の、上記宿主微生物の対数増殖期に発現するプロモーターである、〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載の方法。

〔９〕上記第１の加水分解酵素遺伝子が、
好ましくは、プロテアーゼ遺伝子、アミラーゼ遺伝子、セルラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子及びリパーゼ遺伝子からなる群より選択され、
より好ましくは、プロテアーゼ遺伝子、アミラーゼ遺伝子、セルラーゼ遺伝子及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子からなる群より選択される、
〔１〕〜〔８〕のいずれか１項記載の方法。

〔１０〕上記第１の組換えカセットが、
好ましくは、目的遺伝子、プロモーター、ターミネーター及び転写調節領域からなる群より選択される１種以上を含むＤＮＡであり、
より好ましくは、制御領域と作動可能に連結されている該目的遺伝子を含むＤＮＡであり、
かつ、該目的遺伝子は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、又はノンコーディングＲＮＡをコードするＤＮＡである、
〔１〕〜〔９〕のいずれか１項記載の方法。

〔１１〕好ましくは、上記第１の組換えカセットが遺伝子欠失用断片である、〔１〕〜〔９〕のいずれか１項記載の方法。

〔１２〕好ましくは、上記宿主微生物がバチルス属菌である、〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項記載の方法。

〔１３〕好ましくは、上記バチルス属菌が枯草菌又はその変異株である、〔１２〕記載の方法。

〔１４〕好ましくは、さらに以下の（１’）〜（４’）を１回以上繰り返す、〔１〕〜〔１３〕のいずれか１項記載の方法：
（１’）上記（４）又は下記（４’）で選択された細胞のＤＮＡ中のさらなる変異対象領域を、さらなる加水分解酵素発現カセットで置換し、かつ該細胞にさらなる選択マーカーの発現能を付与すること、
ここで、該さらなる加水分解酵素発現カセットは、プロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結されたさらなる加水分解酵素遺伝子とを含むＤＮＡである；
（２’）該細胞を、該さらなる加水分解酵素の基質を含有する該さらなる選択マーカー保有株選択培地で培養し、該培地上で増殖かつハローを形成した細胞を、該さらなる加水分解酵素発現カセットを含有する細胞として選択すること；
（３’）該（２’）で選択した細胞に、該さらなる選択マーカーとは別の選択マーカーの発現能を付与し、かつ該さらなる加水分解酵素発現カセットを、さらなる組換えカセットで置換すること；及び
（４’）該（３’）で調製した細胞を、該さらなる加水分解酵素の基質を含有する該別の選択マーカー保有株選択培地で培養し、該培地上でハローを形成せずに増殖する細胞を、該さらなる組換えカセットを含有する細胞として選択すること。

〔１５〕好ましくは、上記細胞への上記さらなる選択マーカーの発現能の付与が、該細胞へのさらなる選択マーカー発現カセットの導入であり、該さらなる選択マーカー発現カセットが、プロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結されたさらなる選択マーカー遺伝子とを含むＤＮＡである、〔１４〕記載の方法。

〔１６〕好ましくは、上記細胞への上記別の選択マーカーの発現能の付与が、該細胞への別の選択マーカー発現カセットの導入であり、該別の選択マーカー発現カセットが、プロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結された別の選択マーカー遺伝子とを含むＤＮＡである、〔１４〕又は〔１５〕記載の方法。

〔１７〕好ましくは、上記（３’）において、上記細胞の上記さらなる選択マーカーの発現能を欠失させることをさらに含む、〔１４〕〜〔１６〕のいずれか１項記載の方法。

〔１８〕好ましくは、上記さらなる選択マーカーの発現能の欠失が、上記別の選択マーカー発現カセットによる上記さらなる選択マーカー発現カセットの置換である、〔１７〕記載の方法。

〔１９〕好ましくは、上記さらなる選択マーカー発現カセットが上記第１選択マーカー発現カセットであり、上記別の選択マーカー発現カセットが上記第２選択マーカー発現カセットである、〔１８〕記載の方法。

〔２０〕好ましくは、上記さらなる選択マーカー発現カセットが、プロモーター、上記第１の選択マーカー遺伝子、及び不活性化された上記第２の選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡであり、かつ上記別の選択マーカー発現カセットが、プロモーター、不活性化された上記第１の選択マーカー遺伝子、及び上記第２の選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡであり、
より好ましくは、上記さらなる選択マーカー発現カセットが、上記〔６〕記載の第１の選択マーカー発現カセットであり、かつ上記別の選択マーカー発現カセットが、上記〔６〕記載の第２の選択マーカー発現カセットである、
〔１９〕記載の方法。

〔２１〕好ましくは、上記さらなる加水分解酵素発現カセットに含まれるプロモーター、上記さらなる選択マーカー発現カセットに含まれるプロモーター、及び上記別の選択マーカー発現カセットに含まれるプロモーターが、同一又は別々の、上記宿主微生物の対数増殖期に発現するプロモーターである、〔１４〕〜〔２０〕のいずれか１項記載の方法。

〔２２〕上記さらなる加水分解酵素遺伝子が、
好ましくは、プロテアーゼ遺伝子、アミラーゼ遺伝子、セルラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子及びリパーゼ遺伝子からなる群より選択され、
より好ましくは、プロテアーゼ遺伝子、アミラーゼ遺伝子、セルラーゼ遺伝子及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子からなる群より選択される、
〔１４〕〜〔２１〕のいずれか１項記載の方法。

〔２３〕好ましくは、上記第１加水分解酵素遺伝子と上記さらなる加水分解酵素遺伝子が同じ遺伝子である、〔２２〕記載の方法。

〔２４〕上記さらなる組換えカセットが、
好ましくは、目的遺伝子、プロモーター、ターミネーター、又は転写調節領域を含むＤＮＡであり、
より好ましくは、制御領域と作動可能に連結されている該目的遺伝子を含むＤＮＡであり、
かつ、該目的遺伝子は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、又はノンコーディングＲＮＡをコードするＤＮＡである、
〔１４〕〜〔２３〕のいずれか１項記載の方法。

〔２５〕好ましくは、上記さらなる組換えカセットが遺伝子欠失用断片である、〔１４〕〜〔２３〕のいずれか１項記載の方法。

〔２６〕好ましくは、上記（４）で選択された細胞に含まれる選択マーカー発現カセットを削除することをさらに含む、〔１〕〜〔１３〕のいずれか１項記載の方法。

〔２７〕好ましくは、上記（４’）で選択された細胞に含まれる選択マーカー発現カセットを削除することをさらに含む、〔１４〕〜〔２５〕のいずれか１項記載の方法。

〔２８〕上記〔２６〕記載の方法であって、好ましくは、
上記第１の選択マーカー発現カセットが、上記宿主微生物のＤＮＡ中の形質発現に関わる領域に置換されており、かつ
上記選択マーカー発現カセットの削除が、上記（４）で選択された細胞に含まれる選択マーカー発現カセットを、該形質発現に関わる領域で置換することである、
方法。

〔２９〕上記〔２７〕記載の方法であって、好ましくは、
上記第１の選択マーカー発現カセットが、上記宿主微生物のＤＮＡ中の形質発現に関わる領域に置換されており、かつ
上記選択マーカー発現カセットの削除が、上記（４’）で選択された細胞に含まれる選択マーカー発現カセットを、該形質発現に関わる領域で置換することである、
方法。

〔３０〕好ましくは、上記形質発現に関わる領域が栄養要求性遺伝子領域である、〔２８〕又は〔２９〕記載の方法。

〔３１〕好ましくは、上記第１の選択マーカーの遺伝子及び第２の選択マーカーの遺伝子が異なる遺伝子であり、かつ各々が薬剤耐性遺伝子又は栄養要求性関連遺伝子である、〔１〕〜〔３０〕のいずれか１項記載の方法。

〔３２〕組換え微生物の宿主細胞の製造方法であって、
微生物細胞に、プロモーターに作動可能に連結された加水分解酵素遺伝子を含むＤＮＡを導入するか、又はプロモーターを導入して該細胞中の加水分解酵素遺伝子と作動可能に連結させること、及び選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡを導入すること；ならびに
該細胞を、該加水分解酵素の基質を含有する該選択マーカー保有株選択培地で培養し、該培地上で増殖かつハローを形成した細胞を選択すること、
を包含する、方法。

〔３３〕上記加水分解酵素遺伝子が、
好ましくは、プロテアーゼ遺伝子、アミラーゼ遺伝子、セルラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子及びリパーゼ遺伝子からなる群より選択され、
より好ましくは、プロテアーゼ遺伝子、アミラーゼ遺伝子、セルラーゼ遺伝子及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子からなる群より選択される、
〔３２〕記載の方法。

〔３４〕好ましくは、上記選択マーカー遺伝子が、薬剤耐性遺伝子又は栄養要求性関連遺伝子である、〔３２〕又は〔３３〕記載の方法。

〔３５〕上記微生物が、好ましくはバチルス属菌であり、より好ましくは枯草菌又はその変異株である、〔３２〕〜〔３４〕のいずれか１項記載の方法。

以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。

本実施例で使用したプライマーを下記表１に示す。

参考例１ RIK1141（trpB'A'::PrrnOcatpt1 erm190 hisC101）の構築
枯草菌株RIK1140（trpB'A'::PrrnOcatpt1 erm hisC101）（特開２０１３−９６０４号公報）から抽出したＤＮＡを用いて、枯草菌株RIK211（trpB'A'::PrrnOkan erm190(oc) hisC101、Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2977-2982）の形質転換を行い、クロラムフェニコール耐性かつエリスロマイシン感受性を示す形質転換体RIK1141を作製した。hisC101は、hisC遺伝子内におけるQ318amber変異を表し、この変異はヒスチジン要求性を示す。またhisC101は、trpC2変異（トリプトファン要求性）と連鎖している。したがって、RIK1141は、トリプトファン要求性及びヒスチジン要求性を示す株である。

参考例２ PCR DNAI断片（trpB'A'::PrrnO-catΔSD erm190）の構築
RIK1140株（trpB'A'::PrrnOcatpt1 erm hisC101）から抽出したＤＮＡを鋳型に、cat遺伝子のＳＤ配列を欠失するように設計したcarΔSD1(ggagg)FプライマーとEm.rプライマーを用いたＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片を作製した。得られたＤＮＡ断片をRIK1141（参考例１）に形質転換し、クロラムフェニコール感受性かつエリスロマイシン耐性の形質転換体RIK1143（trpB'A'::PrrnOcatpt1ΔSD erm hisC101）を取得した。
次に、RIK202（trpB'A'erm190）（Nanamiya et al. (2010) Microbiology 156:2944-2952）のＤＮＡを鋳型として、エリスロマイシン耐性遺伝子からヒスチジン遺伝子までの領域を含むＤＮＡ断片を、empt1.fプライマーとhisC-R2プライマーを用いたＰＣＲにより作製した。該ＤＮＡ断片をRIK1143に形質転換し、エリスロマイシン感受性かつヒスチジン非要求性を示す形質転換体RIK1136（trpB'A'::PrrnO-catΔSD erm190）を取得した。
RIK1136から抽出したＤＮＡを鋳型に、trpD-FプライマーとhisC-R2プライマーを用いたＰＣＲによりＤＮＡ断片 PCR DNAI（trpB'A'::PrrnO-catΔSD erm190）を作製した。

参考例３ コンピテントセルの作製
菌株に応じてトリプトファン（２０μｇ/ｍＬ）又はヒスチジン（５０μｇ/ｍＬ）を含むＣＩ培地（０．２０質量％硫酸アンモニウム、１．４０質量％リン酸水素二カリウム、０．６０質量％リン酸二水素カリウム、０．１０質量％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０質量％グルコース、０．０３質量％アミケース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、５ｍＭ塩化マグネシウム）にて、菌株を３７℃で生育度（ＯＤ６００）の値が１程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部（０．５ｍＬ）を分取し、遠心分離にて菌体のみを回収後、１ｍＬのＣＩＩ培地（０．２０質量％硫酸アンモニウム、１．４０質量％リン酸水素二カリウム、０．６０質量％リン酸二水素カリウム、０．１０質量％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０質量％グルコース、０．０１５質量％アミケース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、５ｍＭ塩化マグネシウム、５μｇ／ｍＬトリプトファン）に菌体を再懸濁することで、枯草菌株のコンピテントセル懸濁液を調製した。

参考例４ 枯草菌の形質転換
調製したコンピテントセル懸濁液１００μＬに、得られたＤＮＡ断片を添加し、３７℃で９０分間振盪培養後、１００μＬのＬＢ液体培地（１質量％トリプトン、０．５０質量％酵母エキス、０．５０質量％ＮａＣｌ）を加え、３７℃で１時間振盪培養した。その後、各形質転換体に応じて、クロラムフェニコール（５μｇ/ｍＬ）、エリスロマイシン（０．５μｇ/ｍＬ）、スキムミルク（１．５％）、及びコーンスターチ（１．５％）から選ばれる１種以上を含むＬＢ寒天培地（１質量％トリプトン、０．５０質量％酵母エキス、０．５０質量％ＮａＣｌ、１．５質量％寒天）に培養液１０μＬ又は１００μＬを塗沫した。３７℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。

参考例５ 枯草菌の最少寒天培地を用いた形質転換
調製したコンピテントセル懸濁液１００μＬに、得られたＤＮＡ断片を添加し、３７℃で９０分間振盪培養した。その後、各形質転換体に応じて、トリプトファン（２０μｇ/ｍＬ）又はヒスチジン（５０μｇ/ｍＬ）を含む最少寒天培地（０．２０質量％硫酸アンモニウム、１．４０質量％リン酸水素二カリウム、０．６０質量％リン酸二水素カリウム、０．１０質量％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．０３質量％アミケース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、０．０５質量％グルコース、１ｍＭ塩化マグネシウム）に培養液５μＬ又は１０μＬを塗沫した。３７℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。

実施例１ プロテアーゼ（nprE）ハローによる形質転換体の選択（１）RIK7001（nprE::PrrnO-nprE trpB'A'::PrrnO-catSD10 erm his101）の構築
RIK1141（参考例１）のプロテアーゼ遺伝子nprEのプロモーターを、rrnOプロモーター（PrrnO）と置換した。nprE遺伝子プロモーターの上流領域及び下流領域の断片を、RIK1141のＤＮＡを鋳型として、P-nprE-upFプライマーとP-nprE-upRプライマー、及びP-nprE-downFプライマーとP-nprE-downRプライマーを用いたＰＣＲにて作製した。PrrnO断片は、RIK1141を鋳型として、rrnO-upFプライマーとPrrnO-catsd-Rプライマーを用いて作製した。得られた３断片から、P-nprE-upFプライマーとP-nprE-downRプライマーを用いたＰＣＲにより、ＤＮＡ断片[nprE::PrrnO-nprE]を作成した。
次に、RIK1215（ΔrrnHG1ΔrrnW2ΔrrnO1ΔrrnD1ΔrrnB2ΔrrnA1ΔrrnI2 rrnEanti-SD10 (GGAGG)trpB'A'::PrrnOcatpt1SD10 (CCTCC) erm hisC101）（特開２０１３−９６０４号公報）のＤＮＡを鋳型として、trpD-FプライマーとhisC-R2プライマーを用いて、ＤＮＡ断片[trpB'A'::PrrnO-catSD10 erm his101]を作製した。
上記[nprE::PrrnO-nprE]断片と[trpB'A'::PrrnO-catSD10 erm his101]断片をRIK1141株に形質転換した後、細胞をエリスロマイシン及びスキムミルクを含有するＬＢプレートで培養し、エリスロマイシン耐性（増殖（＋））かつ培地上にハローを形成した（ハロー（＋））細胞を選択した。得られた形質転換体をRIK7001として取得した。

（２）RIK7011（nprE::rrnOantiSD10 trpB'A'::PrrnO-catSD10 erm hisC101）の構築
nprE遺伝子プロモーターの下流領域断片を、（１）で作製したRIK7001のＤＮＡを鋳型として、P-nprE-down-F0-ver2プライマーとP-nprE-downR2プライマーを用いたＰＣＲにて作製した。改変アンチＳＤ（anti-SD10）配列を有するrrnOのＤＮＡ断片（rrnOantiSD10）を、RIK1226（ΔrrnHG1ΔrrnW2ΔrrnE1ΔrrnD1ΔrrnB2ΔrrnA1ΔrrnI2 rrnOanti-SD10 (GGAGG)trpB'A'::PrrnOcatpt1SD10 (CCTCC) erm hisC101）（特開２０１３−９６０４号公報）のＤＮＡを鋳型として、rrnO-upFプライマーとrrnO-5R-4プライマーを用いたＰＣＲにて作製した。次いで、（１）で作製したnprE遺伝子プロモーターの上流領域断片、上記下流領域断片、及びrrnOantiSD10断片を、P-nprE-upFプライマーとP-nprE-downR2プライマーを用いたＰＣＲにて連結し、[nprE::rrnOantiSD10]断片を作製した。
次に、RIK7001のnprE遺伝子領域内に目的遺伝子（rrnOantiSD10）を導入するため、作製した[nprE::rrnOantiSD10]断片をRIK7001株に形質転換した。細胞をクロラムフェニコール及びスキムミルクを含有するＬＢプレートで培養し、クロラムフェニコール耐性（増殖（＋））かつ培地上にハローを形成しない（ハロー（−））細胞を選択した。シークエンシングにより、選択された細胞がrrnOantiSD10配列を有することを確認した。得られた形質転換体をRIK7011として取得した。

実施例２ プロテアーゼ（aprE）ハローによる形質転換体の選択
（１）RIK7002（aprE::PrrnO-aprE trpB'A'::PrrnO-catSD10 erm his101）の構築
RIK1141（参考例１）のプロテアーゼ遺伝子aprEのプロモーターを、rrnOプロモーター（PrrnO）と置換した。aprE遺伝子プロモーターの上流領域及び下流領域の断片を、RIK1141のＤＮＡを鋳型として、P-aprE-upF2プライマーとP-aprE-upRプライマー、及びP-aprE-downFプライマーとP-aprE-downR2プライマーを用いたＰＣＲにて作製した。得られた２断片と、実施例１（１）で作製したPrrnO断片から、P-aprE-upF2プライマーとP-aprE-downR2を用いたＰＣＲにより、ＤＮＡ断片[aprE::PrrnO-aprE]を作製した。
上記[aprE::PrrnO-aprE]断片と実施例１（１）で作製した[trpB'A'::PrrnO-catSD10 erm his101]断片をRIK1141株に形質転換した後、細胞をエリスロマイシン及びスキムミルクを含有するＬＢプレートで培養し、エリスロマイシン耐性（増殖（＋））かつ培地上にハローを形成した（ハロー（＋））細胞を選択した。得られた形質転換体をRIK7002として取得した。

（２）RIK7012（aprE::rrnOantiSD10 trpB'A'::PrrnO-catSD10 erm hisC101）の構築
aprE遺伝子プロモーターの上流領域及び下流領域断片を、（１）で作製したRIK7002のＤＮＡを鋳型として、P-aprE-upFプライマーとP-aprE-upRプライマー、及びP-aprE-down-F0-ver2プライマーとP-aprE-downR2プライマーを用いたＰＣＲにて作製した。得られた２断片と、実施例１（２）で作製したrrnOantiSD10断片を、P-aprE-upFプライマーとP-aprE-downR2プライマーを用いたＰＣＲにて連結し、[aprE::rrnOantiSD10]断片を作製した。
次に、RIK7002のaprE遺伝子領域内に目的遺伝子（rrnOantiSD10）を導入するため、作製した[aprE::rrnOantiSD10]断片をRIK7002株に形質転換した。細胞をクロラムフェニコール及びスキムミルクを含有するＬＢプレートで培養し、クロラムフェニコール耐性（増殖（＋））かつ培地上にハローを形成しない（ハロー（−））細胞を選択した。シークエンシングにより、選択された細胞がrrnOantiSD10配列を有することを確認した。得られた形質転換体をRIK7012として取得した。

実施例３ アミラーゼ（amyE）ハローによる形質転換体の選択
（１）RIK7003（amyE::PrrnO-amyE trpB'A'::PrrnO-catSD10 erm his101）の構築
RIK1141（参考例１）のアミラーゼ遺伝子amyEのプロモーターをrrnOプロモーター（PrrnO）と置換した。amyE遺伝子プロモーターの上流領域及び下流領域の断片を、RIK1141のＤＮＡを鋳型として、P-amyE-upF2プライマーとP-amyE-upRプライマー、及びP-amyE-downFプライマーとP-amyE-downR2プライマーを用いたＰＣＲにて作製した。得られた２断片と実施例１（１）で作製したPrrnO断片から、P-amyE-upF2プライマーとP-amyE-downR2を用いたＰＣＲにより、ＤＮＡ断片[amyE::PrrnO-amyE]を作製した。
上記[amyE::PrrnO-amyE]と実施例１（１）で作製した[trpB'A'::PrrnO-catSD10 erm his101]断片をRIK1141株に形質転換した後、細胞をエリスロマイシン及びコーンスターチを含有するＬＢプレートで培養し、エリスロマイシン耐性（増殖（＋））かつ培地上にハローを形成した（ハロー（＋））細胞を選択した。得られた形質転換体をRIK7003として取得した。

（２）RIK7013（amyE::rrnOantiSD10 trpB'A'::PrrnO-catSD10 erm hisC101）の構築
amyE遺伝子プロモーターの上流領域及び下流領域断片を、（１）で作製したRIK7003のＤＮＡを鋳型として、P-amyE-upFプライマーとP-amyE-upRプライマー、及びP-amyE-down-F0-ver2プライマーとP-amyE-downR2プライマーを用いたＰＣＲにて作製した。得られた２断片と、実施例１（２）で作製したrrnOantiSD10断片を、P-amyE-upFプライマーとP-amyE-downR2プライマーを用いたＰＣＲにて連結し、[amyE::rrnOantiSD10]断片を作製した。
次に、RIK7003のamyE遺伝子領域内に目的遺伝子（rrnOantiSD10）を導入するため、作製した[amyE::rrnOantiSD10]断片をRIK7003株に形質転換した。細胞をクロラムフェニコール及びコーンスターチを含有するＬＢプレートで培養し、クロラムフェニコール耐性（増殖（＋））かつ培地上にハローを形成しない（ハロー（−））細胞を選択した。シークエンシングにより、選択された細胞がrrnOantiSD10配列を有することを確認した。得られた形質転換体をRIK7013として取得した。

実施例４ プロテアーゼ（nprE）ハローによる形質転換体の選択
（１）RIK7004（lacA::PrrnO-nprE trpB'A'::PrrnO-catSD10 erm his101）の構築
RIK1141（参考例１）のlacA遺伝子をPrrnO-nprEと置換した。lacA遺伝子の上流領域及び下流領域断片を、RIK1141のＤＮＡを鋳型として、P-lacA-upFプライマーとP-lacA-upRプライマー、及びP-lacA-downFプライマーとP-lacA-downRプライマーを用いたＰＣＲにて作製した。次に、RIK7001（nprE::PrrnO-nprE trpB'A'::PrrnO-catSD10 erm his101（実施例１（１））のＤＮＡを鋳型として、rrnO-upFプライマーとPrrnO-nprE-Rプライマーを用いたＰＣＲにてPrrnO-nprE断片を作製した。得られた３断片から、P-lacA-upFプライマーとP-lacA-downRプライマーを用いたＰＣＲにより、ＤＮＡ断片[lacA::PrrnO-nprE]を作製した。
上記[lacA::PrrnO-nprE]断片と実施例１（１）で作製した[trpB'A'::PrrnO-catSD10 erm his101]断片をRIK1141株に形質転換した後、細胞をエリスロマイシン及びスキムミルクを含有するＬＢプレートで培養し、エリスロマイシン耐性（増殖（＋））かつ培地上にハローを形成した（ハロー（＋））細胞を選択した。得られた形質転換体をRIK7004として取得した。

（２）RIK7014（lacA::rrnOantiSD10 trpB'A'::PrrnO-catSD10 erm hisC101）の構築
RIK1226（実施例１（２））を鋳型に、rrnO-upFプライマーとrrnO-5R-4+XbaIプライマーを用いたＰＣＲにより、３’末端にXbaI切断部位を付加したrrnOantiSD10断片を作製した。次に、RIK1141（参考例１）のＤＮＡを鋳型として、P-nprE-down-F0+XbaIプライマーとP-lacA-downRプライマーを用いたＰＣＲにより、５’末端にXbaI切断部位を付加したlacA遺伝子の下流領域断片を作製した。得られた２断片を制限酵素（XbaI）処理した後、ライゲージョン反応により連結し、ＤＮＡ断片[lacA::rrnOantiSD10]を作成した。
次に、RIK7004のlacA遺伝子領域内に目的遺伝子（rrnOantiSD10）を導入するため、作製した[lacA::rrnOantiSD10]断片をRIK7004株に形質転換した。細胞をクロラムフェニコール及びスキムミルクを含有するＬＢプレートで培養し、クロラムフェニコール耐性（増殖（＋））かつ培地上にハローを形成しない（ハロー（−））細胞を選択した。シークエンシングにより、選択された細胞がrrnOantiSD10配列を有することを確認した。得られた形質転換体をRIK7014として取得した。

実施例５ プロテアーゼ（nprE）ハローによる形質転換体の選択
（１）RIK7005株（nprB::PrrnO-nprE trpB'A'::PrrnO-catSD10 erm his101）の構築
RIK1141（参考例１）のnprB遺伝子をPrrnO-nprEと置換した。nprB遺伝子の上流領域及び下流領域断片を、RIK1141のＤＮＡを鋳型として、P-nprB-upFプライマーとP-nprB-upRプライマー、及びP-nprB-downFプライマーとP-nprB-downRプライマーを用いたＰＣＲにて作製した。得られた２断片と実施例１（１）で作製したPrrnO断片とP-nprB-upFプライマーとP-nprB-downRプライマーを用いてＤＮＡ断片[nprB::PrrnO-nprE]を作製した。
上記[nprB::PrrnO-nprE]断片と実施例１（１）で作製した[trpB'A'::PrrnO-catSD10 erm his101]断片をRIK1141株に形質転換した後、細胞をエリスロマイシン及びスキムミルクを含有するＬＢプレートで培養し、エリスロマイシン耐性（増殖（＋））かつ培地上にハローを形成した（ハロー（＋））細胞を選択した。得られた形質転換体をRIK7005として取得した。

（２）RIK7015（nprB::rrnOantiSD10 trpB'A'::PrrnO-catSD10 erm hisC101）の構築
RIK1141（参考例１）のＤＮＡを鋳型として、P-nprE-down-F0+XbaIプライマーとP-nprB-downRプライマー用いたＰＣＲにより、５’末端にXbaI切断部位を付加したnprB遺伝子の下流領域断片を作製した。この断片と、実施例４（２）で作製した３’末端にXbaI切断部位を付加したrrnOantiSD10断片を制限酵素（XbaI）処理した後、ライゲージョン反応により連結し、ＤＮＡ断片[nprB::rrnOantiSD10]を作製した。
次に、RIK7005のnprB遺伝子領域内に目的遺伝子（rrnOantiSD10）を導入するため、作製した[nprB::rrnOantiSD10]断片をRIK7005株に形質転換した。細胞をクロラムフェニコール及びスキムミルクを含有するＬＢプレートで培養し、クロラムフェニコール耐性（増殖（＋））かつ培地上にハローを形成しない（ハロー（−））細胞を選択した。シークエンシングにより、選択された細胞がrrnOantiSD10配列を有することを確認した。得られた形質転換体をRIK7015として取得した。

実施例６ 組換え細胞からのマーカー遺伝子の削除
RIK7213（amyE::rrnOantiSD10 trpC2）の構築
枯草菌１６８株（trpC2）から抽出したＤＮＡを鋳型として、trpD-FプライマーとhisC-R2プライマーを用いたＰＣＲにより、トリプトファン合成遺伝子（ただしtrpC2変異を含む）からヒスチジン合成遺伝子までの領域を含むＤＮＡ断片を作製した。作製したＤＮＡ断片をRIK7013（実施例３（２））に形質転換した後、細胞をトリプトファンを含有した最少培地で培養し、トリプトファン要求性かつヒスチジン非要求性を示す形質転換体を選択した。選択された形質転換体をRIK7213として取得した。これは、目的遺伝子（rrnOantiSD10）を有し、かつ薬剤耐性マーカーを有さない組換え細胞である。

実施例７ 二重組換え細胞の作製
（１）RIK7021株（amyE::rrnOantiSD10 trpB'A'::PrrnO-catΔSD erm190）の構築
PCR DNAI（参考例２）をRIK7013株（実施例３（２））に形質転換した後、細胞をトリプトファンを含有した最少培地で培養し、トリプトファン要求性かつヒスチジン非要求性を示す形質転換体を選択した。得られた形質転換体が、クロラムフェニコール感受性、エリスロマイシン感受性であることを確認し、RIK7021を取得した。

（２）RIK7032（nprE::PrrnO-nprE amyE::rrnOantiSD10 trpB'A'::PrrnO-catΔSD erm hisC101）の構築
RIK7001（実施例１（１））から抽出したＤＮＡを用いて、ＤＮＡ断片[nprE::PrrnO-nprE]と[erm his101]を上記（１）で作製したRIK7021に形質転換した。細胞をエリスロマイシン及びスキムミルクを含有するＬＢプレートで培養し、培地上にハローを形成し（ハロー（＋））増殖する（増殖（＋））細胞を選択した。選択された細胞をエリスロマイシンを含有したＬＢプレート、クロラムフェニコールを含有したＬＢプレート、トリプトファンを含有した最少寒天培地、トリプトファンとヒスチジンを含有した最少寒天培地で培養してさらに選択し、クロラムフェニコール感受性、エリスロマイシン耐性及びヒスチジン要求性を示す細胞を選択した。得られた形質転換体をRIK7032として取得した。

（３）RIK7051（amyE::rrnOantiSD10 nprE::rrnOantiSD10 trpB'A'::PrrnO-catSD10 erm hisC101）の構築
RIK7011（実施例１（２））から抽出したＤＮＡを用いて、ＤＮＡ断片[nprE::rrnOantiSD10]と[trpB'A'::PrrnO-catSD10 erm hisC101]を上記（１）で作製したRIK7032に形質転換した。細胞をクロラムフェニコール及びスキムミルクを含有するＬＢプレート上で培養し、培地上にハローを形成せず（ハロー（−））増殖する（増殖（＋））細胞を選択した。選択された細胞をエリスロマイシンを含有したＬＢプレート、クロラムフェニコールを含有したＬＢプレート、トリプトファンを含有した最少寒天培地、トリプトファンとヒスチジンを含有した最少寒天培地で培養してさらに選択し、クロラムフェニコール耐性、エリスロマイシン耐性、ヒスチジン要求性を示す形質転換体を選択した。得られた形質転換体をRIK7051として取得した。

実施例８ 組換え細胞からのマーカー遺伝子の削除
（１）RIK7221（amyE::rrnOantiSD10 nprE::rrnOantiSD10 trpC2）の構築
実施例６と同様の手順で、トリプトファン合成遺伝子からヒスチジン合成遺伝子までの領域を含むＤＮＡ断片を作製した。作製したＤＮＡ断片をRIK7051（実施例７（３））に形質転換し、トリプトファン要求性かつヒスチジン非要求性を示す形質転換体を選択した。選択された形質転換体をRIK7221として取得した。これは、ＤＮＡ上の２か所に目的遺伝子（rrnOantiSD10）を有し、かつ薬剤耐性マーカーを有さない二重組換え細胞である。

本実施例における組換え体の作製手順のフローを以下に示す。

Claims (29)

1. 組換え微生物の製造方法であって、
   （１）第１の加水分解酵素発現カセットと第１の選択マーカーとを共発現する宿主微生物の細胞を調製すること、
   ここで、
   該第１の加水分解酵素発現カセットは、プロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結された第１の加水分解酵素遺伝子とを含むＤＮＡであり、かつ
   該第１の加水分解酵素発現カセットは、該細胞のＤＮＡ中の第１の変異対象領域と置換されている；
   （２）該細胞を、該第１の加水分解酵素の基質を含有する該第１の選択マーカー保有株選択培地で培養し、該培地上で増殖かつハローを形成した細胞を、該第１の加水分解酵素発現カセットを含有する細胞として選択すること；
   （３）該（２）で選択した細胞に第２の選択マーカーの発現能を付与し、かつ該第１の加水分解酵素発現カセットを第１の組換えカセットで置換すること；及び、
   （４）該（３）で調製した細胞を、該第１の加水分解酵素の基質を含有する該第２の選択マーカー保有株選択培地で培養し、該培地上でハローを形成せずに増殖する細胞を、該第１の組換えカセットを含有する細胞として選択すること、
   を包含する、方法。
2. 前記第１の選択マーカーを発現する細胞が、第１の選択マーカー発現カセットを導入された細胞であり、該第１の選択マーカー発現カセットが、プロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子とを含むＤＮＡである、請求項１記載の方法。
3. 前記細胞への前記第２の選択マーカーの発現能の付与が、該細胞への第２の選択マーカー発現カセットの導入であり、該第２の選択マーカー発現カセットが、プロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結された第２の選択マーカー遺伝子とを含むＤＮＡである、請求項１又は２記載の方法。
4. 前記（３）において、前記細胞の前記第１の選択マーカーの発現能を欠失させることをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. 前記第１の選択マーカーの発現能の欠失が、前記第２の選択マーカー発現カセットによる前記第１の選択マーカー発現カセットの置換である、請求項４記載の方法。
6. 前記第１の選択マーカー発現カセットが、プロモーター、前記第１の選択マーカー遺伝子、及び不活性化された前記第２の選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡであり、かつ
   前記第２の選択マーカー発現カセットが、プロモーター、不活性化された前記第１の選択マーカー遺伝子、及び前記第２の選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡである、
   請求項５記載の方法。
7. 前記第１の加水分解酵素発現カセットに含まれるプロモーター、前記第１の選択マーカー発現カセットに含まれるプロモーター、及び前記第２の選択マーカー発現カセットに含まれるプロモーターが、同一又は別々の、前記宿主微生物の対数増殖期に発現するプロモーターである、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
8. 前記第１の加水分解酵素遺伝子が、プロテアーゼ遺伝子、アミラーゼ遺伝子、セルラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子及びリパーゼ遺伝子からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
9. 前記第１の組換えカセットが、目的遺伝子、プロモーター、ターミネーター及び転写調節領域からなる群より選択される１種以上を含むＤＮＡである、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
10. 前記第１の組換えカセットが、制御領域と作動可能に連結されている目的遺伝子を含むＤＮＡである、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
11. 前記第１の組換えカセットが遺伝子欠失用断片である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
12. 前記宿主微生物がバチルス属菌である、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
13. 前記バチルス属菌が枯草菌又はその変異株である、請求項１２記載の方法。
14. さらに以下の（１’）〜（４’）を１回以上繰り返す、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法：
    （１’）前記（４）又は下記（４’）で選択された細胞のＤＮＡ中のさらなる変異対象領域を、さらなる加水分解酵素発現カセットで置換し、かつ該細胞にさらなる選択マーカーの発現能を付与すること、
    ここで、該さらなる加水分解酵素発現カセットは、プロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結されたさらなる加水分解酵素遺伝子とを含むＤＮＡである；
    （２’）該細胞を、該さらなる加水分解酵素の基質を含有する該さらなる選択マーカー保有株選択培地で培養し、該培地上で増殖かつハローを形成した細胞を、該さらなる加水分解酵素発現カセットを含有する細胞として選択すること；
    （３’）該（２’）で選択した細胞に、該さらなる選択マーカーとは別の選択マーカーの発現能を付与し、かつ該さらなる加水分解酵素発現カセットを、さらなる組換えカセットで置換すること；及び
    （４’）該（３’）で調製した細胞を、該さらなる加水分解酵素の基質を含有する該別の選択マーカー保有株選択培地で培養し、該培地上でハローを形成せずに増殖する細胞を、該さらなる組換えカセットを含有する細胞として選択すること。
15. 前記細胞への前記さらなる選択マーカーの発現能の付与が、該細胞へのさらなる選択マーカー発現カセットの導入であり、該さらなる選択マーカー発現カセットが、プロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結されたさらなる選択マーカー遺伝子とを含むＤＮＡである、請求項１４記載の方法。
16. 前記細胞への前記別の選択マーカーの発現能の付与が、該細胞への別の選択マーカー発現カセットの導入であり、該別の選択マーカー発現カセットが、プロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結された別の選択マーカー遺伝子とを含むＤＮＡである、請求項１４又は１５記載の方法。
17. 前記（３’）において、前記細胞の前記さらなる選択マーカーの発現能を欠失させることをさらに含む、請求項１４〜１６のいずれか１項記載の方法。
18. 前記さらなる選択マーカーの発現能の欠失が、前記別の選択マーカー発現カセットによる前記さらなる選択マーカー発現カセットの置換である、請求項１７記載の方法。
19. 前記さらなる選択マーカー発現カセットが前記第１選択マーカー発現カセットであり、前記別の選択マーカー発現カセットが前記第２選択マーカー発現カセットである、請求項１８記載の方法。
20. 前記さらなる選択マーカー発現カセットが、プロモーター、前記第１の選択マーカー遺伝子、及び不活性化された前記第２の選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡであり、かつ
    前記別の選択マーカー発現カセットが、プロモーター、不活性化された前記第１の選択マーカー遺伝子、及び前記第２の選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡである、
    請求項１９記載の方法。
21. 前記さらなる加水分解酵素発現カセットに含まれるプロモーター、前記さらなる選択マーカー発現カセットに含まれるプロモーター、及び前記別の選択マーカー発現カセットに含まれるプロモーターが、同一又は別々の、前記宿主微生物の対数増殖期に発現するプロモーターである、請求項１４〜２０のいずれか１項記載の方法。
22. 前記さらなる加水分解酵素遺伝子が、プロテアーゼ遺伝子、アミラーゼ遺伝子、セルラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子及びリパーゼ遺伝子からなる群より選択される、請求項１４〜２１のいずれか１項記載の方法。
23. 前記第１加水分解酵素遺伝子と前記さらなる加水分解酵素遺伝子が同じ遺伝子である、請求項２２記載の方法。
24. 前記さらなる組換えカセットが、目的遺伝子、プロモーター、ターミネーター及び転写調節領域からなる群より選択される１種以上を含むＤＮＡである、請求項１４〜２３のいずれか１項記載の方法。
25. 前記さらなる組換えカセットが、制御領域と作動可能に連結されている目的遺伝子を含むＤＮＡである、請求項１４〜２３のいずれか１項記載の方法。
26. 前記さらなる組換えカセットが遺伝子欠失用断片である、請求項１４〜２３のいずれか１項記載の方法。
27. 前記（４）で選択された細胞に含まれる選択マーカー発現カセットを削除することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
28. 前記（４’）で選択された細胞に含まれる選択マーカー発現カセットを削除することをさらに含む、請求項１４〜２６のいずれか１項記載の方法。
29. 組換え微生物の宿主細胞の製造方法であって、
    微生物細胞に、プロモーターに作動可能に連結された加水分解酵素遺伝子を含むＤＮＡを導入するか、又はプロモーターを導入して該細胞中の加水分解酵素遺伝子と作動可能に連結させること、及び選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡを導入すること；ならびに
    該細胞を、該加水分解酵素の基質を含有する該選択マーカー保有株選択培地で培養し、該培地上で増殖かつハローを形成した細胞を選択すること、
    を包含する、方法。