JPH0866191A - 環状イソマルトオリゴ糖合成酵素遺伝子を含有するｄｎａ、組み換え体ｄｎａ、及び環状イソマルトオリゴ糖合成酵素の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 下記の制限酵素開裂地図を有し、かつ、環状
イソマルトオリゴ糖合成酵素（分子量103kd ）遺伝子を
含有するＤＮＡ、該ＤＮＡをベクタ−DNAに挿入した組
み換え体ＤＮＡ、該組み換え体ＤＮＡを含み、環状イソ
マルトオリゴ糖合成酵素生産能を有するエッシェリヒア
属に属する微生物を、培地に培養し、微生物より環状イ
ソマルトオリゴ糖合成酵素を採取することによる該酵素
の製造法。 【化１】 （式中、ＢはBamHI 、ＥはEcoRI 、ＨはHindIII 、Ｐは
PstIを示す。） 【効果】 本発明によれば、短時間に、かつ、培地に高
価なデキストランを用いることなく効率良くマルトオリ
ゴ糖合成酵素を得ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、環状イソマルトオリゴ
糖合成酵素遺伝子を含有するＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組
み換え体ＤＮＡ、及び該組み換え体ＤＮＡを含む宿主を
培地に培養し、培養物から環状イソマルトオリゴ糖合成
酵素を採取することによる該酵素の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】デキストランから環状イソマルトオリゴ
糖合成酵素の作用により合成される環状イソマルトオリ
ゴ糖は、土壌より単離したバチルス・エスピー T-3040
株のデキストラン含有培地での培養液から、本発明者等
により初めて単離された新規な環状オリゴ糖であり、サ
イクロデキストリンと同様に低分子化合物と包接化合物
を形成することにより、医薬品、食品等への利用が期待
され、また抗腐食剤として有用な環状オリゴ糖である。
(特開平6-197783号公報）。更に、デキストランから環
状イソマルトオリゴ糖を合成する酵素である環状イソマ
ルトオリゴ糖合成酵素も、本発明者等により、同培養液
から初めて単離された。そして、上記環状イソマルトオ
リゴ糖合成酵素は、バチルス属に属し、環状イソマルト
オリゴ糖合成酵素生産能を有する微生物、例えばバチル
ス・エスピーT-3040株をデキストリン含有培地に培養
し、培養物より該酵素を採取することにより製造されて
いる。(特願平5-153456号公報）。しかしながら、上記
酵素の製造法によるときには、バチルス・エスピー T-3
040株を培養するため培養時間が長く、かつ、培地に高
価なデキストランの添加を必要し、また、酵素の収率の
点で充分ではなかった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、環状
イソマルトオリゴ糖合成酵素遺伝子を含有するＤＮＡを
単離し、該ＤＮＡを含む組み換え体ＤＮＡを得、該組み
換え体ＤＮＡを含む宿主を培地に培養し、培養物から環
状イソマルトオリゴ糖合成酵素を採取することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は、
上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、バチルス・エ
スピー T-3040菌株から環状イソマルトオリゴ糖合成酵
素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡを初めて単離及
び構造決定することに成功し、更に、該ＤＮＡをベクタ
ーＤＮＡに組み込んでなる組み換え体ＤＮＡを得、該組
み換え体ＤＮＡを含むエッシェリシア属に属する微生物
を培地に培養すれば、環状イソマルトオリゴ糖合成酵素
を効率良く製造することができること等の知見を得、本
発明を完成させた。

【０００５】すなわち、本発明は、下記の制限酵素開裂
地図を有し、かつ、環状イソマルトオリゴ糖合成酵素
（分子量103kd ）遺伝子を含有するＤＮＡ、

【０００６】

【化２】 （式中、ＢはBamHI 、ＥはEcoRI 、ＨはHindIII 、Ｐは
PstIを示す。）

【０００７】配列番号１に示されるアミノ酸配列を有す
る環状イソマルトオリゴ糖合成酵素をコードするＤＮ
Ａ、配列番号２に示される塩基配列を有する環状イソマ
ルトオリゴ糖合成酵素をコードするＤＮＡ、配列番号４
に示されるアミノ酸配列を有する成熟環状イソマルトオ
リゴ糖合成酵素をコードするＤＮＡである。本発明はま
た、上記いずれかの記載のＤＮＡ（但し、配列番号４に
示されるアミノ酸配列を有する成熟環状イソマルトオリ
ゴ糖合成酵素をコードするＤＮＡを除く）を含む組み換
え体ＤＮＡ、並びに該組み換え体ＤＮＡを含むエッシェ
リシア属に属する微生物を培地に培養し、培養物より環
状イソマルトオリゴ糖合成酵素を採取することを特徴と
する環状イソマルトオリゴ糖合成酵素の製造法である。

【０００８】以下、本発明について詳細に説明する。先
ず、環状イソマルトオリゴ糖合成酵素をコードする遺伝
子を含有するＤＮＡの調製について述べる。本酵素をコ
ードする遺伝子を含有するＤＮＡのドナー微生物として
は、本酵素を生産するものであれば、如何なるものでも
よく、例えば、バチルス・エスピーT-3040菌株（FERM B
P-4132）等が挙げられる。上記菌株の培養は、原則的に
は一般微生物の好気的培養で採用される方法と同じであ
り、通常は、液体培地による振盪培養法または、通気撹
拌培養法等が用いられる。培地としては、適当な窒素
源、炭素源、ビタミン、ミネラル及び本酵素の誘導基質
であるデキストランを含んだものが用いられる。pHは、
本菌が成育するpH領域であればいずれでもよく、通常
は、6〜8の範囲が好ましい。

【０００９】培養条件は、例えば、通常20〜40℃で、16
時間〜4日間振盪培養または通気撹拌培養を行なう。こ
のようにして得られる培養物を、例えば3000rpm以上、
好ましくは8000〜10000rpmで5分以上、好ましくは10〜1
5分間遠心分離してバチルス・エスピー T-3040株の菌体
を得る。この菌体より、例えば、斎藤、三浦の方法［バ
イオケム・バイオフィズ・アクタ（Biochem.Biophys.Ac
ta)、第72巻、第619頁（1963年）］の方法等により染色
体DNAを得ることができる。

【００１０】次いで、この染色体DNAに突出末端を生じ
させる制限酵素、例えばSau3A1〔ベーリンガーマンハイ
ム社製〕を、温度30℃以上、好ましくは37℃、酵素濃度
0.1〜10ユニット/mlで20分以上、好ましくは30分〜2時
間作用させて部分消化し、種々の鎖長の染色体DNA断片
を得る。染色体DNA断片は、必要に応じてフェノ−ル抽
出処理、フェノ−ル、クロロホルム抽出処理、エタノ−
ル沈殿処理等の既存の精製行程により精製する。

【００１１】一方、本発明において用いることのできる
ベクタ−DNAとしては、如何なるものでもよく、例えば
プラスミドベクタ−DNA、バクテリオファ−ジベクタ−D
NA等が挙げられるが、具体的には、例えば、プラスミド
pUC118DNA〔宝酒造社製〕等が好ましい。

【００１２】上記ベクタ−DNAに突出末端を生じさせる
制限酵素、例えばBamHＩを、温度30℃以上、好ましくは
37℃、酵素濃度10〜1000ユニット/mlで1時間以上、好ま
しくは1〜3時間作用させて消化し、切断されたベクタ−
DNAを得る。ベクタ−DNAは、必要に応じてフェノ−ル抽
出処理、フェノ−ル、クロロホルム抽出処理、あるいは
エタノ−ル沈殿処理等の既存の精製行程により精製す
る。

【００１３】次いで、上記のようにして得たバチルス・
エスピー T-3040株由来で、環状イソマルトオリゴ糖合
成酵素をコードする遺伝子を含有するDNA断片混合物と
切断されたベクタ−DNAを混合し、これに例えば大腸菌D
NAリガ−ゼ〔ニュ−イングランドバイオラブス社製〕T4
DNAリガ−ゼ〔ベ−リンガ−マンハイム社製〕等、好ま
しくはT4DNAリガ−ゼを、温度4〜37℃、好ましくは4〜1
6℃、酵素濃度1〜100ユニットで1時間以上、好ましくは
6〜24時間作用させて組み換え体ＤＮＡを得る。本工程
は市販のライゲ−ションキット〔宝酒造社製〕を用いて
行なうことも可能である。

【００１４】この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大
腸菌K-12、好ましくは大腸菌JM101（ATCC33876)、大腸
菌JM109〔宝酒造社製〕、大腸菌HB101（ATCC33694)、大
腸菌DHＩ(ATCC33849)、大腸菌χ-1776 (ATCC31244)、大
腸菌XL1-Blue MRF'[東洋紡社製] 等を形質転換あるいは
形質導入して夫々の菌株を得る。この形質転換は、ディ
−・エム・モ−リソン（D.M.Morrison)の方法〔メソヅ
・イン・エンザイモロジ−（Methods in Enzymology)、
第68巻、第326〜331頁（1979年）〕により行なうことが
できる。また形質導入は、ビ−・ホ−ン（B.Hohn）の方
法〔メソズ・イン・エンザイモロジ−（Methods in Enz
ymology)、第68巻、第299〜309頁（1979年）〕によって
行なうことができる。

【００１５】そして、上記菌株より環状イソマルトオリ
ゴ糖合成酵素生産能を有する菌株をスクリ−ニングする
ことにより、環状イソマルトオリゴ糖合成酵素をコ−ド
する遺伝子を含有するDNAをベクタ−DNAに挿入した組み
換え体ＤＮＡを含み、環状イソマルトオリゴ糖合成酵素
生産能を有するエッシェリヒア属に属する菌株を得るこ
とができる。

【００１６】このようにして得られた菌株より純化され
た新規な組み換え体ＤＮＡを得るには、例えば、ピ−・
グ−リ−（P.Guerry）等の方法〔ジェイ．バクテリオロ
ジ−（J.Bacteriology)、第116巻、第1064〜1066頁（19
73年）〕、デ−・ビ−・クレウェル（D.B.Clewell)の方
法〔ジェイ．バクテリオロジ−（J.Bacteriology)、第1
10巻、第667〜676頁（1972年）〕等により得ることがで
きる。

【００１７】更に上記環状イソマルトオリゴ糖合成酵素
をコードする遺伝子を含有するDNAを用いて、実施例１
の項目(4) に示すようにTaqポリメラ−ゼを用いたサン
ガ−・ジデオキシ・タ−ミネ−ション（Sanger/dideoxy
termination）法によって環状イソマルトオリゴ糖合成
酵素遺伝子の全塩基配列の解析を行ない（配列番号2参
照）、次いで前記塩基配列を有する遺伝子によって翻訳
されるポリペプチドのアミノ酸一次配列を確定する（配
列番号1参照）。

【００１８】上記のようにして得られた環状イソマルト
オリゴ糖合成酵素遺伝子を含有するDNAをベクタ−DNAに
挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、環状イソマルトオリ
ゴ糖合成酵素生産能を有するエッシェリヒア属に属する
菌株を用いて環状イソマルトオリゴ糖合成酵素を生産す
るには、培養方法は、原則的には一般微生物の好気的培
養で採用される方法と同じであるが、通常は、液体培地
による振盪培養法または、通気撹拌培養法等が好まし
い。また、培地としては、例えば酵母エキス、ペプト
ン、肉エキス、コ−ンスティ−プリカ−あるいは大豆も
しくは小麦ふすまの浸出液等の1種以上の窒素源に燐酸
第一カリウム、燐酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸
第二鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の1種以上を
添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添
加したものが用いられる。なお、初発pHは、7〜9に調製
するのが適当である。また培養は30〜42℃、好ましくは
37℃前後で4〜24時間、好ましくは6〜24時間実施するの
が好ましい。

【００１９】培養終了後、該培養物より環状イソマルト
オリゴ糖合成酵素を採取するには、通常の酵素採取手段
を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を
超音波破砕処理、摩砕処理等で破砕するか、または、リ
ゾチ−ム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、ま
たは、トルエン等の存在下で振盪もしくは放置して自己
消化をおこなわせ本酵素を菌体外に排出させる。この溶
菌液を濾過、遠心分離などして固形部分を除去し、必要
によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩あ
るいは硫酸マンガンにより除核酸したのち、これに硫
安、アルコ−ル、アセトン等を添加して分画し、沈殿物
を採取し、これを水に透析した後真空乾燥して粗酵素標
品を得る。

【００２０】更に、環状イソマルトオリゴ糖合成酵素の
精製標品を得るには、例えばDEAE-セファロ−ス〔ジエ
チルアミンエチルセファロ−ス、ファルマシア社製〕、
DEAE-セファデックス〔ファルマシア社製〕等のイオン
交換クロマトグラフィ−、あるいは、例えばセファデッ
クスG−200〔ファルマシア社製〕、バイオラッドP−150
〔バイオラッド社製〕等のゲル濾過による各種クロマト
グラフィ−を行ない、必要により、例えばTSK gel DEAE
-5PW〔東ソ−社製〕等のイオン交換クロマトグラフィ−
あるいは、例えば、TSK gel エ−テル5PW〔東ソ−社
製〕、TSK gel フェニル5PW〔東ソ−社製〕等の疎水ク
ロマトグラフィ−、あるいは、例えばTSK gel G3000SW
〔東ソ−社製〕等のHPLC（高速液体クロマトグラフィ
−）操作を適宜組合せて実施することにより、高度に精
製された環状イソマルトオリゴ糖合成酵素標品を得るこ
とができる。

【００２１】上記手段により得られる精製環状イソマル
トオリゴ糖合成酵素の理化学的性質は、以下の通りであ
る。 作用 デキストラン等のα−1、6結合より成るグルコースポリ
マーに作用し、分子内糖転移反応により環状イソマルト
オリゴ糖を生成する。 基質特異性 α−1、6結合を主鎖とするデキストリンには作用する
が、構造中に一部グルコースのα−1、6結合を有する、
アミロペクチン、プルラン等には作用しない。 至適pH及び安定pH pH5.5付近で作用し、pH4.5〜8.5の範囲で安定である。

【００２２】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定され
るものではない。 〔実施例１〕（環状イソマルトオリゴ糖合成酵素遺伝子
の単離、配列決定） (1)バチルス・エスピー T-3040菌株の染色体DNAの調製 1%デキストラン40（名糖産業社製）、1%ペプトン（極東
製薬工業社製）、0.5%NaCl及び0.1%イ−ストエキストラ
クト（ディフコ社製）からなる液体培地（水道水使用、
pH 7.0)100mlを500ml容坂口フラスコに入れ、120℃で20
分間、滅菌処理を行なった。これに、バチルス・エスピ
ー T-3040菌株（FERM BP-4132)保存スラントより1白金
耳接種し、30℃で1日間振盪培養した。本培養液1mlを上
記と同様の培地組成と滅菌条件により調製した10mlの培
地を含有する大型試験管に接種し、30℃、120rpmの条件
で2日間振盪培養を行ない、培養終了後、培養液から800
0rpmで20分間の遠心分離処理により菌体を分離し、湿潤
菌体約50mgを得たのち、該菌体から斎藤、三浦の方法
〔バイオケム．バイオフィズ．アクタ．（Biochim.Biop
hys. Acta)、第72巻、第619頁（1963年）〕により染色
体DNA溶液1mlを得た。次いで、この染色体溶液360μl
（約200μg染色体DNA）及び制限酵素Sau3A1（宝酒造社
製）0.2ユニットを、50mMトリスー塩酸緩衝液（100mM Na
Cl及び10mM MgSO₄含有）（pH7.4）に混合し、37℃で1時
間反応させて部分消化液を得た。反応終了液を常法によ
り、フェノ−ル抽出処理し、エタノ−ル沈殿処理した
後、このSau3A1で部分消化されたDNA断片が再結合する
ことを防止するために、モレキュラ−・クロ−ニング
（Molecular Cloning)、第133〜134頁記載の方法で子牛
ホスファタ−ゼ（Calf Intestine Alkaline Phosphatas
e)処理により、DNA断片の脱燐酸化反応を行ない、常法
によりフェノ−ル抽出処理し、更にエタノ−ル沈殿処理
して、Sau3A1で部分消化されたバチルス・エスピー T-3
040菌株の染色体DNA断片160μgを得た。

【００２３】(2)プラスミドベクタ−pUC118DNAを利用し
たバチルス・エスピー T-3040菌株の染色体DNAライブラ
リ−の作製及び環状イソマルトオリゴ糖合成酵素遺伝子
の検索 プラスミドベクタ−pUC118DNA（宝酒造社製）20μg及び
制限酵素BamHＩ（宝酒造社製）10ユニットを、50mMトリ
ス-塩酸緩衝液（100mM NaCl及び10mM MgSO4含有）（pH
7.4）に混合し、温度37℃で2時間反応させて消化液を得
た。反応終了液を常法により、フェノ−ル抽出処理し、
エタノ−ル沈殿処理して、BamHＩで消化されたプラスミ
ドベクタ−pUC118を得た。次いで、このBamHＩで消化さ
れたプラスミドベクタ−pUC118DNA断片1μg、上記項目
(1)で得られたSau3A1で部分消化されたバチルス・エス
ピー T-3040菌株の染色体DNA断片1μg及びDNAライゲ−
ションキット（宝酒造社製）を常法に従って混合したの
ち、温度16℃で16時間反応し、DNAを連結させた。この
ようにして得た組み換え体プラスミドDNA含有液10μlを
大腸菌コンピテントセル（XL1-Blue MRF')〔東洋紡社
製〕100μlと混合し、氷中で20分間静置することにより
形質転換を行なった。本形質転換液110μlを前記と同様
の滅菌条件により調製した滅菌済T-Y培地［1%（W/V）バ
クト−トリプトン（ディフコ社製）、0.5%（W/V）イ−
ストエキストラクト（ディフコ社製）及び0.5%（W/V）N
aCl（pH7.2）］3mlに接種し、37℃で30分間振盪培養し
た後、培養液を200μlずつ滅菌済ブルーデキストラン含
有X-Galプレ−ト［0.5%(W/V)ブルーデキストラン（ファ
ルマシア社製）、1%（W/V）バクト−トリプトン（ディ
フコ社製）、0.5%（W/V）イ−ストエキストラクト（デ
ィフコ社製）、0.5%（W/V）NaCl、1.5%寒天（pH7.2）を
前記と同様の滅菌条件により滅菌処理したものに、滅菌
済フィルタ−（孔径0.22μm)〔ミリポア社製〕で無菌濾
過したIPTG（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）
（ベ−リンガ−マンハイム社製）、X-Gal（5-bromo-4-c
hloro-3-indolyl-galactopyranoside）（ベ−リンガ−
マンハイム社製）及びアンピシリン（シグマ社製）を無
菌的に添加して夫々、50μg/ml（W/V）IPTG、40μg/ml
（W/V）X-Gal及び25μg/ml（W/V）アンピシリンの濃度
に調製した培地を直径9cmのシャ−レに20mlずつ分注し
たプレ−ト］に塗布し、37℃で24時間静地培養した。生
じたコロニーのうち、白色コロニ−のものを染色体DNA
ライブラリーとし、ライブラリーの中でコロニーのまわ
りにクリアーハローを生じる菌株を検索した。その結
果、染色体DNAライブラリ−約2000コロニ−より陽性コ
ロニ−を1株得た。該陽性株を前記と同様の滅菌条件に
より調製した滅菌済T-Y培地にアンピシリン及びIPTGを
各々終濃度50μg/mlになるように、無菌的に添加して調
製した液体培地3mlに1白金耳接種後、37℃で16時間振盪
培養を行ない培養終了後、培養液を8000rpmで20分間遠
心分離することにより菌体を分離し、湿潤菌体約2mgを
得た。該菌体から、〔モレキュラ−・クロ−ニング・ア
・ラボラトリ−・マニュアル・セカンド・エディション
（Molecular Cloning a Laboratory Manual Second Edi
tion)、第25〜28頁、コ−ルド・スプリング・ハ−バ−
・ラボラトリ−・プレス（ColdSpring Harbor Laborato
ry Press)、1989年〕記載のアルカリ法により環状イソ
マルトオリゴ糖合成酵素遺伝子を含んだプラスミドDNA
を抽出し、常法に従いエタノール沈殿処理により精製し
た後、200μlのTE(10mM Tris、1mM EDTA、 pH 8.0)緩衝
液に溶解した。該組み換え体プラスミドDNAをpCI429と
命名した。該プラスミドDNAを用いて〔ジェイ. バクテ
リオロジ−（J. Bacteriology)第119巻、第1072頁〜107
4頁 (1974年)〕記載の形質転換法により大腸菌XL1-Blue
MRF' 株を形質転換し、環状イソマルトオリゴ糖合成活
性を検討し、形質転換株を得た。このようにして得られ
た大腸菌XL1-Blue MRF'(pCI429) は、工業技術院生命工
学工業技術研究所にFERM BP-4783として寄託されてい
る。更に、本組み換え体プラスミドDNA1μgを制限酵素H
indIII( ベ−リンガ−マンハイム社製)、BamHI(宝酒造
社製)及びEcoRI （ベ−リンガ−マンハイム社製）、Pst
Ｉ（ベーリンガーマンハイム社製）を組み合せて処理す
ることにより切断した後、常法に従い0.7%及び1.5%アガ
ロ−スゲル電気泳動を行ない各DNA断片の長さを調べる
ことにより、制限酵素開裂地図を作成した。

【００２４】(3)大腸菌XL1-Blue MRF'(pCI429) の培養
及び粗酵素液の調製 大腸菌XL1-Blue MRF'(pCI429)(FERM BP-4783) を、T-Y
培地3ml中で温度37℃で16時間振盪培養したのち、培養
液を氷中で2分間超音波処理し、12000rpmで20分間遠心
分離操作をすることにより、細胞残渣を取り除いて得た
粗酵素液中の環状イソマルトオリゴ糖合成活性は、約3m
U/mlであった。尚、比較のためpUC118ベクタ−DNAを有
する大腸菌JM109を用いて、上記と同様の処理を行なっ
て得た細胞抽出液中の環状イソマルトオリゴ糖合成活性
を測定した結果、活性は検出されなかった。

【００２５】(4)バチルス・エスピー T-3040株（FERM B
P-4132)由来の環状イソマルトオリゴ糖合成酵素遺伝子
の塩基配列の解析 項目(2)で得られた組み換え体プラスミドpCI429DNA10μ
gを制限酵素SphＩ（ベ−リンガ−マンハイム社製）1ユ
ニット、BamHＩ（宝酒造社製）1ユニット、制限酵素用
緩衝液（ベ−リンガ−マンハイム社製）2μl及び滅菌水
10μlと混合して、37℃で1時間処理することにより切断
し、反応溶液を1.5%アガロ−スゲル電気泳動操作に供し
た。目的のDNA断片をゲルから常法に従って抽出したの
ち、エタノ−ル沈殿処理を行なって約5μgの精製DNA断
片を得た。次いで、SphＩ（ベ−リンガ−マンハイム社
製）1ユニット、BamHＩ（宝酒造社製）1ユニット、制限
酵素用緩衝液（ベ−リンガ−マンハイム社製）2μl及び
滅菌水19μlと混合して37℃で１時間反応を行なったpUC
119ベクタ−DNA1μgと該精製DNA約2.5μg及びライゲ−
ションキット（宝酒造社製）を混合し、連結反応を16℃
で16時間行なった。該反応液を用いて〔ジェイ. バクテ
リオロジ−（J. Bacteriology)第119巻、第1072頁〜107
4頁 (1974年)〕記載の形質転換法により大腸菌XL1-Blue
MRF' 株を形質転換し、環状イソマルトオリゴ糖合成酵
素活性を検討し、形質転換株を得た。更に、該形質転換
株の培養液10mlから、〔モレキュラ−・クロ−ニング・
ア・ラボラトリ−・マニュアル・セカンド・エディショ
ン（Molecular Cloning a Laboratory Manual Second E
dition) 第25〜28頁、コ−ルド・スプリング・ハ−バ−
・ラボラトリ−・プレス（Cold Spring Harbor Laborat
ory Press)、1989年〕記載のアルカリ法により組み換え
体プラスミドDNAを約20μg得、該プラスミドをpCI519と
命名した。このプラスミドは、pCI429に挿入されている
環状イソマルトオリゴ糖合成酵素遺伝子を含有したDNA
断片が逆向きに挿入されている以外はpCI429と基本的に
は全く同じである。

【００２６】次いで、組み換え体プラスミドDNApCI429
及びpCI519を用いてキロシ−クエンス用欠失キット（宝
酒造社製）を用い、ヘニコフ（Henikoff)の方法［ジ−
ン（Gene)、第28巻、第351〜359頁、（1984年）］に従
い、環状イソマルトオリゴ糖合成酵素遺伝子に種々の欠
失が導入されたプラスミドDNAを作製し、項目(2)と同様
にして大腸菌XL1-Blue MRF'(東洋紡社製）を形質転換し
た。この様にして得られた大腸菌にヘルパ−ファ−ジM1
3KO7（宝酒造社製）を感染させることにより、メッシン
グ（Messing)の方法［メソズ・エンザイモロジ−（Meth
ods in Enzymology)、第101巻、第20〜78頁、（1983
年)］に従って1本鎖DNAを調製した。得られた1本鎖DNA
によるシ−クエンシングはタックポリメラ−ゼシ−クエ
ンシングキット（Taq polymerase sequencing kit) [ア
プライド・バイオシステム・インスツルメント〔ABI社
製〕］及びDNAシ−クエンサ−［アプライド・バイオシ
ステム・インスツルメント〔ABI社製〕］を用いて、常
法に従って行なった。得られたバチルス・エスピーT-30
40菌株（FERM BP-4132)由来の環状イソマルトオリゴ糖
合成酵素遺伝子の全塩基配列を配列番号2に、また該塩
基配列から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸一次配列
を配列番号1に夫々示した。

【００２７】〔実施例２〕１% デキストラン40（名糖産
業社製）、１%ペプトン（極東製薬工業社製）、0．5% N
aCl及び0.1%イーストエキス（ディフコ社製）からなる
液体培地（水道水使用、pH 7.0)100mlを500ml容坂口フ
ラスコに分注し、120℃で20分間殺菌処理を行なったも
のに、バチルス・エスピーT-3040菌株（FERM BP-4132)
保存スラントより1白金耳接種し、30℃で1日間振盪培養
して培養物を得た。本培養液1000mlを上記と同様の培地
組成と殺滅菌条件により調製した300Lの培地を含有する
500L容タンクに接種し、30℃、0.25vvm、70rpmの条件で3
日間通気撹拌培養を行ない、培養終了後、培養液300Lを
マイクローザ（旭化成工業社製、限外濾過膜、登録商標
名）を用いた膜処理により除菌し、得られた除菌液を更
に分子量6000カットのフォロファイバーにより6.3Lに濃
縮した後、濃縮液を900mlずつ-20℃に凍結保存した。

【００２８】900mlの濃縮液を用いて、環状イソマルト
オリゴ糖合成酵素の精製を行なった。先ず、本濃縮液を
解凍後、1mM EDTA含有の10mMリン酸緩衝液(pH7.0)に対
して4℃で1晩透析処理を行なった。透析物を遠心分離し
て不溶物を除去した後、上清液を同緩衝液で平衡化した
DEAEーセファロースCL6Bカラムにアプライした。同緩衝
液で洗浄後、0〜0.8MのNaCl濃度勾配により吸着蛋白質
を溶出した。集めた活性画分320mlに対して、終濃度1.0
Mになるように硫安を加え、遠心分離により不溶物を除
去した。上清液を以下の操作による分取用HPLCで精製し
た。上清液を1.0M硫安、10mM EDTA含有の100mMリン酸緩
衝液(pH7.0)で平衡化したTSKgel Phenyl5PWカラムにア
プライし、同緩衝液で洗浄後、1.0〜0Mの硫安濃度勾配
により吸着蛋白質を溶出した。

【００２９】集めた活性画分150mlに対して、終濃度1.0
Mになるように硫安を添加し、遠心分離により不溶物を
除去した。上清液を再度1.0M硫安、10mM EDTA含有の100
mMリン酸緩衝液(pH7.0)で平衡化したTSKgel Phenyl5PW
カラムにアプライし、同緩衝液で洗浄後、同緩衝液中の
硫安濃度を0.3M迄下げたステップグラジエントで1度洗
浄した後、0.3〜0Mの硫安濃度勾配により吸着タンパク
質を溶出した。集めた活性画分88mlを限外濾過で約1ml
に濃縮した後、1mM EDTA含有の10mMリン酸緩衝液(pH7.
0)20mlを加えて塩濃度を稀釈した。本溶液を1mM EDTA含
有の10mMリン酸緩衝液(pH7.0)で平衡化したTSKgel DEAE
5PWカラムにアプライし、同緩衝液で洗浄後、0.15MのNa
Clで1度洗浄した後、0.15〜0.4MのNaCl濃度勾配により
吸着タンパクを溶出した。集めた活性画分12mlを0.9ml
迄限外濃縮した。10mM EDTA及び200mM NaCl含有の100mM
リン酸緩衝液(pH7.0)で平衡化したTSKgel G3000SWカラ
ムに、0.3mlずつ酵素溶液をアプライし、同緩衝液により
溶出した。本操作を残り0.6mlについて同様に行なった
(0.3mlずつ2回)。得られた活性画分を集めてSDS PAGEに
供したところ、シングルバンドを示したことから、他の
夾雑蛋白質は除去されたと判断し精製を終了させた。本
精製酵素をデキストランとインキュベーションしたとこ
ろ、デキストランから環状イソマルトオリゴ糖の生成が
確認された。ポリペプチドのN末端アミノ酸配列の決定
は、気相式ペプチドシークエンサー［アプライド・バイ
オシステム・インスツルメント〔ABI社製〕］によって
行った。その結果を、配列番号3に示す。

【００３０】この結果から、環状イソマルトオリゴ糖合
成酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸一次配列
は、配列番号4に示す通りであり、環状イソマルトオリ
ゴ糖合成酵素活性を有するポリペプチドのN末端側に続
くポリペプチドは、ポリペプチドの分泌に関わる配列で
あることが判明した。

【００３１】

【発明の効果】上述したことから明らかな如く、本発明
環状イソマルトオリゴ糖合成酵素遺伝子を含有するＤＮ
Ａを組み込んでなる新規な組み換え体ＤＮＡを含むエッ
シェリシア属に属する菌株を培地に培養することによ
り、短時間に、かつ、培地に高価なデキストランを用い
ることなく効率良くマルトオリゴ糖合成酵素を得ること
ができるので、本発明は産業上極めて有用なものであ
る。

【００３２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：972 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Val Arg Phe Met Tyr Ala Leu Arg Lys Arg Arg Leu Ser Leu Leu 5 10 15 Leu Ala Met Ser Leu Leu Val Met Cys Val Ala Ser Val Val Ser Pro 20 25 30 Pro Pro Gln Ala Leu Ala Ser Gly Ser Gly Gly Ile Glu Arg Val Phe 35 40 45 Thr Asp Lys Ala Arg Tyr Asn Pro Gly Asp Ala Val Ser Ile Arg Val 50 55 60 Gln Ala Lys Asn Gly Thr Gly Ser Ser Trp Ser Gly Ala Ala Arg Leu 65 70 75 80 Glu Ile Phe His Leu Glu Asn Ser Val Tyr Thr Ser Ser Gln Ser Leu 85 90 95 Ser Leu Thr Asn Gly Gln Ser Thr Thr Leu Thr Phe Thr Trp Thr Ala 100 105 110 Pro Ser Thr Asp Phe Arg Gly Tyr Phe Val Arg Ile Asp Ala Gly Thr 115 120 125 Leu Gly Gln Gly Ala Thr Ala Ile Asp Val Ser Ser Asp Phe Thr Lys 130 135 140 Tyr Pro Arg Tyr Gly Tyr Ile Ser Glu Phe Glu Ser Gly Glu Thr Ala 145 150 155 160 Leu Glu Ser Lys Ala Lys Val Asp Gln Leu Ala Gln Asp Tyr His Ile 165 170 175 Asn Ala Trp Gln Phe Tyr Asp Trp Met Trp Arg His Asp Lys Met Ile 180 185 190 Lys Arg Thr Gly Gly Ser Ile Asp Ser Thr Trp Leu Asp Leu Phe Asn 195 200 205 Arg Glu Ile Ser Trp Ser Thr Leu Gln Asn Gln Ile Asp Ala Val His 210 215 220 Asp Val Asn Gly Lys Ala Met Ala Tyr Ala Met Ile Tyr Ala Ser Arg 225 230 235 240 Glu Asn Tyr Ser Pro Leu Gly Ile Ser Pro Thr Trp Gly Ile Tyr Glu 245 250 255 Asp Ser Ser His Thr Asn Gln Phe Asp Val Asp Phe Gly Asp Gly Ser 260 265 270 Thr Tyr Leu Tyr Met Ser Asp Pro Gln Asn Pro Asn Trp Gln Asn Tyr 275 280 285 Ile His Ala Glu Tyr Ile Asp Ser Ile Asn Thr Ala Gly Phe Asp Gly 290 295 300 Ile His Val Asp Gln Met Gly Gln Arg Ser Asn Val Tyr Asp Tyr Asn 305 310 315 320 Gly Asn Ser Ile Asp Leu Ser Thr Arg Phe Ser Pro Phe Leu Asp Gln 325 330 335 Ala Lys Ser Val Leu Ser Ala Asn Asn Pro Ala Arg Asp Asn Leu Thr 340 345 350 Tyr Asn Ile Val Asp Gly Thr Val Asn Gly Trp Ala Val Asn Asp Val 355 360 365 Ser Lys Asn Ala Asp Leu Asp Phe Leu Tyr Ser Glu Ile Trp Tyr Leu 370 375 380 Ser Asp Ser Tyr Asn Gln Leu Lys Asn Tyr Ile Glu Gln Leu Arg Ala 385 390 395 400 Asn Gly Gly Asn Lys Ala Val Val Leu Ala Ala Tyr Met Asn Tyr Ala 405 410 415 Asp Asn Ala Gly Thr Arg Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Ser Met Thr Asn 420 425 430 Val Ser Thr Asn Thr Asn His Ala Gly Tyr Thr Gly Ser Gly Phe Val 435 440 445 Asp Gln Phe Ala Ser Thr Gly Asp Lys Val Ser Phe Ala Ile Asn Ala 450 455 460 Pro Glu Ala Gly Asp Tyr Ser Leu Val Phe Arg Tyr Gly Asn Asn Thr 465 470 475 480 Gly Ala Asn Ser Thr Leu Asn Leu Tyr Val Asp Gly Asn Phe Val Gln 485 490 495 Lys Leu Tyr Phe Phe Asn Gln Ser Ser Trp Gly Thr Trp Lys His Asp 500 505 510 Ala Trp Tyr Gln Val Pro Leu Thr Gln Gly Ala His Thr Val Glu Leu 515 520 525 Arg Tyr Glu Ser Gly Asn Val Gly Ala Val Asn Leu Asp Ser Leu Thr 530 535 540 Leu Gly Thr Phe Asp Glu His Ser Val Arg Leu Ala Asp Ala Met Met 545 550 555 560 Ser Ala Ser Gly Ala Thr His Ile Glu Leu Gly Asp Asp Asn Gln Met 565 570 575 Leu Pro His Glu Tyr Tyr Pro Asn Arg Ser Lys Thr Met Arg Ser Ser 580 585 590 Leu Lys Asn Ala Met Lys Asp His Tyr Asn Phe Ile Thr Ala Tyr Glu 595 600 605 Asn Leu Leu Phe Asp Ser Asp Val Val Pro Asn Asp Thr Gly Ser Gln 610 615 620 Phe Val Asn Leu Thr Gly Val Ser Ala Ser Gly Asp Gly Ser Ala Asn 625 630 635 640 Thr Val Trp Tyr Ile Asn Lys Arg Thr Ser Asp Tyr Asn Ile Val His 645 650 655 Leu Ile Asn Leu Leu Gly Asn Asp Asn Gln Trp Arg Asn Thr Ala Ser 660 665 670 Gln Pro Ser Phe Gln Thr Asn Leu Pro Ala Lys Ile Tyr Ile Gly Ala 675 680 685 Asp Glu Thr Ile Ser Asp Val Tyr Leu Ala Ser Pro Asp Leu Ser Gly 690 695 700 Gly Glu Thr Gln Glu Leu Ala Phe Thr Ser Gly Thr Asp Ala Gly Gly 705 710 715 720 Lys Tyr Val Ser Phe Thr Val Pro Glu Leu Lys Tyr Trp Asn Met Ile 725 730 735 Tyr Met Lys Arg Thr Phe Ser Val Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Glu Ala 740 745 750 Glu Thr Ala Ile Lys Ser Asn Val Ser Thr Asn Thr Asn His Ala Gly 755 760 765 Tyr Thr Gly Ser Gly Phe Val Asp Gly Phe Ser Ser Thr Asn Asp Gly 770 775 780 Val Ser Phe Val Val Lys Ser Thr Ala Ser Asp Asp Tyr Ala Leu Arg 785 790 795 800 Phe Arg Tyr Ala Asn Gly Gly Ser Asp Ala Thr Arg Asp Val Tyr Val 805 810 815 Asp Gly Lys Leu Ala Gly Thr Val Ser Phe Lys Ser Thr Gly Ser Trp 820 825 830 Ser Thr Trp Ser Tyr Gly Glu Ile Thr Ala Arg Leu Glu Pro Gly His 835 840 845 His Thr Ile Val Leu Trp Gln Thr Ser Gly Asn Thr Gly Ala Ile Asn 850 855 860 Leu Asp His Leu Asp Leu Asp Lys Thr Tyr Ile Trp Gln Phe Asp Arg 865 870 875 880 Gln Ile Val Ser Val Pro Ala Gly Tyr Arg Ile Thr Phe Arg Thr Gly 885 890 895 Leu Pro Gly Trp Val His Trp Gly Val Asn Gly Trp Thr Gly Val Thr 900 905 910 Asp Thr Pro Leu Arg Ser Asn Gly Ser Leu Asp Gly Asn Leu Asp His 915 920 925 Glu Thr Ser Ile Gly Pro Phe Ala Thr Gly Thr Ala Val Asp Val Thr 930 935 940 Phe Leu Trp Asp Asp Asn Asn Asn Gly Ile Leu Glu Pro Ser Thr Asp 945 950 955 960 Arg Trp Glu Gly Thr Asp Phe Gly Ile Asn Val Ser 965 970

【００３３】配列番号：２ 配列の長さ：2916 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：染色体DNA 配列： ATGGTGAGAT TTATGTACGC TTTAAGGAAA AGACGGCTTT CCCTCCTGCT TGCGATGTCC 60 CTGTTAGTTA TGTGCGTCGC ATCCGTCGTA TCCCCTCCCC CGCAAGCGCT AGCATCAGGC 120 TCTGGCGGCA TCGAGCGGGT ATTCACCGAC AAAGCCCGCT ATAATCCAGG CGACGCTGTC 180 TCGATCCGCG TGCAGGCAAA AAACGGCACC GGCTCAAGCT GGAGCGGCGC CGCCCGACTG 240 GAAATTTTTC ATTTGGAGAA CTCGGTGTAC ACCTCTTCCC AATCCTTATC GTTAACAAAC 300 GGGCAATCCA CGACGCTGAC CTTCACTTGG ACGGCTCCAT CCACGGACTT CAGAGGTTAC 360 TTCGTCCGGA TCGATGCCGG GACGCTGGGG CAAGGAGCAA CGGCGATCGA CGTCTCCAGC 420 GACTTCACGA AATATCCGCG ATACGGATAT ATTAGCGAAT TCGAGTCCGG CGAGACGGCA 480 TTGGAGAGCA AGGCCAAGGT GGATCAGCTT GCGCAGGATT ACCACATTAA CGCCTGGCAG 540 TTCTACGACT GGATGTGGCG ACACGACAAA ATGATCAAGC GCACCGGCGG CAGCATCGAC 600 TCCACCTGGC TGGACTTGTT CAACCGCGAG ATTTCCTGGT CCACCCTTCA GAATCAGATC 660 GACGCGGTGC ATGACGTAAA CGGCAAGGCG ATGGCTTACG CCATGATCTA CGCCTCCCGC 720 GAGAACTATT CGCCTCTCGG CATCAGTCCG ACCTGGGGCA TCTACGAGGA CTCCTCCCAT 780 ACGAACCAGT TCGACGTCGA CTTCGGTGAC GGCAGCACGT ACCTCTATAT GTCCGACCCG 840 CAAAATCCCA ATTGGCAAAA TTATATCCAT GCCGAATACA TCGATTCCAT CAACACCGCG 900 GGCTTCGACG GCATCCACGT GGACCAGATG GGCCAGCGCA GCAACGTGTA CGATTACAAC 960 GGCAACTCCA TTGATCTCTC CACACGCTTC TCGCCGTTTC TGGACCAGGC CAAAAGCGTA 1020 CTTAGCGCTA ACAACCCTGC CCGCGACAAC CTGACCTATA ATATCGTCGA CGGCACGGTA 1080 AACGGATGGG CGGTAAACGA TGTAAGCAAA AACGCCGATC TCGACTTCCT GTACAGCGAA 1140 ATCTGGTATC TCTCGGACAG CTACAACCAG CTTAAAAACT ATATCGAGCA GCTACGCGCG 1200 AACGGCGGCA ACAAAGCGGT CGTGCTGGCA GCCTATATGA ACTATGCTGA CAATGCCGGC 1260 ACGCGTTACG AAGCGGAGAG CGCGTCGATG ACGAACGTCT CGACGAATAC GAATCATGCC 1320 GGGTACACGG GGAGCGGATT TGTCGACCAG TTCGCAAGCA CAGGCGATAA GGTTTCCTTT 1380 GCGATCAACG CTCCCGAGGC AGGAGATTAT TCGCTCGTAT TCCGTTACGG CAACAACACA 1440 GGAGCCAATT CGACGCTTAA TCTGTACGTG GACGGAAACT TCGTGCAGAA GCTGTATTTC 1500 TTCAACCAGA GCAGTTGGGG AACATGGAAG CACGACGCCT GGTACCAGGT GCCGCTGACG 1560 CAAGGAGCCC ACACCGTAGA GCTGCGGTAC GAATCCGGCA ACGTCGGCGC GGTTAACCTC 1620 GACAGCTTGA CGCTTGGCAC GTTCGACGAA CATTCCGTAC GGCTGGCGGA TGCCATGATG 1680 TCGGCGAGCG GCGCGACGCA TATCGAGCTG GGCGACGACA ACCAGATGCT GCCGCACGAA 1740 TATTATCCAA ACCGAAGCAA GACGATGCGA AGCTCGCTCA AAAACGCGAT GAAGGATCAT 1800 TACAACTTCA TCACGGCTTA CGAGAACCTG CTGTTCGACT CGGATGTCGT CCCTAACGAC 1860 ACCGGCTCGC AATTCGTGAA TCTGACGGGC GTCAGCGCAA GCGGCGACGG ATCGGCCAAC 1920 ACGGTCTGGT ATATCAATAA AAGGACGTCG GATTACAATA TCGTTCACCT CATTAATCTG 1980 CTCGGCAATG ATAACCAATG GCGCAATACG GCGTCGCAGC CAAGCTTCCA GACCAATCTT 2040 CCGGCTAAAA TCTACATCGG CGCGGACGAA ACGATTTCGG ACGTCTATCT CGCCTCGCCT 2100 GACCTGAGCG GCGGGGAGAC GCAGGAACTG GCATTCACTT CGGGCACGGA TGCCGGAGGC 2160 AAATACGTTT CCTTTACGGT GCCGGAGCTG AAGTACTGGA ATATGATCTA CATGAAACGT 2220 ACGTTCAGCG TGCCTGCTAA CGACATCTAT GAAGCGGAGA CGGCGATCAA GTCGAACGTC 2280 TCGACGAACA CGAATCATGC CGGCTATACG GGGAGCGGCT TCGTCGACGG ATTTTCTTCT 2340 ACAAATGACG GCGTCTCCTT CGTCGTGAAG TCGACGGCCT CCGACGATTA CGCGCTGCGT 2400 TTCCGTTATG CCAACGGCGG CTCCGACGCA ACCCGGGACG TGTACGTTGA TGGCAAGCTC 2460 GCAGGCACCG TTTCGTTTAA GAGCACGGGC TCTTGGAGCA CATGGAGCTA CGGCGAGATC 2520 ACCGCGCGTC TGGAGCCCGG CCACCACACC ATTGTGCTAT GGCAGACGAG CGGCAACACC 2580 GGGGCAATCA ACCTCGATCA TCTGGATCTC GACAAAACGT ACATTTGGCA GTTCGACCGT 2640 CAAATTGTCA GCGTACCTGC CGGATACCGC ATTACCTTCC GAACGGGATT GCCGGGCTGG 2700 GTGCACTGGG GCGTAAACGG CTGGACGGGC GTGACCGATA CGCCGCTCCG GAGCAACGGC 2760 TCCCTGGACG GCAATCTGGA TCACGAGACG TCCATCGGAC CGTTCGCCAC CGGCACCGCG 2820 GTCGACGTTA CGTTCCTGTG GGACGACAAC AACAACGGTA TCCTGGAACC AAGCACGGAC 2880 AGATGGGAAG GGACGGACTT CGGGATCAAT GTGAGC 2916

【００３４】配列番号：３ 配列の長さ：24 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 種類：ペプチド 配列： Ser Gly Ser Gly Gly Ile Glu Arg Val Phe Thr Asp Lys Ala Arg Tyr 5 10 15 Asn Pro Gly Asp Ala Val Ser Ile 20

【００３５】配列番号：４ 配列の長さ：934 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 種類：ペプチド 配列: Ser Gly Ser Gly Gly Ile Glu Arg Val Phe Thr Asp Lys Ala Arg Tyr 5 10 15 Asn Pro Gly Asp Ala Val Ser Ile Arg Val Gln Ala Lys Asn Gly Thr 20 25 30 Gly Ser Ser Trp Ser Gly Ala Ala Arg Leu Glu Ile Phe His Leu Glu 35 40 45 Asn Ser Val Tyr Thr Ser Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Asn Gly Gln 50 55 60 Ser Thr Thr Leu Thr Phe Thr Trp Thr Ala Pro Ser Thr Asp Phe Arg 65 70 75 80 Gly Tyr Phe Val Arg Ile Asp Ala Gly Thr Leu Gly Gln Gly Ala Thr 85 90 95 Ala Ile Asp Val Ser Ser Asp Phe Thr Lys Tyr Pro Arg Tyr Gly Tyr 100 105 110 Ile Ser Glu Phe Glu Ser Gly Glu Thr Ala Leu Glu Ser Lys Ala Lys 115 120 125 Val Asp Gln Leu Ala Gln Asp Tyr His Ile Asn Ala Trp Gln Phe Tyr 130 135 140 Asp Trp Met Trp Arg His Asp Lys Met Ile Lys Arg Thr Gly Gly Ser 145 150 155 160 Ile Asp Ser Thr Trp Leu Asp Leu Phe Asn Arg Glu Ile Ser Trp Ser 165 170 175 Thr Leu Gln Asn Gln Ile Asp Ala Val His Asp Val Asn Gly Lys Ala 180 185 190 Met Ala Tyr Ala Met Ile Tyr Ala Ser Arg Glu Asn Tyr Ser Pro Leu 195 200 205 Gly Ile Ser Pro Thr Trp Gly Ile Tyr Glu Asp Ser Ser His Thr Asn 210 215 220 Gln Phe Asp Val Asp Phe Gly Asp Gly Ser Thr Tyr Leu Tyr Met Ser 225 230 235 240 Asp Pro Gln Asn Pro Asn Trp Gln Asn Tyr Ile His Ala Glu Tyr Ile 245 250 255 Asp Ser Ile Asn Thr Ala Gly Phe Asp Gly Ile His Val Asp Gln Met 260 265 270 Gly Gln Arg Ser Asn Val Tyr Asp Tyr Asn Gly Asn Ser Ile Asp Leu 275 280 285 Ser Thr Arg Phe Ser Pro Phe Leu Asp Gln Ala Lys Ser Val Leu Ser 290 295 300 Ala Asn Asn Pro Ala Arg Asp Asn Leu Thr Tyr Asn Ile Val Asp Gly 305 310 315 320 Thr Val Asn Gly Trp Ala Val Asn Asp Val Ser Lys Asn Ala Asp Leu 325 330 335 Asp Phe Leu Tyr Ser Glu Ile Trp Tyr Leu Ser Asp Ser Tyr Asn Gln 340 345 350 Leu Lys Asn Tyr Ile Glu Gln Leu Arg Ala Asn Gly Gly Asn Lys Ala 355 360 365 Val Val Leu Ala Ala Tyr Met Asn Tyr Ala Asp Asn Ala Gly Thr Arg 370 375 380 Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Ser Met Thr Asn Val Ser Thr Asn Thr Asn 385 390 395 400 His Ala Gly Tyr Thr Gly Ser Gly Phe Val Asp Gln Phe Ala Ser Thr 405 410 415 Gly Asp Lys Val Ser Phe Ala Ile Asn Ala Pro Glu Ala Gly Asp Tyr 420 425 430 Ser Leu Val Phe Arg Tyr Gly Asn Asn Thr Gly Ala Asn Ser Thr Leu 435 440 445 Asn Leu Tyr Val Asp Gly Asn Phe Val Gln Lys Leu Tyr Phe Phe Asn 450 455 460 Gln Ser Ser Trp Gly Thr Trp Lys His Asp Ala Trp Tyr Gln Val Pro 465 470 475 480 Leu Thr Gln Gly Ala His Thr Val Glu Leu Arg Tyr Glu Ser Gly Asn 485 490 495 Val Gly Ala Val Asn Leu Asp Ser Leu Thr Leu Gly Thr Phe Asp Glu 500 505 510 His Ser Val Arg Leu Ala Asp Ala Met Met Ser Ala Ser Gly Ala Thr 515 520 525 His Ile Glu Leu Gly Asp Asp Asn Gln Met Leu Pro His Glu Tyr Tyr 530 535 540 Pro Asn Arg Ser Lys Thr Met Arg Ser Ser Leu Lys Asn Ala Met Lys 545 550 555 560 Asp His Tyr Asn Phe Ile Thr Ala Tyr Glu Asn Leu Leu Phe Asp Ser 565 570 575 Asp Val Val Pro Asn Asp Thr Gly Ser Gln Phe Val Asn Leu Thr Gly 580 585 590 Val Ser Ala Ser Gly Asp Gly Ser Ala Asn Thr Val Trp Tyr Ile Asn 595 600 605 Lys Arg Thr Ser Asp Tyr Asn Ile Val His Leu Ile Asn Leu Leu Gly 610 615 620 Asn Asp Asn Gln Trp Arg Asn Thr Ala Ser Gln Pro Ser Phe Gln Thr 625 630 635 640 Asn Leu Pro Ala Lys Ile Tyr Ile Gly Ala Asp Glu Thr Ile Ser Asp 645 650 655 Val Tyr Leu Ala Ser Pro Asp Leu Ser Gly Gly Glu Thr Gln Glu Leu 660 665 670 Ala Phe Thr Ser Gly Thr Asp Ala Gly Gly Lys Tyr Val Ser Phe Thr 675 680 685 Val Pro Glu Leu Lys Tyr Trp Asn Met Ile Tyr Met Lys Arg Thr Phe 690 695 700 Ser Val Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Glu Ala Glu Thr Ala Ile Lys Ser 705 710 715 720 Asn Val Ser Thr Asn Thr Asn His Ala Gly Tyr Thr Gly Ser Gly Phe 725 730 735 Val Asp Gly Phe Ser Ser Thr Asn Asp Gly Val Ser Phe Val Val Lys 740 745 750 Ser Thr Ala Ser Asp Asp Tyr Ala Leu Arg Phe Arg Tyr Ala Asn Gly 755 760 765 Gly Ser Asp Ala Thr Arg Asp Val Tyr Val Asp Gly Lys Leu Ala Gly 770 775 780 Thr Val Ser Phe Lys Ser Thr Gly Ser Trp Ser Thr Trp Ser Tyr Gly 785 790 795 800 Glu Ile Thr Ala Arg Leu Glu Pro Gly His His Thr Ile Val Leu Trp 805 810 815 Gln Thr Ser Gly Asn Thr Gly Ala Ile Asn Leu Asp His Leu Asp Leu 820 825 830 Asp Lys Thr Tyr Ile Trp Gln Phe Asp Arg Gln Ile Val Ser Val Pro 835 840 845 Ala Gly Tyr Arg Ile Thr Phe Arg Thr Gly Leu Pro Gly Trp Val His 850 855 860 Trp Gly Val Asn Gly Trp Thr Gly Val Thr Asp Thr Pro Leu Arg Ser 865 870 875 880 Asn Gly Ser Leu Asp Gly Asn Leu Asp His Glu Thr Ser Ile Gly Pro 885 890 895 Phe Ala Thr Gly Thr Ala Val Asp Val Thr Phe Leu Trp Asp Asp Asn 900 905 910 Asn Asn Gly Ile Leu Glu Pro Ser Thr Asp Arg Trp Glu Gly Thr Asp 915 920 925 Phe Gly Ile Asn Val Ser 930

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 戸辺 光一朗 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の制限酵素開裂地図を有し、かつ、
   環状イソマルトオリゴ糖合成酵素（分子量103kd ）遺伝
   子を含有するＤＮＡ。 【化１】 （式中、ＢはBamHI 、ＥはEcoRI 、ＨはHindIII 、Ｐは
   PstIを示す。）
2. 【請求項２】 配列番号１に示されるアミノ酸配列を有
   する環状イソマルトオリゴ糖合成酵素をコードするＤＮ
   Ａ。
3. 【請求項３】 配列番号２に示される塩基配列によりコ
   ードされる請求項２記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号４に示されるアミノ酸配列を有
   する成熟環状イソマルトオリゴ糖合成酵素をコードする
   ＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項１乃至請求項３のいずれかの項記
   載のＤＮＡをベクターＤＮＡに組み込んでなる組み換え
   体ＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項５記載の組み換え体ＤＮＡを含む
   エッシェリシア属に属する微生物を培地に培養し、培養
   物より環状イソマルトオリゴ糖合成酵素を採取すること
   を特徴とする環状イソマルトオリゴ糖合成酵素の製造
   法。