DE1946682A1 - Verfahren zur Herstellung von Hyaluronidase - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Hyaluronidaae durch Kultivierung der Stämme Strptomyces hyalurolyticus und auch auf ein Verfahren zur lieinigung der neuen Hyaluronidase.

Die Hyaluronidase ist ein Enzym für die Depolymerisation von Hyaluronsäure, wobei ein niedrig molekulares Zuckerderivat erhalten wird. Es ist allgemein bekannt, daß das Enzym in der Hodensekretion von Säugern enthalten ist und daß es als "Ausbreitungsfaktor" bezeichnet wird* K₀ Meyer et al haben ein Enzym von der. kristallinen Linse eines Augapfels isoliert, und sie haben auch gefunden, daß ein autolysiertes Produkt« welches durch die Einwirkung von Pneumococcus gebildet wird,

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die Viskosität von Mucopolysaccharide]* verringert und sie unter Bildung eine3 reduzierenden Zuckers depolycierisiert» Das Enzym wird von K, Meyer und seinen Mitarbeitern als Hyaluronidase bezeichnet, welche dem Ausbreitungsfaktor entspricht.

Biese Hyaluronidase findet man in größeren Mengen in der Haut, der WlIz, den Hoden und dem Samen von Tieren» im Gift von Bienen und Schlangen und im Bindegewebe von Kaulquappen» Diese Hyaluronidase wird auch als Exoenzym von pathogenen Bakterien gefunden, wie 2,B. bei Clostridium welehii, Streptococcus hemolyticus, Staphylococcus aures, Pneumococcus und dgl, Dieses Enzym reguliert die Gewebedurchlässigkeit und die Fruchtbarkeit von Tieren und spielt auch eine Rolle bei der Eindringung von. Gift, das durch Bakterien sekretiert wird, und bei der menschlichen Ernährung» Dieses Enzym, welches physiologisch und pathologisch wichtig ist, wird klinisch verwendet_a Eine handelsübliche Hyaluronidase wird aus den Rinderhoden hergestellt, und deshalb ist die Herstellung von Hyaluronidase aus dieser Quelle beschränktα Auch besitzt die Hyaluronidase, die unter Verwendung von Rinderhoden oder Bakterien hergestellt wird den Nachteil, daß sie bei der Reinigung unstabil ist,,

Es wird hier darauf hingewiesen, daß die Hyaluronidase bisher nicht in anderen Mikroorganismen als Bakterien gefunden wurde,

Erfindungsgemäß wurde nunmehr festgestellt, daß eine neue Art von Streptomyces, die aus dem Boden isoliert wurde, in einer Nährlösung eine große Menge stabilse Hyaluronidase anhäufen kann ο Die neue Art, die au Streptomyces gehört, wird als Hyaluronidase erzeugende Streptomyces sp. No₀ 81-10 bezeichnet und wird von den Erfindern Streptomyces hyalurolyticus nov₀ sp_o genanntο

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Die ideologischen Charakteristiken des Streptomyces hyalurolyticus nov. sp. (Streptomyces sp_o Ho. 81-10) werden in der Folge aufgeführt ο Sie -wurden durch die Verfahren identifiziert» die in "Bergey^!s Manual of Determinative Bacteriology", 7. Auflage (1957) und "The Actinomycetee", Band II <1961) von S.A. Waksman beschrieben Bind.

I. Morphologische Charakteristiken:

(1) Sporentragende Hyphae: einfach, keine WirteletBndigkeit» gerade oder teilweise gebogene Sporaphoren, keine Spiralen·

(2) Sporen: elliptisch, 1,0 χ 0,7jm, , glatte Oberfläche, erzeugen Ketten von mehr ale IO Sporen.

(3) i) Sphärische Sporangien: keine ii) Peitschensporen: keine

iii) Sclerotia: keine. ii) Luftnycel: vird gebildet.

^f5) Vegetatives Mycel: dünner als Luftmycel, keine Segmentation, kein Septum«

II» Kulturcharakteristiken:

Wenn nichts anderes angegeben ißt, werden die Kulturcharakteristiken nach einer zehntägigen Kultivierung bei 30⁰C beobachtet. Die Angabe der Farbe bei den verschiedenen Kulturen wurde mit Hilfe des "Standard of Color*¹, herausgegeben νοβ Japan Color Research Institute, bestirnt·

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6AO OR(OtNAU

Ku3.turcharnkteristj.ken

Medium	WachBtum	Luftmycel	lösliches Pigment
'1'Nähragar	mäßig, bernsteinfarben, glänzend, hefeartige Oberfläche	nichts	gelblich braun
(2) v 'Sucroee- Nitrat- Agar	mäßig, hefeartige Oberfläche, gerunzelt (unter)	schwach, weiß	gelblich braun
^^syntheti scher Agar	mäßig, weiß	bräunlich weiß bis blaß orange, spät	blaß gelb lich-braun
^'Glucose- Aeparagin- Agar	mäßig, weiß, dünn	schwach, weiß bis blaß orange	blaß gelb lich-braun
(^Ca-Maleat- Agar	schwach, farblos	schwach, weiß	nichts
*6Wucose- Pepton- Agar	mäßig, blaß gelblich- braun, hefeartig, ge runzelt (unter)	schwach, gräulich·^ weiß	dunkel gelblich braun
	mäßig, creamfarbig bis braun, gerunzelte Oberfläche	mäßig, weiß	bräunlich schwarz
^8^Kartoffel- Bclinitz	reichlich, gelblich braun, gewellt und gerunzelt	mäßig, gräulich weiß	dunkel gelblich braun
^Earotten- sclmitz	nichts	nichts -	nichts

Fortsetzung

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SAD ORIGINAL

	•j» *% ■»	reichlich, weiß bis blaß orange, und bis rosa-weiß	gelblich braun
no) Haferaiebl- agar	reichlich, weiß, flach	nichts oder schwach, weiß	dunkel braun
(11 ) v''' 3!yrosin-* agar	schwach, farblos	nichts	dunkel rötlich braun
^ ^Gelatine	farblos öder creamfarhen, kraterförraig oder schichtenförmig, starke Verflüssi gung,	schwach, weiß	dunkel gelb
(^Wh	reichlichι weiß Oder oreamfarben» ringförmige Ober fläche, Coagulation, langsame Peptoni- eierung» keine Lackrausreduktion	nichts	nichts
*t4*Zellülose« media	nichts	nichts	dunkel braun
(i5)Pepton- lösung	reichlich, nem- branös, weiß bis gräulich-weiß, keine Irübung	nichts oder schwach	hell braun
*i6*Nährlösung	reichlich, mem- branös, matt weiß, erzeugt ein Itycelgeflecht, keine Trübung

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Physiologie ehe Eigenschaften* Aerob oder anaerob? aerob.

'femperaturhereich für das Wachstum und optimale Tempera-

turi t8-40°0_t 27-3O^öG„

pH-Bereich fUr das Wachstum und optimaler pH: 5·11».-7-8»

Verbrauch von Kohlenstoff quellen:

Xylose

I/Iannose Sucrose Baffinoae Glycerin Inulin Sorbit

Inositol - , Salicin + , Stärke + , Galactose f> Glucose Lactose Rhanaiose Mannit Dextrin Maltose

Verflüssigung von Gelatine (proteolytische Wirkung):

positiv (stark)·

Ooagulierung und Peptonisierung von Milch (prot8olytiaphe. Wirkung): positiv (stark);, Hydrolyse von Stärke (amylolytische Wirkung):

positiv (stark)a

Verbrauch von Zellulose (zellulolytischa V/irkung):

negativ« Nitratreduktion:- positiv Tyrosiase {Melaninbildung) ί p03itlv_o Ghromogene Wirkung: positiv.

Hämolyse: negativ» Hydrogensiafatbildung: positiv» Katalaßebildung: negativ, Indolbilöuiig: nsgativ.

Abtöbungs temperatur:

Minuten)

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Aufgrund der Sateache, daß Streptomyces sp«, No. 81-10 das Wachstum von Hyphae fördert» vegetatives Mycelium ohne Segment bildet und kein Sporangium bildet, geht hervor, daß er zur Familie otraptoiaycetaceae gehört, Weiterhin wächst Streptomyees sp. No 81-10 nicht bei einer Temperatur oberhalb 5O⁰G, erzeugt r,uhn oder mehr Sporen» die miteinander in einer Kette verbunden 3ind, und tragt ein Luftmycel; deshalb gehört er zur Art Streptonycea, Weiterhin wird angenommen, daß Streptomyces sp„ No 81-10 nach der Klassifizierung von Waksman zur Gruppe A II gehört, da ea sich hierbei um eine Mikrobe der chromogenon Type handelt, die keine Virtelständigkeit bildet» Diese Gruppe Λ II enthält 69 Arten _t aber sie unterscheiden eich von Streptomycee sp, Ko. 81-10 im Wachstum in der Farbe und auch darin, daß die ßporentragendβ Hyphae keine Spiralen bildet«

Ia Hinblick auf die obigen Betrachtungen und im Hinblick auf die Tatsache, dnß Streptomyces sp. Ho« 81-tO eine neue Hyalurojiidr.se bildet, kann man sagen» daß Streptomycos sp. Ho₀ 81-10 eine neue Art lot, der aufgrund der physiologischen Eigenschaften der Kaiiit; Utreptcmyces hyalurolyticu« gegeben wurde c Streptoir.yce.3 hvelurclytictis nov„ ορ_ς vtu*de im "Institute of Applied Microbiology'¹, der Universit£.t Tokyo in Japan als Nummer "I,A .1U 1801 ζ" niedergelegt,

Streptoaycen hynlurolyticue nov, sp_; I.A₀H₀ 18012 kann auf einen Medi\ua lcultiviert verden, das für die Herstellung von Hyaluronidpee verwendet wird_f vobei die üblichen Rulturmethoden verwendet werden, wie z,E. eine aerobe fsste Kultur, eine lauchhultur und dgl, Eine bevorzugte Kulturmsthode ist die Bülüftungn/Eöwegungs-Eultia', bei der ein flüSEiges Medium

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c^» Q mm

Das Kulturmedium enthält Glycerin, Glucose, lösliche Stärke, Sucrose oder Dextrin als Kohlenstoffquelle, Casaminosäure_f Pepton, Fleischextrakt» Malzextrakt, Flüssigkeit, in der Mais eingeweicht wurde, entfettetes Soyabohnenpulver, Hefeextrakt, Harnstoff oder Ammoniumsalze als Stickstoff quelle, verschiedene Phosphate, Natriumchlorid oder MgSO^⁰THgO als anorganische Säure, Antischaurabildungsmittel und andere Zusätze, Es wird bevorzugt, lösliche Stärke oder Dextrin als Kohlenstoffquelle und Hefeextrakt, Oasaminosäure oder (HH^)oSO. als Stickstoffquelle zu verwenden

Wenn ein solches Kulturmedium mit Streptomyces hyalurolyticus spe I₀A₈M₀ 180t2 geimpft und dann bei einer Temperatur

von 27-30⁰C 48-96 Stunden lang unter Belüftung kultiviert wird, dann erreicht die Bildung von Hyaluronidase ein Maximum* Der pH-V/ert einer Kul'^irlösung kann entsprechend dem verwendeten Kiilturiaedium verringert werden, aber Streptomyces hyalurolyticus nov, sp₆ I,A«Mo 18012 wird dadurch im Wachstum und in der Bildung von Hyaluronidase nicht beeinflußt» Wenn Calciumcarbonat einem Kulturmedium zugesetzt wird, dann wird die Bildung von Hyaluronidase gelegentlich verringert *

Zur Herstellung einer rohen Hyaluronidase werden zuerst die Zellen mit Hilfe einea geeigneten Verfahrens vom Kulturmedium abgetrennt, und hierauf wird das resultierende Kulturfiltrat oder sin konzentriertes Kulimrf iltratj, welches durch. Konzentrierung des Kulturfiltrats unter Vakuum erhalten wird, einer Lösungsmittelausfällung oder einer Aussalzung unterworfen,,

Beispiele¹ für"organische Lösungsmittel, die gemäß der Erfindung verwendet werden_t sind Äthylalkohol, Methylalkohol und Aceton* "um Aussalzen können beispielsweise Amtnoniumsulfat und Magnesiumsulfat verwend-st "werden»

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Die rohe Hyaluronidase enthält eine große Menge eines braunen Pigments der Melanintype, welches durch Strptomyees hyalurolyticus nov. ep» I₀AoMa 18012 gebildet wird, "und auch andere färbende Stoffe, die -vom Kulturmedium stammen,, Dieses figment und diese färbenden Stoffe können durch die herkömmlichen Reinigungsverfahren nioht vollständig abgetrennt werden« Außerdem wird die gereinigte Hyaluronidase nicht in hohen Ausbeuten erhalten«

Gemäß der Erfindung wurde nunmehr weiterhin ein Verfahren zur Reinigung der Enzyme gefunden, bei welchem Anionenaustauschharzs, adsorbierende synthetische Harze und Kationenaustauschharze für die Abtrennung der färbenden Stoffe verwendet werden. Dabei wird das Enzym in einer hohen Ausbeute erhalten· Die Anionenaustausehharze und die adsorbierenden synthetischen Harze ^ _- können nach Vaschen mit Säuren und Alkalien wieder verwendet werden» Diese Harze bedürfen keiner Pufferung»

Das neue Verfahren zum Heinigen der rohen Hyaluronidase wird in der Folge erläutert:

Zuerst wird ein Anionenaustauschharz mit einer 2 η Salzsäure und einer 2 η liatriumhydroxydlösung gewaschen. Dann wird das Harz mit Wasser gewaschen, bis das ausfließende Wasser einen pH-Wert von 5-6 aufweist. Das gewaschene Harz wird in eine Kolonne eingebracht, und dann wird eine lösung, die die rohe Hyaluronidase enthält, durch die Kolonne hindurchgeschiokto Der pH-Wert des resultierenden Effluats ändert sich von 5 auf 9, und deshalb wird der pH-Wert auf ungefähr 5_fO eingestellt, indem eine 1 η Salzsäure zum Effluat zugegeben wird.

AIb zweites wird das Effluat durch eine Schicht eines adsorbierenden Harzes hindurchgeführt, welches in eine Kolonne ein-

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■ - ίο -

gebracht und in der gleichen Weise wie oben mit Säure und Alkali behandelt worden ist«, Auch hier wird der pH-Wert dea resultierenden Ef fluate durch Zusat2 von 1 η Salzsäure auf ungefähr 5»O eingestellt ο

Abschließend wird das Bffluat durch eine Schicht eines gepufferten, schwachsauren Kationenaustauschharzes mit einem pH-Wert von 4-5 hindurchgeführt, wodurch die Hyaluronidase auf dem Kationenaustauschharz adsorbiert wird. Die adsorbierte Hyaluronidase kann vom Kationenaustauschharz abgetrennt werden, indem sie mit einer 0,5 molaren Pufferlösung gelöst wird, die Essigsäure und ein Acetat enthält» Das Produkt ist dann eine gereinigte farblose Hyaluronidase_o

Beispiele für Anionenaustausehharze, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, sind Duolite A-2, A-4» A-6 und A-7, die von der Diamond Alkali Company hergestellt werden* und Amberlite XE-225» welches von Rohm und Haas hergestellt wird ο Beispiele für adsorbierende Harze, die gemäß der Erfindung verwendet werden, sind Duolite ES-33 und Duolite ES-30, die von der Diamond Alkali Company hergestellt werden«, Beispiele für Kationenaustauschharze, die gemäß der Erfindung verwendet werden, sind Duolite BS-80, Duolite CS-I01, die durch die Diamond Alkali Company hergestellt werden, und Amberlite ZRC-50 sowie Amberlite XB 64, die von Rohm und Haas hergestellt werden,, Be soll noch erwähnt werden, daß gemäß der Erfindung auch Diäthylaminoäthylzellulose (DEAE-Zellulose) zum Reinigen der rohen Hyaluronidase verwendet werden kann»

Dieses Enzympräparat spaltet Hyaluronsäure in ein Oligosaccharide welches durch Reduktion von Anilinhydrogenphthalat nachgewiesen wird. Das Enzympräparat bildet kein N-Acetylglucosamin und keine Glueuronsäure. Die Aktivität läßt sich auch dadurch zei-

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daß dna Vermögen von Hyaluronsäure, eine Proteintrübung

n, aufgehoben wird, und auch dadurch, daß die hohe Viekoaitüt der Substrat lösung durch das ßnaym verringert wird_o In uegenaalF, zur p.us Hoden gewonnenen Hyaluronidase kann dieses Knnyra Chondroitin und Chondroitinsulfat nicht zersetzen.

Der optimale pll-v.'ert und die optimale Temperatur für die Enzymnktivität aind 5,0 bzw, 65-7O⁰C. Der stabile pH-v/ert-Bereich während 24 Stunden bei 37⁰C liegt zwischen 4 und 10, Dieses .'MiBy₁Ti ist gegenüber Wärme bemerkenswert stabil; es findet i'cino Kierkliche Verringerung der Aktivität durch eine 30 Minuten d'ueinde Würrosbehandlimg bei bia zu 75-8O⁰C statte fiine ;;crciii;i(Xtc EnzymlöBung kenn mehrere Monate in Kühlscliränken ;-'»lfv:ort werden, ohno &■■>.% irg-?ndoine "Verringerung der Aktivi~ tab vor sich geht«. Hg \md Kn '-Ionsn inliibieren dan Enzym, wan "Un Gegerr.p.iz au der a\is Hoden und aus Pnetimoeoccen gewon~ neuen Hyeluronidase öt«i^v _:'_Jt £in Vfjrgleich der enzymatischen

n von Hodc^5>?"_t Bakterien- und Btreptorayces-Hyaluist in tier folgenden Tabelle 1 geneigt-

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8AD ORIGINAL

Tabelle 1

Vergleich der neuen Hyaluronidase und der bekannten Hyaluronidasen.

	Tierische Hyaluronidase	bakterielle Hyaluronidase	neue Hyaluronidase
Quelle	Rinderhoden	Clostridium welchii, Streptococcus heraalytieuB, Staphylococcus aureus	Streptomyces hyalurolyticus novo spο IoAoM«, 18012
Substrat- spezifit ät	Hyaluronsäure, Chondroitin, Chondroitin- ßchwefelaäure	Hyaluronsäure, Chondroitin	Hyaluronsäure
ι/arme Sta bilität	eine Wärmebe handlung bei 8O0G während 30 Minuten er gibt eine 50$ige Restaktivität eine Wärmebe handlung bei 100°0 während 5 Minuten er gibt eine 80^ige Hestak- tivität	Streptococcus: eine Wärmebe handlung bei 45°C während 15 Hinuten er gibt eine In- aktivität. Staphylococcus; eine Wärmebe handlung bei 550C während 5 Minuten er gibt eine 10/oige Hest- aktiTTität	line Wärmebe handlung bei 7O0C und wäh rend 50 Minu ten ergibt eine 100#ige Restaktivität- eine Wärmebe handlung bei 8O0C während 30 Minuten ergibt eine 95^igQ Rest aktivität *
pH- Stabilität	breiter Bereich	unterhalb pH 5 und oberhalb pH 8 unstabil	t>H 4,0-11,0 \breiter Be reich)
optimaler pH	5,5-6f2	5,5-6.2	5,0
Inhibitor 1	T. 4·-'- n ++ „ -H Ie , Cu « Zn	Fe'H\ Zn++	Mntj:, Hg++i Zn^ aktiviert

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ORIGINAL

Aus den obigen Resultaten ist ersichtlich, daß die Hyaluronic daae von Streptomyces hyalurolyticus nov, Bp_s I₀A₀Mo 18012 sich klar von der aus Tieren oder Bakterien gewonnenen untersnheideto Ea isb das erstemal» daß eine mikrobialle Hyaluronidase in anderen Quellen als pabhogenen Bakterien gefunden wurde,

Die erfindungsgemäße Hyaluronidase wurde naoh dem neuen Verfahren von !Dolksdorf geprüfte Zunächst wurdo Hyaluronsäure aus Nabelschnüren nach dem Dori'man¹ sehen Verfahren hergestellt-Eine Lösung von Hyaluronsäure, die annähernd ! mg/ml enthielt, wurde dadurch hergestellt, daß die Hyaluronsäure In einem 0,02 m Mcllvaine-Puffer (pH 5,0\ der 0,2i MaCi enthielt, aufgelöst wurde» I?ür den Versuch wurden 0,5 ml ■ Enaymlööiu*g mit 0,5 ml Hyaluronsäurelösung (die Lösungen wurden vorher auf 6O⁰G erwärmt) gemischt und 50 Minuten bei 6O⁰C inkubiert» Hierauf wurden 4 ml saures Pferdeserum, das mit der 40-fachen Menge Pufferlösung verdünnt worden war, rasch zugegeben, und genau 10 Minuten später wurde die optische Dicht·) in einem Spektralfotometer bei 660 m Ji gemessen, Bs wurden Eor*trollver~ suche mit deaktivierten iünzymlösungen (10 Minuten ώμΪ 100°ΰ erhitzt) nach dem gleichen Verfahren ausgeführte üiifea^ disaen Bedingungen verringert die , 1'-.R₀W₁ ('frubungsrt.aasi einheit),die der Enzymkonzentration ent spricht _s ilia um die Halfte„

Die Erfindung wird durch die ;tOl?jenden Beispiuiu iiLUs.^1· i.-i? läutert-

Beispiel 1

10 Liter eines Kiaturmediunw < $il ?_ä2}_} das 3,Οϊ5 ;H^!i'b .>h.; iitärkt), 0,5/> Pepton, 0,5^ Plöiöxitidicbrakt, 0_#^ ''wii-.i.,*Μ_Ο O,\5³A Höfeextrakb und ü_t I# K^Hi¹U, thil/hlelt, wiir^Jxi la ^v-i

0 Ü J H H S / \ H { Π

BAD

von vier 20 ,1 fassenden Fermantierbehältem eingegossen, Nach einer 15 Minuten dauernden S teiviliaierung bei 120°ü wurde das Kulturmedium irdt 200 ml Streptomjoea hyalurolytlous noTo apo I₀A₀H, 18012 geimpft₉ der auf dem gleißhan Medium vorkül biviert worden mir, utid hierauf wurde ©ine TaiichkuL fc tvierung 40 ^ritundan lang bei 3O⁰O unter Rühren (300 ü/min) und Belüftung {15 l/min) ausgeführt.» Das resultierende KuIfcurinedium wurde sum Aötrennsü der Zellen filtriert mid dann Zum Konzentrat i'ju:ed© ilfehylalkoliol augasetat, um <las 2'ohe K herausteilen, bis die Konzentration des Äthylalkohols 39-77$ erreichte= Hierauf immte das i'ohe Biispa unter vermindertem .Druck getrooküöt» Das i^;ohe Ensym "besaß die bat von 1600 T_ail₃Ü_e/g_e

Bins 10/iige Lösimg dies-:=?; rollen Bnayma wurde durali eine Schicht eines Duol.it© A«2 liax'sesi mit einer ireschwindigkeit von 300 r<ü»/st iunäiwuh-geTalaPi^ uelciies -»/orher mit einer 3äus?s und einem Alkali geuasöiisn liöxfieii ITKFa Hierauf iiwuile das mit Wassar gemMOksiu Ba Ä@y pH«l?©5?t des resultie^s&cleii Bffluate Bieh mif ^₅O Ιϊίϊο.ί35?ΐ@₃ vfiaMe öss? püriert (kwc-oh

1 si Salssiäii^s auf 5_;0 iäiieiigaa'feellto Dia^eii diesen Yergaß* als 90/i d©^ fürbsMaa Stoffe a<is des Lösoag ci©s

J Oi..' j ' L \ is.

vaix

Id ι

ORlGANAt

ursprünglichen Lösung des rohen Enzyms vorhanden waren,. Das Enzym wurde mit einer Ausbeute von ungefähr 73$ gewonnen» Die spezifische Aktivität deB Enzyms stieg auf daß 4-fache der ursprünglichen Aktivität«,

Abschließend wurde das Effluat in einer 0,01 molaren Pufferlösung (pH * 5,0), die Essigsäure enthielt, bei 5°C 24 Stunden lang dialysiort und dann durch eine Schicht Duolite BS-80-Harz hindurchgeführt, das vorher mit der gleichen Pufferlösung gepuffert worden war, um das Enzym am genannten Harz zu adsorbieren«. Das ndßoroierte Enzym vrurde aus dem Harz herausgelöst, inder.i eine 0,2-0,5 molare Pufferlösung» die Essigsäure enthielt, (hirr;h die Iliraochicht hindurchgeführt; vr.irdeo Hierbei wurden alle :";irbünden stoffe entfernt, 'und cm imrde ein klares Effluat erhalten, i).u3 kla:*e K;"Cluat vrorda bei xiiiuirigsii Temperaturen dialyr.i'-.rt, uuvor vjiriindertom örruck konsentriort und gefriergetrocknet. wol)o?. η:·ί·:?ΙϋΐΓ 5 g des (Tereinirten öis,ves mit einer spe- ::3Π.πο:ιοπ Alchr.vjtj.vt von 2297 Τ.Γ-,*»¹./"rag erhalten wurden. Das Kiujyn wir(··: ril: oiner Ausbeute von 64?» gewonnene Die Versuchsne ü:.iv\ in der folgend en Tabelle 2 ausann.engefejßt.

00988 5/1875 ϊ/^ρώ η&Λ BAD

Tabelle 2

Art dee Ensyms

Gresamtaktivität
(TRU)

geeamtes Protein
(Tyrosin, mg)

Bpazifisehe Ausbeute Entfärbungs= Aktivität grad

(TRU/mg
Tyrosin)

	Lösung des rohen Enzyms	400000	7600
0098	Lösung, die durch Duolite A-2-Harz ' hindurchge~ vo schickt worden ist	355000	2200
tn ■*» ο»	j Lösung, die durch Duolite ÜS-53-Iiars hindurchges chiclet worden ist	293000	1200
tn	iäffluat aus dem Duolite BS-80-Hars	257250	112

53

161

244

2297

100

73

64

99»5

100

Beispiel 2

250 1 des gleichen Eulturmediuins. wie in Beispiel 1 wurden in einen $00 1 fassenden Fermentierbehälter eingeführt, und das Kulturmedium wurde mit Streptomyces hyalurolyticus nov_a sp» IoA..H„ 18012 geimpft und 45 Stunden unter Rühren (200 U/min) und Belüftung (1:1) bei 30°0 kultiviert. Eb wurden ungefähr 1,3 kg eines gräulich-weißen rohen Enzympulvers erhalten. Das rohe Enzym besau die Hyaluronidaseaktivität von 2,5 TofioUo/mgo 160 g des rohen ünzyms wurden in Wasser aufgelöst, um eine lO^ige Lösung herzustellen· Die Lösung wurde durch eine Schicht Duolite A~7-Harz hindurchgefUhrt, welches vorher mit einer Säure und einem Alkali gewaschen worden war, und hierauf mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 500 ml/et mit Wasser gewaschen., Der pH-Wert des resultierenden JSffluats wurde durch Zusatz von 1 η Salzsäure auf 5,0 eingestellte Dann wurde das Effluat durch eine Schicht Duolite ES-33-Harz hindurohgeführt, welches vorher mit einer Säure und einem Alkali gewaschen worden war ο Hierauf wurde das Harz mit Hasser gewaschen. Der pH-Wert des resultierenden Effluats wurde auf 4,1 eingestellt, und das Effluat wurde in einer 0,05 molaren Pufferlösung (pH β 4,1), die Essigsäure enthielt, bei 5⁰C dialysiert« Dae dialysierte Effluat wurde durch eine Schicht Duolite OS-1Ot-Harz hindurchgeführt, welches ein schwach-saures Eationenaustausehharz ist, und mit einer 0,05 molaren Pufferlösung (pH « 4,1) die Essigsäure enthielt, gepuffert, um die Hyaluronidase auf dem Harz zu adsorbieren. Die Hyaluronidase wurde aus dem Harz dadurch herausgelöst, daß dieses mit einer 0,5 molaren Pufferlösung (pH s 6,0), die Essigsäure enthielt, behandelt wurde_o Die Hyaluronidase enthaltende Lösung wurde 24 Stunden in einer 0,01 molaren Pufferlösung (pH « 4, t)f dialysiert„ Die dialysierte Lösung wurde durch eine Schicht IJläthylaiainoäthylzelluloee hindurchgeführt, die vorher mit der 0,01 molaren Pufferlösung

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gepuffert worden war, um Verunreinigungen auf der Zallulose zu adsorbieren. Hierbei wurde ein Bffluat erhalten, da3 die Hyaluronidase enthielt. Das Effluat wurde in einer 0,005 molaren Pufferlösung (pH =* 8,0), die Phosphorsäure enthielt, dialysiert, und hierauf wurde das dialysierte Effluat durch eine Schicht Diäthylaminoäthylzellulose hindurchgeführt, die vorher mit der 0,005 molaren Pufferlösung gepuffert worden war, um die Hyaluronidase auf der Zellulose zu adsorbieren, Die adsorbierte Hyaluronidase wurde aus der genannten Diäthyl« aminoäthylzellulose herausgelöst, indem sie mit einer
0,05 molaren. Pufferlösung, die Phosphorsäure enthielt, behandelt wurdeο Durch dieses Verfahren wurden alle färbenden
Stoffe entfernt und eine klare Lösung hergestellte Die spezifische Aktivität der klaren lösung wurde auf das 80-fache der ursprünglichen Aktivität gesteigert» Das Enzym wurde mit einer Ausbeute von ungefähr 30$ erhalten»

Die Versracfcsergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengefaßt σ

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Tabelle 3

Art des Enzyms

Gesanrtakti- gesamtes Provität tein

(THU) (Tyrosin, mg)

spezifische Ausbeute Bntfärbungs-Aktivität grad

(TRü/mg Tyrosin)

	Lösung des rohen iinzyms	395000	7540	52	100	0
O 25 to	Lösung, die durch Duolite A-7-Harz , hindurchgeschiolrfc wurde	323900	2367	137"	82	91,0
03 X> CJH _*	^ Lösung, die durch » Duolite ES-53-Harz hindur c hge 3 ciü-ck ι	262359	1154	227	66	99,3 ^
CO -J	Kffluat aus <: em, Duolite ÖS-101-Hars	230376	150	1539	59	99?3
	li'oaxmg, die durolx JDEAE-Zelluloae (pH a 4) hirdnroh- gefiihrt wurde	175389	84	2099	45	99 j 8
	Jiffluat aus der DBAB-Zellulose (ώΗ a 8.0)	121709	30	4057	31	99,9

CX) CD OO

1946632

Eb ist schwierig, die färbenden Stoffe der Melanintype, die durch die Einwirkung von Streptomyces gebildet werden, aus der Hyaluronidase abzutrennen, wenn die bekannten Verfahren zum Reinigen von Hyaluronidase verwendet werden„ Diese färbenden Btoffe können jedoch praktisch vollständig aus einer

rohen Ilyalurcnidase abgetrennt werden* wenn sie durch ein gescniOKX wird

Anionenaustauf?chhary_t welches vorher mit einer Säure und einem Alkali gewaschen aber nicht mit einer Pufferlösung gepuffert woT'äen ist, und wenn dann daa Effluat durch ein entfärbendes und adsorbierendes Harz hindurchgeführt wird, und dieses EiTluat wiederum durch ein Kationenaustauschharz hindurchgeführt wird, welches auf einen pH von 4,0-5_f0 gepuffert ist, um die Hyaluronidaae auf dem genannten Harz zu.adsorbieren, und wenn dann schließlich die adsorbierte Hyaluronidase aus dem Harz herausgelöst wird. Hierbei wird eine farblose gereinigte Hyaluronidase in einer hohen Ausbeute und ohne Aktivitätsverluat erhalten«, Die Erfindung kann also wirtschaftlich in großem Maßstab zur Reinigung von roher Hyaluronidase verwendet werden.

009885/ 1875 OßiGlNAL

Claims (1)

1. Patentanspruch e

   1 ο Verfahren zur Herstellung einer neuen Hyaluronidase, dadurch gekennzeichnet , daß man Streptomyces hyalurolyticus nov, sp., I₀A₃M₀ 18012 auf einem geeigneten Kulturmedium kultiviert, das Kulturmedium filtriert und das Kulturfiltrat konzentriert, reinigt und trocknet_o

   2_O Verfahren zum Reinigen der neuen Hyaluronidase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Kulturfiltrat durch ein schwach alkalisches Anionenaustauschharz hindurchgeführt wird, welches vorher mit einer Säure und einem Alkali aber nicht mit einer Pufferlösung gewaschen worden ist, und daß man dann das resultierende Effluat durch ein saures Kationenaustauschharz hindurchführt _s welches vorher gepuffert worden ist, um die neue Hyaluronidase am sauren Kationenaustauschharz zu adsorbieren»

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