FR2629099A1 - Acide desoxyribonucleique portant l'information genetique de la glutamine synthetase et son utilisation - Google Patents
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Abstract
On décrit un ADN ayant une séquence de bases codant pour une séquence d'acides aminés spécifique d'un polypeptide constituant la glutamine synthétase. On décrit également un transformant portant ledit ADN, et un polypeptide préparé par l'expression de l'information génétique dudit ADN par ledit transformant, ainsi qu'un procédé de préparation de ce polypeptide. Le procédé fournit une méthode efficace pour produire de la glutamine synthétase de pureté élevée, et il consiste à cultiver un transformant ayant ledit ADN qui est étranger par rapport au microorganisme hôte, pour amener ledit transformant à exprimer l'information génétique dudit ADN, et à recueillir le polypeptide constituant la glutamine synthétase à partir du bouillon de culture.
Description
ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE PORTANT L'INFORMATION GENETIQUE DE
LA GLUTAMINE SYNTHETASE ET SON UTILISATION.
La présente invention porte sur un acide désoxy-
ribonucléique (ADN) portant l'information génétique de la glutamine synthétase, sur un transformant portant ledit ADN, et sur un polypeptide préparé grâce à l'expression de l'information génétique dudit ADN par ledit transformant,
ainsi que sur un procédé de préparation de ce polypeptide.
La glutamine synthétase est désignée par l'expression Lglutamate:ammoniac ligase (formant de l'ADP) conformément à la nomenclature E.C. 6.3.1.2.. L'enzyme catalyse la réaction suivante (Enzyme Handbook, 775, (1982); Asakura Publishing Co.): ATP + L-glutamate + NH4+ ADP + Acide phosphorique minéral + L-glutamine On sait que la glutamine synthétase existe dans les cerveaux et les foies de divers animaux, et dans les fèves. On sait également qu'elle est produite par des microorganismes appartenant aux genres Micrococcus, Brevibacterium, Corynebacterium (brevets japonais publiés
n 33594/1982 et 155321/1984), Methanobacterium [Arch.
Microbiol., 144 (4), 350-354 (1986], et Bacillus
[J. Biochem. 98 (5), 1211-1219 (1985)].
Egalement, il y a eu des publications sur le clonage de la glutamine synthétase provenant du hamster chinois [Publication de la demande internationale WO 87/04462; The EMBO Journal, vol. 3, no 1, 65-71 (1984)], de Phaseolus vulaaris L.[Journal of Molecular and Applied
Genetics, 2, 589-599 (1984)], et d'une bactérie photo-
synthétique Rhodopseudomonas capsulata [Journal of
Bacterioloqy, Vol. 155, n_ 1 Juillet, 1983, 180-185].
Etant donné que-la glutamine synthétase utilise 1;ion NH4+ dans la réaction dans laquelle elle agit comme catalyseur, comme représenté dans le schéma réactionnel ci-dessus, elle peut être utilisée comme réactif pour l'analyse quantitative de l'ion NH4+ existant dans un échantillon ou libéré dans une réaction, ou pour consommer l'ion NH4+ contenu dans un échantillon (brevet japonais publié n 56095/1986). Par exemple, la glutamine synthétase est utilisée comme réactif pour l'analyse quantitative ou la consommation de l'ion NH4+, ou pour l'analyse quantitative ou la consommation d'urée conformément à une série de réactions comme ci-après: Uréase Urée + H20 2 NH3 + CO2
NH3 + H20 - NH4+ + OH
Glutamine synthétase NH4+ + ATP + L-glutamate G ADP + Acide phosphorique minéral + L-glutamine Pyruvate kinase ADP + Acide phosphoénolpyruvique ATP + Pyruvate Pyruvate oxydase Pyruvate + 02 Acétyl phosphate + CO2 + H202 Lactate déshydrogénase Pyruvate + NADH2 Lactate + NAD Ces réactions sont éventuellement menées à une réaction produisant H202 ou à une réaction consommant NADH2 pour l'analyse quantitative aisée de l'ion NH4+ ou de l'urée. Dans le système réactionnel produisant H202, H202 peut être aisément quantifiée à l'aide d'une électrode à H202 ou par colorimétrie à la H202-peroxydase. En variante,
H202 produite peut être consommée par l'action de catalase.
Dans le système réactionnel consommant NADH2, l'analyse quantitative peut être effectuée par la détermination de la
réduction d'absorbanee à une longueur d'onde de 340-360 nm.
La productivité de la glutamine synthétase par les microorganismes connus, producteurs de glutamine synthétase, qui ont été décrits jusqu'ici, est assez faible. Un autre problème que l'on rencontre avec ces microorganismes connus producteurs de glutamine synthétase est la difficulté pour éliminer du produit les autres enzymes co-existantes. Il existe par conséquent une demande pour un procédé plus avantageux de production de la glutamine synthétase. Par ailleurs, il n'y a pas eu, dans la littérature, de publications sur une structure chimique détaillée de la glutamine synthétase provenant de microorganismes ou sur ses
caractéristiques génétiques.
Les présents inventeurs ont entrepris des études approfondies pour améliorer l1 rendement en glutamine synthétase, pour réduire la quantité d'enzymes étrangères, et pour réduire les coûtsde production. Comme résultat, les inventeurs ont réussi à cloner le gène de la glutamine synthétase provenant de microorganismes et à élucider sa structure primaire par l'application des techniques du génie génétique. De plus, les inventeurs ont mis au point un procédé pour préparer la glutamine synthétase par la transformation du gène dans d'autres microorganismes et la culture de ces microorganismes En conséquence, la présente invention a pour but de proposer un ADN comprenant une séquence de bases codant pour une séquence d'acides aminés d'un polypeptide qui constitue la glutamine synthétase provenant d'un microorganisme, un transformant portant ledit ADN, un polypeptide produit par l'expression de l'information génétique dudit ADN, de même qu'un procédé de production
d'un tel polypeptide.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront plus aisément ci-après à la
lecture de la description suivante.
La Figure 1 est une représentation montrant une carte d'endonucléase pour le plasmide pGS2. L'ADN de la présente invention peut être préparé, par exemple, par le procédé suivant, grâce à l'application des techniques du génie génétique. L'ADN d'un microorganisme qui est le donneur du gène de la glutamine synthétase et possède une capacité de production de
glutamine synthétase est tout d'abord séparé et purifié.
Cet ADN est digéré à l'aide d'ondes ultrasoniques ou d'endonucléases de restriction. L'ADN digéré et un ADN vecteur d'expression, qui est digéré et rendu linéaire, sont réunis avec une ADN ligase, ou similaire, par leurs cassures d'extrémités ou extrémités cohésives, pour former un cercle fermé. Le vecteur d'ADN recombinant ainsi obtenu est introduit dans un microorganisme hôte reproductible. On cultive des microorganismes possédant ledit vecteur d'ADN recombinant qui est choisi, au moyen d'un criblage, à l'aide d'un marqueur du vecteur et de l'activité glutamine synthétase en tant qu'indicateurs. Ledit vecteur d'ADN recombinant est ensuite séparé des cellules cultivées et il est purifié. L'ADN de la présente invention, possédant l'information génétique de la glutamine synthétase, est
ensuite séparé dudit vecteur d'ADN recombinant.
Comme donneur du gène de la glutamine synthétase, on peut utiliser des microorganismes ayant une capacité de production de glutamine synthétase, ainsi que des tissus de divers animaux,producteurs de glutamine synthétase. Ceux-ci comprennent Bacillus sp. EH113 (FERM BP-2281), Bacillus cereus [J. Biochem., 98 (5), 1211-1219 (1985)] appartenant au genre Bacillus, Micrococcus glutamicus ATCC 13032, ATCC 13060, et ATCC 13059 appartenant au genre Micrococcus, Brevibacterium flavum ATCC 14607, Brevibacterium ammoniacenes ATCC 6872 et ATCC 6871 (brevets japonais publiés n 33594/1982 et 155321/1984) appartenant au genre Brevibacterium, des microorganismes producteurs de glutamine synthétase appartenant au genre Methanobacterium. Parmi ceux-ci, les donneurs du gène de la glutamine synthétase préférés sont les microorganismes producteurs de glutamine synthétase. Le procédé d'obtention d'un ADN produit par le
microorganisme donneur du gène va maintenant être décrit.
On cultive tout d'abord n'importe lequel parmi les microorganismes donneurs du gène mentionnés ci-dessus, dans un milieu de culture liquide, sous aération, pendant 1 à 3 jours. Le bouillon de culture est soumis à une centrifugation pour recueillir les cellules, après quoi les cellules sont lysées pour produire un lysat contenant le gène de la glutamine synthétase. Un traitement par une enzyme lysant la paroi cellulaire, telle que le lysozyme ou la B-glucanase, est utilisé pour la bactériolyse, en combinaison, si nécessaire, avec une autre enzyme, telle qu'une protéase ou avec un agent tensio-actif, tel que le laurylsulfate de sodium. De plus, la digestion physique des parois cellulaires au moyen de la congélation-décongélation ou de la presse de French, par exemple, peut être employée
conjointement avec la lyse.
Des méthodes classiques de purification, comprenant, par exemple, une déprotéinisation par une extraction au phénol, un traitement par protéase, un traitement par ribonucléase, une précipitation dans un alcool, et une centrifugation, peuvent être appliquées, soit indépendamment, soit en combinaison, pour la séparation et
la purification de l'ADN provenant du lysat.
La digestion de l'ADN du microorganisme ainsi séparé et purifié peut être effectuée à l'aide d'un traitement par ultrasons ou par des endonucléases de restriction. Cependant, afin d'assurer une jonction aisée des fragments d'ADN et de l'ADN à vecteur, l'utilisation d'endonucléases de restriction est préférable, en particulier l'utilisation d'endonucléases de type II, agissant sur des séquences nucléotidiques spécifiques,
telles que EcoRI, HindIII, BamHI, ou similaires.
Un vecteur souhaitable employé est un phage ou un ADN plasmide qui est capable de se répliquer de façon autonome dans des cellules bactériennes hôtes et qui est restructuré pour être utilisé comme vecteur recombinant
génétique par traitement artificiel.
Dans le cas o Escherichia coli est utilisé comme microorganisme hôte, par exemple,; gt.-C,)gt.>B, ou
similaires, peuvent être utilisés comme phage.
Comme plasmides, pBR322, pBR325, pACYC184, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19, ou similaires, sont utilisés lorsque Escherichia coli est le microorganisme hôte, alors que pUB1l10, pC194, ou similaires, sont utilisés lorsque Bacillus subtilis est le microorganisme hôte. De plus, on peut employer des vecteurs navettes, qui peuvent se répliquer de façon autonome dans des cellules bactériennes hôtes de deux ou plusieurs microorganismes, par exemple, dans à la fois Escherichia coli et Saccharomyces cerevisiae. Ces vecteurs sont, de façon souhaitable, digérés à l'aide de la même endonucléase de restriction que celle utilisée dans la digestion de l'ADN du microorganisme mentionné ci-dessus,
donneur du gène de la glutamine synthétase.
Une méthode classique de réunion utilisant une ADN ligase peut être employée pour relier l'ADN bactérien et le fragment de vecteur. Par exemple, l'extrémité cohésive de l'ADN bactérien et celle du fragment de vecteur sont toutd'aborc mises sousforme bicaténaire, puis un ADNrecombinant constitué par l'ADN bactérien et le fragment de vecteur peuvent être préparés par l'action d'une ADN ligase appropriée. Si nécessaire, 1'ADN bactérien-fragment de vecteur misss foe biOEaie Et intraiit dans le microorganisme hôte pour produire l'ADN recombinant
à l'aide d'ADN ligase in vivo.
On peut utiliser, comme bactérie hôte, tout microorganisme qui permet une réplication autonome et stable de l'ADN recombinant et qui est capable d'exprimer le caractère de l'ADN étranger. Des exemples de ces microorganismes comprennent Escherichia coli DH1, Escherichia coli HB101, Escherichia coli W3110, Escherichia coli C600, et similaires, lorsque le microorganisme hôte est
celui appartenant a l'espèce Escherichia coli.
L'introduction de l'ADN recombinant dans le microorganisme hôte peut être effectuée, par exemple, en présence de l'ion calcium, lorsque le microorganisme hôte
est une bactérie appartenant au genre Escherichia.
Lorsqu'une bactérie appartenant au genre Bacillus est utilisée comme microorganisme hôte, on peut utiliser une méthode par cellules compétentes ou l'introduction par fusion électrique d'ADN recombinant liposomal dans les protoplaste des microorganismes hôtes protoplastes. Une méthode par
microinjection peut être également employée.
L'introduction de l'ADN désiré dans le micro-
organisme hôte peut être détectée au moyen d'un criblage utilisant un marqueur de résistance aux médicaments du
vecteur et l'activité glutamine synthétase en même temps.
Par exemple, on peut choisir des bactéries qui se développent sur un milieu de culture sélectif à base du marqueur de résistance aux médicaments et qui produisent la
glutamine synthétase.
L'ADN recombinant possédant ledit gène de glutamine synthétase, une fois sélectionné de cette manière, peut être extrait du transformant pour être introduit dans une autre bactérie hôte. En variante, un ADN du gène de glutamine synthétase peut être isolé à l'aide d'une endonucléase de restriction ou similaire, à partir d'un ADN recombinant possédant un gène de la glutamine synthétase, et il est réuni avec un fragment de vecteur linéaire obtenu d'une manière similaire, pour produire un ADN recombinant possédant de nouvelles caractéristiques. Cet ADN recombinant peut alors être introduit dans d'autres
microorganismes hôtes.
Un ADN codant pour une glutamine synthétase mutéine, qui possède une activité glutamine synthétase substantielle, est un gène mutant, produit par des techniques de génie génétique, à partir d'un gène de glutamine synthétase de la présente invention. Un ADN codant pour cette mutéine peut être préparé a l'aide de diverses techniques de génie génétique, telles que la méthode de mutagénèse spécifiques du site, la substitution de bases spécifiques a l'aide d'un oligonucléotide synthétique, et similaires. Parmi les ADNs de glutamine synthétase mutéine ainsi préparés, ceux ayant des caractéristiques particulièrement excellentes, sont finalement introduits dans un vecteur, pour produire un ADN recombinant. Cet ADN recombinant est ensuite introduit dans le microorganisme hôte pour produire une glutamine
synthétase mutéine.
La séquence de bases de l'ADN de cette invention, préparé par la méthode décrite ci-dessus, peut être
déterminée par la méthode di-désoxy [Science, 214, 1205 -
1210 (1981)]. Par exemple, la séquence de bases d'un gène de glutamine synthétase dans un plasmide préparé à l'aide d'un microorganisme appartenant au genre Bacillus comme microorganisme donneur de gène de glutamine synthétase, et Escherichia coli comme bactérie hôte, est la suivante:
10 20 30 40 50 60
GCAAAGTTCACACGTGAAGACATCACTCGTTTAGCAAAAGAAGAAAATGTTAAGTACATC
80 90 100 110 120
CGTTTACAGTTTACTGACATTTTAGGGACGATTAAAAACGTTGAAATCCCAGTTAGTCAA
140 150 160 170 180
-30 TTAGAAAAAGCTCTTGATAACAAAATGATGTTTGACGGATCTTCTATTGAAGGCTTCGTA
200 210 220 230 240
CGTATCGAAGAATCTGATATGTACCTATATCCTGATTTAAATACATGGGTTATCTTCCCT
250 260 270 280 290 300
TGGACTTCTGAAAAAGGTAAAGTTGCTCGTCTAATTTGTGATATTTATAATACAGATGGA
310 320 330 340 350 360
GCACCTTTTGATGGAGACCCTCGTACTAACTTAAAACGTGTCCTTGCAGAAGCAAGAGAA
370 380 390 400 410 420
ATGGGCTTCACTGATTTTAATCTTGGACCTGAACCAGAATTCTTCTTATTCAAACTAGAT
430 440 450 460 470 480
GCAGCTGGAGAGCCAACTCTAGAATTGAATGATAAAGGCGGATACTTTGACCTTGCGCCT
490 500 510 520 530 540
ACTGACCTAGGAGAAAACTGCCGTCGCGATATCGTTCTTGAACTTGAAGAAATGGGATTT
550 560 570 580 590 600
GAAATTGAAGCATCCCACCATGCAAGTAGCTCCAGGACACACGAAATTGACTTTAAATAT
610 620 630 640 650 660
GCAGATGCAATTTCAGCATGTGATAACATCCAAACTTTCAAATTGGTCGTTAAAACGATT
670 680 690 700 710.720
GCCCGTAAACATGGTTTACACGCAACATTCATGCCTAAACCATTGTTCGGTGTTAATGGA
730 740 750 760 770 780
TCAGGTATGCACTGTCCAGTTTCTTTATTCAAAGGAAGCCAAAATGCCTTTTACGATACA
790 800 810 820 830 840
GAAGGAAAATTAGAACTAAGTAAAACAGCAGAGCAATTTATCGCTGGTATCATTAAGCAT
850 860 870 880 890 900
GCTCCTAGCTTCACAGCGGTAACAAACCCAACTGTTAACTCATACAAACGTCTAGTGCCT
910 920 930 940 950 960
GGTTACGAAGCTCCTTGTTATGTTGCTTGGTCTGCTAAAAACCGTAGCCCATTAATTCGT
970 980 990 1000 1010 1020
ATCCCAGCTTCACGCGGTGTTAGTACTCGTGTTGAGGTACGTAGTGTOCGATCCAGCAGCC
1030 1040 1050 1060 1070 1080
AATCCATACTTGGCACTTGCTGTAATATTGAAAGCTGGTCTTGACGGTATCAAAAACAAC
1090 1100 1110 1120 1130 1140
CTAACTCCTCCAGCTCCAGTTGACCGTAACATTTATGTAATGAATAAAGAAGAACGTGAA
1150 1160 1170 1180 1190 1200
GAAGTAGGAATCGTAGATCTACCAGCTACTTTATATGCTGCATTGGAAACATTAAAATCC
1210 1220 1230 1240 1250 1260
AATGAATCATCAAAGAAGCTCTTGGTGATCACTTGCTTG-AACACTTCATCGAAGCAAAA
1270 1280 1290 1300 1310 1320
GAAATTGAGTGGGATATGTTCCGCACACAAGTTCACCCATGGGAACGCGAACAATATATG
TCTACTTAT (II)
Dans la séquence de bases (II) ci-dessus, l'extrémité 5' qui est en amont du codon GCA peut avoir n'importe quel codon dans la mesure o celui-ci code pour un acide aminé. De plus, l'extrémité 5' peut avoir un ou plusieurs codons codant pour un acide aminé. Un exemple préféré de l'élément à l'extrémité 5' est ATG, un codon initiateur, ou un acide polydésoxyribo-
nucléique correspondant à un peptide signal. L'extré-
mité 3' qui est en aval de TAT peut avoir un codon de terminaison de translation ou n'importe quel codon codant pour un acide aminé. De plus, il peut y avoir un ou
plusieurs codons codant pour un acide aminé à l'extré-
mité 3, à la condition que, dans ce cas, il soit souhaitable qu'un codon de terminaison de translation soit
présent à l'extrémité 3' de ces codons.
La séquence d'acides aminés du polypeptide produit par l'expression de l'ADN de la présente invention peut être prédite à partir de la séquence de bases de l'ADN. La séquence d'acides aminés de la fraction constituant l'extrémité N-terminale dudit polypeptide peut être déterminée par la méthode discutée ci-dessous. Un microorganisme donneur du gène de la glutamine synthétase, capable de produire la glutamine synthétase, est tout d'abord cultivé dans un milieu nutritif, afin de produire et
d'accumuler de la glutamine synthétase dans les cellules.
Les cellules cultivées sont recueillies à partir du bouillon, par filtration, centrifugation, ou moyens similaires. Les cellules recueillies sont ensuite détruites, soit par des moyens mécaniques, soit par des moyens enzymatiques, à l'aide de lysozyme ou similaire, et, au lysat, de 1'EDTA et/ou un agent tensio-actif approprié sont ajoutés, si nécessaire, pour solubiliser et séparer la
glutamine synthétase sous la forme d'une solution aqueuse.
Cette solution aqueuse de glutamine synthétase est ensuite concentrée, ou, sans être concentrée, soumise à un fractionnement au sulfate d'ammonium, une filtration sur gel, une chromatographie d'adsorption, ou une chromatographie d'échange d'ions, afin d'obtenir une glutamine synthétase de pureté élevée. La séquence d'acides aminés de la fraction constituant l'extrémité N terminale du peptide glutamine synthétase est déterminée pour cette glutamine synthétase hautement purifiée, à l'aide d'un séquenceur de protéines en phase liquide (Beckman System 890ME, fabriqué par Beckman, Inc.). De cette manière, il a été confirmé que la séquence d'acides aminés au moins de ladite fraction était identique à la séquence d'acides aminés de l'extrémité N terminale de la glutamine synthétase obtenue par les techniques de génie génétique. La séquence d'acides aminés déterminée de cette manière à partir de la séquence de bases (II) était équivalentea la séquence d'acides aminés de formule (I) suivante: AlaLysPheThrArgGluAspIleThrArgLeuAlaLysGluGluAsnValLysTyrIle ArgLeuGlnPheThrAspIleLeuGlyThrIleLysAsnValGluIleProValSerGln LeuGluLysAlaLeuAspAsnLysMetxetPheAspGlySerserIleGluGlyPheVal ArgIleGluGluSerAspMetTyrLeuTyrProAspLeuAsnThrTrpValIlePhePro TrpThrSerGluLysGlyLysValAlaArgLeuIleCysAspIleTyrAsnThrAspGly AlaProPheAspGlyAspProArgThrAsnLeuLysArgValLeuAlaGluAlaArgGlu MetGlyPheThrAspPheAsnLeuGlyProGluProGluPhePheLeuPheLysLeuAsp AlaAlaGlyGluProThrLeuGluLeuAsnAspLysGlyGlyTyrPheAspLeuAlaPro ThrAspLeuGlyGluAsncysArgArgAspIlevalLeuGluLeuGluGluMetGlyPhe GluIleGluAlaSerHisHisAlaSerSerSerArgThrHisGluIleAspPheLysTyr AlaAspAlaIleSerAlaCysAspAsnIleGlnThrPheLysLeuValValLysThrIle AlaArgLysHisGlyLeuHisAlaThrpheMetProLysProLeuPheGlyValAsnGly SerGlyMetHisCysProValSerLeuPheLysGlySerGlnAsnAlaPheTyrAspThr GluGlyLysLeuGluLeuserLysThrAlaGluGlnPheIleAlaGlyIleIleLysHis AlaProSerPheThrAlaValThrAsnproThrValAsnSerTyrLysArgLeuValPro GlyTyrGluAlaProCysTyrvalAlaTrpSerAlaLysAsnArgserProLeuIleArg IleProAlaSerArgGlyValSerThrArgValGluvalArgServalAspproAlaAla AsnProTyrLeuAlaLeuAlaValIleLeuLysAlaGlyLeuAspGlyIleLysAsnAsn LeuThrProProAlaProValAspArgAsnIleTyrValMetAsnLysGluGluArgGlu GluValGlyIleValAspLeuProAlaThrLeuTyrAlaAlaLeuGluThrLeuLysSer AsnGluIleIleLysGluAlaLeuGlyAspHisLeuLeuGluHisPheIleGluAlaLys GluIleGluTrpAspMetPheArgThrGlnValHisProTrpGluArgGluGlnTyrMet SerThrTyr (I) Dans la séquence d'acides aminés de formule (I), le reste-d'acide aminé en amont de l'extrémité N-terminale Ala peut consister en un ou plusieurs acides aminés. Sont donnés comme exemples préférés de ce reste d'acide aminé, un Met et un peptide signal.. Il peut y avoir un ou plusieurs restes d'acides aminés en aval de l'extrémité C-terminale Tyr. Le transformant ainsi obtenu, lorsqu'il est cultivé dans un milieu nutritif, peut produire une quantité
importante de polypeptide ayant une activité glutamine.
synthétase d'une manière stable.
La culture du microorganisme hôte qui est un transformant est conduite dans les conditions déterminées en prenant en considération les caractéristiques physiologiques et nutritives du microorganisme hôte. Dans la plupart des cas, on emploie une culture liquide. Cependant, dans une production à échelle industrielle, une culture dans des conditions d'agitation aérobie et intensive est plus avantageuse. Une grande variété de milieux nutritifs habituellement utilisés pour la culture de bactéries peut être utilisée pour cultiver le microorganisme hôte. D'une manière spécifique, tous composés carbonés qui sont
assimilables peuvent être utilisés comme sources de carbone.
Ceux-ci comprennent, par exemple, le glucose, le sucrose, le lactose, le maltose, le fructose, les mélasses, et similaires. Comme sources d'azote, tous composés azotés disponibles peuvent être employés, comprenant les peptones, les extraits de viande, les extraits de levure, les hydrolysats de caséine, et similaires. D'autres ingrédients, comprenant des sels, tels que phosphates, carbonates et sulfates, de même que des sels de magnésium, de calcium, de potassium, de fer, de manganèse, de zinc, et similaires, et certains types d'acides aminés ou de
vitamines, peuvent être utilisés s'ils conviennent.
On peut faire varier la température de la culture dans une plage dans laquelle les bactéries peavent se développer et produire de la glutamine synthétase. La plage des températures que l'on préfère va de 20 à 42 C pour Escherichia coli. On peut faire varier le temps de la culture à un certain degré en fonction des conditions de la culture. En.principe, la culture est terminée au moment o
le rendement de glutamine synthétase atteint un maximum.
Dans la pratique habituelle, cela prend environ 12 à 48 heures. Il est possible de faire varier le pH des milieux de culture à l'intérieur de la plage dans laquelle les bactéries peuvent se développer et produire la glutamine synthétase. La plage des pH particulièrement préférée va
d'environ 6 à 8.
La glutamine synthétase peut être séparée et récupérée à partir du bouillon de culture alors qu'il contient des cellules lorsque de la glutamine synthétase est contenue dans le bouillon. Cependant, la glutamine synthétase et les cellules contenues dans le bouillon de culture sont généralement séparées la première des secondes par filtration, centrifugation, ou moyens similaires, avant que la glutamine synthétase ne soit récupérée. Lorsque la glutamine synthétase est contenue à l'intérieur des cellules, les cellules sont tout d'abord séparées par filtration ou centrifugation. Les cellules recueillies sont ensuite détruites, soit par des moyens.mécaniques, soit par des moyens enzymatiques, à l'aide du lysozyme ou similaire, et aux bactéries détruites, un agent chélatant, tel que l'EDTA, et/ou un agent tensio- actif approprié, sont ajoutés, si nécessaire, pour solubiliser la glutamine synthétase, permettant ainsi de recueillir la glutamine synthétase sous
la forme d'une solution aqueuse.
Les solutions contenant la glutamine synthétase que l'on obtient ainsi, sont ensuite concentréespar évaporation sous vide ou par l'utilisation d'un filtre, et elles sont soumises à un traitement de relargage par du sulfate d'ammonium, du sulfate de sodium, ou similaires, ou à une précipitation fractionnée à l'aide d'un solvant organique hydrophile, tel que le méthanol, l'6thanol, l'acétone, ou similaires. Le précipité est dissous dans l'eau, et la solution est dialysée à travers une membrane semi-perméable, afin d'éliminer les impuretés de faible masse moléculaire. En variante, le précipité est purifié à l'aide d'une filtration sur gel, d'une chromatographie d'adsorption, d'une chromatographie d'échange d'ions, ou similaires. La glutamine synthétase purifiée est produite à partir de la solution cbntenant la glutamine synthétase, qui est obtenue par l'utilisation de ces divers moyens, par
évaporation sous vide, lyophilisation, ou similaires.
L'activité de la glutamine synthétase ainsi préparée est mesurée conformément à la méthode suivante: CMélange réactionnel>: Tampon Trischlorhydrique 0,2 M (pH 8,0).. 0,2 ml Glutamate de sodium 2 M.............
..... 50 pl Sulfate d'ammonium 1 M.................... 50 1il MgCl2 0,2 M............................... 50 Pl ATP 0,2 M............................DTD: ..... 10 >1l Acide phosphoénolpyruvique 0,1 M.......... 10 Pl Pyruvate kinase (500 U/ml)................ 10 1l Pyruvate oxydase (500 U/ml).........DTD: ...... 10,1 Thiamine pyrophosphate 0,1 M.............. 2 l KH2PO4 0,1 M...DTD: ........................... 50 1l FAD 1 mM................................DTD: .. 10 1 Amino-4 antipyrine à 0,3%................ 0,1 ml Phénol à 0,2%....DTD: ........................ 0,1 ml Peroxydase (45 U/ml)......................DTD: 0,1 ml Eau purifiée.............................. 0,348 ml Dans un tube à essai, on introduit 1,0 ml du mélange réactionnel ayant la composition- ci-dessus et on équilibre la température à 37 C pendant 3 minutes. On ajoute 50 >1 d'une solution enzymatique et on incube à 37 C pendant 10 minutes. On fait cesser la réaction en ajoutant 2 ml de dodécylsulfate de sodium à 0,5% et on mesure..DTD: l'absorbance à 550 nm de la couleur rouge produite.
L'activité de la substance pour produire 1 M d'ADP par minute a été définie comme 1 unité (U)
Dans la présente description, les acides aminés,
peptides, acides nucléiques, et composés apparentés aux acides nucléiques sont indiqués de manière abrégée selon la nomenclature en vigueur. Quelques exemples des abréviations sont énumérés ci-dessous. Toutes les désignations des acides aminés se rapportent aux isomères L. ADN: Acide désoxyribonucléique ARN: Acide ribonucléique A: Adénine T: Thymine G: Guanine C: Cytosine Ala: Alanine Arg: Arginine Asn: Asparagine Asp: Aspartate Cys: Cystéine Gln: Glutamine Glu: Glutamate Gly: Glycine His: Histidine Ile: Isoleucine Leu: Leucine Lys: Lysine Met: Méthionine Phe: Phénylalanine Pro: Proline Ser: Sérine Thr: Thréonine Trp: Tryptophane Tyr: Tyrosine Val: Valine D'autres caractéristiques de la présente invention
apparaîtront au cours de la description suivante des modes
de réalisation qui sont donnés à titre d'exemples pour illustrer l'invention et qui ne sont pas destinés à en
limiter la portée.
EXEMPLES
Exemple 1 [Préparation d'un ADN chromosomique] On a préparé un ADN chromosomique à partir de la souche Bacillus sp. EH113 (FERM BP-2281) conformément à la méthode suivante. La souche a été soumise à une cultureavec secousses pendant toute une nuit, à 37 C, dans 150 ml d'un milieu de bouillon standard. Le bouillon cultivé a été centrifugé à 3 000 tpm pendant 10 minutes, afin de recueillir les cellules. Les cellules ont été mises en suspension dans 5 ml d'une solution contenant 10% de saccharose, 50 mM de Tris acide chlorhydrique (pH 8,0) et mM d'EDTA. A la suspension, on a ajouté 1 ml de solution de lysozyme (10 mg/ml), et le mélange a été incubé à 37 C pendant 15 minutes, en faisant suivre par l'addition de 1 ml de SDS (dodécylsulfate de sodium) à 10%. On a ajouté à la suspension ainsi obtenue un volume égal d'un solvant mixte de chloroforme et de phénol (1:1), et le mélange a été agité et centrifugé à 10 000 tpm, pendant 3 minutes, pour séparer les couches aqueuse et de solvant. A la couche aqueuse séparée, on a ajouté lentement 2 fois son volume d'éthanol, et on a agité lentement le mélange avec une tige de verre, afin d'amener l'ADN à s'enrouler autour de la tige. L'ADN séparé de cette manière a été dissous dans 10 ml d'une solution contenant 10 mM de Tris acide chlorhydrique (pH 8,0) et 1 mM d'EDTA (une telle solution est désignée ci- après par l'abréviation "TE"). Cette solution a été
traitée par un volume égal de solvant mixte chloroforme-
phénol, et elle a été à nouveau centrifugée afin de séparer la couche aqueuse. On a encore ajouté à cette couche aqueuse 2 fois son volume d'éthanol, et l'ADN a été à nouveau séparé du mélange de la même manière que celle décrite ci-dessus. Cet ADN a été ensuite dissous dans 2 ml
de TE.
Exemple 2 [Construction du plasmide pGS 2 possédant le gène de la glutamine synthétase] (1) On a mélangé et incubé à 37 C pendant 1 heure pour digestion, 2 "l (environ 0,5 ig) de l'ADN chromosomique de Bacillus sp préparé à l'Exemple 1, 1 "l de tampon de digestion de HindIII [TrisHCl 100 mg (pH 7,5), MgC12 70 mM, NaCi 0.6 M, et mercaptoéthanol 70 mM] concentré 10 fois, 1 1l de HindIII (10 unités/pl; produit par Takara Shuzo Co., Ltd.), et 6 1l d'eau. De façon séparée, environ 0,3 pg dé l'ADN pBR322 (produit par Takara Shuzo Co., Ltd.), a été digéré à l'aide de HindIII selon la même méthode. A celui-ci, on a ajouté 0,6 unité de phosphatase alcaline (produite par Takara Shuzo Co., Ltd.; ci-après désignée de temps en temps par l'abréviation "BAP"), et le mélange a été incubé à 650C pendant 1 heure. Les deux solutions d'ADN digérés, ainsi digérées par HindIII, ont été mélangées ensemble, et à cette solution d'ADN mélangés,
0,1 volume d'acétate de sodium 3M a été ajouté.
Ensuite, la solution a été traitée par un volume égal d'un solvant mixte chloroforme-phénol, et centrifugée pour séparer la couche aqueuse. A celle-ci, on a ajouté 2 fois son volume d'éthanol, et on a recueilli l'ADN précipité à l'aide d'une centrifugation et on l'a séché sous vide. L'ADN séché a été dissous dans 89 ul d'eau, et à celui-ci, 10 ul de tampon de ligation [Tris acide chlorhydrique 0,5 M (pH 7,6), mgC12 0,1 M, dithiiothréitol 0,1 M, spermidine 10 mM, ATP 10 mM] concentré 10 fois et 1M1 d'ADN ligase T4 (350 unités; produit par Takara Shuzo Co., Ltd.) ont été ajoutés et mélangés, et on a laissé reposer le mélange à 4 C pendant toute une nuit. Cette solution d'ADN a été traitée par un mélange chloroforme-phénol, et l'ADN a été précipité par l'éthanol, séché sous vide, et
dissous dans 10,l de TE.
(2) Escherichia coli TH16 [Stock n ME 8459, J. Bacteriol., 153, 1247 (1983); fourni par National Institute of Genetics] a été cultivé dans 100 ml de milieu BHI [Brain Heart Infusion - Infusion de Cervelle et de Coeur, produite par Difco Co.], recueilli durant la phase de croissance logarithmique par centrifugation (10 000 tpm, 2 minutes), et mis en suspension dans ml d'une solution refroidie par de la glace, contenant 30 mM d'acétate de potassium, 100 mM de RbCl, mM de CaCl2, 50 mM de MnCl2, et 15% de glycérine
302 2
(pH 5,8). Après avoir laissé reposer la suspension à 0 C pendant 5 minutes, celle-ci a été centrifugée afin d'éliminer le surnageant. Les cellules ont été mises en suspension dans 4 ml d'une solution contenant 10 mM de tampon MOPS (produit par Dotite Co.), 75 mM de 352, 10 mM de RbCl et 15% de glycérine (pH 6,5), et CaC12,1 l0 mM de RbC1 et 15% -de glycérine (pH 6,5), et on a laissé la suspension à 0 C pendant 15 minutes,
afin d'obtenir des cellules compétentes.
(3) A 200 p1 de la suspension de cellules d'Escherichia coli, on a ajouté 10 1i de la solution d'ADN préparée selon (1) ci-dessus. Après avoir laissé reposer le mélange à 0 C pendant 30 minutes, on lui a ajouté 1 ml de milieu BHI, et le mélange a été maintenu à 37 C pendant 90 minutes. Une fraction aliquote du
mélange (100 ml) a été étalée sur une plaque de gélose-
BHI contenant 25 yg/ml d'ampicilline et autant de kanamycine, et cultivée pendant toute une nuit à 37 C, pour produire des transformants. Ces transformants ont été répliqués sur une plaque de milieu M9 (composition: 1 g de NH4C1, 6 g de Na2HPO4, 3 g de KH2PO4, 0,5 g de 1gd-HC,6gd a P4 NaCl, 2ml de MgSO4 1 M, 10 ml de glucose à 20%, 0,1 ml de CaC12 1 M, 1 ml de chlorure de thiamine à 1 mg/ml, g de gélose, et 1 1 d'eau), et ils ont été cultivés
encore pendant toute une-nuit à 37 C. Environ -
2 000 colonies de transformants ainsi produits ont été examinées, et 3 souches se développant dans le milieu M9 contenant de la thiamine ont été obtenues. L'une
des 3 souches a été appelée Escherichia coli TH16 pGS2.
Un plasmide a été préparé à partir de cette souche conformément à la méthode de Maniatis et al [Maniatis et al, Molecular Cloning, 86-94, Cold Spring Harbor (1982)]. Des cellules compétentes d'Escherichia coli DH1 préparées conformément à la méthode mentionnée ci-dessus, ont été transformées avec cet ADN. Le transformant ainsi obtenu a été appelé Escherichia coli DH1 pGS2 et déposé auprès du "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology", selon le Traité de Budapest; dépôt n 2265, FERM BP-2265. Cette souche, après purification, a été cultivée dans un milieu BHI, & 37 C, pendant toute une nuit. La capacité de production de glutamine synthétase a été déterminée sur
?629099
ce transformant purifié conformément à la méthode de mesure de la glutamine synthétase mentionnée ci-dessus, pour trouver que le transformant a une activité
glutamine synthétase d'environ 3 u/ml.
Le plasmide porté par cette souche a été séparé selon la même méthode mentionnée ci-dessus. Le plasmide ainsi séparé qui contient le gène de la glutamine synthétase et le gène pBR322 a été appelé pGS2. Exemple 3 [Séparation de l'ADN àplasmide pGS2] Escherichia coli DH1 pGS2 a été soumis à une culture avec secousses dans 1 1 de milieu BHI (produit par Difco Co.). Lorsque la prolifération a atteint une turbidité de DO660 = 1, 0, on a ajouté au bouillon du chloramphénicol à une concentration finale égale à ug/ml, la culture avec secousses a été poursuivie au moins pendant 16 autres heures, à 37 C. Après achèvement de la culture, le bouillon a été centrifugé à 3 000 tpm, pendant 10 minutes, afin de recueillir des cellules bactériennes, à partir desquelles l'ADN à plasmide a été préparé conformément à la méthode au lysozyme-SDS et à la méthode au chlorure de césium-bromure d'éthidium [Maniatis
et al, Molecular Cloninq, 86-94, Cold Spring Harbor (1982)].
Exemple 4 [Cartographie du plasmide pSG2 et détermination de la séquence de bases du gène de la glutamine synthétase] Une carte de clivage a été préparée à l'aide des endonucléases EcoRI, XbaI, SphI, BglII, NcoI (toutes produites par Takara Shuzo Co., Ltd.), et NdeI (produit par BRL co.) sur 1'ADN à plasmide pGS2 préparé à partir d'Escherichia coli DH1 pGS2 de la même manière qu'à l'Exemple 3. Les résultats sont représentés sur la Figure 1. La séquence de bases de l'ADN contenant le gène de la glutamine synthétase a été déterminée conformément à la méthode didésoxy à l'aide du phage M13 [Science, 214, 1205-1210 (1981)]. La séquence de bases et la séquence d'acides aminés du gène codant pour la glutamine synthétase étaient telles que représentées par les formules respectivement (II) et (I). Exemple 5 [Préparation de la glutamine synthétase] Le transformant FERM P-9492 a été cultivé dans 1 de milieu BHI (produit par Difco Co.) à 370C, pendant 20 heures, à l'aide d'un fermenteur vibrant. Les cellules cultivées ont été recueillies par centrifugation à 5 oo000 tpm pendant 10 minutes. Les cellules ont été lavées avec 2 1 de sérum physiologique, et mises en suspension dans 2 1 de tampon phosphate 10 mM (pH 7,5). A la suspension ainsi préparée, on a ajouté lmg/ml de lysozyme et du Triton X-100, à une concentration de 0,1%. Après incubation à 37 C pendant 30 minutes, le mélange a été centrifugé à 5 000 tpm
pendant 10 minutes pour recueillir le surnageant résultant.
1,8 1 de ce surnageant a été soumis à une précipitation par le sulfate d'ammonium (40-65%). Le précipité a été recueilli par centrifugation à 5 000 tpm pendant 30 minutes, dissous dans 250 ml de tampon phosphate 10 mM (pH 7,5), dessalé avec Sephadex G-25, puis a été soumis à une chromatographie d'échange d'ions sur DEAE-Sephallose CL-6B, pour recueillir la fraction active. Cette fraction a été dessalée et lyophilisée, pour obtenir un produit pulvérulent. On a trouvé que cet échantillon d'enzyme présentait une activité glutamine synthétase de 19,2 u/mg, comme résultat de la mesure de l'activité glutamine
synthétase conformément à la méthode mentionnée ci-dessus.
La présente invention assure une production
efficace de glutamine synthétase de pureté élevée.
L'invention a également élucidé la structure du gène de la
glutamine synthétase.
Il va de soi que de nombreuses modifications et variantes de la présente invention sont possibles à la lumière des enseignements ci-dessus. Il doit par conséquent être entendu que le domaine de protection ne doit en aucune manière être limité aux modes de réalisation décrits ici d'une manière spécifique, et que l'invention peut être mise en oeuvre autrement qu'avec ces modes de réalisation
spécifiquement décrits.
Claims (8)
1 - ADN comprenant une séquence de bases codant pour une séquence d'acides aminés d'un polypeptide
constituant une glutamine synthétase.
2 - ADN selon la revendication 1, caractérisé par le fait que ladite séquence d'acides amines du polypeptide constituant la glutamine synthétase est représentée par la formule (I) suivante, partant des extrémitesN-terminales: AlaLysPheThrArgGluAspIleThrArgLeuAlaLysGluGluAsnValLysTyrIle ArgLeuGlnPheThrAspIleLeuGlyThrIleLysAsnValGluIleProValSerGln LeuGluLysAlaLeuAspAsnLysMetMetPheAspGlySerSerIleGluGlyPheVal ArgIleGluGluSerAspMetTyrLeuTyrproAspLeuAsnThrTrpvalIlePhePro TrpThrSerGluLysGlyLysValAlaArgLeuIlecysAspIleTyrAsnThrAspGly AlaProPheAspGlyAspProArgThrAsnLeuLysArgValLeuAlaGluAlaArgGlu MetGlyPheThrAspPheAsnLeuGlyProGluProGluPhePheLeuPheLysLeuAsp AlaAlaGlyGluProThrLeuGluLeuAsnAspLysGlyGlyTyrPheAspLeuAlaPro ThrAspLeuGlyGluAsncysArgArgAspIlevalLeuGluLeuGluGluMetGlyphe GluIleGluAlaSerHisHisAlaserserserArgThrHisGluIleAsppheLysTyr AlaAspAlaIleSerAlaCysAspAsnIleGlnThrPheLysLeuValValLysThrIle AlaArgLysHisGlyLeuHisAlaThrPheMetProLysProLeuPheGlyvalAsnGly SerGlyMetHisCysProvalSerLeuPheLysGlySerGlnAsnAlaPheTyrAspThr GluGlyLysLeuGluLeuSerLysThrAlaGluGlnPheIleAlaGlyIleIleLysHis AlaProSerPheThrAlavalThrAsnproThrvalAsnserTyrLysArgLeuvalpro GlyTyrGluAlaProCysTyrvalAlaTrpSerAlaLysAsnArgserProLeuIleArg IleProAlaSerArgGlyValSerThrArgValGluvalArgSerValAspProAlaAla AsnProTyrLeuAlaLeuAlavalIleLeuLysAlaGlyLeuAspGlyIleLysAsnAsn LeuThrProProAlaProValAspArgAsnIleTyrValMetAsnLysGluGluArgGlu GluValGlyIleValAspLeuProAlaThrLeuTyrAlaAlaLeuGluThrLeuLysSer AsnGluIleIleLysGluAlaLeuGlyAspHisLeuLeuGluHisPheIleGluAlaLys GlulleGluTrpAspMetPheArgThrGlnvalHisProTrpGluArgGluGlnTyrMet SerThrTyr (I) 3 - ADN selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il comprend une séquence de bases représentée par la formule (II) suivante, partant de l'extrémité 5':
20 30 40 50 60
GCAAAGTTCACACGTGAAGACATCACTCGTTTAGCAAAAGAAGAAAATGTTAAGTACATC
70 80 90 100 110 120
CGTTTACAGTTTACTGACATTTTAGGGACGATTAAAAACGTTGAAATCCCAGTTAGTCAA
140 150 160 170 180
TTAGAAAAAGCTCTTGATAACAAAATGATGTTTGACGGATCTTCTATTGAAGGCTTCGTA
200 210 220 230 240
CGTATCGAAGAATCTGATATGTACCTATATCCTGATTTAAATACATGGGTTATCTTCCCT
250 260 270 280 290 300
TGGACTTCTGAAAAAGGTAAAGTTGCTCGTCTAATTTGTGATATTTATAATACAGATGGA
310 320 330 340 350 360
GCACCTTTTGATGGAGACCCTCGTACTAACTTAAAACGTGTCCTTGCAGAAGCAAGAGAA
370 380 390 400 410 420
ATGGGCTTCACTGATTTTAATCTTGGACCTGAACCAGAATTCTTCTTATTCAAACTAGAT
430 440 450 460 470 480
GCAGCTGGAGAGCCAACTCTAGAATTGAATGATAAAGGCGGATACTTTGACCTTGCGCCT
490 500 510 520 530 540
ACTGACCTAGGAGAAAACTGCCGTCGCGATATCGTTCTTGAACTTGAAGAAATGGGATTT
550 560 570 580 590 600
GAAATTGAAGCATCCCACCATGCAAGTAGCTCCAGGACACACGAAATTGACTTTAAATAT
610 620 630 640 650 660
GCAGATGCAATTTCAGCATGT7GATAACATCCAAACTTTCAAATTGGTCGTTAAAACGATT
670 680 690 700 710 720
GCCCGTAAACATGGTTTACACGCAACATTCATGCCTAAACCATTGTTCGGTGTTAATGGA
730 740 750 760 770 780
TCAGGTATGCACTGTCCAGTTTCTTTATTCAAAGGAAGCCAAAATGCCTTTTACGATACA
790 800 810 820 830 840
GAAGGAAAATTAGAACTAAGTAAAACAGCAGAGCAATTTATCGCTGGTATCATTAAGCAT
850 860 ' 870 880 890 900
GCTCCTAGCTTCACAGCGGTAACAAACCCAACTGTTAACTCATACAAACGTCTAGTGCCT
910 920 930 940 950 960
GGTTACGAAGCTCCTTGTTATGTTGCTTGGTCTGCTAAAAACCGTAGCCCATTAATTCGT
970 980 990 1000 1010 1020
ATCCCAGCTTCACGCGGTGTTAGTACTCGTGTTGAGGTACGTAGTGTCGATCCAGCAGCC
1030 1040 1050 1060 1070 1080
AATCCATACTTGGCACTTGCTGTAATATTGAAAGCTGGTCTTGACGGTATCAAAAACAAC
1090 1100 1110 1120 1130 1140
CTAACTCCTCCAGCTCCAGTTGACCGTAACATTTATGTAATGAATAAAGAAGAACGTGAA
1150 1160 1170 1180 1190 1200
GAAGTAGGAATCGTAGATCTACCAGCTACTTTATATGCTGCATTGGAAACATT"AAAATCC
1210 1220 1230 1240 - 1250 1260
AATGAAATCATCAAAGAAGCTCTTGGTGATCACTTGCTTGAACACTTCATCGAAGCAAAA
1270 1280 1290 1300 1310 1320
GAAATTGAGTGGGATATGTTCCGCACACAAGTTCACCCATGGGAACGCGAACAATATATG
TCTACTTAT (II)
4 - Transformant comprenant un ADN dont la séquence de bases code pour une séquence d'acides aminés du polypeptide constituant la glutamine synthétase et qui est
étranger. par rapport au microorganisme hôte.
5 - Transformant selon la revendication 4, caractérisé par le fait que ladite séquence d'acides aminés du polypeptide constituant la glutamine synthétase est représentée par la formule (I) suivante, partant des extrémitésN-terminales: AlaLysPheThrArgGluAspIleThrArgLeuAlaLysGluGluAsnValLysTyrIle ArgLeuGlnPheThrAspIleLeuGlyThrIleLysAsnValGluIleProValSerGln LeuGluLysAlaLeuAspAsnLysMetMetPheAspGlySerSerIleGluGlyPheVal ArgIleGluGluSerAspMetTyrLeuTyrProAspLeuAsnThrTrpValIlePhePro TrpThrSerGluLysGlyLysValAlaArgLeuIleCysAspIleTyrAsnThrAspGly AlaProPheAspGlyAspProArgThrAsnLeuLysArgvalLeuAlaGluAlaArgGlu MetGlyPheThrAspPheAsnLeuGlyProGluProGluPhePheLeuPheLysLeuAsp AlaAlaGlyGluProThrLeuGluLeuAsnAspLysGlyGlyTyrPheAspLeuAlaPro ThrAspLeuGlyGluAsnCysArgArgAspIleValLeuGluLeuGluGluMetGlyPhe GluIleGluAlaSerHisHisAlaSerserSerArgThrHisGluIleAspPheLysTyr AlaAspAlaIleSerAlaCysAspAsnIleGlnThrPheLysLeuValValLysThrIle AlaArgLysHisGlyLeuHisAlaThrPheMetProLysProLeuPheGlyValAsnGly SerGlyMetHisCysProValSerLeuPheLysGlySerGlnAsnAlaPheTyrAspThr GluGlyLysLeuGluLeuSerLysThrAlaGluGlnPheIleAlaGlyIleIleLysHis AlaProSerPheThrAlaValThrAsnProThrValAsnSerTyrLysArgLeuValPro GlyTyrGluAlaProCysTyrValAlaTrpSerAlaLysAsnArgSerProLeuIleArg IleProAlaSerArgGlyValSerThrArgValGluValArgSerValAspProAlaAla AsnProTyrLeuAlaLeuAlaValIleLeuLysAlaGlyLeuAspGlyIleLysAsnAsn LeuThrProProAlaProValAspArgAsnIleTyrValMetAsnLysGluGluArgGlu GluValGlyIleValAspLeuProAlaThrLeuTyrAlaAlaLeuGluThrLeuLysSer AsnGluIleIleLysGluAlaLeuGlyAspHisLeuLeuGluHisPheIleGluAlaLys GluIleGluTrpAspMetPheArgThrGlnvalHisProTrpGluArgGluGlnTyrMet SerThrTyr (I) 6 - Transformant selon la revendication 4, caractérisé par le fait qu'il comprend une séquence de bases représentée par la formule (II) suivante, partant de l'extrémité 5':
10 20 30 40 50 60
GCAAAGTTCACACGTGAAGACATCACTCGTTTAGCAAAAGAAGAAAATGTTAAGTACATC
80 90 100 - 110 120
CGTTTACAGTTTACTGACATTTTAGGGACGATTAAAAACGTTGAAATCCCAGTTAGTCAA
140 150 160 170 180
TTAGAAAAAGCTCTTGATAACAAAATGATGTTTGACGGATCTTCTATTGAAGGCTTCGTA
200 210 220 230 240
CGTATCGAAGAATCTGATATGTACCTATATCCTGATTTAAATACATGGGTTATCTTCCCT
250 260 270 280 290 300
TGGACTTCTGAAAAAGGTAAAGTTGCTCGTCTAATTTGTGATATTTATAATACAGATGGA
310 320 330 340 350 360
GCACCTTTTGATGGAGACCCTCGTACTAACTTAAAACGTGTCCTTGCAGAAGCAAGAGAA
370 380 390 400 410 420
ATGGGCTTCACTGATTTTAATCTTGGACCTGAACCAGAATTCTTCTTATTCAAACTAGAT
430 440 450 460 470 480
GCAGCTGGAGAGCCAACTCTAGAATTGAATGATAAAGGCGGATACTTTGACCTTGCGCCT
490 500 510 520 530 540
ACTGACCTAGGAGAAAACTGCCGTCGCGATATCGTTCTTGAACTTGAAGAAATGGGATTT
550 560 570 580 590 600
GAAATTGAAGCATCCCACCATGCAAGTAGCTCCAGGACACACGAAATTGACTTTAAATAT
610 620 630 640 650 660
GCAGATGCAATTTCAGCATGTGATAACATCCAAACTTTCAAATTGGTCGTTAAAACGATT
670 680 690 700 710 720
GCCCGTAAACATGGTTTACACGCAACATTCATGCCTAAACCATTGTTCGGTGTTAATGGA
730 740 750 76l 770 780
TCAGGTATGCACTGTCCAGTTTCTTTATTCAAAGGAAGCCAAAATGCCTTTTACGATACA
790 800 810 820 830 840
GAAGGAAAATTAGAACTAAGTAAAACAGCAGAGCAATTTATCGCTGGTATCATTAAGCAT
850 860 870 880 890 900
GCTCCTAGCTTCACAGCGGTAACAAACCCAACTGTTAACTCATACAAACGTCTAGTGCCT
910 920 930 940 950 960
GGTTACGAAGCTCCTTGTTATGTTGCTTGGTCTGCTAAAAACCGTAGCCCATTAATTCGT
970 980 990 1000 1010 1020
ATCCCAGCTTCACGCGGTGTTAGTACTCGTGTTGAGGTACGTAGTGTCGATCCAGCAGCC
1030 1040 1050 1060 1070 1080
AATCCATACTTGGCACTTGCTGTAATATTGAAAGCTGGTCTTGACGGTATCAAAAACAAC
1090 1100 1110 1120 1130 1140
CTAACTCCTCCAGCTCCAGTTGACCGTAACATTTATGTAATGAATAAAGAAGAACGTGAA
1150 1160 1170 1180 1190 1200
GAAGTAGGAATCGTAGATCTACCAGCTACTTTATATGCTGCATTGGAAACATTAAAATCC
1210 1220 1230 1240 1250 1260
AATGAAATCATCAAAGAAGCTCTTGGTGATCACTTGCTTGAACACTTCATCGAAGCAAAA
1270 1280 1290 1300 1310 1320
GAAATTGAGTGGGATATGTTCCGCACACAAGTTCACCCATGGGAACGCGAACAATATATG
TCTACTTAT (II)
7 - Transformant selon la revendication 4, caractérisé par le fait que le microorganisme hôte est un
microorganisme appartenant au genre Escherichia.
8 - Transformant selon la revendication 7, caractérisé par le fait que le microorganisme hôte est un
microorganisme appartenant à l'espèce Escherichia coli.
9 - Transformant selon la revendication 8, caractérisé par le fait que ledit microorganisme hôte est Escherichia coli DH1 pGS 2 [Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology; dépôt n 2265,
FERM BP-2265].
- Polypeptide constituant la glutamine synthétase comprenant une séquence d'acides aminés représentée par la formule (I) suivante, partant des extrémitésN-terminales: AlaLysPheThrArgGluAspIleThrArgLeuAlaLysGluGluAsnvalLysTyrIle ArgLeuGlnPheThrAspIleLeuGlyThrIleLysAsnValGluIleProValSerGln LeuGluLysAlaLeuAspAsnLysMetMetpheAspGlySerserIleGluGlyPheVal ArgIleGluGluSerAspMetTyrLeuTyrProAspLeuAsnThrTrpvalIlePhePro TrpThrSerGluLysGlyLysValAlaArgLeuIleCysAspIleTyrAsnThrAspGly AlaProPheAspGlyAspProArgThrAsnLeuLysArgValLeuAlaGluAlaArgGlu MetGlyPheThrAspPheAsnLeuGlyProGluProGluPhePheLeuPheLysLeuAsp AlaAlaGlyGluProThrLeuGluLeuAsnAspLysGlyGlyTyrPheAspLeuAlaPro ThrAspLeuGlyGluAsnCysArgArgAspIleValLeuGluLeuGluGluMetGlyPhe GluIleGluAlaSerHisHisAlaSerSerSerArgThrHisGluIleAspPheLysTyr AlaAspAlaIleSerAlaCysAspAsnIleGlnThrPheLysLeuvalValLysThrIle AlaArgLysHisGlyLeuHisAlaThrPheMetProLysProLeuPheGlyvalAsnGly SerGlyMetHisCysProValSerLeuPheLysGlySerGlnAsnAlaPheTyrAspThr GluGlyLysLeuGluLeuSerLysThrAlaGluGlnPheIleAlaGlyIleIleLysHis AlaProSerPheThrAlaValThrAsnProThrvalAsnSerTyrLysArgLeuValPro GlyTyrGluAlaProcysTyrValAlaTrpSerAlaLysAsnArgSerProLeuIleArg IleProAlaSerArgGlyvalSerThrArgValGluValArgSerValAspProAlaAla AsnProTyrLeuAlaLeuAlavalIleLeuLysAlaGlyLeuAspGlyIleLysAsnAsn LeuThrProProAlaProValAspArgAsnIleTyrValMetAsnLysGluGluArgGlu GluValGlyIleValAspLeuProAlaThrLeuTyrAlaAlaLeuGluThrLeuLysSer AsnGluIleIleLysGluAlaLeuGlyAspHisLeuLeuGluHisPheIleGluAlaLys GluIleGluTrpAspHetPheArgThrGlnvalHisproTrpGluArgGluGlnTyrMet SerThrTyr (I) 11 - Procédé de préparation de la glutamine synthétase, caractérisé par le fait qu'il comprend: -la culture d'un transformant ayant un ADN qui comprend une séquence de bases codant pour une séquence d'acides aminés d'un polypeptide constituant la glutamine synthétase et qui est étranger par rapport au microorganisme hôte, pour amener ledit transformant à exprimer l'information génétique dudit ADN; et - la collecte du polypeptide constituant la glutamine
synthétase à partir du bouillon de culture.
12 - Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que la séquence d'acides aminés du polypeptide constituant la glutamine synthétase est représentée par la formule (I) suivante, en partant des extrémitésN-terminales: AlaLysPheThrArgGluAspIleThrArgLeuAlaLysGluGluAsnValLysTyrIle ArgLeuGlnPheThrAspIleLeuGlyThrIieLysAsnValGluIleProValSerGln LeuGluLysAlaLeuAspAsnLysMetMetPheAspGlySerSerIleGluGlyPheVal ArgIleGluGluSerAspMetTyrLeuTyrProAspLeuAsnThrTrpValIlePhePro TrpThrSerGluLysGlyLysValAlaArgLeuIleCysAspIleTyrAsnThrAspGly AlaProPheAspGlyAspProArgThrAsnLeuLysArgValLeuAlaGluAlaArgGlu MetGlyPheThrAspPheAsnLeuGlyProGluProGluPhePheLeuPheLysLeuAsp AlaAlaGlyGluProThrLeuGluLeuAsnAspLysGlyGlyTyrPheAspLeuAlaPro ThrAspLeuGlyGluAsnCysArgArgAspIleValLeuGluLeuGluGluMetGlyPhe GluIleGluAlaSerHisHisAlaSerSerSerArgThrHisGluIleAspPheLysTyr AlaAspAlaIleSerAlaCysAspAsnIleGlnThrPheLysLeuValValLysThrIle AlaArgLysHisGlyLeuHisAlaThrPheMetProLysProLeuPheGlyValAsnGly SerGlyMetHisCysProValSerLeuPheLysGlySerGlnAsnAlaPheTyrAspThr GluGlyLysLeuGluLeuSerLysThrAlaGluGlnPheIleAlaGlyIleIleLysHis AlaProSerPheThrAlaValThrAsnProThrValAsnSerTyrLysArgLeuValPro GlyTyrGluAlaProCysTyrValAlaTrpSerAlaLysAsnArgSerProLeuIleArg IleProAlaSerArgGlyValSerThrArgValGluValArgSerValAspProAlaAla AsnProTyrLeuAlaLeuAlaValIleLeuLysAlaGlyLeuAspGlyIleLysAsnAsn LeuThrProProAlaProValAspArgAsnIleTyrValMetAsnLysGluGluArgGlu GluValGlyIleValAspLeuProAlaThrLeuTyrAlaAlaLeuGluThrLeuLysSer AsnGluIleIleLysGluAlaLeuGlyAspHisLeuLeuGluHisPheIleGluAlaLys GluIleGluTrpAspMetPheArgThrGlnValHisproTrpGluArgGluGlnTyrMet SerThrTyr (I)
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