JPS6012029B2 - コレステリンオキシダ−ゼの製法 - Google Patents

コレステリンオキシダ−ゼの製法

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JPS6012029B2
JPS6012029B2 JP55083024A JP8302480A JPS6012029B2 JP S6012029 B2 JPS6012029 B2 JP S6012029B2 JP 55083024 A JP55083024 A JP 55083024A JP 8302480 A JP8302480 A JP 8302480A JP S6012029 B2 JPS6012029 B2 JP S6012029B2
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ハンス・ザイデル
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    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、微生物からコレステリンオキシダーゼを製造
する方法に関する。
酵素コレステリンオキシダーゼは、特に体液中のコレス
テリンを非常に特異的かつ敏感に定量測定することを可
能とするので、非常に重要になっている。
この酵素は、通例、1種以上のコレステリンオキシダー
ゼ誘導物質を含有する媒体上で培養される微生物かち得
られる。しかしながら、誘導物質の添加にもかかわらず
、最大達成可能なコレステリンオキシダーゼ活性は、他
の酵素に比べて比較的低いので、この酵素の達成可能な
力価活性を更に高めることを可能とする方法を見つける
必要がある。
この場合、誘導物質として、それ自体所望酵素の基質で
あるか又はこの種の基質と化学的に近似しているような
物質が使用される。
高い活性収率を得るためには、コレステリンオキシダー
ゼ誘導物質の添加が必要であり、即ち誘導物質が存在し
ないと、微生物にとっては酵素を形成することはまった
〈不経済であり、そのために使用できず、その際、まれ
こ誘導物質としての作用を有する物質の酵素分解に使用
される。誘導物質なしでは、種々の微生物は同様にコレ
ステリンオキシダーゼを形成するが、後処理に耐える程
度の量ではなく、一般に約100U/そ程度である。コ
レステリンオキシダーゼ誘導物質を使用すると、一般に
所望酵素の活性収率は高まるが、他方で、この方法は複
雑になり、再現性が負に影響される。
このことは、使用される誘導物質が、強い親水性を有し
、従って再現可能な微細かつ均一な分配で、微生物の水
性培養媒体に合併することが困難であることに基づく。
従って培養時に誘導物質を添加せずに添加のもとで得ら
れる収率に少なくとも相当する収率でコレステリンオキ
シダーゼを得る方法をみつけることが望ましい。本発明
は、前記問題をまったく又は部分的に解決することを目
的とする。
殊に、本発明の目的は公知方法におけるよりも高い酵素
収率を得るように実施するコレステリンオキシダーゼの
製法を得ることである。もう1つの課題はコレステリン
オキシダーゼ誘導物質の不存在下に操作できるこの種の
方法をみつけることである。この課題は、本発明により
、コレステリンオキシダーゼの製法により解決され、こ
れは、ストレプトマイセス・グリセオフスクス(Str
eptomyces 稗iseo机sc瓜 DSM40
191 ・ATCC23916)、ストレプトマイセス
・ハイグロスコ ピクス(Streptomyces
hy餌oscopに雌)DSM40771・ATCCI
O976)ストレブトマイセス・アシドマイセテイクス
(Streptomycesacidomycetic
瓜 DSM40798・ATCCI1611)及び/又
はアルトロバクター・パラフイネンス(山throMC
ter paraffi船nS DSM312AT
CCI5591)を培養し、培養液上澄み及び/又は細
胞から酵素を取り出すことによりうる。
ここで使用されている4種の菌株は寄託機関から公表さ
れている1977年のDSM−カタログに収載されてい
る。本発明により使用される微生物を用いて、従来達成
可能な値をはるかに越えた活性が得られる。
培養液1夕当り2000Uの従来の最大活性が達成され
たが、本発明によれば、培養液1〆当り約6000Uま
での活性が得られる。しかしながら、これらの優れた収
率は、コレステリンオキシダーゼ誘導物質の添加なしで
得られることは特に意想外のこれである。
本発明により使用される微生物は、公知の本質的コレス
テリンオキシダーゼ生産菌に比べて6の音までも高い酵
素活性を生じる本質的コレステリンオキシダーゼ生産菌
である。この活性は約5〜10夕/そのビオマス含量を
有する培養媒体に関連している。本発明方法で使用され
る微生物は、培養液上澄み中にも酵素を生じ、この際培
養液上澄み中の合計活性は、一般に、細胞の溶解時に得
られる粗エキス中の活性より大きい。
本発明方法で使用される微生物は、通例ストレプトマィ
セス属菌に使用される栄養培地上で好気性条件で特に振
動培養で培養することもできる。
可溶性デンプン10〜30夕/夕、ベプトン(肉)2〜
10夕/そ、コウポェキス2〜102/夕並びに慣用の
塩、徴量元素及びビタミンを含有する培地が特に好適で
あると立証された。この種の靖地の使用時に、一般に2
〜5日の培養時間で最大収率が得られる。本発明により
、高いコレステリンオキシダーゼ活性を得ることにより
生産方法を著るしく廉価にすることができる。
この場合に、コレステリンオキシダーゼ誘導物質を排除
することができるのは特に有利であり、これは方法を廉
価にするだけでなく、その再現性を箸るしく高める。次
に実施例につき本発明を説明する。
例1 ストレプトマイセス・グリセオフスクス DSMM40191(ATCC23916=IFO12
870)を次の組成の培地中で培養する。
可溶性デンプン 20タ′そべプト
ン(肉) 5夕/そコウポエキス(デイ
フコ) 4夕/そCaC〇3
2夕/そKN〇3
1夕/そK2HP〇4
0.5夕/そMgS〇4・7日2〇
1.03夕/そNaCそ
0.5夕/そFeS〇4・7日2〇
○‐02夕/夕菌株を100肌‘−ェーレ
ンマィャーフラスコ中の渚地10地中で2日間培養し、
250の【ェーレンマィャーフラスコ中で同じ培地40
のZ中に移す。
引続き振動下に3000で培養する。3日後に試料を取
り出し、培養液上澄み及び粗エキス中のコレステリンオ
キシダーゼの活性を検査する。
粗エキスは、5の‘培養液を遠心分離し、ビオマスを0
.09M燐酸塩緩衝液(pH7)5机上で洗浄し、同じ
緩衝液5の‘中に再懸濁させ10%トリトン×100一
落液0.2の‘を添加して溶解させることにより得られ
る。室温で10分放置の後に遠心分離し、上澄みを粗エ
キスとして得た。活性測定の実施のために、24仇mで
の吸光度増加に基づき、コレステノン形成(pH7.5
で0.5モル/〆燐酸塩緩衝液中で)を測定した。
対照のために、それぞれコレステリンを添加せずに空値
を測定した。次の結果が得られた:合計U/そ(培養液
) : 5741 そのうちの粗エキス中U/そ:1118 そのうちの培養液上澄中U/そ : 4628例2例1
の方法をストレプトマィセス・ハィグロスコピクスDS
M40771(=ATCCIO976)の使用下に、繰
り返した。
3日及び4日培養の後に測定を行なった。
次の活性が得られた:培養時間 A 計 租エキス
培養液上澄みく日) (Uノム)くUノム) (U
/と)3 4765 1260 35054 5
223 1423 3800 誘導物質としてのコレステリン2%の存吾で培養すると
、活性収率は、やっと半分に達した。
例3ストレプトマイセス・アシドマイセテイクスDSM
40798(=ATCCI1611=m03125)を
用いて、例1記載の方法を繰り返した。
3日もしくは4日の培養の際の結果を次表に示す。
培養時間 △ 計 粗エキス 培養液上澄みく日)
(U/必) (Uノム) くU/と)3 165
6 721 9354 2052 711 13
41 誘導物質としてのコレステリン2%の存在で培養を実施
すると、活性収率は50%だけ上昇した。
例4アルトロバクター・パラフイネンスDSM312(
=ATCCI5591)を用いて、例1記載の方法を繰
り返した。
但し媒体にコレステリン3%をコゥポェキス中の懸濁液
の形で(合計10タ′〆)が添加した。4日培養の後に
、粗エキス中には4470U/そが認められた。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1 コレステリンオキシダーゼを製造するために、スト
    レプトマイセス・グリセオフスクスDSM40191、
    ストレプトマイセス・ハイグロスコピクスDSM407
    71、ストレプトマイセス・アシドマイセテイクスDS
    M40798及び/又はアルトロバクター・パラフイネ
    ンスDSM312を培養液上澄及び/又は細胞から酵素
    を得ることを特徴とする、コレステリンオキシダーゼの
    製法2 ロレステリンオキシダーゼ誘導物質を含有しな
    い媒体中で培養する特許請求の範囲第1項記載の方法3
    可溶性デンプン10〜30g/l、ペプトン2〜10
    g/l、コウポエキス2〜10g/l並びに塩、微量元
    素及びビタミンを含有する媒体中で培養する、特許請求
    の範囲第1項又は第2項記載の方法
JP55083024A 1979-06-20 1980-06-20 コレステリンオキシダ−ゼの製法 Expired JPS6012029B2 (ja)

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DE2924875.7 1979-06-20

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JPS565094A JPS565094A (en) 1981-01-20
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DE (2) DE2924875A1 (ja)
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DE3060364D1 (en) 1982-06-24
DE2924875A1 (de) 1981-01-29
CA1145278A (en) 1983-04-26
EP0021311A1 (de) 1981-01-07
SU1026656A3 (ru) 1983-06-30
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